CN105200081A

CN105200081A - 一种甜瓜离体再生的方法及其在甜瓜遗传转化中的应用

Info

Publication number: CN105200081A
Application number: CN201510689484.XA
Authority: CN
Inventors: 许勇; 张春秋; 张海英; 宫国义
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: CN105200081B

Abstract

本发明公开了一种甜瓜离体再生的方法。本发明所提供的一种甜瓜离体再生的方法包括下述步骤：①以甜瓜子叶为外植体，将外植体接种于芽诱导培养基进行培养，获得不定芽丛；②将步骤①获得的不定芽丛置于芽伸长培养基甲进行培养，获得不定芽；③将步骤②获得的不定芽置于生根培养基进行培养，获得甜瓜再生苗。本发明提供的甜瓜离体再生的方法，具有不定芽诱导率高，玻璃化程度低，再生周期短等优势，将该方法应用在甜瓜遗传转化中，可获得较高的转化率。

Description

一种甜瓜离体再生的方法及其在甜瓜遗传转化中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甜瓜离体再生的方法及其在甜瓜遗传转化中的应用。

背景技术

甜瓜(CucumismeloL.)是一种重要的水果型蔬菜作物，属于葫芦科(Cucurbitaceae)，黄瓜属(Cucumis)，甜瓜种。甜瓜在国内外栽培普遍，近年来，随着甜瓜生产的规模化发展，甜瓜病虫害发生日益严重，造成甜瓜产量锐减、品质下降。

利用转基因技术手段进行种质定向改良是培育高产优质的甜瓜新品种的有效途径。开展甜瓜转基因技术研究，对于甜瓜病虫害防治及品种改良均具有重要的意义。与其它作物相比，甜瓜转基因技术研究进展相对缓慢，目前将外源基因导入甜瓜的方法主要有农杆菌介导法、花粉管通道法、显微注射法和基因枪法等，其中农杆菌介导的转化法相对比较成熟，且费用低、基因沉默现象少，是目前双子叶植物遗传转化的主要方法。建立一个高效、稳定的再生系统，是植物遗传转化成功的前提条件。器官分化途径是甜瓜进行外源基因遗传转化时的一个主要途径，通过器官分化出不定芽建立再生系统周期短，避免了体细胞变异。目前，通过器官分化途径进行甜瓜遗传转化的研究已有不少成功的报道，但在子叶离体再生过程中，也存在由愈伤组织分化出芽困难,直接分化不定芽分化率较低,且再生体系重复性差等问题，因此，建立高效、稳定的再生体系仍然是研究的重点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是建立高效、稳定的甜瓜再生体系。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种甜瓜离体再生的方法。

本发明提供的甜瓜离体再生的方法包括下述步骤：

①以甜瓜子叶为外植体，将外植体接种于芽诱导培养基进行培养，获得不定芽丛；

所述芽诱导培养基可为含有1.0mg/L～2.0mg/L(例如1.0mg/L～2.0mg/L或1.0mg/L或2.0mg/L)的6-BA的MS固体培养基；

②将步骤①获得的不定芽丛置于芽伸长培养基甲进行培养，获得不定芽；

所述芽伸长培养基甲可为含有0.1mg/L～0.2mg/L的6-BA和0.03mg/L～0.07mg/L(例如0.03mg/L～0.05mg/L或0.05mg/L～0.07mg/L或0.03mg/L或0.05mg/L或0.07mg/L)的IAA的MS固体培养基；

③将步骤②获得的不定芽置于生根培养基甲进行培养，获得甜瓜再生苗；

所述生根培养基甲可为含有0.05mg/L～0.15mg/L(例如0.05mg/L～0.1mg/L或0.1mg/L～0.15mg/L或0.05mg/L～0.15mg/L或0.1mg/L或0.15mg/L或0.05mg/L)的IBA和2g/L～4g/L(例如2g/L～3g/L或3g/L～4g/L或2g/L或3g/L或4g/L或2g/L～4g/L)的活性炭的MS固体培养基。

所述芽诱导培养基具体可为含有1.0mg/L的6-BA的MS固体培养基。

所述芽伸长培养基甲具体可为含有0.1mg/L的6-BA和0.05mg/L的IAA的MS固体培养基。

所述生根培养基甲具体可为含有0.1mg/L的IBA和3g/L的活性炭的MS固体培养基。

上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤①中所述外植体的制备方法为：将甜瓜种子播种于MS固体培养基，培养后获取甜瓜种子的子叶部分。所述外植体的制备方法中，所述培养的条件可为：26℃～30℃、暗培养3～5天。所述培养的条件具体可为：28℃、暗培养3天。所述甜瓜种子具体可为消毒后的甜瓜种子。所述甜瓜种子的消毒步骤可为：甜瓜种子剥去种皮，用70％(体积比)乙醇水溶液浸泡20～30s，用无菌水洗2～3次，然后将甜瓜种子用1％(质量体积比)次氯酸钠水溶液消毒10min，无菌水洗涤4～5次后，用无菌滤纸吸干多余水分，获得消毒后的甜瓜种子。

上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤①中所述培养的条件可为：25℃～28℃，培养28天～35天。所述培养可为光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度为1500Lx～2500Lx。所述步骤①中所述培养的条件具体可为：26℃，培养28天。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000Lx。所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤②中所述培养的条件可为：25℃～28℃，光照培养14～28天。所述培养可为光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度为1500Lx～2500Lx。所述步骤②中所述培养的条件具体可为：26℃，培养21天。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000Lx。所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤③中所述培养的条件可为：25℃～28℃。所述培养可为光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度为1500Lx～2500Lx。所述步骤③中所述培养的条件具体可为：26℃。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000Lx。所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

上述任一所述甜瓜离体再生的方法在甜瓜遗传转化中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种甜瓜遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；

(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对甜瓜子叶外植体进行侵染；

(3)完成步骤(2)后，取所述甜瓜子叶外植体，置于共培养培养基，进行共培养；

所述共培养培养基可为含有1.0mg/L～2.0mg/L(例如1.0mg/L～2.0mg/L或1.0mg/L或2.0mg/L)的6-BA和90μM～110μM(例如90μM～110μM或90μM～100μM或100μM～110μM或90μM或100μM或110μM)的乙酰丁香酮的MS固体培养基；

