CN105198977A - 植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因与应用。本发明所提供的植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物白粉病抗性相关的蛋白质。实验证明，本发明提供的植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因能提高植物的白粉病抗性。

Description

植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因与应用。
背景技术
甜瓜(CucumismeloL.)是一种在国内外普遍栽培的水果型蔬菜作物，属于葫芦科(Cucurbitaceae)，黄瓜属(Cucumis)，甜瓜种。甜瓜是我国高端农业的优势作物，对农民增收与农业结构调整有着重要意义。
白粉病是一种严重危害甜瓜生产的世界性病害，从苗期至收获期均可发生。白粉病主要危害甜瓜的叶片，也侵染叶柄和茎蔓，可导致植株光合能力下降，引起早衰甚至死亡，严重影响甜瓜的产量和品质。近年来，随着生产的规模化和商品化程度的提高，白粉病迅速蔓延，已成为国内外甜瓜等瓜类作物绿色生产的主要障碍。
引起甜瓜白粉病的病原菌主要有单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)和二孢白粉菌(Golovinomycescichoracearum)，其中以单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)占主导。甜瓜白粉病菌生理小种多，分化快，仅单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)常见生理小种就多达7个，包括0、1、2US、2F、3、4和5，其中单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)2F生理小种是国内大部分地区的优势生理小种，因此开展对单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)2F生理小种的抗病基因研究将是解决甜瓜白粉病的首要突破口。
植物抗病基因的克隆是深入研究植物与病原物的分子互作机理，有效防治植物重要病害的基础和前提。植物抗病基因的克隆主要基于图位克隆(map-basedcloning)和转座子标签(transposontagging)两种策略，通过图位克隆得到目标基因并找到引起表型变化的关键位点是目前功能基因研究的热点。图位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，其基本原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库(包括YAC、BAC、TAC、PAC或Cosmid文库)，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步移(chromosomewalking)形式获得含有目的基因的克隆片段，其核心任务是染色体步移，如果能找到与目标基因很近的标记，以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小，就可以直接筛选到含有目标基因的克隆，最终得到目的基因。目前，运用图位克隆技术已分离到了大量的植物抗病基因，但迄今为止，未见甜瓜白粉病抗病基因被成功分离克隆的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物白粉病抗性。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种植物白粉病抗性相关的蛋白。
本发明所提供的植物白粉病抗性相关的蛋白，名称为Pm-2F，来源于甜瓜(CucumismeloL.)，是如下a1)或a2)或a3)的蛋白质：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物白粉病抗性相关的蛋白质。
其中，序列表序列2由1084个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a3)中的Pm-2F，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的Pm-2F可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的Pm-2F的编码基因可通过将序列表序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述Pm-2F的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述编码Pm-2F的核酸分子可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表序列1所示的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Pm-2F的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Pm-2F的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表序列1由3255个核苷酸组成，序列表序列1的核苷酸编码序列表序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码Pm-2F的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的编码Pm-2F的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码Pm-2F且与植物白粉病抗性相关，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有所述编码所述Pm-2F的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述表达盒可为表达盒A；所述表达盒A包括启动子、编码所述Pm-2F的核酸分子和终止子。所述启动子可为CaMV35S启动子；所述终止子可为NOS终止子。
