WO2005040374A1 - ゲノムｄｎａ断片の選抜方法 - Google Patents

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WO2005040374A1 PCT/JP2004/015743 JP2004015743W WO2005040374A1 WO 2005040374 A1 WO2005040374 A1 WO 2005040374A1 JP 2004015743 W JP2004015743 W JP 2004015743W WO 2005040374 A1 WO2005040374 A1 WO 2005040374A1
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genomic dna
dna fragment
plants
fragment
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PCT/JP2004/015743
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French (fr)
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Tomoaki Kubo
Toshihiko Komari
Satoru Usami
Yoshimitsu Takakura
Yukoh Hiei
Yuji Ishida
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Japan Tobacco Inc.
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    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently selecting a genomic DNA fragment that can produce a mutation that can be agriculturally beneficial to a plant.
  • a plant genomic library is transformed by applying a shotgun 'claw jungle to a genomic library as a plant instead of a microorganism (Klee et al. Mol Gen Genet 210: 282-287, 1987).
  • a genomic library was constructed from arabidopsis transformants produced by introducing a kanamycin-resistant gene derived from a microorganism, and a mixed strain containing a large number of agrobacterium strains containing genomic clones was discarded from a petunia leaf disc.
  • petunia cells resistant to kanamycin that is, petunia cells containing a kanamycin resistance gene derived from an Arabidopsis transformant.
  • the results showed that the microorganism-derived kanamycin resistance gene in the Arabidopsis genome can be captured even after transformation into petunia.
  • Heterosis is the phenomenon in which the first generation of hybrids (F1) shows stronger viability than both parents when two parent varieties are crossed.
  • F1 hybrid stress
  • the whole plant has high vigor, large plants and organs, high yield, high growth rate, disease,
  • Various traits such as resistance to insect damage, resistance to various environmental stresses such as drought, high temperature and low temperature, increase / decrease of specific components, increase / decrease of specific enzyme activity, etc. are observed. Many are very useful for agriculture.
  • the first-generation hybrid breeding method which produces new varieties by crossing different parents, has been used for the improvement of cultivated plants for a long time, and greatly contributes to breeding excellent varieties in many crops including corn. Dedication.
  • the first generation hybrid breeding method requires a number of steps, including breeding and improving breeding groups, breeding inbred lines, general combination ability test, specific combination ability test, and selection of F1 varieties. Each step requires a great deal of time and effort. In addition, heterosis often has a great effect when genetically distantly related parents are crossed, but on the other hand, when the relative relationship is distant, the mating often does not have fertility even when crossed. The range of species that can be used was limited.
  • Heterosis traits are dominated by many loci in different linkage groups, in which alleles that favor survival and productivity are dominant and those that are disadvantageous are recessive. It is considered that there are many cases. Because of the large number of loci linked together, it is almost impossible to obtain a line in which the favorable allele is homozygous at all of the many loci. However, in F1, heterosis is caused by the combination of all the favorable alleles of the parents.
  • each two alleles are heterozygous.Either of the alleles may be more favorable to survival and productivity than homozygous. Heterosis power is developed by summation.
  • heterosis is governed by a large number of genetic factors, and it has been difficult to cultivate new varieties with improved traits whose expression is observed to be improved in heterosis by conventional techniques. .
  • the traits whose expression is enhanced by heterosis are often so-called quantitative traits, but genetic analysis of the quantitative trait loci (QTL, Quantitative Trait Loci) that govern them is not easy.
  • QTL quantitative trait loci
  • molecular biological techniques it has become possible to perform genetic analysis of QTL using DNA markers.
  • chromosomal sites containing QTLs that govern certain quantitative traits have been identified.
  • research to clone agriculturally useful genes using molecular maps and molecular biology techniques is also being actively pursued.
  • the site containing the QTL can only be roughly identified, and the DNA fragment containing a large number of genes theoretically becomes apparent as a DNA fragment containing the QTL. It ’s not good. Then, it is not easy to identify a fragment having a size that can be crawled or a fragment that can be introduced into a plant by transformation. In addition, it takes a long time and a lot of labor to create a detailed gene map, identify the desired gene based on the map information, and close the gene. In fact, there have been few cases in which DNA fragments that increase quantitative traits have been cloned based on QTL analysis.
  • a vector that can clone a large DNA fragment of 40 to 80 kb and that can introduce a gene into a plant is known (Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6535-6540, 1999). ). Experiments have also been attempted to introduce individual, specific cloned genomic fragments from plants into higher plants. However, no attempt has been made to individually introduce a large number of genomic fragments constituting a genomic DNA library into plants with unknown functions.
  • Patent Document 1 PCT International Publication WO 03/018808 A
  • Non-Patent Document 1 Jordan et al. Trends in Plant Sciences 17: 392-398,2002
  • Non-Patent Document 2 Dairi et al. Mol Gen Genet 262: 957-964, 2000
  • Non-Patent Document 3 Klee et al. Mol Gen Genet 210: 282-287, 1987
  • Non-Patent Document 4 Olszewski et al. Nucleic Acid Res. 16: 10765-10782, 1988
  • Non-Patent Document 5 Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops, p.173, ed.Coors and Pandey, 1999, American Society of Agronomy, Inc. and Crop science Society of America, Inc., Madison, WI, U.S.A.
  • Non-Patent Document 6 Fu and Dooner, Proc.Natl Acad Sci USA 99: 9573-9578, 2002
  • Non-Patent Document 7 Song and Messing, Proc Natl Acad Sci USA 100: 9055-9060, 2003
  • Non-Patent Document 8 Schwartz, Theor Appl Genet 43: 117-120, 1973
  • Non-Patent Document 9 Hollick and Chandler, Genetics 150: 891-897, 1998
  • Non-Patent Document 10 Stuber, Plant Breeding Reviews 12: 227-251, 1994
  • Non-patent literature l l Li and Yuan, Plant Breeding Reviews 17: 15-158, 2000
  • Non-Patent Document 12 Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA 96: 6535-6540, 1999
  • Non-Patent Document 13 Ku et al. Nature Biotechnol. 17: 76-80, 1999
  • Non-Patent Document 14 SWbata and Liu Trends in Plant Sci 5: 354-357, 2000
  • the present invention provides a method for efficiently selecting a large number of genomic DNA fragments that can produce agriculturally beneficial mutations, and selecting and preparing them as cloned DNA fragments.
  • the present invention provides a method for efficiently selecting and preparing a genomic DNA fragment that improves the expression of a trait whose expression is improved by a plurality of genetic factors. [0028] The present invention provides a method for efficiently selecting a large number of genomic DNA fragments capable of improving a trait or a quantitative trait expressed in heterosis, and selecting and preparing as a cloned DNA fragment. I will provide a.
  • the present invention relates to a method for breeding group breeding, improvement, self-breeding, general combination ability test, specific combination ability test, selection of F1 varieties and the like, which cannot be avoided by techniques such as the first generation hybrid breeding method.
  • Another object of the present invention is to provide a method for efficiently selecting and preparing genomic DNA fragments that can bring about a potentially agriculturally useful mutation to a plant without requiring many steps, each of which requires a long time.
  • the present invention is based on only the phenotype of the plant into which the genomic DNA fragment has been introduced, even when the mechanism of the expression of the trait and the information on each gene that causes the trait to be expressed are almost unknown.
  • a method for efficiently selecting and preparing a genomic DNA fragment that can bring about a mutation that can be agriculturally beneficial to a plant by selecting a superior individual.
  • the present invention provides a genomic DNA that enables expression similar to the trait improvement observed in heterosis (hereinafter, referred to as "heterosis-like expression”) not only between the same plant varieties but also between different plant varieties.
  • heterosis-like expression a genomic DNA that enables expression similar to the trait improvement observed in heterosis
  • the present invention provides a method for efficiently selecting and preparing a large number of genomic DNA fragments that enable heterosis-like expression without requiring much time and labor.
  • the present invention provides a method for transforming a plant with a genomic DNA fragment prepared by the method of the present invention, which is capable of causing a mutation that can be agriculturally beneficial to a plant, or a genomic DNA fragment capable of causing heterosis-like expression.
  • the present invention provides a method for producing a plant having a mutation which may be agriculturally beneficial, and a plant produced by the method.
  • the present invention relates to all or a part of a genomic DNA fragment capable of causing a mutation that can be agriculturally beneficial to a plant or a genomic DNA fragment capable of causing heterosis-like expression, prepared by the method of the present invention.
  • the term "agriculturally beneficial mutation” refers to "a plant, particularly a cultivated plant or a plant under normal or favorable cultivation conditions for the plant or under conditions where some stress is applied to the plant. And Z or an ornamental plant, a mutation that causes a quantitative increase or decrease or an increase or decrease in the growth rate of at least a part of the plant. Stressful conditions include salt concentration, high and low temperatures, dryness, disease and the like in the cultivation area.
  • Such a mutation causes high yield if the number of seeds and leaves increases under normal cultivation conditions, and does not die under the conditions of disease stress and the like. This is because an increase in the number of leaves and stems means resistance to disease stress and the like. Naturally, content components and enzymes contained in plants are also included in "parts of plants”. Decreasing the size of the whole or part of the plant is also often agriculturally beneficial because dwarf plants are actively bred and widely cultivated!
  • the concept of "a mutation that causes a quantitative increase or decrease or an increase in the growth rate of at least a part of a plant under some cultivation conditions” is a concept of "vig.” high (vigor), large plants and organs, high yield, high growth rate, disease and insect resistance, strong against various environmental stresses such as drought, high temperature and low temperature, increase and decrease of specific components Includes many agriculturally beneficial mutations, such as increased or decreased specific enzyme activity, dwarfism, etc.
  • selection includes the case where when a certain selected group is subjected to a certain selection step, the element of the selected group becomes zero, that is, the selected group includes: Includes cases where it is found that elements that meet the selection criteria are not included
  • the present invention is a method for selecting a genomic DNA fragment that can bring about a mutation that can be agriculturally beneficial to a plant by the following steps (1) to (4) and, if desired, (5).
  • genomic DNA fragment is isolated from a plant by a commonly used method. After strict restriction digestion and size fractionation, construct a genomic DNA library by a conventional method.
  • the plant that supplies the genomic DNA fragment there is no particular limitation on the plant that supplies the genomic DNA fragment, but a preferred example is a plant that can generate heterosis by crossing with a plant into which the genomic DNA fragment is introduced.
  • a preferred example is a plant that can generate heterosis by crossing with a plant into which the genomic DNA fragment is introduced.
  • the plant to be introduced is japonica rice, Oryza 'Lfipogon, which is a kind of wild rice, and indica rice are preferable.
  • the plant to be introduced is a specific corn variety, other corn varieties or wild-type teosinte are preferred examples of the source plant.
  • larger heterosis is observed in plants with a closer relationship. Conventionally, when the relative relationship is distant, crossing becomes impossible, so that heterosis in combination with plants with distant relatives could not be used. Since the genomic DNA fragment of the original plant can be easily used, the plant is also preferred because of its close relationship, and can be used as the donor plant.
  • Various vectors can be used as the closing vector used for the construction of the genome library.
  • a vector that can be used directly for transformation of the plant into which it is introduced is used.
  • PSB200 or pCLD04541 can be used to transform rice, tobacco, arabidopsis, etc.
  • pSB25UNpHm can be used to transform corn. .
  • the DNA fragment to be cloned may contain at least one gene, but each gene in the genome and a region required for controlling its expression are included. As much as possible, a size of 1 kb or more is preferred, a size of 10 kb or more is more preferred, more preferably 20 kb or more, more preferably 30-40 kb or more. In any case, there is no particular upper limit on the size of the DNA fragment as long as it can be introduced into the clawing vector. Methods for partial restriction digestion to obtain such DNA fragment sizes are known.
  • the total number of clones constituting the genomic DNA library that is, the size of the library, is preferably large enough to include many genes of the plant genome.
  • a restriction enzyme that recognizes four bases, such as MboI or Taql.
  • Methods for determining appropriate degradation conditions are known, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
  • the total number of clones for an arbitrary genomic fragment to be included in the genomic DNA library with a certain probability is calculated by the following equation.
  • ⁇ is the probability that an arbitrary genomic fragment is contained in the genomic DNA library
  • f is the average length of the genomic fragment contained in the clone / genome size of the original plant
  • N is the total number of genomic clones. is there).
  • genomic DNA library After the construction of the genomic DNA library, some of the clones constituting the library are incorporated into Escherichia coli and cultured. Count the number of colonies that appear (for plasmid or cosmid vectors) and plaque (for phage vectors), and estimate the total number of clones contained in the library. Furthermore, DNA is prepared from a portion of the colonies and phages that have appeared, the size of the cloned DNA fragment is measured, and the average fragment length is estimated.
  • a vector that can be used directly for plant transformation for example, a vector such as pSB200, pCLD04541, or pSB25UNpHm
  • an individual clone can be used as it is in a transformation experiment. Otherwise, the transformation experiment can be performed after transferring all or a part of the DNA fragment contained in each clone to a transformation vector.
  • the destination plant used for the transformation may be a plant different from the plant from which the genomic DNA is derived, may be a different variety of the same species, or may be a same species of the same species.
  • preferable plants include plants for producing cereals such as rice, barley, wheat, and corn; plants for producing luxury products such as coffee, cocoa, tea, and tobacco; and ornamental plants such as vegetables, fruits, and flowers. There is a wide range of plants with virtually no restrictions.