(4)完成步骤(3)后，取所述甜瓜子叶外植体，依次置于初步筛选培养基和再次筛选培养基进行培养，获得抗性芽甲；

所述初步筛选培养基可为含有0.5～1.5mg/L(例如0.5～1.5mg/L或0.5mg/L或1mg/L或1.5mg/L或0.5～1mg/L或1～1.5mg/L)的6-BA、40～60mg/L(例如40mg/L～60mg/L或40mg/L或50mg/L或60mg/L)的Kan和90～110mg/L(例如90mg/L～110mg/L或90mg/L或110mg/L或100mg/L)的Tim的MS固体培养基；

所述再次筛选培养基可为含有0.5～1.5mg/L(例如0.5～1.5mg/L或0.5mg/L或1mg/L或1.5mg/L)的6-BA、60～80mg/L(例如60mg/L～80mg/L或60mg/L或70mg/L或80mg/L)的Kan和90～110mg/L(例如90mg/L～110mg/L或90mg/L或110mg/L或100mg/L)的Tim的MS固体培养基；

(5)完成步骤(4)后，取所述抗性芽甲，置于芽伸长培养基乙进行培养，获得抗性芽乙；

所述芽伸长培养基乙可为含有0.1mg/L～0.2mg/L(例如0.1mg/L～0.2mg/L或0.1mg/L或0.2mg/L)的6-BA、0.03mg/L～0.07mg/L(例如0.03mg/L～0.05mg/L或0.05mg/L～0.07mg/L或0.03mg/L或0.05mg/L或0.07mg/L)的IAA、40～60mg/L(例如40mg/L～60mg/L或40mg/L或50mg/L或60mg/L)的Kan和90～110mg/L(例如90mg/L～110mg/L或90mg/L或110mg/L或100mg/L)的Tim的MS固体培养基。

(6)完成步骤(5)后，取抗性芽乙置于生根培养基乙培养，获得甜瓜转化苗。

所述生根培养基乙可为含有0.05mg/L～0.15mg/L(例如0.05mg/L～0.1mg/L或0.1mg/L～0.15mg/L或0.05mg/L～0.15mg/L或0.1mg/L或0.15mg/L或0.05mg/L)的IBA、2g/L～4g/L(例如2g/L～3g/L或3g/L～4g/L或2g/L或3g/L或4g/L或2g/L～4g/L)的活性炭和40mg/L～60mg/L(例如40mg/L～60mg/L或40mg/L或50mg/L或60mg/L)的特美汀(Timentin，Tim)的MS固体培养基。

所述共培养培养基具体可为含有1.0mg/L的6-BA和100μM的乙酰丁香酮的MS固体培养基。

所述初步筛选培养基具体可为含有1mg/L的6-BA、50mg/L的Kan和100mg/L的Tim的MS固体培养基。

所述再次筛选培养基具体可为含有1mg/L的6-BA、70mg/L的Kan和100mg/L的Tim的MS固体培养基。

所述芽伸长培养基乙具体可为含有0.1mg/L的6-BA、0.05mg/L的IAA、50mg/L的Kan和100mg/L的Tim的MS固体培养基。

上述甜瓜遗传转化的方法中，所述“侵染”为所述重组农杆菌的侵染液侵染10～15min。所述“所述重组农杆菌的侵染液”的制备方法具体可为：用MS液体悬浮培养基悬浮所述重组农杆菌。所述MS液体悬浮培养基可为含有90μM～110μM(例如90μM～110μM或90μM或110μM或100μM)的乙酰丁香酮的MS液体培养基。

所述“侵染”具体可为所述重组农杆菌的侵染液具体侵染15min。

所述MS液体悬浮培养基具体可为含有100μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基。

上述甜瓜遗传转化的方法中，所述重组农杆菌的侵染液的OD₆₀₀值可为0.4～0.6(例如0.4～0.6或0.4或0.6)。

所述重组农杆菌的侵染液的OD₆₀₀值具体可为0.6。

上述任一所述农杆菌可为根癌农杆菌，具体可为EHA105。所述目的基因具体可为Pm-2F基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)。所述重组表达载体为将所述目的基因插入载体pCHF3的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将序列表中序列1所示的DNA分子插入载体pCHF3的SacⅠ和BamHⅠ识别位点之间得到的重组载体pCHF3-Pm-2F，重组载体pCHF3-Pm-2F表达序列表中序列2所示的蛋白质。将重组载体pCHF3-Pm-2F导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F。

上述甜瓜遗传转化的方法中，所述步骤(3)中所述共培养的条件可为：25℃～28℃、暗培养2～3天。所述步骤(3)中所述共培养的条件具体可为：26℃、暗培养3天。

上述甜瓜遗传转化的方法中，所述步骤(4)中所述培养的条件可为：25℃～28℃、培养28～35天。所述培养可为光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度为1500Lx～2500Lx。所述步骤(4)中所述培养的条件具体可为：26℃，培养28天。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000Lx。所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

上述甜瓜遗传转化的方法中，所述步骤(5)中所述培养的条件可为：25℃～28℃、培养14～28天。所述培养可为光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度为1500Lx～2500Lx。所述步骤(5)中所述培养的条件具体可为：26℃，培养21天。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000Lx。所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

上述甜瓜遗传转化的方法中，所述步骤(6)中所述培养的条件可为：25℃～28℃。所述培养可为光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度为1500Lx～2500Lx。所述步骤(6)中所述培养的条件具体可为：26℃。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000Lx。所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

本发明还保护含有上述任一所述芽诱导培养基、所述芽伸长培养基甲和所述生根培养基甲的用于甜瓜离体再生的试剂盒甲或含有上述任一所述共培养培养基、所述初步筛选培养基、所述再次筛选培养基、所述芽伸长培养基乙和所述生根培养基乙的用于甜瓜遗传转化的试剂盒乙。