所述重组载体可为将所述Pm-2F的编码基因(即序列表序列1所示的DNA分子)通过含有所述Pm-2F的编码基因的表达盒插入出发质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为将所述Pm-2F的编码基因(即序列表序列1所示的DNA分子)插入载体pCHF3的多克隆位点得到的重组质粒，即用序列表序列1所示的DNA分子插入载体pCHF3的SacⅠ和BamHⅠ识别位点之间得到的重组载体pCHF3-Pm-2F。
所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。
所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)具体可为根癌农杆菌EHA105。
所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述Pm-2F的编码基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
所述Pm-2F，或，所述编码所述Pm-2F的核酸分子，或，含有所述编码所述Pm-2F的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物白粉病抗性中的应用也属于本发明的保护范围。
所述Pm-2F，或，所述编码所述Pm-2F的核酸分子，或，含有所述编码所述Pm-2F的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育植物白粉病抗性的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的一种培育转基因植物的方法，包括将编码所述Pm-2F的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比白粉病抗性增强。
上述培育转基因植物的方法中，所述编码Pm-2F的核酸分子可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表序列1所示的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Pm-2F的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Pm-2F的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表序列1由3255个核苷酸组成，序列表序列1的核苷酸编码序列表序列2所示的氨基酸序列。
上述任一所述白粉病可由白粉病菌P.xanthii2F感染植物引起。
上述任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物是如下d1)-d5)中的任一种：d1)葫芦科(Cucurbitaceae)植物；d2)黄瓜属(Cucumis)植物；d3)甜瓜种植物；d4)甜瓜；d5)甜瓜材料K7-1。
所述甜瓜材料K7-1)为日本厚皮类型，高抗单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)2F生理小种的甜瓜品种。
实验证明，利用本发明提供的植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因能增加植物白粉病抗性：与未转基因的K7-2植株的白粉病抗性相比，甜瓜转基因株系ML1的植株、甜瓜转基因株系ML2的植株、甜瓜转基因株系ML3的植株、甜瓜转基因株系ML4的植株、甜瓜转基因株系ML5的植株、甜瓜转基因株系ML6的植株和甜瓜转基因株系ML7的植株的白粉病抗性明显增强：未转基因的K7-2植株和转空载体ML8植株接种白粉病菌P.xanthii2F10天后，子叶开始布满白粉病菌P.xanthii2F，15天后子叶和茎上均布满白粉病菌P.xanthii2F，15天后真叶开始发病，病情级别为5级，即严重感白粉病；而甜瓜转基因株系ML1的植株、甜瓜转基因株系ML2的植株、甜瓜转基因株系ML3的植株、甜瓜转基因株系ML4的植株、甜瓜转基因株系ML5的植株、甜瓜转基因株系ML6和甜瓜转基因株系ML7的植株的子叶和茎上均有少量白粉，真叶无白粉病菌出现，抗病性病情级别均在1-3级之间。结果表明，植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因能增加植物白粉病抗性。
附图说明
图1为BAC克隆的双末端测序峰图。
图2为载体pCHF3-Pm-2F构建示意图。
图3为甜瓜离体再生的过程。
图4为转基因甜瓜的PCR检测结果。
图5为转基因甜瓜的PCR检测结果。
图6为转基因甜瓜的Southern杂交分析结果。
图7为转基因甜瓜的实时定量PCR结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所用的甜瓜品种记载在如下文献中：ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168.其中K7-1(即甜瓜材料K7-1)为日本厚皮类型，高抗单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)2F生理小种的甜瓜品种；K7-2为感白粉病新疆哈密瓜(CucumismeloL.ssp.meloconvar.ameri(Pang.)Greb.)的甜瓜品种；PI124112、PMR45、PMR6、PI124111、Topmark、Védrantais、WMR29、NantaisOblong、Edisto47、PI414723、PMR5、IranH和MR1为甜瓜白粉病病原生理小种鉴别寄主品种。公众可从北京市农林科学院蔬菜研究中心获得，以重复本实验。
载体pCHF3记载在如下文献中：王爱萍，景瑞莲，杨武德，董琦.小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体的构建与遗传转化.应用与环境生物学报(2008),14(6):750-752.