  • the transformation method may be any existing method! For example, as a biological introduction method, a force injection method such as an aglobatalyte method is used.As a physical introduction method, a microinjection method, an electoral port method, a particle gun method, a silicon carbide method, an air injection method, or the like is used. The polyethylene glycol method is known.
  • a biological introduction method a force injection method such as an aglobatalyte method is used.
  • a physical introduction method, a microinjection method, an electoral port method, a particle gun method, a silicon carbide method, an air injection method, or the like is used.
  • the polyethylene glycol method is known.
  • the genomic DNA is integrated into the genome of the target plant. According to the present invention, it was an advantage that the number of genomic DNA fragments capable of causing heterosis-like expression, which can provide one plant genome library, is not limited to one. Therefore, in order to select more genomic fragments, it is desirable to introduce more genomic fragments individually into
  • the selection method of the present invention does not prevent the inclusion of any preliminary selection step, in order to eliminate the bias of the candidate fragments to be selected, the genomic DNA fragment to be introduced into the plant must be prepared before the introduction. In addition, it is desirable not to include a preliminary selection step as much as possible.
  • genomic DNA fragment to be introduced what kind of phenotype the DNA fragment is involved in, especially in the original plant, is! do not need. Only by selecting the phenotype of the transformant is the power to identify useful genomic DNA fragments.
  • each genomic clone to be introduced into a plant is amplified and Z or stored. Storage is carried out by a conventional method, such as purified DNA, a bacterium such as Escherichia coli containing a genomic clone, or a yeast.
  • the regenerated transgenic plant and its progeny plant are plant
  • vigor size of plant and individual organsWeight, yield, growth rate, disease 'resistance to insect damage, dryness'High temperature' resistance to various environmental stresses such as low temperature, increase of specific components', Evaluate various agriculturally useful traits, such as increasing or decreasing specific enzyme activities.
  • vigor refers to the vitality and vigorous growth of the whole plant.
  • the trait to be evaluated is not particularly limited as long as it is an agriculturally useful trait, irrespective of the characteristics of the genomic DNA fragment source plant or the introduced genomic DNA fragment. Is preferably a quantitative trait or a trait that is improved by heterosis, and is preferably a trait that is agriculturally useful when the target plant is regarded as a breeding target.
  • a phenotypically mutated plant is selected for a trait evaluated in comparison with a plant into which the genomic fragment has not been introduced. For example, compared to a plant into which the genomic fragment has not been introduced, the vigor of the whole plant is higher and the vigor of the plant and individual organs is higher. High weight, high yield, high growth rate, high resistance to diseases and insects, dryness, high temperature High resistance to various environmental stresses such as low temperature, high and low specific components, specific enzyme activity Plants that show an increase, decrease, etc. can be selected. For each trait, the direction of mutation to be selected is not limited to one.
  • the dwarf trait is an important agronomic trait that is a breeding target in various crops, so the size of plants and individual organs is higher than that of plants that have not introduced the genomic fragment. Plants that have become smaller can also be selected. The same applies to other traits.
  • Such traits are mostly so-called quantitative traits, and greatly affect not only genetic factors but also environmental factors. Even in the case of a small plant into which a genomic fragment has not been introduced, the measured value shows a distribution having a certain variation due to environmental factors and the like. According to the present invention, in a population of plants into which a genomic DNA fragment has been randomly introduced, if the genomic DNA fragment causing the phenotypic variation is present, it is expected that the distribution of measured values will be broadened. Then, by selecting a plant showing a measurement value located at the end of this distribution, a small population including a plant containing a genomic DNA fragment that causes a phenotypic variation can be obtained.
  • the progeny plants are evaluated, and repetitive surveys for various traits are performed. And other traits, etc., and can be evaluated in detail from the viewpoint of molecular biology, genetics, biochemistry and plant physiology. After various evaluations, it can be used agriculturally as a new variety. In addition, if a plant exhibiting more excellent traits can be obtained from these plants, the genomic DNA fragment introduced into such a plant and selected as a genomic DNA fragment of even higher value can be selected. be able to.
  • genomic DNA fragments introduced into the selected plants are separately stored as genomic clones as described above, and may be propagated in Escherichia coli using a clawing vector, PCR, or LAMP.
  • the required amount can be produced using a biochemical propagation method such as the method.
  • the base sequence is determined, the contained genes, introns, etc.
  • the analysis of the genetic element of the above can be investigated in detail.
  • This genomic fragment can be introduced into any plant using a known transformation technique, so that it is possible to improve the breed of a plant different from the plant from which the genomic DNA fragment is derived, and to cultivate a different variety of the same plant. It can be used for improving and breeding the same varieties of plants of the same species.
  • step (4) If necessary, all or part of the genomic DNA fragment thus selected is again introduced into the same or different plant, and the same evaluation is carried out. Can be subjected to a typical selection process. In this case, the transformation may be performed using the same clawing vector used in step (2), or another clawing vector may be used.
  • the genomic DNA fragment selected in step (4) is subcloned into the vector. Since the restriction sites used for cloning in the cloning vector vary depending on the cloning vector, depending on the restriction enzyme used, only a part of the genomic DNA fragment selected in step (4) is subcloned. May be appropriate.
  • the size of the DNA fragment that can be closed varies depending on the closing vector or the method of closing, and for this reason, it may be appropriate to subclone only a part of the DNA fragment.
  • One of the effects of performing a secondary selection step using only a part of the DNA fragment is that transformation is performed using only a part of the DNA fragment, and the entire DNA fragment is used. If it is found that the same effect is obtained as in the case where the genomic DNA fragment is selected in step (4), an unnecessary portion is clarified.
  • the transformed plant obtained by the secondary transformation and its progeny plants are vigor of the whole plant, the size of the plant and individual organs, weight, yield, growth rate, disease '' Evaluation of various agriculturally useful traits such as resistance to insect damage, resistance to various environmental stresses such as drought, high temperature and low temperature, increase / decrease of specific components, increase / decrease of specific enzyme activity, etc.
  • genomic DNA fragments that resulted in a plant whose phenotype was mutated in comparison with a plant into which the genomic fragment had not been introduced were evaluated in the primary selection step. Irrespective of cultivation conditions, plant species, and other conditions in the plant, it is possible to cause a mutation of a preferred phenotype in a plant, and it is possible to select a particularly preferred genomic DNA fragment.
  • progeny plants are evaluated, and demodulation of various traits is performed, and characteristics of the mutated trait, inheritance pattern, and association with other traits are evaluated. be able to. After various evaluations, they tend to use agriculturally as new varieties.
  • Genomic DNA fragments that have been confirmed to be able to be selected will be selected. Therefore, a genomic DNA fragment of higher value is selected than in the case of only the primary selection.
  • This selection step can be repeated any number of times, and as a result, a genomic DNA fragment of higher value can be selected.
  • the present invention has been described centering on a method for selecting a genomic DNA fragment.
  • the present invention relates to a genomic DNA fragment that can bring about a mutation that can be agriculturally beneficial to the plant thus selected.
  • a plant having a potentially agriculturally useful mutation resulting from transformation with a genomic DNA fragment are also provided.
  • Various methods have been known for introducing a specific DNA fragment into a plant cell or plant tissue, forming a callus on the cell or tissue, culturing the callus, and redistributing the callus into a complete plant. I have. See, for example, Hiei et al. Plant J. 6: 271-282, 1994.
  • the plant may be regenerated from the transformed cells without significant callus formation depending on the plant.
  • the present invention is also effective in this case. To fix the regenerated plant as a variety, the method of Maruta et al. Molecular Breeding 8: 273-284, 2001 is known. [0073] The present invention further provides the genomic DNA fragment of the present invention as a marker in plant breeding.
  • a plant having the genomic DNA fragment of the present invention can be used to enhance the efficiency of plant breeding.
  • Use for breeding refers to use as a genomic DNA fragment donating plant for introducing the genomic DNA fragment of the present invention into another plant, or breeding by a cross breeding method. It may be used as a parent plant for carrying out the process.
  • genomic DNA is also prepared for a progeny plant, which is obtained by crossing a plant known to have the genomic DNA fragment of the present invention with a plant to be breeded, and It is known that a gene containing the genomic DNA fragment of the present invention is selected, and the selected progeny plant individual is used as a marker by using the sequence information of the specific genomic DNA fragment as a marker. al.
  • the entire genomic DNA fragment may be used as a marker, and if a part of the genomic DNA fragment contains a specific sequence, the partial sequence may be used as the marker.
  • the genomic DNA fragment of the present invention may be hybridized to the base sequence of the genomic fragment obtained by the method disclosed herein under mild or severe stringency conditions, and Also included are biologically active isolated DNA and RNA.
  • Hybridization conditions under severe stringency include, for example, those described in Molecular Cloning, etc., at 65 ° C. in 0.5 M sodium phosphate pH 7.2, 1 mM EDTA, 7% SDS, 1% BSA.
  • the genomic DNA fragment selection method of the present invention elucidates the functions of plant genes, such as a method of comparing and examining a base sequence with a known base sequence in conventional genomic analysis and a method of estimating the function of cDNA. Search for DNA fragments involved in heterosis with a new approach that does not need to be performed.
  • the method for selecting a genomic DNA fragment of the present invention comprises the steps of:
  • the method for selecting a genomic DNA fragment of the present invention can select a wide range of traits useful for agriculture where there are no restrictions on the traits to be selected.
  • genomic DNA fragments are selected based on the phenotype of the target plant, and thus the selected genomic DNA fragments are used as they are for breeding the target plant. be able to.
  • a genomic DNA fragment causing the same effect as heterosis is obtained as a cloned DNA fragment and as a DNA fragment that can be easily transformed into a plant. Unlike the use of heterosis by classical breeding methods, it does not require long time and much labor for breeding.
  • the method of selecting a genomic DNA fragment of the present invention differs from the use of heterosis by the classical breeding method in that a genomic fragment of one cultivar is introduced into the other cultivar, so that the breeding between parent varieties can be performed.
  • the combination of plants, which is not possible with the conventional hybrid breeding method, is possible without the limitation of segregation. Therefore, the DNA fragment of the present invention can be easily introduced into various plants by transformation methods, regardless of whether it is the same species or different from the plant derived from the DNA fragment, and used for breeding. Take advantage of the benefits of heterosis in the meantime It is possible.
  • the method for selecting genomic DNA fragments of the present invention does not require searching for loci involved in agronomic traits, so that it can be performed efficiently without requiring a long time and a large amount of labor. It is possible to select genomic DNA fragments that increase or decrease the quantitative trait.
  • genomic DNA fragment of the present invention since the genomic DNA fragment of the present invention has an effect of inducing expression similar to heterosis by transformation, it can be used as a marker in a normal cross breeding method to select progeny of the cross. Efficiency can be greatly increased.
  • FIG. 1 is a genetic map of the closing vector pSB200.
  • FIG. 2 is a genetic map of a closing vector pSB25UNpHm.
  • Fig. 3 is a photograph showing an example of a transgenic plant selected based on external observation of ear size, number of grains per ear, and viga of the whole plant, and a control plant ( Generation: TO, selected lines: 5310).
  • Fig. 4 is a view showing the results of a rice blast resistance test of transformed rice plants selected by introducing a genomic DNA fragment of Oryza 'rufipogon.
  • FIG. 5 is a diagram showing the amount of leaf elongation under stress conditions of a transformed rice plant selected by introducing a genomic DNA fragment of Oryza 'rufipogon.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of introducing a genomic DNA fragment in the growth of transformed tobacco callus selected by introducing a genomic DNA fragment of Oryza 'rufipogon.
  • Fig. 7 is a photograph showing an example of a transgenic plant selected by introducing a genomic DNA fragment of theosinte and a control plant.
  • FIG. 8 is a diagram showing amplification sites of a genomic DNA fragment of Oryza rufipogon by PCR.
  • FIG. 9 is a photograph showing an example of the result of amplification of a genomic DNA fragment of Oryza rufipogon by PCR.
  • FIG. 10 is a photograph showing an example of electrophoresis of a restriction enzyme fragment generated from a genomic DNA fragment of Oryza 'rufipogon.
  • FIG. 11 is a photograph showing an example of electrophoresis of a restriction enzyme fragment of a transformation vector into which a genomic DNA fragment of Oryza 'rufipogon has been incorporated.
  • Example 1 Extraction of genomic DNA from Oryza and Rufipogon Construction of Genomic DNA Library
  • Oryza cultivated in a greenhouse using seeds of Oryza rufipogon, a closely related species of rice, obtained from the National Institute for Bioresources, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries 'Genomic DNA was extracted from the leaves of Luffypogon by a conventional method.
  • This genomic DNA was subjected to partial restriction digestion with the restriction enzyme Taql, and a 30 kb to 50 kb fraction was prepared by sucrose density gradient centrifugation. Using this fraction, cloning was performed at the Nsp (7524) V (sometimes simply referred to as NspV) cleavage site of the cosmid vector PSB200 to construct a genomic DNA library.
  • Nsp 7524
  • V sometimes simply referred to as NspV
  • PSB200 is a cloning vector constructed from pSBll described in Komari et al. (Plant J. 10: 165-174, 1996). That is, the ubiquitin promoter derived from corn, the hygromycin resistance gene, the 3 'end signal of the NOS gene,
  • the Nsp (7524) V cleavage site is added to pSBll.