上述任一所述甜瓜是如下d1)-d4)中的任一种：d1)K7-1；d2)K7-2；d3)绿宝；d4)Topmark。

实验证明，本发明提供的甜瓜离体再生的方法，具有不定芽诱导率高，玻璃化程度低，再生周期短等优势，将该方法应用在甜瓜遗传转化中，可获得较高的转化率。

附图说明

图1为种子萌发天数对不定芽丛诱导率的影响。

图2为载体pCHF3-Pm-2F构建示意图。

图3为预培养天数对甜瓜转化率的影响。

图4为转基因甜瓜的PCR检测结果。

图5为转基因甜瓜的PCR检测结果。

图6为转基因甜瓜的Southern杂交分析结果。

图7为转基因甜瓜的实时定量PCR结果。

图8为甜瓜离体再生的过程。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的甜瓜品种记载在如下文献中：ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168.其中K7-1为日本厚皮类型，高抗单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)2F生理小种的甜瓜品种；K7-2为感白粉病新疆哈密瓜(CucumismeloL.ssp.meloconvar.ameri(Pang.)Greb.)的甜瓜品种；PI124112、PMR45、PMR6、PI124111、Topmark、Védrantais、WMR29、NantaisOblong、Edisto47、PI414723、PMR5、IranH和MR1为甜瓜白粉病病原生理小种鉴别寄主品种；绿宝为薄皮的甜瓜品种，记载于“刘庆辰，李海燕，林建华.塑料大棚早春薄皮甜瓜栽培技术.天津农林科技,2015年02期”一文；公众可从北京市农林科学院蔬菜研究中心获得，以重复本实验。

载体pCHF3记载在如下文献中：王爱萍，景瑞莲，杨武德，董琦.小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体的构建与遗传转化.应用与环境生物学报(2008),14(6):750-752.

下述实施例中所用的培养基如下：

MS液体培养基：将NH₄NO₃1650mg、KNO₃1900mg、KH₂PO₄170mg、MgSO₄·7H₂O370mg、CaCl₂·2H₂O440mg、FeSO₄·7H₂O27.80mg、Na₂EDTA37.30mg、MnSO₄·4H₂O22.30mg、ZnSO₄·7H₂O8.60mg、H₃BO₃6.20mg、KI0.83mg、Na₂M_OO₄·2H₂O0.25mg、CuSO₄·5H₂O0.025mg、C_OCl₂·6H₂O0.025mg、肌醇100.00mg、VB₁0.1mg、VB₆0.5mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、蔗糖30g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8。

MS固体培养基：向MS液体培养基中加入琼脂，使琼脂在培养基中浓度为7g/L得到的培养基。

芽诱导培养基1：含有1.0mg/L的6-BA的MS固体培养基。芽诱导培养基2：含有1.0mg/L的6-BA和0.2mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基3：含有1.0mg/L的6-BA和0.4mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基4：含有1.0mg/L的6-BA和0.6mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基5：含有2.0mg/L的6-BA的MS固体培养基。芽诱导培养基6：含有2.0mg/L的6-BA和0.2mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基7：含有2.0mg/L的6-BA和0.4mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基8：含有2.0mg/L的6-BA和0.6mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基9：含有3.0mg/L的6-BA的MS固体培养基。芽诱导培养基10：含有3.0mg/L的6-BA和0.2mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基11：含有3.0mg/L的6-BA和0.4mg/L的IAA的MS固体培养基。芽诱导培养基12：含有3.0mg/L的6-BA和0.6mg/L的IAA的MS固体培养基。

MS液体悬浮培养基1：含有50μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基。

MS液体悬浮培养基2：含有100μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基。

MS液体悬浮培养基3：含有150μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基。

MS共培养培养基1：含有1.0mg/L的6-BA的MS固体培养基。

MS共培养培养基2：含有1.0mg/L的6-BA和50μM的乙酰丁香酮的MS固体培养基。

MS共培养培养基3：含有1.0mg/L的6-BA和100μM的乙酰丁香酮的MS固体培养基。

MS共培养培养基4：含有1.0mg/L的6-BA和150μM的乙酰丁香酮的MS固体培养基。

初步筛选培养基1：含有1.0mg/L的6-BA、30mg/L卡那霉素(kanamycin，Kan)和100mg/L的特美汀(Timentin，Tim)的MS固体培养基。

初步筛选培养基2：含有1.0mg/L的6-BA、40mg/LKan和100mg/L的Tim的MS固体培养基。

初步筛选培养基3：含有1.0mg/L的6-BA、50mg/L卡那霉素和100mg/L的特美汀的MS固体培养基。

再次筛选培养基1：含有1.0mg/L的6-BA、50mg/L卡那霉素和100mg/L的特美汀的MS固体培养基。

再次筛选培养基2：含有1.0mg/L的6-BA、60mg/L卡那霉素和100mg/L的特美汀的MS固体培养基。

再次筛选培养基3：含有1.0mg/L的6-BA、70mg/L卡那霉素和100mg/L的特美汀的MS固体培养基。

再次筛选培养基4：含有1.0mg/L的6-BA、80mg/L卡那霉素和100mg/L的特美汀的MS固体培养基。

芽伸长培养基1：含有0.1mg/L的6-BA的MS固体培养基。

芽伸长培养基2：含有0.2mg/L的6-BA的MS固体培养基。

芽伸长培养基3：含有0.3mg/L的6-BA的MS固体培养基。

芽伸长培养基4：含有0.1mg/L的6-BA和0.05mg/L的IAA的MS固体培养基。

芽伸长培养基5：含有0.2mg/L的6-BA和0.05mg/L的IAA的MS固体培养基。

芽伸长培养基6：含有0.3mg/L的6-BA和0.05mg/L的IAA的MS固体培养基。

芽伸长培养基7：含有0.1mg/L的6-BA和0.1mg/L的IAA的MS固体培养基。

芽伸长培养基8：含有0.2mg/L的6-BA和0.1mg/L的IAA的MS固体培养基。

芽伸长培养基9：含有0.3mg/L的6-BA和0.1mg/L的IAA的MS固体培养基。

芽伸长培养基10：含有0.1mg/L(实际应用中0.05～0.15mg/L均可)的6-BA、0.05mg/L(实际应用中0.03～0.07mg/L均可)的IAA、50mg/L(实际应用中40～60mg/L均可)的Kan和100mg/L(实际应用中90～110mg/L均可)的Tim的MS固体培养基。