下述实施例中所用的培养基如下：
MS液体培养基：将NH4NO31650mg、KNO31900mg、KH2PO4170mg、MgSO4·7H2O370mg、CaCl2·2H2O440mg、FeSO4·7H2O27.80mg、Na2EDTA37.30mg、MnSO4·4H2O22.30mg、ZnSO4·7H2O8.60mg、H3BO36.20mg、KI0.83mg、Na2MOO4·2H2O0.25mg、CuSO4·5H2O0.025mg、、COCl2·6H2O0.025mg、肌醇100.00mg、VB10.1mg、VB60.5mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、蔗糖30g溶于1L蒸馏水，pH5.8。
MS固体培养基：向MS液体培养基中加入琼脂，使琼脂在培养基中浓度为7g/L得到的培养基。
MS液体悬浮培养基：含有100μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基。
MS共培养培养基：含有1.0mg/L的6-BA和100μM的乙酰丁香酮的MS固体培养基。
初步筛选培养基：含有1.0mg/L的6-BA、50mg/L卡那霉素和100mg/L的特美汀的MS固体培养基。
再次筛选培养基：含有1.0mg/L的6-BA、70mg/L卡那霉素和100mg/L的特美汀的MS固体培养基。
芽伸长培养基：含有0.1mg/L(实际应用中0.05～0.15mg/L均可)的6-BA、0.05mg/L(实际应用中0.03～0.07mg/L均可)的IAA、50mg/L(实际应用中40～60mg/L均可)的Kan和100mg/L(实际应用中90～110mg/L均可)的Tim的MS固体培养基。
生根培养基：含有0.1mg/L(实际应用中0.05～0.15mg/L均可)的IBA、3g/L(实际应用中2～4mg/L均可)的活性炭和50mg/L(实际应用中40～60mg/L均可)的Tim的MS固体培养基。
实施例1、Pm-2F基因的获得
获得Pm-2F基因的步骤如下：
1、甜瓜材料K7-1基因组BAC文库的构建
(1)将甜瓜材料K7-1的种子表面消毒后，28℃催芽，然后播种于灭菌土壤中，25-28℃光照培养。
(2)完成步骤(1)后，待长出3片真叶时，开始暗培养，三天后取幼嫩的茎尖，提取大片段基因组DNA。
(3)完成步骤(2)后，构建BAC文库。BAC文库构建过程中，载体为CopyControlTMpCC1BACTMVector(美国Epicentre公司产品)，感受态细胞为用DH10B菌株(美国Invitrogen公司产品)制备的感受态细胞。
最终，构建了69,120个克隆，每个克隆平均插入片段大小为85kb，获得覆盖甜瓜基因组13倍左右的甜瓜材料K7-1基因组BAC文库。
2、含目的基因的阳性BAC克隆的PCR筛选及鉴定
(1)构建板池，然后利用标记引物对板池进行PCR筛选，结果编号为A49、A59和A81的板池为阳性板池，即这三个阳性板池均包含目的基因所在的阳性单克隆。
(2)完成步骤(1)后，将编号为A49、A59和A81的阳性板池所对应的384孔板取出，用复制针将384板中的临近4个克隆的菌液混合，然后用步骤(1)中的标记引物进行四合一阳性混合菌液的筛选，筛选得到两个阳性单克隆，分别命名为阳性单克隆A49-E16和阳性单克隆A81-G15。
(3)完成步骤(2)后，在培养基中接种阳性单克隆(阳性单克隆A49-E16或阳性单克隆A81-G15)，培养12h，得到阳性克隆菌液。
(4)完成步骤(3)后，用标记引物对步骤(3)得到的阳性单克隆菌液进行PCR，均得到含有目标条带的PCR扩增产物。回收PCR扩增产物，进行测序。
(5)以甜瓜材料K7-1的基因组DNA为模板，用标记引物进行PCR，得到PCR扩增产物2。回收PCR扩增产物，进行测序。
测序结果显示，步骤(4)获得的PCR扩增产物和步骤(5)获得的PCR扩增产物的测序结果完全一致。结果表明，阳性单克隆为目标阳性克隆。
3、阳性克隆测序与序列分析预测
(1)阳性BAC克隆的测序
将PCR筛选得到的阳性克隆A49-E16菌液进行划线活化，挑取单克隆，用标记引物再次对该单克隆进行PCR，均得到含有目标条带的PCR扩增产物。然后将单克隆在北京六合华大基因科技股份有限公司进行BAC克隆测序。
(2)Shotgun亚克隆文库的构建
用碱裂解法提取阳性BAC克隆A49-E16的质粒DNA，然后进行脉冲场电泳。结果表明，阳性克隆A49-E16的插入片段大小约80kb。
BAC双末端测序结果表明(图1)，末端序列为单一规则峰，无双峰或套峰出现；并且将BAC双末端测序结果进行Blastn比对，均比对上高度相似的甜瓜序列。在确定阳性克隆A49-E16为单一克隆无细菌污染后，进行Shotgun亚克隆文库构建，构建过程中分别利用重测序、克隆测序和PCR的方法补低质量和单覆盖，内部洞以及外部洞，进而得到完成图。测序数据平均覆盖度为8.7×，拼接成1个Scaffold，得到插入片段总长度为80,266bp。
(3)基因预测与序列分析和Pm-2F基因的获得
与步骤(2)测序的80,266bp区间同源的甜瓜基因组中包含9个基因，其中基因MELO3C015353P1编码NBS-LRR蛋白，全长2706bp。而步骤(2)测序的80,266bp区间中该基因的等位基因全长3255bp(如序列表中序列1所示)，将该基因命名为CmPm-2F基因，简称Pm-2F基因。
实施例2、转Pm-2F基因甜瓜的获得及其鉴定
一、构建重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F