  • pSB200 a genomic DNA library having an average fragment length of about 40 kb can be constructed.
  • PSB200 is also a vector for transformation of higher plants, and can introduce genes into various plants using the hygromycin resistance gene as a selection marker.
  • Oryza 'Luffigong's genomic DNA library is a clone of japonica rice with clones
  • the constituent clones of the genomic DNA library were individually introduced into Agrobacterium strain LBA4404 (pSBl) ( Komari et al. 1996).
  • the method used for the introduction is Triparental mating (Ditta et al. Proc Natl Acad Sci. USA 77: 7347-7351, 1980).
  • These agrobacterium were individually introduced into rice (cultivar Yukihikari).
  • the transformation was carried out according to Hiei et al. 1994 by inoculating an immature embryo with agrobacterium.
  • the immature embryos of the varieties Yukihikari are sold for food and obtained from plants sown with green rice and cultivated in a greenhouse or their progeny plants cultivated in a greenhouse.
  • a transformed plant was obtained in which a total of 5310 genomic DNA fragments contained in the genomic DNA library were individually introduced. In addition, for each genomic DNA fragment, 115 independent transformants were obtained.
  • a transformed current plant is referred to as a TO generation plant, and its progeny plants are referred to as a T1 generation plant, a T2 generation plant, and the like in order of generation.
  • Example 3 Oriza 'Luffigon's genomic DNA fragments contained in a genomic DNA fragment contained in the library
  • the transformed plants were cultivated in a greenhouse, and the individual plants were examined for the overall plant size, plant height, relative growth rate, number of ears, above-ground weight, ear weight, ear length, number of fertile grains, and yield.
  • the relative growth rate refers to the amount of daily growth per unit plant height, and is calculated by ((Survey end day plant height Survey start day plant height) Z days of survey period) Z Survey start plant height.
  • Tables 1 to 6 and FIG. 3 show examples of selected plants and names given to the introduced genomic DNA fragments. In these examples, multiple transformants in which the same genomic fragment was introduced showed similar mutations and were selected.
  • the distribution of the measured values of the control plant was applied to a normal distribution.
  • Rice (Yukihikari) transformed with GUS gene was used as a control plant.
  • the probability of appearance of a line showing the measured value of the selected transformed plant line was calculated.
  • the value of the probability of appearance for the number of selected lines is extremely small, and the expected value of the appearance of such selected lines is far below 1.0. Therefore, the assumption that the introduced fragment had no effect was rejected, and it was statistically proved that the selected line showed significant mutation.
  • transgenic ⁇ S plants and control plants generation: T0, number of selected lines' ⁇
  • Control plant 558 0.55 Standard deviation: 0.30 [Table 6] Examples of transformants selected based on spike length and whole plant viga and control plants
  • plants of the progeny of the transgenic plants were cultivated, and the plants were evaluated in the same manner as described above.
  • individuals containing the introduced genomic DNA fragment are expected to separate from individuals not containing the introduced genomic DNA fragment according to Mendel's law.
  • the presence or absence of the introduced fragment is determined using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. Investigated.
  • Tables 7 to 9 below show examples of the selected plants and names given to the introduced genomic DNA fragments.
  • all plants in which the presence of the introduced fragment was confirmed by PCR showed the same mutation, and the introduced fragment was detected by PCR. None of the viable plants showed such mutations.
  • selection was performed based on the viga of the whole plant and some measured values.
  • transgenic plant selected based on plant height at 14th H after transplantation and viga of whole plant and control plant (generation: Tl, number of selected lines 114)
  • transgenic plant selected based on plant height and whole plant viga 21 days after transplantation and paired plants (generation: ⁇ , number of selected lines 114)
  • Example 4 Selection of target objects based on evaluation of disease resistance
  • the T1 generation plant of the transformed line created in Example 2 was transformed and compared with V ⁇ , Yukihikari and Koshihikari as control plants, and evaluated for V and blast resistance. Plants having mutations in resistance-related traits were selected. In addition, genomic DNA fragments introduced into these plants were selected as genomic DNA fragments that could cause agriculturally beneficial mutations in the crop.
  • the inoculation source was adjusted as follows.
  • the flora of the rice blast strain TSU-01 was inoculated on an oatmeal agar medium (Difco) containing 10 g / 1 of sucrose, and cultured at 26 ° C in the dark for 3 weeks.
  • 10 ml of sterile distilled water was added to the plate, the hypha was cut with a sterilized paintbrush, and the plate was cultured under illumination at 25 ° C for 3 days.
  • 8 ml of LB liquid medium (Difco) diluted to 1/2 concentration with sterile distilled water was placed in the plate, and the conidia were suspended with a sterile paintbrush. After filtering the suspension through double gauze, the conidia concentration was adjusted to about 2 ⁇ 10 6 conidia / ml.
  • Silwet L-77 was added to the inoculum so that the final concentration was 0.01%.
  • Inoculation was performed by applying the inoculum with a paintbrush to the developed top leaf of the plant 19 days after transplantation. Immediately after the application, the inoculated leaves were passed through a plastic tube, the upper and lower openings were filled with absorbent cotton, and sufficiently moistened with distilled water. The plants were cultivated for one week at a photoperiod of 14 hours, 25 ° C during the day and 20 ° C at night. During this time, the cotton wool packed in the tube opening was moistened with distilled water once a day. Cut the inoculated leaves and reduce the number and area of lesions to 0 (no symptom)? Evaluation was made with a morbidity of 3 (lesions spread on most of the leaves).
  • the presence or absence of the introduced fragment was also determined based on the individual and individual abilities of the collected leaf pieces based on their sensitivity to idalomycin. Individuals without hygromycin resistance, ie, introduced fragments ⁇ individuals were excluded as separate individuals, and the average morbidity of the transformed individuals was compared. Many of the transgenic lines showed the same degree of disease as the untransformed control “Yukihikari”. The following shows examples of 13 transformed lines. A014D1201, A020E0401, A023F0303 and A078C0102 showed significantly lower morbidity than the control “Yukihikari” (FIG. 4). In particular, the average morbidity of A078C0102 was 0, indicating that the introduced Oryza refipogon genomic fragment may have conferred a high degree of blast resistance.
  • Example 5 Selection of an object to be shaped based on the evaluation of drying resistance
  • the degree of drought tolerance of the transformed plants was evaluated.
  • the evaluation was performed on a five-stage scale for each individual with the naked eye (0: one withered, 5: completely recovered). In order to correct the variation in data among the pots, the score of each test individual was subtracted by the score of Yukihikari in the same pot, and the value was used as the score of each individual. Based on the evaluation results, the top 10% were selected as plants containing genomic fragments that are more likely to confer drought tolerance to the crop.
  • the leaf length of the top leaf of each individual was measured immediately before the drying treatment and one week after the treatment.
  • Leaf length one week after treatment Force The value obtained by subtracting the leaf length immediately before the treatment was defined as the amount of leaf elongation under drought stress treatment conditions for each individual.
  • re-watering treatment was performed. After 4 days, the degree of recovery was examined, and the amount of leaf elongation under stress treatment conditions was evaluated. Evaluation was performed as described above, except that Yukihikari (T2), in which only the GUS gene was introduced, was also added.
  • Example 6 Evaluation of maize transformed by genomic DNA fragments contained in a genomic DNA library derived from Oryza rufipogon, selection of mutated cattle plant
  • Maize was transformed using the Agrobacterium containing a genomic fragment derived from Oryza rufipogon prepared in Example 1. Transformation was performed according to Ishida et al 2003 (Plat Biotechnol. 20: 57-66). The introduced variety is inbred variety A188 (obtained from the Research Institute for Biological Resources, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries). Similarly to Example 1, a genomic DNA library and an Agrobacterium containing a genomic DNA fragment derived from Oryza rufipogon were prepared using pSB25UNpHm as a vector. Using this, corn was transformed in the same manner as described above. As a result, transformants into which a total of 108 genomic DNA fragments contained in the genomic DNA library were individually introduced were obtained.
  • pSB25UNpHm replaces the promoter of the bar gene of pSB25 described in Ishida et al. Nature Biotech 14: 745-750, 1996 with a maize-derived ubiquitin promoter, and further has an Nsp (7524) V cleavage site, -Better with Seel cleavage site and Ceul cleavage site.
  • pSB25UNpHm has the same cloning ability as pSB200, and can introduce genes into various plants such as maize using the bar gene as a selection marker.
  • Transgenic plants were cultivated in a greenhouse as in the case of rice, and plant height on the 28th day after transplantation, plant height on the 35th day, relative growth rate (((plant height on the 35th day after transplantation, 28 / 7) 28 days after Z transplantation), leaf height, maximum ear weight, maximum number of ear grains, maximum ear total grain weight, 1 grain weight (maximum total ear weight Z maximum)
  • the effect of the introduced genomic DNA fragment was investigated by investigating the number of ear grains. In order to compensate for seasonal growth irregularities, the average value of all individuals on the same pot picking day was calculated, and the data was normalized using the formula of (value of each individual-average value) Z-average value and analyzed.
  • Maize (A188) transformed with the GUS gene was used as a control plant.
  • the variance was significantly greater than that of the control plants. This showed that the distribution of measured values in the plant population into which the genomic DNA fragment was introduced was broadened.
  • the probability of appearance of a line showing the measured value of the selected transgenic plant line was calculated.
  • the value of the probability of occurrence with respect to the number of selected strains is extremely small in each case, so the expected value of the appearance of such selected strains is significantly lower than 1.0.
  • the results were below the expected value in 5 lines. Therefore, the assumption that the introduced fragment had no effect was rejected, and it was statistically proved that the selected lines showed significant mutation.
  • the obtained transformed maize was cultivated in a greenhouse, and pollen was fed with pollen of a maize variety (A188) that was separately grown in a greenhouse to obtain seeds.
  • the generation derived from this seed is referred to herein as the T1 generation.
  • T1 generation 5 to 8 individuals per line were cultivated in a greenhouse and examined for traits.
  • individuals containing the introduced genomic DNA fragment will be separated from those containing the introduced genomic DNA fragment according to Mendel's law.Therefore, the presence or absence of the introduced fragment is investigated using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. did. The presence or absence of the fragment can be checked using the PCR method. (Details are described in Example 16).
  • transgenic plants in which one or more traits were mutated and their progeny were selected.
  • genomic DNA fragments introduced into these plants were selected as genomic DNA fragments capable of causing maize to have agriculturally beneficial mutations.
  • Example of transgenic plant selected based on relative growth rate
  • transgenic ffi corn sorghum
  • Transformation of tobacco was carried out using the agrobacterium containing the genomic DNA fragment derived from Oryza rufipogon prepared in Example 1. Transformation method is Komari Theor Appl The introduced variety is SRI (Kodama et al. Plant Physiol 105: 601-605, 1994).
  • the transformed plant and its progeny are cultivated in a greenhouse in the same manner as in the case of rice corn, and the whole plant has a bigger, plant height, relative growth rate, leaf number, leaf length, leaf width, leaf weight.
  • the effect of the introduced genomic DNA fragment was determined by examining the above-ground weight, yield, drought tolerance, salt tolerance, disease resistance, and the like. Then, for one or more of these traits, a mutated transgenic product and its progeny were selected. Furthermore, genomic DNA fragments introduced into these plants were selected as genomic DNA fragments capable of causing mutations that could be agriculturally beneficial in tobacco.
  • the probability of appearance of an individual showing the measured value of the selected transgenic plant individual was calculated.
  • the value of the probability of appearance of the plant exemplified here with respect to the number of selected individuals is extremely small, and thus the expected value of the appearance of such selected individuals is significantly lower than 1.0. Therefore, the assumption that the introduced fragment had no effect was rejected, and it was proved statistically that the selected individuals exhibited significant mutation.
  • genomic DNA was isolated from Arabidopsis thaliana, a genomic DNA library was constructed, and genomic clones constituting the genomic DNA library were individually transformed into rice by a transformation method. (Yukihikari). As a result, a transgenic plant was obtained in which a total of 1477 genomic DNA fragments contained in the genomic DNA library were individually introduced.
  • the Arabidopsis ecotype used was Columbia, and the seed was obtained from the international Arabidopsis Genetic Resource Bank (eg, RIKEN
  • Bioresource Center Power is also available.
  • Transgenic plants and their progeny are planted in a greenhouse as in the case of Oryza rufipogon-derived genomic DNA library, and the overall plant size, plant height, relative growth rate, number of panicles, Genomic DNA introduced by examining the above-ground weight, ear weight, ear length, fertile grain number, yield, leaf number, leaf length, leaf width, leaf weight, drought tolerance, salt tolerance, disease resistance, etc. The effect of the fragments was determined.
  • the rice (Yukihikari) transformed with the GUS gene was used as a control plant. Then, among these traits, one or more traits were selected, and a transgenic plant having a mutation and its progeny were selected.
  • the genomic DNA fragments introduced into the selected plants were selected as genomic DNA fragments derived from Arabidopsis, which can cause agriculturally beneficial mutations in the crop.