生根培养基1：含有0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L或0.6mg/L的IBA，0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L或0.6mg/L的IAA的MS固体培养基。

生根培养基2：含有0.1mg/L(实际应用中0.05～0.15mg/L均可)的IBA和3g/L(实际应用中2～4mg/L均可)的活性炭的MS固体培养基。

生根培养基3：含有0.1mg/L(实际应用中0.05～0.15mg/L均可)的IBA、3g/L(实际应用中2～4mg/L均可)的活性炭和50mg/L(实际应用中40～60mg/L均可)的Tim的MS固体培养基。

实施例1、甜瓜离体再生的方法

甜瓜离体再生的方法如下：

1、种子萌发

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

(1)种子消毒：挑取30粒饱满的甜瓜(K7-1、K7-2、Topmark或绿宝)种子，剥去种皮，用70％(体积比)乙醇水溶液浸泡20～30s，用无菌水洗2～3次。然后将甜瓜种子用1％(质量体积比)次氯酸钠水溶液消毒10min，无菌水洗涤4～5次后，用无菌滤纸吸干多余水分。(2)将消毒后的种子置于MS固体培养基，28℃(实际应用中26℃～30℃均可)，暗培养2天，然后统计种子萌发率，种子萌发率＝发芽种子数/播种种子数×100％。

按照上述步骤，将暗培养2天分别替换为暗培养3天、暗培养4天、暗培养5天、光暗交替培养2天、光暗交替培养3天、光暗交替培养4天和光暗交替培养5天，其它步骤均不变，分别得到不同处理条件下种子的萌发率。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)中，光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

实验结果见表1，相同培养天数条件下，暗培养甜瓜种子的萌发率比光照培养种子的萌发率高；暗培养3天的种子萌发率比暗培养2天的种子萌发率明显提高，与暗培养4天的种子萌发率和暗培养5天的种子萌发率相比则差别不大。结果表明，甜瓜种子萌发的最佳培养条件是在MS固体培养基中28℃暗培养3天。

表1.不同培养条件甜瓜种子的萌发率(％)

2、不定芽丛的诱导

(1)激素浓度配比对不定芽丛诱导的影响

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

对步骤1中暗培养3天的种子，切除胚根和子叶两端1-2mm，将子叶部分切成0.5cm*0.5cm的小块，作为外植体(图8中A)。各挑取30个子叶外植体，接种于芽诱导培养基(MS固体培养基、芽诱导培养基1、芽诱导培养基2、芽诱导培养基3、芽诱导培养基4、芽诱导培养基5、芽诱导培养基6、芽诱导培养基7、芽诱导培养基8、芽诱导培养基9、芽诱导培养基10、芽诱导培养基11或芽诱导培养基12)，光暗交替培养28天(实际应用中28天～35天均可)，统计发生不定芽丛的外植体数目，计算不定芽丛诱导率和平均出芽数，不定芽丛诱导率＝产生不定芽丛的外植体数/接种外植体总数×100％，平均出芽数＝全部外植体总芽数/接种外植体数，从而筛选出不定芽丛诱导的最佳激素浓度。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)。光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

实验结果见表2，6-BA和IAA的不同配比影响甜瓜子叶不定芽丛的分化：在MS固体培养基中外植体有少量愈伤但无芽丛的分化，但当6-BA的浓度过高(如3.0mg/L)时，产生的不定芽丛数量相对较少，愈伤组织较多并呈淡黄色，疏松质软，玻璃化现象严重，可见高浓度6-BA对不定芽丛的诱导存在有一定抑制作用；IAA可以促进愈伤组织的形成，但随着IAA浓度的增加，玻璃化现象加重，并抑制不定芽丛的产生。结果表明，6-BA在芽诱导培养基中的浓度在1.0～2.0mg/L之间可获得较高的不定芽丛诱导率，其中接种于芽诱导培养基1上的不定芽诱导率达89.3％，平均出芽数为8.2个，形成的不定芽丛呈绿色，致密紧凑、生长旺盛，分化出的不定芽丛密集(图8中B)，下述实验用芽诱导培养基1进行不定芽丛的诱导。

表2.激素浓度配比对不定芽丛诱导的影响

(2)不同日龄子叶外植体对不定芽丛诱导的影响

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

对步骤1中暗培养2天的种子、暗培养3天的种子、暗培养4天的种子或暗培养5天的种子，切除胚根和子叶两端1-2mm，将子叶部分切成0.5cm*0.5cm的小块，作为外植体。各挑取30个子叶外植体，分别接种于芽诱导培养基1进行不定芽丛诱导，光照交替培养30天后统计发生不定芽丛的外植体数目，计算不定芽丛诱导率，不定芽丛诱导率＝产生不定芽丛的外植体数/接种外植体总数×100％。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)。光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

实验结果见图1，暗培养3-5天的子叶外植体的不定芽丛诱导率均维持在较高的水平，其中暗培养3天时子叶外植体不定芽丛诱导率最高，不同甜瓜品种均在70％以上，随着暗培养时间的延长，子叶外植体不定芽丛诱导率有所下降。结合种子萌发率实验，采用暗培养3天的子叶作为外植体进行不定芽丛的诱导。

(3)不同甜瓜品种对不定芽丛诱导的影响

不同甜瓜品种的不定芽丛诱导率也存在差异，这可能与材料本身的内源激素种类和水平有关，不同品种的基因型对外源激素诱导作用的敏感性存在差异。

对步骤1中暗培养3天的种子，切除胚根和子叶两端1-2mm，将子叶部分切成0.5cm*0.5cm的小块，作为外植体。各挑取30个子叶外植体，分别接种于芽诱导培养基1进行不定芽丛诱导，光照交替培养30天后统计发生不定芽丛的外植体数目，计算不定芽丛诱导率和平均出芽数，不定芽丛诱导率＝产生不定芽丛的外植体数/接种外植体总数×100％，平均出芽数＝全部外植体总芽数/接种外植体数。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)。光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