1、以人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子为模板，用人工合成的引物PchAF：5-TCGAGCTCGATGGCAGAATCAATTCTG-3’(划线部分为SacI酶切位点)和引物PchAR：5’-CAGGATCCGTTAGTTCATGGTGGGAAGC-3’(划线部分为BamHI酶切位点)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并回收。
25μLPCR反应体系包括50ng模板DNA、2.5μL10×Buffer(含15mMMgCl2)、1.0μLdNTPs(浓度为2.5mM)、1UTaqDNA聚合酶、1μL引物PchAF(10μM)、1μL引物PchAR(10μM)和ddH2O。其中TaqDNA聚合酶、10×Buffer(含15mMMgCl2)和dNTPs均为北京全式金生物技术有限公司的产品。
PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，64℃30s，72℃2min，共循环30次；72℃延伸10min；4℃保持。
2、将步骤1回收的PCR扩增产物与载体pEASY-T1(北京全式金生物技术有限公司产品)连接，得到重组质粒，命名为pEASY-Pm-2F。
3、将重组质粒pEASY-Pm-2F用SacⅠ和BamHⅠ双酶切、回收，得到约3300bp的DNA片段。
4、将载体pCHF3用SacⅠ和BamHⅠ双酶切、回收，得到约10kb左右的载体骨架。
5、将步骤3的DNA片段和载体骨架连接，得到重组质粒，命名为重组质粒pCHF3-Pm-2F(pCHF3-Pm-2F的载体示意图见图2)，将重组质粒pCHF3-Pm-2F转入大肠杆菌DH5ɑ中，得到含有重组质粒pCHF3-Pm-2F的重组大肠杆菌，命名为DH5ɑ/pCHF3-Pm-2F。所述重组质粒DH5ɑ/pCHF3-Pm-2F含有序列表中序列1所示的DNA分子，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
6、将重组质粒DH5ɑ/pCHF3-Pm-2F用电击法转化根癌农杆菌EHA105，挑取重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pCHF3-Pm-2F。
按照上述步骤5和6的方法，将pCHF3-Pm-2F替换为载体pCHF3，其它步骤均不变，得到含有质粒pCHF3的重组农杆菌EHA105/pCHF3，作为空白对照。
二、转Pm-2F基因甜瓜的获得
甜瓜离体再生的过程见图3，具体实验过程如下：
1、获得外植体
挑取30粒饱满的甜瓜K7-2种子，剥去种皮，用70％(体积比)乙醇水溶液浸泡20～30s，用无菌水洗2～3次。然后将甜瓜种子用1％(质量体积比)次氯酸钠水溶液消毒10min，无菌水洗涤4～5次后，用无菌滤纸吸干多余水分。将消毒后的种子置于MS固体培养基，26℃(实际应用中25℃～28℃均可)，暗培养3天，切除胚根和子叶两端1-2mm，将子叶部分切成0.5cm*0.5cm的小块，即为外植体(图3中A)。
2、农杆菌侵染外植体
(1)农杆菌侵染液的制备
将步骤一构建的重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F接种到含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEP液体培养基，28℃，180rpm振荡培养至对数生长期，5000rpm、离心10min，收集菌体后用MS液体悬浮培养基重悬，得到农杆菌侵染液。以MS液体培养基的OD600为参照，调整农杆菌侵染液的OD600值为0.6。
(2)农杆菌侵染外植体
用步骤(1)制备的农杆菌侵染液侵染外植体15min，侵染后的外植体先在无菌滤纸上吸去多余菌液，再置于MS共培养培养基上共培养3天。
共培养条件：26℃，暗培养。
3、抗性芽的筛选
完成步骤2共培养后的外植体转移至初步筛选培养基中光照培养7～10天，然后在初步筛选培养基中继代一次，继续光照培养7～10天。将完成初步筛选的外植体转移至再次筛选培养基中光照培养7～10天，然后在再次筛选培养基中继代一次，继续光照培养7～10天，即可得到出抗性芽(图3中B)。光照培养条件：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)，光照强度2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx)，光照周期16h/8h。
4、抗性芽的伸长
将步骤3获得的抗性芽从再次筛选培养基转移至芽伸长培养基，光照培养培养21天(实际应用中14天～28天均可)，诱导芽伸长生长(图3中C和图3中D)，获得2-3cm的不定芽。光照培养条件：26℃(实际应用中25℃～28℃均可)，光照强度2000Lx(实际应用中1500Lx～2500Lx)，光照周期16h/8h。
5、生根
将步骤4获得的不定芽切下，置于生根培养基进行生根培养(图3中E和图3中F)，获得再生苗，待再生苗根系发达后，去掉封口膜炼苗3～5天(图3中G)，将再生苗从三角瓶中取出，洗去根上附着的生根培养基，移栽入预先高压灭菌的蛭石和草炭土1﹕1(体积比)基质中于温室中培养(图3中H)，即获得转Pm-2F基因的抗性植株。
将上述步骤2中的重组农杆菌EHA105/pCHF3-Pm-2F替换为重组农杆菌EHA105/pCHF3，重复步骤1-5，其它步骤均不变，获得转空载体的植株。
三、抗性植株的检测