  • Example 9 Evaluation of rice plants transformed by genomic DNA fragments contained in a genomic DNA library derived from rosegrass, selection of mutated bovine plants
  • genomic DNA was isolated from rosegrass (Chloris gayana), a genomic DNA library was constructed, and the genomic clones constituting the genomic DNA library were individually transformed into rice by the transformation method. (Yukihikari). As a result, transgenic plants were obtained in which a total of 1450 genomic DNA fragments contained in the genomic DNA library were individually introduced.
  • the variety of rosegrass used was commercially available as Riki Riede. Transgenic plants and their progeny are cultivated in a greenhouse, as in the case of the genomic DNA library derived from Oryza rufipogon.
  • the rice plant (Yukihikari) transformed with the GUS gene was used as a control plant. Then, for one or more of these traits, a transgenic plant having a mutation and its progeny were selected.
  • the genomic DNA fragment introduced into the selected plants was selected as a genomic DNA fragment derived from rosegrass that can cause agriculturally beneficial mutations in the crop.
  • Example 10 Evaluation of rice and corn transformed by genomic DNA fragments contained in a genomic DNA library derived from sorghum, selection of mutated cattle-like plants
  • genomic DNA was isolated from sorghum (Sorghum bicolor), a genomic DNA library was constructed, and genomic clones constituting this genomic DNA library were individually transformed into rice (Yuki Strain), and corn (A188). As a result, transformants into which 2560 and 200 genomic DNA fragments contained in the genomic DNA library were individually introduced were obtained.
  • the sorghum variety used is commercially available as Gold Sorgo I. Transgenic plants and their progeny plants are cultivated in a greenhouse, as in the case of the genomic DNA library derived from Oryza rufipogon, and the whole plant is made up of viga, plant height, relative growth rate, number of ears, and aboveground part.
  • Examples of the total panicle weight of rice are shown below (Table 21).
  • the control plant The distribution of constant values was fitted to a normal distribution.
  • the rice (Yukihikari) transformed with the GUS gene was used as a control plant. According to this normal distribution, assuming that the introduced fragment had no effect, the probability of appearance of a line showing the measured value of the selected transformed plant line was calculated. In each case, the value of the probability of occurrence with respect to the number of selected strains is extremely small in each case, and the expected value of the appearance of such selected strains is much lower than 1.0.
  • Out of the 2504 lines investigated for the total panicle weight 43 lines showed results that were lower than expected. Therefore, the assumption that the introduced fragment had no effect was rejected, and it was statistically proved that the selected line showed significant mutation.
  • the plant height on the 28th day after the transplantation of the transgenic plant the plant height on the 35th day, and the relative growth rate (((35 days after the transplantation, plant height on the 28th day after the transplantation) (Plant height) / 7) 28 days after Z transplantation), leaf height, maximum panicle weight, maximum panicle number, maximum panicle total grain weight, 1 panicle weight (maximum panicle total grain weight Z maximum panicle grain)
  • the variance of the relative growth rate, the maximum number of panicles, and the weight of one grain was significantly larger than that of the control plant.
  • the average value of all individuals on the same potting day was calculated, and the data was standardized and analyzed using the formula of (value of each individual-average value) Z average value.
  • corn (A188) transformed with the GUS gene was used as a control plant. According to this normal distribution, assuming that the introduced fragment had no effect, the probability of appearance of a line showing the measured value of the selected transformant or line was calculated. In each of the strains exemplified here, the numerical value of the probability of occurrence with respect to the number of selected strains is extremely small. The expected value for the emergence of selected strains like this is well below 1.0. Of the 150 lines studied, the relative growth rate was 7 lines, and the maximum number of spikelets was 8 lines, and the expected value was less than 1.0. Therefore, the assumption that the introduced fragment had no effect was rejected, and it was statistically proved that the selection line showed significant mutation.
  • genomic DNA fragment derived from sorghum was selected as a genomic DNA fragment capable of causing a corn to have an agriculturally beneficial mutation.
  • Example 11 Evaluation of rice transformed by genomic DNA fragments contained in a genomic DNA library derived from theosinth
  • genomic DNA was isolated from theosin (KZea diploperenis), a genomic DNA library was constructed, and the genomic clones constituting the genomic DNA library were individually transformed into rice (Yukihikari ).
  • the teosinte varieties used are those that are sold as teosinte for pasture.
  • the transgenic product and its progeny plants are cultivated in a greenhouse, as in the case of the genomic DNA library derived from Oryza rufipogon, and the whole plant has a viga, plant height, relative growth rate, number of ears, and above-ground weight.
  • the effect of the introduced genomic DNA fragment was determined by investigating the cultivar, ear weight, ear length, number of fertile grains, yield, number of leaves, leaf length, leaf width, leaf weight, drought resistance, and disease resistance. . Then, for one or more of these traits, a transgenic plant having a mutation and its progeny were selected.
  • the genomic DNA fragment introduced into the selected plant was selected as a teosinte-derived genomic DNA fragment capable of causing agriculturally beneficial mutations in the crop.
  • the rice (Yukihikari) transformed with the GUS gene was used as a control plant.
  • Figure 7 shows the rice cultivation status after the introduction of the teosinte genomic fragment.
  • genomic DNA was isolated from Sorghum Sudanese, a genomic DNA library was constructed, and genomic clones constituting the genomic DNA library were individually transformed into rice by the transformation method. (Yukihikari). As a result, a transgenic plant was obtained in which a total of 2644 genomic DNA fragments contained in the genomic DNA library were individually introduced.
  • the Sudangrass varieties used are those that are commercially available for pasture use. Transgenic plants and their progeny plants are cultivated in a greenhouse, as in the case of the genomic DNA library derived from Oryza rufipogon, and the whole plant is made up of viga, plant height, relative growth rate, number of ears, and aboveground part.
  • genomic DNA was isolated from millet (Seteria italica), a genomic DNA library was constructed, and genomic clones constituting the genomic DNA library were individually transformed into rice ( (Yukihikari) was introduced. As a result, transformants were obtained in which a total of 2952 genomic DNA fragments contained in the genomic DNA library were individually introduced.
  • the varieties of millet used are the very early Italian millet R, which is commercially available for pasture.
  • Transgenic plants and their progeny are cultivated in a greenhouse as in the case of the genomic DNA library derived from Oryza's rufibongon, and the whole plant is bigger, plant height, relative growth rate, number of ears, and aboveground weight.
  • the effect of the introduced genomic DNA fragment was determined by investigating, ear weight, ear length, number of fertile grains, yield, number of leaves, leaf length, leaf width, leaf weight, drought tolerance, disease resistance, etc. . Then, for one or more of these traits, a transformed plant in which a mutation occurred and a progeny plant thereof were selected.
  • the genomic DNA fragment introduced into the selected plant was selected as a millet-derived genomic DNA fragment capable of causing agriculturally beneficial mutations in the crop.
  • Example 4 Evaluation of ti products transformed by genomic DNA fragments contained in genomic DNA library from Giagrass ⁇ , selection of ti products from ⁇
  • genomic DNA is isolated from girgrass (Panicum maximum), a genomic DNA library is constructed, and the genomic clones constituting this genomic DNA library are individually transformed by the transformation method. Introduced to rice, corn and tobacco. The girgrass varieties used were colored gingergrass commercially available for pasture use.
  • Transgenic animals and their progeny plants are cultivated in a greenhouse, as in the case of the genomic DNA library derived from Oryza rufipogon, and the whole plant is made up of Viga, plant height, relative growth rate, number of ears, Introduced genomic DNA by investigating aboveground weight, ear weight, ear length, number of fertile grains, yield, number of leaves, leaf length, leaf width, leaf weight, drought tolerance, salt tolerance, disease resistance, etc. The effect of the fragment was determined. Then, for one or more of these traits, a transgenic plant having a mutation and its progeny were selected. The genomic DNA fragment introduced into the selected plant was selected as a genomic DNA fragment derived from girgrass, which can cause an agriculturally beneficial mutation in rice, corn, or tobacco.
  • Selected Genomic DNA Fragments as Type I Selected genomic DNA fragments (AS4 (A011D07), AS8 (A014E08), AS19 (A010B03), AS20 (A011C02), AS22 ( A014D12), AS27 (A012D12), AS28 (A015C06),
  • AS4 A011D07
  • AS8 A014E08
  • AS19 A010B03
  • AS20 A011C02
  • AS22 A014D12
  • AS27 A012D12
  • AS28 A015C06
  • PCR PCR2 in Fig. 8
  • the primer sequences used are as follows. AS4: 5 '-TGGGCTCCAGCAGAAACGAACCCT-3' and 5 '-CTTATATTTAGGAACGGAGTGAGT-3'
  • PCRs were performed using Takara ExTaq (TAKARA) or Takara LA Taq (TAKARA), heat denaturation (94 ° C, 30 seconds), annealing (58 ° C, 30 seconds) and extension reaction (72 ° C). , 30 seconds) was repeated 30 times or 35 times.
  • the PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the genomic DNA evaluated in Example 3 and mutated in rice was transformed into corn in Example 6.
  • the obtained transformed corn was cultivated in a greenhouse, and pollen of the maize variety A188, which had been grown in a separate greenhouse, was pollinated. It is expected that the obtained progeny seeds will be separated from individuals containing the genomic DNA fragment of Oryza 'rufipogon and from individuals not containing the fragment. Therefore, using the border sequence of the T-DNA of the introduced genomic DNA fragment as a marker, amplification was performed by PCR and the presence or absence of a genomic DNA fragment derived from Oryza rufipogon was examined. As a result, plant individuals having the marker were determined to be suitable for breeding and usable for further breeding steps, and plant individuals not having the marker were determined to be unsuitable for breeding.
  • Table 30 shows the relationship between the presence or absence of the introduced genomic DNA fragment and the measured value of the trait. [Table 30] Relationship between presence / absence of the fragment and traits based on markers created from the extracted genome fragments
  • the plasmid was isolated from the bacterial pellet according to a conventional method (alkali method), and the plasmid DNA was dissolved in 40 ⁇ l to obtain a selected genomic DNA fragment and a genomic DNA fragment containing a cloning vector.
  • Example 17 Using the plasmid DNA prepared in Example 17 (clone name: AS88, AS90, AS95-AS102, AS104-AS106), a reaction solution comprising the following components was prepared.
  • Each plasmid DNA contains the following genomic DNA fragment. (A018D06,
  • the reaction solution was mixed with 41 ⁇ 6 dye and mixed, and subjected to electrophoresis (100 V, 1 hour) using 0.71 on a 0.7% agarose gel. After the electrophoresis, the gel was stained with EtBr to obtain restriction enzyme fragments that also generated genomic cloning power. An example of this is shown in Fig. 10.19.Integration of a genomic DNA fragment reported in E. coli into a vector for transformation (DSB200).
  • plasmid DNA genomic DNA fragment G001A03 isolated and purified from Escherichia coli
  • a BP reaction 25. C,- ⁇
  • the plasmid DNA was precipitated. After centrifugation (15000 rpm), the obtained precipitate was washed with 70% ethanol and dissolved with 10 ⁇ l of TE.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli DB3.1 by electoporation, plated on LA (Sp50Cm30), and cultured at 28 ° C for 3 days.
  • the single colony that grew was cultured in 2 ml of LB (Sp50Cm30), plasmid DNA was isolated according to a standard method (alkaline method), fragment analysis was performed using Hindlll and Sacl, and the target plasmid was selected.
  • the recombinant plasmid (G001A03DEST) was selected using this as an index (Fig. 11, lane 2). .
  • an LR reaction was performed under the same conditions as the BP reaction, and a clone G001A03bar in which the drug selection marker gene was replaced was selected.
  • the aatRl-ccdB-Cm-aatR2 fragment was replaced by the aatBlbar-aatB2 fragment by the LR reaction, and the vector size changed from 10.4 kb to 9.3 kb.
  • G001A03bar was selected using this as an index (Fig. 11, lane 3). ).
  • the target selected fragment was successfully incorporated into a vector that can be transformed into a plant.
  • Example 20 Analysis of Selected Genomic DNA Clones The nucleotide sequence of 280-500 bases at both ends of the selected genomic DNA fragment was investigated. The results are also shown by the SEQ ID numbers corresponding to the genomic DNA fragments in Tables 1 to 9 and FIG. In addition, Table 31 below shows the sequences of PCR primer pairs that can detect these fragments by the PCR method.
  • the genomic DNA fragments selected in Examples 3 to 14 were introduced into rice, corn, and tobacco by the method described in Example 2, Example 6, or Example 7.
  • the obtained transgenic plants and their progeny plants were evaluated in the same manner as in Example 3-14. And comment For one or more of the traits evaluated, a transgenic plant having a mutation and its progeny were selected.
  • the genomic DNA fragments introduced into the selected plants were selected as genomic DNA fragments capable of causing agriculturally beneficial mutations in crops.
  • Genomic DNA fragments confirmed to be feasible were selected. Therefore, a genomic DNA fragment of higher value was selected than in the case of only the primary selection.
  • Table 32 shows examples of genomic DNA fragments thus selected.