表3.甜瓜品种对不定芽丛诱导率的影响

甜瓜品种	不定芽丛诱导率(％)	平均出芽数(个)
			K7-1	72	5.8
K7-2	83	7.2

Topmark	76	6.0
			绿宝	78	8.3

实验结果见表3，不定芽丛诱导率最高的是K7-2，诱导率为83％，平均出芽数为7.2个；不定芽丛诱导率最低的是K7-1，诱导率为72％，平均出芽数为5.8个；二者不定芽丛诱导率相差11％，可见甜瓜品种对不定芽丛诱导率有一定影响。下述实验以K7-2为材料进行实验。

3、芽伸长培养基对不定芽的影响

实验重复三次，每次重复30个外植体，每次重复的步骤如下：

当步骤2(3)在芽诱导培养基1上的不定芽丛生长至0.5～lcm时，切下分化的不定芽丛转入芽伸长培养基(MS固体培养基、芽伸长培养基1、芽伸长培养基2、芽伸长培养基3、芽伸长培养基4、芽伸长培养基5、芽伸长培养基6、芽伸长培养基7、芽伸长培养基8或芽伸长培养基9)，光照交替培养21天(实际应用中14天～28天均可)后分化出明显的茎叶的形态，即获得不定芽，根据茎叶形态从而筛选出芽伸长培养基的最佳激素浓度。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)。光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

实验结果见表4，在MS固体培养基中不定芽叶色深绿、生长缓慢、节间短，但当6-BA的浓度过高(如0.2mg/L)时，不定芽虽然生长很快，但容易形成玻璃化，因此芽伸长培养基中6-BA的浓度为0.1mg/L就能满足不定芽的伸长生长；添加微量的IAA有助于茎的正常生长，但当IAA浓度较高(如0.1mg/L)时，不定芽生长较快，节间变长且茎较细，在一定程度上还会加重不定芽的玻璃化现象。结果表明，6-BA在芽伸长培养基中的浓度在0.1～0.2mg/L之间可适于不定芽的生长(图8中C和图8中D)，IAA在芽伸长培养基中的浓度在0.03～0.07mg/L之间可适于不定芽的生长，形成的不定芽的叶色深绿、节间适中、生长健壮。

表4.激素浓度配比对不定芽伸长的影响

芽伸长培养基	不定芽形态
		MS固体培养基	生长缓慢，叶色深绿，茎粗，节间短
芽伸长培养基1	叶色深绿，茎较粗，节间适中
		芽伸长培养基2	轻度玻璃化，茎较粗，节间适中
芽伸长培养基3	玻璃化严重，茎较粗，节间适中
		芽伸长培养基4	叶色深绿，茎适中，节间适中
芽伸长培养基5	轻度玻璃化，茎适中，节间适中
		芽伸长培养基6	玻璃化严重，茎适中，节间适中
芽伸长培养基7	轻度玻璃化，茎细，节间较长
		芽伸长培养基8	轻度玻璃化，茎细，节间较长
芽伸长培养基9	玻璃化严重，茎细，节间较长

4、生根培养基对再生培养的影响

当步骤3在芽伸长培养基4上培养2～4周伸长至2～3cm时，切下不定芽，转入生根培养基(生根培养基1或生根培养基2)进行光照交替培养，获得再生苗。培养15天后根据根部发育形态，筛选出最佳生根培养基。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)。光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

结果表明，添加低浓度IBA(0.1mg/L)即可较好的诱导根形态正常、根毛浓密，根系粗长；在培养基中添加低浓度的IAA(0.1mg/L)时，生根速度快，但根量较少，根系较细，不利于再生苗移栽成活。在不定芽生根的过程中也存在玻璃化现象，在培养基中添加适量(3g/L)的活性炭能使培养中玻璃化苗比例下降，根系生长健壮(图8中E和图8中F)。

5、炼苗移栽

待步骤4的再生苗在生根培养基2上根系发达后，去掉封口膜炼苗3～5天(图8中G)，将再生苗从三角瓶中取出，洗去根上附着的生根培养基2，移栽入预先高压灭菌的蛭石和草炭土1﹕1(体积比)基质中于温室中培养(图8中H)，前期注意保湿遮阴，3～5天后逐渐增加透光量，一周后可常规管理，幼苗移栽成活率达90％以上。

实施例2、根据实施例1的甜瓜离体再生的方法在建立甜瓜遗传转化方法中的应用

一、构建重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F

1、以人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子为模板，用人工合成的引物PchAF：5-TCGAGCTCGATGGCAGAATCAATTCTG-3’(划线部分为SacI酶切位点)和引物PchAR：5’-CAGGATCCGTTAGTTCATGGTGGGAAGC-3’(划线部分为BamHI酶切位点)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并回收。

25μLPCR反应体系包括50ng模板DNA、2.5μL10×Buffer(含15mMMgCl₂)、1.0μLdNTPs(浓度为2.5mM)、1UTaqDNA聚合酶、1μL引物PchAF(10μM)、1μL引物PchAR(10μM)和ddH₂O。其中TaqDNA聚合酶、10×Buffer(含15mMMgCl₂)和dNTPs均为北京全式金生物技术有限公司的产品。

PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，64℃30s，72℃2min，共循环30次；72℃延伸10min；4℃保持。

2、将步骤1回收的PCR扩增产物与载体pEASY-T1(北京全式金生物技术有限公司产品)连接，得到重组质粒，命名为pEASY-Pm-2F。

3、将重组质粒pEASY-Pm-2F用SacⅠ和BamHⅠ双酶切、回收，得到约3300bp的DNA片段。

4、将载体pCHF3用SacⅠ和BamHⅠ双酶切、回收，得到约10kb左右的载体骨架。

5、将步骤3的DNA片段和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒，命名为pCHF3-Pm-2F(pCHF3-Pm-2F的载体示意图见图2)，将pCHF3-Pm-2F转入大肠杆菌DH5ɑ中，得到含有重组质粒pCHF3-Pm-2F的重组大肠杆菌，命名为DH5ɑ/pCHF3-Pm-2F。所述重组质粒DH5ɑ/pCHF3-Pm-2F含有序列表中序列1所示的DNA分子，编码序列表中序列2所示的蛋白质。

6、将重组质粒DH5ɑ/pCHF3-Pm-2F用电击法转化根癌农杆菌EHA105，挑取重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pCHF3-Pm-2F。