1、用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别提取转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA和转空载体的植株的叶片基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以引物对1进行PCR扩增；用K7-2未转基因的叶片基因组DNA代替转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阴性对照。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保持。
用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别提取转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以引物对2分别进行PCR扩增；用K7-2未转基因的叶片基因组DNA和转空载体的植株的叶片基因组DNA分别代替转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阴性对照。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保持。
引物对1：NPTⅡF：5’-ATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGG-3’和NPTⅡR：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT-3’。
引物对2：35S-pro：5’-GAAGTTCATTTCATTTGGAGAGG-3’和pCHF3R：5’-TTAGTTCATGGTGGGAAGC-3’。
实验结果见图4(图4为用引物对1PCR扩增的实验结果，其中M为DNAMarker，泳道1-9为以转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA为模板的实验结果，10为以转空载体植株的叶片基因组DNA为模板的实验结果，CK为以K7-2未转基因的叶片基因组DNA为模板的实验结果)和图5(图5为用引物对2PCR扩增的实验结果，其中M为DNAMarker，泳道1-9为以转Pm-2F基因的抗性植株的叶片的基因组DNA为模板的实验结果，10为以转空载体植株的叶片基因组DNA为模板的实验结果，CK为以K7-2未转基因的叶片基因组DNA为模板的实验结果)，如果转Pm-2F基因的抗性植株的基因组DNA用引物对1扩增出约790bp的条带，同时用引物对2扩增出约3500bp的条带，则该抗性植株即为甜瓜转基因阳性植株；而转空载体的植株用引物对1可以扩增获得790bp条带,同时用引物对2不能扩增出3500bp条带；K7-2未转基因的植株用引物对1不能扩增获得790bp条带，用引物对2不能扩增出3500bp条带。
2、随机选择转空载体的ML8植株(简称ML8)和步骤1鉴定为阳性的7株株系，分别命名为甜瓜转基因株系ML1(简称ML1)、甜瓜转基因株系ML2(简称ML2)、甜瓜转基因株系ML3(简称ML3)、甜瓜转基因株系ML4(简称ML4)、甜瓜转基因株系ML5(简称ML5)、甜瓜转基因株系ML6(简称ML6)和甜瓜转基因株系ML7(简称ML7)。用SDS法提取各甜瓜转基因株系植株的幼嫩叶片基因组DNA，取20μg基因组DNA，分别用序列表的序列3所示的探针序列进行Southern杂交。用K7-2未转基因植株的幼嫩叶片基因组DNA代替甜瓜转基因株系植株的幼嫩叶片基因组DNA，作为阴性对照。
实验结果见图6(泳道1-9依次为以ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和ML8植株的幼嫩叶片基因组DNA为模板的实验结果，CK为以K7-2未转基因的叶片基因组DNA为模板的实验结果)。结果表明，ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和ML8均显示有不同拷贝的基因插入，而K7-2未出现杂交信号，说明Pm-2F基因已成功整合到ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的基因组中,载体pCHF3已成功整合到ML8的基因组中。
3、分别用Trizol法提取K7-2未转基因植株、转空载体的植株和步骤2中各甜瓜转基因株系植株的总RNA并反转录为cDNA，并以此cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测Pm-2F基因的相对表达量(以甜瓜actin基因为内参基因)。
鉴定Pm-2F基因的引物为5’-GTTCTTTCCCACTCCAAGAG-3’和5’-CCTTCACAGCATAACTATTGTAC-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第53位至第193位所示。
鉴定actin基因的引物为actin-F：5’-ATTCTTGCATCTCTAAGTACCTTCC-3’和actin-R：5’-CCAACTAAAGGGAAATAACTCACC-3’。
其中荧光定量PCR上样体系按照OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKitII(PerfectRealTime)(TaKaRa公司产品)的说明书上样，反应体系为共20μl，SYBRPremixExTaqTMⅡ10μl，正反向引物(10μM)0.8μl，模板cDNA1.6μl，ddH2O6.8μl。PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。