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Abstract

　植物に導入して農業上有益となる植物の改良を行うためのゲノムDNA断片の選抜方法を提供する。 　本発明の方法は、(1) 植物からゲノムDNAを調製し、クローニングベクターを用いて、ゲノムDNAライブラリーを構築し；(2) ゲノムDNAライブラリーを構成する複数のゲノムクローンの各々に含まれるゲノム断片を、個別に植物に導入し、形質転換植物を作出し； (3) 形質転換植物、または、その子孫の植物を栽培し、表現型に農業上有益となりうる変異の生じた植物を選抜し；(4) 工程(3) において選抜された植物に、工程(2) において導入されていたゲノムDNA断片を、目的とするゲノムDNA断片として選抜する；工程からなる。                                                                             

Description

明 細 書
ゲノム DNA断片の選抜方法
技術分野
[0001] 本発明は、植物に農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断片 を効率良く選抜する方法に関する。
背景技術
[0002] 農業上有益な新品種を育成するため、従来から、植物同士を交配させて後代を選 抜する交配育種法や、植物に突然変異を誘発させる突然変異育種法などが行われ てきた。また近年では、バイオテクノロジーの進歩により、有用遺伝子を導入しその機 能を発現させる遺伝子組換え植物も育成されて！ヽる。
個 1遣伝早 人による新品 音成
通常、遺伝子組換えにより新品種を育成するためには、まず遺伝子を単離し、その 機能を解析する必要がある。植物遺伝子についての分子生物学的知見は、近年飛 躍的に増大しており、多くの種のゲノム DNA配列が決定され、部分長鎖および全長 鎖 cDNAクローンも多数単離され、その配列も決定されている。但し、これまでにクロ ーン化され、推定されている遺伝子機能の多くは、単に、遺伝子のコード領域の塩基 配列またはそれ力も推定されるタンパク質のアミノ酸配列が、従来発見されて 、る酵 素遺伝子などの配列と類似であるとの情報に基づいており、遺伝子の機能を検証す るには、形質転換体において遺伝子の発現と表現型とがー致することを確認しなけ ればならない。そのため、個々の遺伝子の機能解明には大変な時間と労力が必要と なり、その解明はほとんど進んでいない。 全長鎖 cDNAクローンを単離し、これを適 当なプロモーター、ターミネータ一と連結し、形質転換することにより、遺伝子の機能 を検証しょうとする試みがある。またこれを進めて、完全長 cDNAのライブラリーを植物 に導入して、遺伝子機能を網羅的に解析する技術も開発されている (WO
03/018808 A)。し力し、これらにおいては、その遺伝子が本来持つプロモーターでな ぐさらにイントロンその他の遺伝子発現制御機能も除かれてしまっているので、遺伝 子本来の機能を発現することは期待しにくい。また、遺伝子によっては、そのスプライ シングの方法が一通りではないために（Jordan et al. Trends in Plant Sciences7:392-398,2002)、 cDNAクローンから本来の機能が失われている場合もある 。実際、このような形質転 ^¾物に認められる変異は、新品種育成の実用性には乏 しい。
[0003] 近年ではバイオインフォマティクスの手法を利用し、各遺伝子のタンパク質に翻訳さ れるコーディング領域、プロモーター領域、イントロン領域などの推定も行われている 。 DNA断片を用いたマイクロアレイ技術により、遺伝子の発現様式が調査されている 。遺伝子ノックアウト技術により、機能欠失変異体が数多く作製されており、遺伝子機 能解析に使われている。また、ァクチべーシヨンタギングにより、遺伝子発現を高進し た形質変換体が作製され、遺伝子機能解析に使われている。遺伝子によりコードさ れるタンパク質相互間の関係を明らかにするために、トゥーハイブリッドシステムが用 いられている。
[0004] しかし、バイオインフォマティックスによる遺伝子機能の推定では、既知のタンパク 質の機能や構造と、それをコードする遺伝子の配列との関係から得られた知見を、機 能不明の遺伝子の機能探索に利用する場合が多いが、最近の研究によって、 cDNA の中には、タンパク質に翻訳されないものが多く存在すること、すなわち、 mRNA様の RNAが転写はされるもののタンパク質は生成されな ヽ遺伝子が、多く存在することが 明らかとなった。また、転写後、低分子の RNAとして機能する遺伝子も多い。したがつ て、これまでのバイオインフォマティックスの技術では、機能解明が困難なゲノム DNA 上の遺伝子も多い。そのため、このような最新の手法を駆使しても、遺伝子機能の推 定は容易ではない。
[0005] 上記のように遺伝子機能の解析は現在でも容易ではな ヽ。そして、たとえ遺伝子機 能が特定できたとしても、このような個別遺伝子の形質転換を行う方法では、いわゆ るへテロシスにおいて発現の向上が認められる形質や量的形質を向上させた新品種 を育成することは困難である。
[0006] ある生物について、当該生物が有する、既知の表現型をもたらす遺伝子を捕捉す るために、当該生物のゲノムライブラリーを構築し、これらをプラスミドとして酵母や細 菌などの微生物に導入して形質転換細胞を作製、さらに、当該既知の表現型につい て知られている情報、例えば当該遺伝子の転写産物などの情報を基に、形質転換 細胞を選抜し、これを利用して目的遺伝子をクローユングしょうとする試み (ショットガ ン.クロー-ング）が広く行われている（Dairi et al. Mol Gen Genet 262: 957-964, 2000.) o
[0007] また、ショットガン 'クローユングを応用し、ゲノムライブラリーの導入先を、微生物で はなく植物にして、植物ゲノムライブラリーを形質転換した例がある（Klee et al. Mol Gen Genet 210:282-287, 1987)。この実験では、微生物由来カナマイシン耐性遺伝 子を導入して作製したァラビドプシス形質転換体から、ゲノムライブラリーを構築し、 ゲノムクローンを含むァグロバタテリゥム菌株を多数含む混合菌株をペチュニアの葉 片ディスクに感染させ、カナマイシン耐性のペチュニア細胞、すなわち、ァラビドプシ ス形質転換体に由来するカナマイシン耐性遺伝子を含むペチュニア細胞を選抜して いる。その結果、ァラビドプシスゲノム中の微生物由来カナマイシン耐性遺伝子が、 ペチュニアに形質転換した後でも捕捉可能なことが示された。
[0008] さらに、ァラビドプシスにお!、て、 Acetohydroxy acid synthase (AHAS)遺伝子の突 然変異のため Chlorosulforonに耐性を示す突然変異体から、ゲノムライブラリーを構 築し、変異型 AHAS遺伝子を含むゲノムクローンを 3個単離して、これらのクローンをタ ノ コに導入したところ、 Chlorosulforonに耐性の形質転換体を得た例が開示されて ヽ る（Olszewski et al. Nucleic Acid Res. 16:10765—10782, 1988.)。
[0009] これらの研究は、ゲノムライブラリーを利用して植物細胞を形質転換し、遺伝子クロ 一ユングを行う技術を開示している。しかし、これらの研究は、ゲノムライブラリー供与 植物の未知の遺伝子の捕捉に成功したものではないし、未知の遺伝子による形質転 ^¾物の改良に成功したものでもない。これらの技術をもってしても、農業上有用な 形質、とりわけヘテロシスにおいて発現の向上が認められる形質や量的形質を向上 させた新品種を育成することは困難である。
ヘテロシス
ヘテロシス (雑種強勢)とは、 2つの親品種を交雑したときに、雑種第一代 (F1)が両 親より強い生活力を示す現象をいう。ヘテロシスにおいては、植物体全体のビガ一 (vigor)が高い、植物体および器官が大きい、収量が高い、生長速度が速い、病害 · 虫害に強い、乾燥，高温'低温等さまざまな環境ストレスに対して強い、特定成分の 増 ·減、特定酵素活性の増 ·減等々、さまざまな形質の向上が認められるが、これらの 形質には農業上極めて有益なものが多い。ヘテロシスを用いた育種法として、異なる 親を掛け合わせて新品種を作出する一代雑種育種法が古くから栽培植物の改良に 利用されており、トウモロコシを始め、多くの作物において優良品種育成に大きな貢 献をしてきた。しカゝし一代雑種育種法は、育種集団の育成'改良、自殖系統の育成、 一般組合せ能力検定、特定組合せ能力検定、 F1品種の選出等々の、多数のステツ プを必要とし、さらに、それぞれのステップには多大な時間と労力が必要となる。また 、ヘテロシスは遺伝的に遠縁の親同士の掛け合わせで大きな効果が認められること が多いが、その反面、類縁関係が遠い場合、交配しても稔性をもたないことも多ぐ交 配を行うことができる種の範囲は限られたものであった。
[0010] ヘテロシスを起こす分子機構は未だ解明されていない。最近の育種学の教科書に おいても、「生理学的、生化学的および分子レベルでの（ヘテロシス）の原因因子は、 今日でも 1952年に開かれたヘテロシス会議の当時と同じぐ殆ど知られていない」 (Genetics and Exploitation of Heterosis inし rops, p.173, ed. Coors ana Panaey, 1999, American Society of Agronomy, Inc. and Crop Science Society of America, Inc., Madison, WI, U. S. A.)と記載されている。
[0011] 最近、トウモロコシに関してヘテロシスに関連する興味深い報告がなされた。 Fu and
Dooner, Proc. Natl Acad Sci USA 99:9573—9578, 2002と Song and Messing, Proc Natl Acad Sci USA 100:9055-9060, 2003である。両報とも、トウモロコシの特定の遺 伝子座に着目して品種間の塩基配列の差異を調査し、その結果トウモロコシにおい ては、品種間差異が、イネなどの自殖性作物の場合と比べ相当に大き!、ことが示さ れた。
[0012] これらの知見は、ヘテロシスの現れやすい他殖性のトウモロコシでは、自殖性の作 物よりも、品種間のゲノム DNAの配列の差異が大き 、ことを示す興味深 、ものである 1S ヘテロシスを起す分子機構が解明されたと 、えるものではな 、。
[0013] このようにへテロシスを起こす分子レベルでの機構にっ 、ては未だ解明されて!、な い。しかし、マクロなレベルでは、以下に示すような各種の遺伝子の相互作用により、 ヘテロシスが起こることが明らかになってきている。
[0014] ィ）優性遺伝子連鎖効果 (dominance effect)
ヘテロシスの認められる形質は、種々の連鎖群にある多くの遺伝子座に支配され、 各遺伝子座において、生存や生産力に有利な対立遺伝子 (allele)は優性で、不利な 対立遺伝子は劣性である場合が多 、と考えられる。連鎖して!/、る遺伝子座が多!、た め、多数の遺伝子座のすべてにおいて、有利な対立遺伝子がホモとなる系統を得る ことは不可能に近い。しかし、 F1においては、両親の持つすべての有利な対立遺伝 子を合わせもつことができるため、ヘテロシスが弓 Iき起こされる。
[0015] 口）超優'性効果 (over- dominance effect)
多数の遺伝子座において、それぞれ 2つの対立遺伝子がヘテロに存在する場合の 方力 どちらかの対立遺伝子がホモに存在する場合よりも、生存や生産力に有利な 場合があり、このような効果の総和によりへテロシス力あたらされる。
[0016] また、超優性効果が、とくに作用力の大きな遺伝子座において存在する場合は、そ の単一座の超優性効果によるへテロシスが観察される。この現象を、単一遺伝子へ ァロンス (single— gene heterosis) ^あるいは、単一遺 子 J坐ヘアロンス (single— locus heterosis)という。これは、元の植物では特段の表現型に寄与している訳ではないが 、他の植物の遺伝子の相互作用により有用な変異をもたらす遺伝子、あるいは遺伝 子座である。このような性質をしめす遺伝子、もしくは遺伝子座の例としては、トウモロ コシの alcohol dehydrogenase遺伝子（Schwartz, Theor Appl Genet 43:117-120, 1973 )や、同じくトウモロコシの purple plant座（Hollick and Chandler, Genetics
150:891-897, 1998)の例などが知られて!/、る。
[0017] ハ）非対立遺伝子相互作用 (interaction of non-allelic genes)
生存や生産力に有利な形質が、 F1雑種において、異なった遺伝子間の相乗的な 効果としてもたらされる場合がある。このような性質を示す多数の遺伝子の効果の総 和が、ヘテロシスをもたらす。なお、非対立遺伝子間の相互作用は、ェピスタシス（ epistasis)とも呼ばれる。
[0018] -)糸田胞質遺 1ZS十の $¾J果 (interaction between nuclear genes and cytoplasmic
genes) 核遺伝子と細胞質遺伝子の相互作用により、 F1雑種において、生存や生産力に有 利な形質が発現する場合がある。
[0019] これらの各種、複数の遺伝子の相互作用により、ヘテロシスが引き起こされると考え られている。 Stuber (Plant Breeding Reviews 12:227-251, 1994)は、これらのそれぞれ が実際に関与していることを示す多数の文献を紹介しており、ヘテロシスは、多数の 遺伝因子によって支配されていることを強調している。また、 Li and Yuan (Plant Breeding Reviews 17:15-158, 2000)も、上記のさまざまな効果の総和によってへテロ シスが起こると考えている。
[0020] このようにヘテロシスは、多数の遺伝因子によって支配されているため、従来の技 術ではへテロシスにおいて発現の向上が認められる形質を向上させた新品種を育成 することは困難であった。
碰
ヘテロシスにより発現の向上が認められる形質は、いわゆる量的形質であることが 多いが、これを支配する量的开質遺伝子座 (QTL, Quantitative Trait Loci)について は、その遺伝解析は簡単ではない。しかし、近年の分子生物学的手法の発展ととも に、 DNAマーカーを用いて QTLの遺伝解析を行うことが可能となってきた。実際、あ る量的形質を支配する QTLを含む染色体部位が特定された例もある。さらに遺伝子 地図を利用し、分子生物学的手法により、農業上有用な遺伝子をクローニングする 研究も盛んになつている。