按照上述步骤5和6的方法，将pCHF3-Pm-2F替换为载体pCHF3，其它步骤均不变，得到含有质粒pCHF3的重组农杆菌EHA105/pCHF3，作为空白对照。

二、建立甜瓜遗传转化的方法

根据PCR阳性率和转化率建立甜瓜遗传转化的方法的最佳条件，PCR阳性率(％)＝PCR阳性植株数/获得抗性植株总株数×100％，转化率(％)＝PCR阳性植株株数/接种的外植体总数×100％。

1、获得外植体

用K7-2种子按照实施例1步骤1中的方法进行种子消毒，然后置于MS固体培养基，28℃(实际应用中26℃～30℃均可)、暗培养3天，切除胚根和子叶两端1-2mm，将子叶部分切成0.5cm*0.5cm的小块，该甜瓜子叶块即为外植体。

2、农杆菌侵染外植体

(1)农杆菌侵染液的制备

将步骤一构建的重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F接种到含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEP液体培养基，28℃，180rpm振荡培养至对数生长期，5000rpm、离心10min，收集菌体后用MS液体培养基重悬，得到农杆菌侵染液。以MS液体培养基的OD₆₀₀为参照，调整农杆菌侵染液的OD₆₀₀值为0.4、0.6或0.8。

按照上述方法，将MS液体培养基分别替换为MS液体悬浮培养基1、MS液体悬浮培养基2和MS液体悬浮培养基3，其它步骤均不变，得到相应的农杆菌侵染液。

(2)外植体的预培养

将步骤1获得外植体转移到MS固体培养基进行预培养(预培养天数为1天、2天、3天或4天)，得到待转外植体。

预培养条件：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)，暗培养。

(3)农杆菌侵染外植体

用步骤(1)制备的农杆菌侵染液对步骤(2)的待转外植体和步骤1获得外植体(即不经过预培养的外植体)进行侵染(侵染时间为10min、15min或20min)，侵染后的外植体先在无菌滤纸上吸去多余菌液，再置于MS共培养培养基(MS共培养培养基1、MS共培养培养基2、MS共培养培养基3或MS共培养培养基4)上进行共培养(共培养天数为2天、3天或4天)，研究农杆菌侵染液浓度、侵染时间和共培养时间对转化率的影响，根据转化率和PCR阳性率确定最佳侵染条件。

共培养条件：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)，暗培养。

实验重复三次，每次重复侵染外植体20个。

3、诱导与筛选

完成步骤2共培养后的外植体转移至初步筛选培养基3中光照交替培养7～10天，然后在初步筛选培养基3中继代一次，继续光照交替培养7～10天。将完成初步筛选的外植体转移至再次筛选培养基3中光照交替培养7～10天，然后在再次筛选培养基3中继代一次，继续光照交替培养7～10天，即可分化出抗性芽甲。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)。光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

4、芽的伸长

将步骤3获得的抗性芽甲从再次筛选培养基转移至芽伸长培养基10，光照交替培养培养21天(实际应用中14天～28天均可)，诱导芽伸长生长，获得抗性芽乙。其中光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)。光照培养时的光照强度为2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx均可)，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

5、生根

将步骤4获得的抗性芽乙切下，置于生根培养基3进行生根培养，获得再生苗，即转Pm-2F基因的抗性植株。

将上述步骤2中的重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F替换为重组农杆菌EHA105/pCHF3，重复步骤1-5，其它步骤均不变，获得转空载体的植株。

6、抗性植株的检测

(1)用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别提取转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA和转空载体的植株的叶片基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以引物对1进行PCR扩增；用K7-2未转基因的叶片基因组DNA代替转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阴性对照。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保持。

用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别提取转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以引物对2分别进行PCR扩增；用K7-2未转基因的叶片基因组DNA和转空载体的植株的叶片基因组DNA分别代替转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阴性对照。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保持。

引物对1：NPTⅡF：5’-ATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGG-3’和NPTⅡR：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT-3’。

引物对2：35S-pro：5’-GAAGTTCATTTCATTTGGAGAGG-3’和pCHF3R：5’-TTAGTTCATGGTGGGAAGC-3’。

实验结果见图4(图4为用引物对1PCR扩增的实验结果，其中M为DNAMarker，泳道1-9为以转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA为模板的实验结果，10为以转空载体植株的叶片基因组DNA为模板的实验结果，CK为以K7-2未转基因的叶片基因组DNA为模板的实验结果)和图5(图5为用引物对2PCR扩增的实验结果，其中M为DNAMarker，泳道1-9为以转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA为模板的实验结果，10为以转空载体植株的叶片基因组DNA为模板的实验结果，CK为以K7-2未转基因的叶片基因组DNA为模板的实验结果)，如果转Pm-2F基因的抗性植株的基因组DNA用引物对1扩增出约790bp的条带，同时用引物对2扩增出约3500bp的条带，则该抗性植株即为甜瓜转基因阳性植株；而转空载体的植株用引物对1可以扩增获得790bp条带,同时用引物对2不能扩增出3500bp条带；K7-2未转基因的植株用引物对1不能扩增获得790bp条带，用引物对2不能扩增出3500bp条带。

(2)随机选择转空载体的ML8植株(简称ML8)和步骤(1)鉴定为阳性的7株株系，分别命名为甜瓜转基因株系ML1(简称ML1)、甜瓜转基因株系ML2(简称ML2)、甜瓜转基因株系ML3(简称ML3)、甜瓜转基因株系ML4(简称ML4)、甜瓜转基因株系ML5(简称ML5)、甜瓜转基因株系ML6(简称ML6)和甜瓜转基因株系ML7(简称ML7)。用SDS法提取各甜瓜转基因株系植株的幼嫩叶片基因组DNA，取20μg基因组DNA，分别用序列表的序列3所示的探针序列进行Southern杂交。用K7-2未转基因植株的幼嫩叶片基因组DNA代替甜瓜转基因株系植株的幼嫩叶片基因组DNA，作为阴性对照。