将K7-2未转基因植株中Pm-2F基因的相对表达量作为1，ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和ML8中Pm-2F基因的各个相对表达量见图7(其中CK为以K7-2未转基因的植株)。ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7中Pm-2F基因的表达量分别为K7-2未转基因植株中Pm-2F基因的6.2倍、1.2倍、3.3倍、1.8倍、2.8倍、5.4倍和1.7。结果表明Pm-2F基因已成功整合到ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的基因组中并在转录水平上表达。转空载体的植株ML8中Pm-2F基因的相对表达量和K7-2未转基因的植株无显著差异。
4、抗性植株的抗病性检测
评价甜瓜苗期病情的抗病性，采用如下病情分级标准进行：0级：整个植株没有任何病斑；1级：子叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％以下；2级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％至50％(不含20％，含50％)、茎病斑面积占茎总面积的20％以下；3级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的50％至70％(不含50％，含70％)、茎病斑面积占茎总面积的20％至50％(不含20％，含50％)；4级：子叶病斑、茎病斑和真叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的70％以上(不含70％)、茎病斑面积占茎总面积的50％以上(不不含50％)和真叶病斑面积占真叶总面积的20％以下；5级：整个植株均布满白粉或植株因感病而死亡。
A、白粉病病原菌的分离纯化及接种菌源制备
从北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青农场收集白粉病菌，采用孢子悬浮液喷雾法(ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168)接种于白粉病生理小种鉴定的鉴别寄主(PI124112、PMR45、PMR6、PI124111、Topmark、Védrantais、WMR29、NantaisOblong、Edisto47、PI414723、PMR5、IranH或MR1)上，根据鉴别寄主的抗感反应鉴定收集到的白粉病菌的生理小种为P.xanthii2F。
利用单孢培养技术对上述白粉病菌P.xanthii2F分离纯化，纯化后的白粉病菌P.xanthii2F接种于西葫芦幼苗进行扩繁，然后用灭菌的毛笔将扩繁白粉病菌西葫芦病叶上的孢子刷到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，用干净的纱布过滤去除杂质，调整孢子悬浮液浓度至2.0×105个/mL。
B、转基因苗期抗病接种鉴定
采用孢子悬浮液喷雾法将步骤A中制备孢子悬浮液接种于甜瓜(未转基因K7-2植株、ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6、ML7和转空载体的植株ML8)，接种12～15天后，调查甜瓜植株的抗感反应。
结果表明，K7-2未转基因的植株和转空载体的植株的抗病性无显著差异。与未转基因K7-2植株的抗病性相比，ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的抗病性明显增强：未转基因K7-2植株接种白粉病菌P.xanthii2F10天后，子叶开始布满白粉病菌P.xanthii2F，15天后子叶和茎上均布满白粉病菌P.xanthii2F，15天后真叶开始发病，病情级别为5级，即严重感白粉病；而ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6和ML7的子叶和茎上均有少量白粉，真叶无白粉病菌出现，抗病性病情级别均在1-3级之间。

Claims (10)

1.如下a1)或a2)或a3)的蛋白质：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物白粉病抗性相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表序列1所示的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
5.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物白粉病抗性中的应用。
6.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育具有白粉病抗性的转基因植物中的应用。
7.一种培育转基因植物的方法，包括将权利要求2或3所述核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比白粉病抗性增强。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述白粉病由白粉病菌P.xanthii2F感染植物引起。
9.根据权利要求5或6所述的应用，或，权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于：所述双子叶植物是如下d1)-d5)中的任一种：
d1)葫芦科(Cucurbitaceae)植物；
d2)黄瓜属(Cucumis)植物；
d3)甜瓜种植物；
d4)甜瓜；
d5)甜瓜材料K7-1。
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