[0021] 一部の生物では、染色体上に多くの分子マーカーが同定され、マーカーの連鎖分 祈に基づいた遺伝子地図が作成されている。また、長大なゲノム DNAを連結すること により、物理的な位置関係も明らかになつている。
[0022] 遺伝子地図が作成されている生物では、特定の表現型をしめす形質とマーカーと の連鎖分析、および、それに続く染色体歩行などにより、その形質を支配する遺伝子 の物理的位置を明らかにし、遺伝子を単離する試みが行われている。実際、この手 法（マップベースクローユング）により、いくつかの遺伝子が単離されている。
[0023] しかし、通常の QTL解析では、 QTLを含む部位の同定は大まかにしかできず、理論 的に多数の遺伝子を含む DNA断片力 QTLを含む DNA断片として明らかになるに過 ぎない。そしてクローユング可能な大きさの断片、あるいは、形質転換により植物に導 入することが可能な大きさの断片として同定することは容易ではない。また、詳細な遺 伝子地図を作成して地図情報をもとに求める遺伝子を特定し、遺伝子をクローユング する作業には、長い時間と多くの労力が必要となる。実際に、 QTL解析をもとに、量 的形質を増大させる DNA断片がクローユングされた例はほとんどない。
ゲノム DNAライブラリ一作出 、ゲノム断片による形皙転椽枝術
植物由来のゲノム断片のライブラリーを構築する技術は公知である。その際に形質 転換可能なベクターを用いることも公知である。例えば、 40— 80kbの大きな DNA断片 のクロー-ングができ、植物への遺伝子導入が可能なベクターは公知である（Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6535-6540, 1999)。植物由来の個々の特定のクロ ーンとしてのゲノム断片を、高等植物に導入する実験も試みられてきた。しかし、ゲノ ム DNAライブラリーを構成する、機能が未知の、多数のゲノム断片を個別に植物に導 入する試みはこれまでになされて ヽな 、。
[0024] また、ゲノムクローンを利用した場合に、 cDNAを利用する場合と比べ遺伝子の発現 効率が良くなる場合があることも知られている。実際、ある遺伝子（トウモロコシのホス ホエノーノレピノレビン酸カノレボキシラーゼ Phosphoenolpyruvate carboxylase)を含むゲ ノム断片を、植物 (イネ）に導入したところ、極めて高いレベルで外来遺伝子の発現が 認められたことも報告されている（Ku et al. Nature Biotechnol. 17:76-80, 1999)。ま た、 40 - 80 kbのァラビドプシス由来のゲノムクローン 3個を、個別にァラビドプシスに 導入した実験例が報告されている（Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA 96:6535-6540, 1999, Shibata and Liu Trends in Plant Sci 5:354-357, 2000)。うち 2個のクローンは、 これらのクローンに含まれている遺伝子座に突然変異を起こし重力屈性を失ったァラ ビドプシス系統に導入され、欠失して 、た重力屈性が相補されることが確認されて!ヽ る。
[0025] 上記の知見は、生物の遺伝子、とりわけ、多細胞生物の遺伝子は、時間的、空間 的な分布、および、外的刺激などの環境条件により、その発現量が複雑な制御を受 けていること、即ち、何時、どの組織、細胞で、どんな時に、どの程度の発現をするか 1S その遺伝子の重要性を決定していることを示唆する。即ち、これらの高度な遺伝 子制御を含んだ機能を解明するためには、その遺伝子のゲノム断片に含まれている 、プロモーター、イントロン、ェンハンサー、構造遺伝子、スプライシング部位、その他 の高度な遺伝子発現制御機能のすべてを明らかにしなければならない。しかし、この 作業には多大な労力と時間が必要であり、多くの遺伝因子の相互作用を解明するの は困難である。
特許文献 1 : PCT国際公開 WO 03/018808 A
非特許文献 1 : Jordan et al. Trends in Plant Sciences 17:392-398,2002
非特許文献 2 : Dairi et al. Mol Gen Genet 262: 957-964, 2000
非特許文献 3 : Klee et al. Mol Gen Genet 210:282-287, 1987
非特許文献 4 : Olszewski et al. Nucleic Acid Res. 16: 10765-10782, 1988
非特許文献 5 : Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops, p.173, ed. Coors and Pandey, 1999, American Society of Agronomy, Inc. and Crop science Society of America, Inc., Madison, WI, U. S. A.
非特許文献 6 : Fu and Dooner, Proc. Natl Acad Sci USA 99:9573-9578, 2002 非特許文献 7 : Song and Messing, Proc Natl Acad Sci USA 100:9055—9060, 2003 非特許文献 8 : Schwartz, Theor Appl Genet 43:117-120, 1973
非特許文献 9 : Hollick and Chandler, Genetics 150:891-897, 1998
非特許文献 10 : Stuber, Plant Breeding Reviews 12:227-251, 1994
非特許文献 l l : Li and Yuan, Plant Breeding Reviews 17:15—158, 2000
非特許文献 12 : Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA 96:6535-6540, 1999
非特許文献 13 : Ku et al. Nature Biotechnol. 17:76-80, 1999
非特許文献 14 : SWbata and Liu Trends in Plant Sci 5:354-357, 2000
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0026] 本発明は、農業上有益な変異をもたらすことのできる、多数のゲノム DNA断片を効 率良く選抜し、クローン化された DNA断片として選抜し、調製する方法を提供する。
[0027] 本発明は、複数の遺伝因子により発現が向上する形質について、その発現を向上 させるゲノム DNA断片を効率良く選抜、調製する方法を提供する。 [0028] 本発明は、ヘテロシスにおいて発現が認められる形質や量的形質を向上させること のできる、多数のゲノム DNA断片を効率良く選抜し、クローン化された DNA断片とし て選抜し、調製する方法を提供する。
[0029] 本発明は、一代雑種育種法などの手法で避けることができない、育種集団の育成' 改良、自殖系統の育成、一般組合せ能力検定、特定組合せ能力検定、 F1品種の選 出等々の、各々が長期の時間を要する多数のステップを必要とせずに、植物に農業 上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断片を効率良く選抜、調製す る方法を提供する。
[0030] 本発明は、形質発現の機構や、形質を発現させる個々の遺伝子に関する情報がほ とんどな ヽ場合でも、ゲノム DNA断片を導入した導入先植物の表現型のみに基づ ヽ て優良個体を選抜して、植物に農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノ ム DNA断片を効率良く選抜、調製する方法を提供する。
[0031] 本発明は、同種の植物品種間のみならず異種の植物品種間でも、ヘテロシスで見 られる形質向上と同様の発現 (以下「ヘテロシス様発現」と 、う。）を可能にするゲノム DNA断片を効率良く選抜、調製する方法を提供する。
[0032] 本発明は、多大な時間と人手を要することなぐヘテロシス様発現を可能にする多 数のゲノム DNA断片を短期間に効率よく選抜、調製する方法を提供する。
[0033] 本発明は、本発明の方法で調製した、植物に農業上有益となりうる変異をもたらす ことができるゲノム DNA断片もしくはヘテロシス様発現を引き起こすことができるゲノム DNA断片で植物を形質転換することにより、農業上有益となりうる変異を有する植物 を製造する方法、並びに該方法で製造した植物を提供する。
[0034] 本発明は、本発明の方法で調製した、植物に農業上有益となりうる変異をもたらす ことができるゲノム DNA断片もしくはヘテロシス様発現を引き起こすことができるゲノム DNA断片の全部またはその一部をマーカーとして使用し、農業上有益となりうる変異 を有する植物を育成する方法、並びに該方法で育成した植物を提供する。
〔用語の説明〕
本明細書において、「農業上有益な変異」とは、「植物にとって通常もしくは良好な 栽培条件または植物に何らかのストレスの力かる条件下で、植物、特に栽培植物お よび Zまたは観賞用植物において、植物体の少なくとも一部について、量的な増大 または減少、または、その生長速度の増大または減少をもたらす変異」である。ストレ スの力かる条件とは、栽培地の塩濃度、高温、低温、乾燥、病害等を含む。
[0035] このような変異は、通常の栽培条件下で、子実'茎葉等が増大すれば、多収という 形質になるし、病害ストレス等がおよぶ条件下で枯死せず、対照と比して子実'茎葉 等が増大していれば、病害ストレス等に対する抵抗性を意味するからである。内容成 分や、植物体に含まれる酵素等も、当然、「植物体の一部」に包含される。植物体の 全体または部分のサイズの減少も、矮性植物の育種が盛んに行われ、広く栽培され て!、ることから、農業上有益である場合がしばしばある。
[0036] よって、「何らかの栽培条件下で、植物体の少なくとも一部について、量的な増大ま たは減少、または、その生長速度の増をもたらす変異」という概念は、植物体全体の ビガ一 (vigor)が高い、植物体および器官が大きい、収量が高い、生長速度が速い、 病害'虫害に強い、乾燥，高温'低温等さまざまな環境ストレスに対して強い、特定成 分の増'減、特定酵素活性の増'減、矮性化、等々、農業上有益な多くの変異を包含 する。
[0037] また、組織培養技術を用いた無病種苗の生産なども重要な農業技術であるので、 組織培養における細胞増殖能の向上等も、農業上有益な変異と言えることは言うま でもない。
[0038] 本明細書において、「選抜」という用語には、ある被選抜集団に、ある選抜工程を施 したときに、選抜後の集団の要素がゼロとなるケース、すなわち、被選抜集団に、選 抜基準に適合する要素が含まれていないことが判明するケースも含まれるものとする
。これは、選抜基準に適合する要素が含まれていないことを知ることによって、その被 選抜集団の調査にそれ以上の労力'資源を投入することを避けることができるという、 産業上の有用性に鑑みてのものである。
課題を解決するための手段
[0039] 本発明は、以下の (1)ないし (4)および所望により (5)の工程により、植物に農業上 有益となりうる変異をもたらすことができる、ゲノム DNA断片を選抜する方法である。
[0040] (1)まず、植物から、通常用いられて 、る方法によりゲノム DNA断片を単離し、部分 的に制限分解を行い、サイズ分画の後、常法によりゲノム DNAライブラリーを構築す る。
[0041] ゲノム DNA断片を供与する植物には特別の制限はな 、が、好ま 、例として、ゲノ ム DNA断片の導入先植物との交配によって、ヘテロシスが生じうる植物があげられる 。例えば、導入先の植物がジャポニカイネである場合は、野生イネの一種であるオリ ザ'ルフィポゴンや、インディ力イネが好ましい。導入先の植物がトウモロコシの特定 品種である場合は、トウモロコシの他の品種や、野生種のテオシントなどが好ましい 供与元植物の例である。一般的に、類縁関係の遠い植物ほど大きなヘテロシスが観 察されている。従来は類縁関係が遠い場合には、交配が不可能となるため、類縁関 係の遠い植物との組合わせによるへテロシスを利用できなかったのに対し、本発明の 方法では、交配ができない供与元植物のゲノム DNA断片を容易に利用できるので、 類縁関係の遠 、植物も好まし 、供与元植物として利用可能である。
[0042] ゲノムライブラリーの構築に用いるクローユングベクターとしては、種々のベクターが 利用できる。好ましくは、直接、導入先の植物の形質転換に用いることのできるベクタ 一が用いられる。例えば、イネ、タバコ、ァラビドプシス等を形質転換するためには PSB200や pCLD04541 (Tao and Zhang Nucleic Acid Res 26:4901-4909, 1998)が使 用でき、トウモロコシを形質転換するためには pSB25UNpHmが使用できる。
[0043] クローユングする DNA断片は、単一遺伝子座へテロシスの場合には最低 1つの遺 伝子が含まれればよいが、ゲノム中に存在する個々の遺伝子とその発現制御に必要 な領域が内包できるよう、 1 kb以上が好ましぐ 10 kb以上の大きさがさらに好ましぐ さらに好ましくは 20 kb以上、さらに好ましくは 30— 40 kb以上である。いずれにせよ、 DNA断片の大きさにはクローユングベクターに導入できる限り特別の上限はない。こ のような DNA断片サイズを得るための部分的制限分解の方法は公知である。ゲノム DNAライブラリーを構成するクローンの総数、すなわち、ライブラリーのサイズは、植 物ゲノムの多くの遺伝子が含まれるよう充分に大きいことが好ましい。部分的制限分 解に用いる酵素としては、さまざまなものを用いることができる。より偏りの少ない分解 を行うためには、 4塩基認識の制限酵素、例えば、 MboI、 Taqlなどの使用が望ましい 。適当な分解条件を決定する方法は公知であり、例えば、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York, 2001.に詳細な記載がある。
[0044] 理論的には、任意のゲノム断片が当該ゲノム DNAライブラリーにある確率で含まれ るための、クローンの総数は下記の式により計算される。
Figure imgf000013_0001
(式中、
Ρは、任意のゲノム断片が当該ゲノム DNAライブラリーに含まれる確率であり、 fは、クローンに含まれるゲノム断片の平均長/元の植物のゲノムサイズであり、 Nは、ゲノムクローンの総数である）。