实验结果见图6(泳道1-9依次为以ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和ML8植株的幼嫩叶片基因组DNA为模板的实验结果，CK为以K7-2未转基因的叶片基因组DNA为模板的实验结果)。结果表明，ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和ML8均显示有不同拷贝的基因插入，而K7-2未出现杂交信号，说明Pm-2F基因已成功整合到ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的基因组中,载体pCHF3已成功整合到ML8的基因组中。

(3)分别用Trizol法提取K7-2未转基因植株、转空载体的植株和步骤2中各甜瓜转基因株系植株的总RNA并反转录为cDNA，并以此cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测Pm-2F基因的相对表达量(以甜瓜actin基因为内参基因)。

鉴定Pm-2F基因的引物为5’-GTTCTTTCCCACTCCAAGAG-3’和5’-CCTTCACAGCATAACTATTGTAC-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第53位至第193位所示。

鉴定actin基因的引物为actin-F：5’-ATTCTTGCATCTCTAAGTACCTTCC-3’和actin-R：5’-CCAACTAAAGGGAAATAACTCACC-3’。

其中荧光定量PCR上样体系按照OneStepPrimeScript^TMRT-PCRKitII(PerfectRealTime)(TaKaRa公司产品)的说明书上样，反应体系为共20μl，SYBRPremixExTaqTMⅡ10μl，正反向引物(10μM)0.8μl，模板cDNA1.6μl，ddH2O6.8μl。PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。

将K7-2未转基因植株中Pm-2F基因的相对表达量作为1，ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和ML8中Pm-2F基因的各个相对表达量见图7(其中CK为以K7-2未转基因的植株)。ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7中Pm-2F基因的表达量分别为K7-2未转基因植株中Pm-2F基因的6.2倍、1.2倍、3.3倍、1.8倍、2.8倍、5.4倍和1.7。结果表明Pm-2F基因已成功整合到ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的基因组中并在转录水平上表达。转空载体的植株ML8中Pm-2F基因的相对表达量和K7-2未转基因的植株无显著差异。

(4)抗性植株的抗病性检测

评价甜瓜苗期病情的抗病性，采用如下病情分级标准进行：0级：整个植株没有任何病斑；1级：子叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％以下；2级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％至50％(不含20％，含50％)、茎病斑面积占茎总面积的20％以下；3级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的50％至70％(不含50％，含70％)、茎病斑面积占茎总面积的20％至50％(不含20％，含50％)；4级：子叶病斑、茎病斑和真叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的70％以上(不含70％)、茎病斑面积占茎总面积的50％以上(不不含50％)和真叶病斑面积占真叶总面积的20％以下；5级：整个植株均布满白粉或植株因感病而死亡。

A、白粉病病原菌的分离纯化及接种菌源制备

从北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青农场收集白粉病菌，采用孢子悬浮液喷雾法(ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168)接种于白粉病生理小种鉴定的鉴别寄主(PI124112、PMR45、PMR6、PI124111、Topmark、Védrantais、WMR29、NantaisOblong、Edisto47、PI414723、PMR5、IranH或MR1)上，根据鉴别寄主的抗感反应鉴定收集到的白粉病菌的生理小种为P.xanthii2F。

利用单孢培养技术对上述白粉病菌P.xanthii2F分离纯化，纯化后的白粉病菌P.xanthii2F接种于西葫芦幼苗进行扩繁，然后用灭菌的毛笔将扩繁白粉病菌西葫芦病叶上的孢子刷到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，用干净的纱布过滤去除杂质，调整孢子悬浮液浓度至2.0×10⁵个/mL。

B、转基因苗期抗病接种鉴定

采用孢子悬浮液喷雾法将步骤A中制备孢子悬浮液接种于甜瓜(未转基因K7-2植株、ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和转空载体的植株ML8)，接种12～15天后，调查甜瓜植株的抗感反应。

结果表明，K7-2未转基因的植株和转空载体的植株的抗病性无显著差异。与未转基因K7-2植株的抗病性相比，ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的抗病性明显增强：未转基因K7-2植株接种白粉病菌P.xanthii2F10天后，子叶开始布满白粉病菌P.xanthii2F，15天后子叶和茎上均布满白粉病菌P.xanthii2F，15天后真叶开始发病，病情级别为5级，即严重感白粉病；而ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的子叶和茎上均有少量白粉，真叶无白粉病菌出现，抗病性病情级别均在1-3级之间。

外植体的预培养天数对转化率的影响的实验结果见图3，结果表明，外植体接种MS固体培养基后迅速膨大、向上卷曲，边缘脱离培养基，切口边缘无法接触培养基，获得的不定芽丛玻璃化程度较高，以上现象均不利于转化的进行。不经过预培养的外植体转化率高达9.1％，远高于待转外植体的转化率。

农杆菌侵染外植体的最佳侵染条件结果见表5，结果表明，当农杆菌侵染液浓度适当(如OD₆₀₀值为0.6)才能获得最高的转化率，农杆菌侵染液浓度过高或过低，侵染能力反而下降，导致转化率降低，农杆菌侵染液的最佳浓度为0.4～0.6，优选为0.6；随着农杆菌侵染液侵染时间的增加，外植体分化出抗性苗株数有所上升，但农杆菌侵染液侵染时间达到20min时，培养过程中外植体褐化加重、死亡率升高，脱菌不彻底，易造成农杆菌污染，所以选择最佳侵染时间为10～15min，优选15min；随着共培养时间的增加，外植体分化出抗性苗株数有所上升，但共培养时间达到4天时，农杆菌生长过度而导致脱菌困难，导致外植体发生污染、褐化、死亡，所以最佳共培养时间为2天～3天，优选3天。

表5.农杆菌菌液浓度、侵染时间和共培养天数对甜瓜转化率的影响

乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)对转化率的影响的实验结果如下：农杆菌对酚类化合物乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)具有趋化性，在培养基中适量添加乙酰丁香酮能够诱导激活农杆菌的Vir区表达，从而促进转化效率的提高。在侵染过程和共培养过程中，乙酰丁香酮对农杆菌介导转化率的影响结果表明，随着乙酰丁香酮的在农杆菌侵染液和共培养基中浓度的增加，转化率有所上升，当乙酰丁香酮在农杆菌侵染液和共培养基中的浓度为100μM时，转化率高达13.3％，比未添加乙酰丁香酮的空白对照提高6.6％，但当乙酰丁香酮的浓度达到150μM时，转化率反而会下降，所以在农杆菌侵染液和共培养基中最佳乙酰丁香酮的浓度为50μM～100μM，优选100μM。