[0046] 例えば、イネ由来のゲノム DNAライブラリーの場合、任意のゲノム断片が当該ゲノム DNAライブラリーに含まれる確率を 70%、ゲノム DNAライブラリーの平均断片長を 40 kbとすると、
N=ln(l-0.7)/ln[l-(40 x 103 1 430 x 106 )] = 1.3 x 104
となり 1万 3千個のクローンが必要となる。
[0047] なお、本計算は、単に、多数のクローンを取り扱う意味を例示するために示したもの であり、常にこれだけの数のゲノムクローンを取り扱う必要があるということを示してい る訳ではない。ゲノム DNAライブラリ一中に、植物に農業上有益となりうる変異をもた らすことができるゲノム DNA断片が、複数含まれている場合には、より少数のクローン を調査するだけでも、その中に、求める断片の少なくともひとつが含まれる確率は相 当に高い。
[0048] 個々のクローンに含まれるゲノム断片サイズが大きい場合には、より少数のゲノム断 片数を調査すれば、求めるゲノム断片を獲得することができる。一方、ゲノム断片サイ ズが小さい場合には、その後のクローユング操作等の取扱が容易になり、また、形質 転換によって植物に導入する効率も高くなる。扱う植物のゲノムサイズ、実験の規模 等の要因は総合的に検討して、決定される。
[0049] ゲノムサイズの大きな植物を取り扱う場合には、メチルイ匕された DNA断片を排除す ることによって、発現する遺伝子の内包される DNA断片の頻度を向上させる手法の 利用も有用である。ゲノムサイズの大きな植物には、遺伝子としては機能しない不要 な DNAが多く含まれていると考えられており、そのような DNAはメチル化されているこ とが多 ヽと言われて 、る。メチル化されて ヽる DNAを生化学的に除去する方法は公 知であるし、クロー-ングの際に、メチルイ匕された DNAを除去する性質を持った大腸 菌を用いることによつても、メチル化された DNAの除去が可能である（WO 00/50587)
[0050] ゲノム DNAライブラリーの構築後、ライブラリーを構成するクローンの一部を、大腸 菌に取り込ませて培養する。出現するコロニー数 (プラスミドまたはコスミドベクターの 場合)やプラーク数 (ファージベクターの場合)を計数し、これを元に、ライブラリーに 含まれるクローンの総数を見積もる。さらに、出現したコロニーやファージの一部から 、 DNAを調製し、クローン化された DNA断片の大きさを計測し、平均の断片長を見積 もる。
[0051] (2)ライブラリーを構成する個々のクローンに含まれるゲノム由来の DNAを、個別に 植物に導入する。
[0052] 直接、植物の形質転換に用いることのできるベクター、例えば pSB200、 pCLD04541 、 pSB25UNpHm等のベクターを用いた場合には、個々のクローンをそのまま、形質転 換実験に用いることができる。そうでない場合には、個々のクローンに含まれる DNA 断片の全部または一部を、形質転換用ベクターに移す操作を行った後、形質転換実 験を行うことができる。
[0053] 形質転換に用いる導入先植物は、ゲノム DNAの由来する植物とは異種の植物であ つてもよく、同種の異なる品種であってもよく、同種の同一の品種であってもよい。好 ましい植物の例として、イネ、大麦、小麦、トウモロコシなどの穀物、コーヒー、ココア、 茶、タバコ、等の嗜好品を製造するための植物、野菜類、果物類、花などの観賞用 植物、など実質上制限無く広い範囲の植物があげられる。
[0054] 形質転換の方法は、既存のどのような方法であってもよ!、。例えば、生物的導入法 としてァグロバタテリゥム法など力 物理的導入法としてマイクロインジェクション法、ェ レクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン法、シリコンカーバイド法、エアーインジエタ シヨン法など力 化学的導入法としてポリエチレングリコール法などが知られて 、る。 形質転換によりゲノム DNAは導入先植物のゲノムに組み込まれる。 [0055] 本発明によれば、一つの植物ゲノムライブラリ一力も得られる、ヘテロシス様発現を 引き起しうるゲノム DNA断片は、一つに限られないことが分力つた。そこで、より多く のゲノム断片を選抜するためには、より多くのゲノム断片を、個別に植物に導入する ことが望ましい。また、本発明の選抜方法では、何らかの予備的な選抜工程を含める ことを妨げないが、選抜される候補断片の偏りを排するためには、植物へ導入するゲ ノム DNA断片は、該導入以前に、できるかぎり予備的な選抜工程を含めないことが 望ましい。
[0056] なお、本発明においては、導入するゲノム DNA断片について、当該 DNA断片が、 特に元の植物中にお 、て、どのような表現型に関与して 、るかと!/、つた情報は必要と しない。なぜなら形質転 ^¾物の表現型を選抜することによって初めて、有用なゲノ ム DNA断片が特定される力 である。
[0057] また、植物に導入する各ゲノムクローンについては、その少なくとも一部を増幅およ び Zまたは保管しておく。保管は通常の方法により行ってよぐ純ィ匕された DNA、また は、ゲノムクローンを含む大腸菌等の細菌、酵母等として保管される。
[0058] (3)ゲノム断片が導入された形質転,物は、完全な植物体に再生し、栽培する。
[0059] 再生された形質転換植物、および、その子孫の植物は、植物体全体のビガ一
(vigor),植物体および個別器官の大きさ ·重量、収量、生長速度、病害 '虫害に対す る抵抗性、乾燥 ·高温 '低温等さまざまな環境ストレスに対する抵抗性、特定成分の 増'減、特定酵素活性の増'減、等々、農業上有益なさまざまな形質について評価す る。なお、ビガ一 (vigor)とは、植物体全体の活力や旺盛な生長力のことを言う。
[0060] 本発明にお ヽては、評価する形質は、ゲノム DNA断片供与元の植物や導入された ゲノム DNA断片の特徴などにかかわらず、農業上有用な形質であれば全く制限がな いが、好ましくは、量的形質や、ヘテロシスにより向上が認められる形質であり、また 好ましくは、導入先植物を育種対象とみなした場合に、農業上有用になる形質である
[0061] 評価試験の結果、評価した形質について、当該ゲノム断片を導入しなかった植物と 比較して、表現型が変異した植物を選抜する。例えば、当該ゲノム断片を導入しなか つた植物と比較して、植物体全体のビガ一 (vigor)が高い、植物体および個別器官の 大きぐ重量が高い、収量が高い、生長速度が高い、病害 ·虫害に対する抵抗性が 高い、乾燥 ·高温 '低温等さまざまな環境ストレスに対する抵抗性が高い、特定成分 の増'減、特定酵素活性の増'減、等々を示す植物を選抜することができる。各形質 について、選抜すべき変異の方向は、一方とはかぎらない。例えば、矮性という形質 は、いろいろな作物において育種目標となる重要な農業形質であるので、植物体お よび個別器官の大きさについては、当該ゲノム断片を導入しな力つた植物と比較して より小さくなつた植物も選抜することができる。他の形質についても同様である。
[0062] このような形質は、多くが、いわゆる量的形質であり、遺伝的要因の他、環境的要因 も大きく影響する。ゲノム断片を導入しなカゝつた植物の場合でも、環境要因等のため 、測定値は、あるばらつきを持った分布を示す。本発明により、ゲノム DNA断片をラン ダムに導入した植物の集団では、表現型の変異をもたらすゲノム DNA断片が存在す る場合には、測定値の分布の広がりが大きくなることが期待される。そして、この分布 の端部に位置する測定値を示す植物を選抜することにより、表現型の変異をもたらす ゲノム DNA断片を含む植物を含む小集団を得ることができる。
[0063] このようにして得られた植物、あるいは植物小集団の各々の植物について、子孫の 植物の評価、さらにさまざまな形質に関する反復調査などを行い、変異の認められた 形質の特性、遺伝様式、他の形質等との関連を評価することができ、また、分子生物 学的 ·遺伝学的 ·生化学的'植物生理学的な見地から詳細に評価することができる。 様々な評価の後、新規な品種として農業的に利用することもできる。また、これらの植 物のなかから、さらに優れた形質を示す植物が得られれば、このような植物に導入さ れて 、たゲノム DNA断片を、さらに価値の高!、ゲノム DNA断片として選抜することが できる。
[0064] その際、導入されて!ヽたゲノム DNA断片の解析および取得は、通常のクローニン グの方法により容易に行うことができる。
[0065] (4)選抜された植物に導入されたゲノム DNA断片は、前記のとおりゲノムクローンと して別途保管されており、クローユングベクターを用いて大腸菌で増殖する方法や、 PCR法や LAMP法などの生化学的増殖法を用いて、必要量を製造することができ る。そしてこれらを用いて、塩基配列の決定、含まれている遺伝子、イントロンその他 の遺伝子要素の分析等を詳細に調査することができる。このゲノム断片は、既知の形 質転換手法を用いて、任意の植物に導入することができるので、ゲノム DNA断片が 由来する植物とは異種の植物の品種改良、同種の植物の異なる品種の品種改良、 同種の植物の同一品種の植物の育種に利用することができる。
[0066] (5)このように選抜されたゲノム DNA断片は、必要であれば、その全部または一部を 、再度、同種または異種の植物に導入し、同様な評価を行うことにより、 2次的な選抜 工程に供することができる。この場合、工程 (2)で用いたものと同一のクローユングべ クタ一を用いて形質転換を行ってもょ 、し、別のクローユングベクターを用いてもょ ヽ 。別のクロー-ングベクターを用いる場合には、工程 (4)で選抜されたゲノム DNA断 片をそのベクターにサブクロー-ングすることになる。クロー-ングベクター中のクロ 一-ングに用いる制限部位はクロー-ングベクターにより異なるので、用いる制限酵 素によっては、工程 (4)で選抜されたゲノム DNA断片の一部のみをサブクローユング するのが適当である場合がある。また、クローユングベクターまたはクローユングの方 法によってクローユングできる DNA断片の大きさが異なるので、この理由によっても該 DNA断片の一部のみをサブクローユングするのが適当である場合がある。該 DNA断 片の一部のみを用いて 2次的な選抜工程を実施することの効果のひとつは、該 DNA 断片の一部のみを用いて形質転換を行って、該 DNA断片の全部を用いた場合と同 様な効果を示すことが判明した場合には、工程 (4)で選抜されたゲノム DNA断片中 の不要部分が明らかになることである。 2次的な形質転換によって得られた形質転換 植物、および、その子孫の植物は、植物体全体のビガ一 (vigor)、植物体および個別 器官の大きさ ·重量、収量、生長速度、病害 '虫害に対する抵抗性、乾燥 ·高温 '低温 等さまざまな環境ストレスに対する抵抗性、特定成分の増 ·減、特定酵素活性の増- 減、等々、農業上有益なさまざまな形質について評価する。
[0067] 評価試験の結果、評価した形質にっ 、て、当該ゲノム断片を導入しなかった植物と 比較して、表現型が変異した植物を生じたゲノム DNA断片は、 1次の選抜工程にお ける栽培条件、植物種、等の条件にかかわらず好ましい表現型の変異を植物に生じ ることが可能であり、特に好ましいゲノム DNA断片として選抜できる。 2次以降の選抜 工程においても 1次の選抜工程と同様に、例えば、当該ゲノム断片を導入しなカゝつた 植物と比較して、植物体全体のビガ一 (vigor)が高い、植物体および個別器官の大き さ、重量が高い、収量が高い、生長速度が高い、病害 ·虫害に対する抵抗性が高い、 乾燥 ·高温 '低温等さまざまな環境ストレスに対する抵抗性が高い、特定成分の増- 減、特定酵素活性の増'減、等々を示す植物を選抜することができる。
[0068] 選抜された植物については、子孫の植物の評価、さらにさまざまな形質に関する反 復調查などを行い、変異の認められた形質の特性、遺伝様式、他の形質等との関連 を評価することができる。様々な評価の後、新規な品種として農業的に利用すること ちでさる。
[0069] 2次選抜の結果、再度植物に導入しても農業上有益な変異をもたらすことができる ことが確認されたゲノム DNA断片や、他の植物にも農業上有益な変異をもたらすこと ができることが確認されたゲノム DNA断片が選抜されることになる。したがって、 1次選 抜のみの場合よりも、より価値の高いゲノム DNA断片が選抜されることになる。
[0070] この選抜工程は何度でも繰り返すことができ、その結果、より価値の高 、ゲノム DNA 断片を選抜することができる。
[0071] 選抜されたゲノム DNA断片に含まれる遺伝子の転写物や、それに由来する cDNA の解析、また、ゲノム DNA断片の塩基配列力も推定される遺伝子の特性等を、詳細 かつ総合的に解析することにより、このゲノム DNA断片に含まれる遺伝子機能の推定 や、ヘテロシスを引き起こす機構の解明に有用な知見を得ることができる。
[0072] 以上、ゲノム DNA断片の選抜方法を中心に、本発明を説明したが、本発明はこうし て選抜された植物に農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断 片、当ゲノム DNA断片での形質転換により生じた農業上有益となりうる変異を有する 植物も提供する。特定の DNA断片を植物細胞または植物組織に導入し、該細胞ま たは組織をカルス化し、該カルスを培養しさらに完全植物体に再分ィ匕させる方法は、 既に種々の方法が知られている。例えば、 Hiei et al. Plant J. 6:271-282, 1994を参照 のこと。また、植物によっては、形質転換細胞から顕著なカルス化を経ないで植物体 が再生される場合もあるが、本発明はこの場合にも有効である。再分化した植物を品 種として固定するためには、 Maruta et al. Molecular Breeding 8:273- 284,2001の方 法が知られている。 [0073] 本発明はさらに、本発明のゲノム DNA断片を、植物の品種改良におけるマーカー として
使用する方法にも関する。すなわち、本発明のゲノム DNA断片を有する植物は、植 物の品種改良の効率を高めるために使用できる。品種改良のための使用とは、本発 明のゲノム DNA断片を他の植物に導入するための、ゲノム DNA断片供与用植物と しての使用であってもよぐあるいは交配育種法により品種改良を行うための親植物 としての使用であってもよい。例えば、本発明のゲノム DNA断片を有することが知ら れている植物と、品種改良をすべき植物とを掛け合わせて得られた、後代植物個体 力もゲノム DNAを調製し、該ゲノム DNA中に本発明のゲノム DNA断片が含まれて いるものを選択し、選択した後代植物個体を、特定のゲノム DNA断片の配列情報を 用いて、該 DNA断片をマーカーとすることは公知であり、例えば Komori et al.