初步筛选培养基和再次筛选培养基中激素浓度对转化率有一定的影响，具体实验步骤如下：①将步骤一构建的重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F接种到含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEP液体培养基，28℃，180rpm振荡培养至对数生长期，5000rpm、离心10min，收集菌体后用MS液体悬浮培养基2重悬，得到农杆菌侵染液。以MS液体培养基的OD₆₀₀为参照，调整农杆菌侵染液的OD₆₀₀值为0.6。②将步骤①制备的农杆菌侵染液对步骤1获得外植体侵染15min，侵染后的外植体先在无菌滤纸上吸去多余菌液，再置于MS共培养培养基3上共培养3天，共培养条件：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)，暗培养。③完成步骤②共培养后的外植体转移至初步筛选培养基(初步筛选培养基1、初步筛选培养基2、初步筛选培养基3或初步筛选培养基4)中光照培养7～10天，然后在初步筛选培养基中继代一次，继续光照培养7～10天。将完成初步筛选的外植体转移至再次筛选培养基(再次筛选培养基1、再次筛选培养基2、再次筛选培养基3或再次筛选培养基4))中光照培养7～10天，然后在再次筛选培养基中继代一次，继续光照培养7～10天，即可分化出抗性芽甲。光照培养条件：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)，光照强度2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx)，光照周期16h/8h。④按照上述步骤4-6的方法，进行芽的伸长、生根和抗性植株的检测。结果表明，外植体对Kan比较敏感，不同浓度的Kan对于外植体均有一定的毒害作用，浓度越高毒害作用越强烈，综合比较初步筛选培养基和再次筛选培养基中不同Kan浓度的处理选择压下所获得的抗性植株数和PCR阳性率，选择初步筛选培养基中Kan浓度为40～50mg/L，优选为50mg/L，选择再次筛选培养基中Kan浓度为60～70mg/L，优选为70mg/L。

表6.不同抗生素对甜瓜转化率的影响

Tim对转化率的影响的实验结果如下：Tim是一种新型的有效抑制农杆菌的抗生素，抑制农杆菌的同时，对于植物材料的影响很小，只在高浓度时外植体的生长速度略有减慢。将上述步骤1-5中的初步筛选培养基3、再次筛选培养基3和芽伸长培养基4中Tim的浓度100mg/L分别替换为0mg/L、50mg/L、80mg/L和150mg/L，其它步骤均不变，得到再生苗。综合比较抗性植株数和PCR阳性率，选择初步筛选培养基3、再次筛选培养基3和芽伸长培养基4中Tim的浓度为90～110mg/L，优选为100mg/L。

Claims

1.一种甜瓜离体再生的方法，包括下述步骤：

所述芽诱导培养基为含有1.0mg/L～2.0mg/L的6-BA的MS固体培养基；

所述芽伸长培养基甲为含有0.1mg/L～0.2mg/L的6-BA和0.03mg/L～0.07mg/L的IAA的MS固体培养基；

所述生根培养基甲为含有0.05mg/L～0.15mg/L的IBA和2g/L～4g/L的活性炭MS固体培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤①中，所述外植体的制备方法为：将甜瓜种子播种于MS固体培养基，培养后获取甜瓜种子的子叶部分。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述外植体的制备方法中，所述培养的条件为26℃～30℃、暗培养3～5天。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤①中，所述培养的条件为：25℃～28℃，培养28天～35天；

所述步骤②中，所述培养的条件为：25℃～28℃，培养14～28天；

所述步骤③中，所述培养的条件为：25℃～28℃。

5.权利要求1-4任一所述方法在甜瓜遗传转化中的应用。

6.一种甜瓜遗传转化方法，包括如下步骤：

所述共培养培养基为含有1.0mg/L～2.0mg/L的6-BA和90μM～110μM的乙酰丁香酮的MS固体培养基；

(4)完成步骤(3)后，取所述甜瓜子叶外植体，依次在初步筛选培养基和再次筛选培养基上进行培养,获得抗性芽甲；

所述初步筛选培养基为含有0.5～1.5mg/L的6-BA、40～60mg/L的Kan和90～110mg/L的Tim的MS固体培养基；

所述再次筛选培养基为含有0.5～1.5mg/L的6-BA、60～80mg/L的Kan和90～110mg/L的Tim的MS固体培养基；

所述芽伸长培养基乙为含有0.1mg/L～0.2mg/L的6-BA、0.03mg/L～0.07mg/L的IAA、40～60mg/L的Kan和90～110mg/L的Tim的MS固体培养基。

(6)完成步骤(5)后，取抗性芽乙置于生根培养基乙培养，获得甜瓜转化苗；

所述生根培养基乙为含有0.05mg/L～0.15mg/L的IBA、2g/L～4g/L的活性炭和40mg/L～60mg/L的Tim的MS固体培养基。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“侵染”的方法如下：将所述甜瓜子叶置于所述重组农杆菌的菌悬液中10～15min；

所述重组农杆菌的菌悬液的制备方法为：将所述重组农杆菌悬浮于含有90μM～110μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述重组农杆菌的侵染液的OD₆₀₀值为0.4～0.6。

9.如权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤(3)中所述共培养的条件为25℃～28℃、暗培养2～3天；

所述步骤(4)中所述培养的条件为25℃～28℃，光照培养28～35天；

所述步骤(5)中所述培养的条件为25℃～28℃，光照培养14～28天；

所述步骤(6)中所述培养的条件为25℃～28℃。

10.用于甜瓜离体再生的试剂盒甲或用于甜瓜遗传转化的试剂盒乙：

所述试剂盒甲含有权利要求1中所述芽诱导培养基、所述芽伸长培养基甲和/或所述生根培养基甲；

所述试剂盒乙含有权利要求5中所述共培养培养基、所述初步筛选培养基、所述再次筛选培养基、所述芽伸长培养基乙和/或所述生根培养基乙。