Euphytica 129:241- 247,2003等に記載されている。なお、マーカーとしての使用にお いては、ゲノム DNA断片全体をマーカーとしてもよぐ該ゲノム DNA断片の一部に特 有の配列を含むなら、当該一部の配列をマーカーとしてもよい。
[0074] なお、本発明におけるゲノム DNA断片には、温和なまたは苛酷なストリンジェンシ 一の条件下で、本明細書に開示した方法で得られるゲノム断片の塩基配列にハイブ リダィズし、かつ生物学的に活性のある単離された DNA及び RNAも含まれる。苛酷 なストリンジエンシーによるハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、 Molecular Cloning等に記載されている、 0.5M sodium phosphate pH7.2、 1 mM EDTA、 7% SDS 、 1% BSA中で 65°Cでハイブリダィゼーシヨンさせた後、 40 mM sodium phosphate buffer pH7.2、 1 mM EDTA, 5% SDS、 0.5% BSA中、 65°Cで洗浄操作、その後 40 mM sodium phosphate buffer pH7.2、 1 mM EDTA, 1% SDS中、 65°Cで洗浄操作を行うと いう条件、温和なストリンジエンシーによるハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 0.5M sodium phosphate pH7.2、 1 mM EDTA、 7% SDS、 1% BSA中で 55°Cでハイブリ ダイゼーシヨンさせた後、 40 mM sodium phosphate buffer pH7.2、 1 mM EDTA, 5% SDS、 0.5% BSA中で 55°C、 15分を二回、 40 mM sodium phosphate buffer pH7.2、 1 mM EDTA, 1% SDS中で 55°C、 15分を二回、洗浄操作を行うという条件、あるいは、 Molecular Cloningに記載されているように、 30% deionized formamide, 0.6M NaCl, 40 mM sodium phosphate pH7.4, 2.5 mM EDTA, 1% SDS中で 42°Cで、ハイブリダィゼ ーシヨンさせた後、 2XSSC, 0.1% SDS,中で室温で 10分を二回、さらに同じ buffer中で 55°Cで 1時間洗浄操作を行うという条件が挙げられるが、これらに限定されるもので はない。
発明の効果
[0075] 本発明のゲノム DNA断片選抜方法は、従来のゲノム解析の中で塩基配列を既知の 塩基配列と比較検討する方法や、 cDNAの機能推定する方法のように植物の遺伝子 の機能を解明することを必要としない、新しいアプローチでヘテロシスに関与する DNA断片を探索する。
[0076] 本発明のゲノム DNA断片選抜方法は、導入するゲノム DNA断片について、当該
DNA断片が、特に元の植物中において、どのような表現型に関与しているかといった 情報を必要としない、新しいアプローチで農業に有用な形質に関与する DNA断片を 探索する。
[0077] 本発明のゲノム DNA断片選抜方法は、選抜する形質について制限がなぐ農業に 有用な形質について、広範囲に選択することができる。
[0078] 本発明のゲノム DNA断片選抜方法は、ゲノム DNA断片について、導入先植物の表 現型で選抜しているため、選抜されたゲノム DNA断片は、導入先植物の育種にその まま利用することができる。
[0079] 本発明のゲノム DNA断片選抜方法は、ヘテロシス同様の効果を引き起こすゲノム DNA断片を、クローンィ匕された DNA断片として、かつ、植物への形質転換を容易に 行うことができる DNA断片として獲得することを可能にしたため、古典的な育種法によ るへテロシスの利用と異なり、育種に伴う長い時間と多くの労力を必要としない。
[0080] また、本発明のゲノム DNA断片選抜方法は、古典的な育種法によるへテロシスの利 用と異なり、一方の品種のゲノム断片を他方の品種に導入するため、親品種間の生 殖的隔離の制限を受けず、従来の一代雑種育種法では不可能だった植物同士の組 み合わせが可能となる。従って、本発明の DNA断片は、 DNA断片由来の植物と同種 であるか異種であるかを問わず、さまざまな植物に形質転換法により容易に導入し、 育種に利用することができるので、短期間に、効率良くへテロシスの利点を利用する ことが可能である。
[0081] さらにまた、本発明のゲノム DNA断片選抜方法は、 QTL解析と異なり、農業形質に 関与する遺伝子座を探索する必要がないために、長い時間と多大な労力を要するこ となぐ効率よく量的形質を増大または減少させるゲノム DNA断片を選抜することが 可能である。
[0082] また、本発明のゲノム DNA断片は、形質転換によりへテロシス同様の発現を引き起 こす効果があるため、通常の交配育種法においてマーカーとして利用することによつ て、交配後代の選抜効率を非常に高めることができる。
図面の簡単な説明
[0083] [図 1]図 1は、クローユングベクター pSB200の遺伝子地図である。
[図 2]図 2は、クロー-ングベクター pSB25UNpHmの遺伝子地図である。
[図 3]図 3は、穂の大きさの外部観察、一穂の粒数、および、植物全体のビガ一に基 づき選抜された形質転 ^¾物の例と対照植物を示す写真である (世代: TO、被選抜 系統数： 5310)。
[図 4]図 4は、オリザ'ルフィポゴンのゲノム DNA断片を導入して選抜された形質転換 イネの 、もち病抵抗性検定結果を示す図である。
[図 5]図 5は、オリザ'ルフィポゴンのゲノム DNA断片を導入して選抜された形質転換 イネの、ストレス条件下における、葉の伸長量を示す図である。
[図 6]図 6は、オリザ'ルフィポゴンのゲノム DNA断片を導入して選抜された形質転換 タバコのカルスの増殖におけるゲノム DNA断片導入効果を示す図である。
[図 7]図 7は、テオシントのゲノム DNA断片を導入して選抜された形質転 ネの例と 対照植物を示す写真である。
[図 8]図 8は、オリザ ·ルフィポゴンのゲノム DNA断片の PCRによる増幅箇所を示した図 である。
[図 9]図 9は、オリザ.ルフィポゴンのゲノム DNA断片の PCRによる増幅結果の一例を 示す写真である。
[図 10]図 10は、オリザ'ルフィポゴンのゲノム DNA断片から生じる制限酵素断片を電 気泳動させた一例を示す写真である。 [図 11]図 11は、オリザ'ルフィポゴンのゲノム DNA断片を組み込んだ形質転換ベクタ 一の制限酵素断片を電気泳動させた一例を示す写真である。
実施例
[0084] 以下の実施例において、とくに明示しない限り、詳細な実験手順は、 Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc, (Supplements up to No. 59, July 2002, are included) ^または、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.に記載されている。
実施例 1.オリザ，ルフィポゴンからのゲノム DNAの柚出 ゲノム DNAライブラリーの構 農林水産省生物資源研究所より入手した、イネの近縁種オリザ'ルフィポゴンの種 子を用い、温室で栽培したオリザ'ルフィポゴンの葉から、常法によりゲノム DNAを抽 出した。このゲノム DNAを制限酵素 Taqlにより、部分的制限分解を行った後、ショ糖 密度勾配遠心により、 30 kbから 50 kbの画分を調製した。この画分を用いて、コスミド ベクター PSB200の Nsp(7524)V (単に NspVと記す場合もある）切断部位にクローユング を行い、ゲノム DNAライブラリーを構築した。
[0085] PSB200は、 Komari et al. (Plant J. 10:165- 174,1996)に記載された pSBl lより構築し たクロー-ングベクターである。すなわち、トウモロコシ由来のュビキチンプロモータ 一に、ハイグロマイシン耐性遺伝子と、 NOS遺伝子の 3'末シグナル、さらに、
Nsp(7524)V切断部位を pSBl lに付与したものである。 pSB200を用いると、平均断片 長約 40 kb前後のゲノム DNAライブラリーを構築することができる。また、 pSB200は、 高等植物の形質転換用ベクターでもあり、ハイグロマイシン耐性遺伝子を選抜マーカ 一としてさまざまな植物に遺伝子導入をすることができる。
[0086] このライブラリーにおいてクローン化された DNA断片の多くは、約 30 kbから約 50 kb の大きさであり、クローンの総数は、約 8万個であった。なお、用いた大腸菌の菌株は 、 DH5 a、および GeneHogである。
¾ 列 2.オリザ'ルフィポゴン由 のゲノム DNAライブラリーの構成クローンによるジ ャポニ力イネの形皙転椽 上記ゲノム DNAライブラリーの構成クローンを、個別に、ァグロバタテリゥム菌株 LBA4404(pSBl) (Komari et al. 1996)に導入した。導入に用いた方法は、 Triparental mating (Ditta et al. Proc Natl Acad Sci. U.S.A.77:7347— 7351, 1980 )である。これら のァグロパクテリゥムを、個別に、イネ（品種ゆきひかり）に導入した。形質転換法は、 Hiei et al. 1994に従い、未熟胚にァグロバタテリゥムを接種する方法により行った。品 種ゆきひカゝりの未熟胚は、食用に販売されて!ヽる玄米を播種し温室で栽培した植物 、または、温室で栽培したその子孫の植物より得た。
[0087] その結果、上記ゲノム DNAライブラリーに含まれる計 5310個のゲノム DNA断片を、 個別に導入した形質転換植物が得られた。また、それぞれのゲノム DNA断片につい て、 1一 5個体の独立な形質転換体を得た。本明細書では、常法にしたがい、形質転 換された当代の植物を TO世代の植物とよび、その子孫の植物を、世代順に T1世代 の植物、 T2世代の植物等と呼ぶ。
[0088] ここで、この結果を先述した式にあてはめると、 5310=ln(l-P)/ln[l-(40 x 103 1 430 x
106 )]より、 P=0.39となり、これら 5310個のゲノム DNA断片に、任意のオリザ 'ルフィポ ゴン由来のゲノム DNA断片が含まれる確率は 39%である。
¾施例 3.オリザ'ルフィポゴン由 のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断 片によって 転橼されたジャポユカイネの ¾平^^、 の牛じた ti の fe
形質転換植物を温室で栽培し、それぞれの個体について、植物体全体のビガ一、 草丈、相対生長率、穂数、地上部重、穂重、穂長、可稔粒数、収量を調査した。本明 細書において相対生長率とは、単位草丈当たりの 1日の生長量を表し、（(調査終了 日草丈 調査開始日草丈) Z調査期間日数) Z調査開始草丈 によって求められる。 調査の結果、対照植物と比較して、いずれかの形質について変異が認められた植物 を選抜した。表 1から 6および図 3に、選抜された植物の例と、導入されたゲノム DNA 断片に付与した名称を示す。これらの例では、同一のゲノム断片が導入された形質 転換体の中での複数のものが同様な変異を示し、選抜された。各ゲノム断片につい て、選抜された植物の測定値の平均を示す。植物体全体のビガ一の外観観察に基 づき選抜された植物は、多くの場合、何らかの測定数値についても変異が生じてい た。下記の例は、いずれも、植物体全体のビガ一と何らかの測定数値に基づいて、 選抜が行われたものである。
[0089] 下記の例では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。なお GUS遺 伝子を形質転換したイネ（ゆきひかり）を対照植物とした。この正規分布にしたカ^、、 導入断片の効果がな ヽと仮定した場合に、選抜された形質転換植物系統の測定値 を示すような系統が出現する確率を算出した。いずれの場合も、被選抜系統数に対 する、出現確率の数値は著しく小さぐこのような選抜系統が出現する期待値は 1.0を 大きく下回る。したがって、導入断片の効果がないとする仮定は棄却され、選抜系統 が有意な変異を示すことが、統計的に証明された。
[0090] [表 1] 移植後: R目の草丈と植物体全体のビガ一に基づき選抜きれた形質転¾¾物の例と対照植物 (世代： TO、 被選抜系統数 84S)
Figure imgf000024_0001
[0091] [表 2]
移植後 21日目の草丈と植物体全体のビガ一に基づき遷抜された形質転^ S物の例と対照植物 (世代 ： T0、 被選抜系統数 '· 931)
Figure imgf000024_0002
[0092] [表 3] 移植後 14日目から 21日目までの相対生長率と植物体全体のビガ一に基づき選抜 れた 形質 15換植物の例と対照植物 （世代： T0、 被選抜系統数： 841)
[0093] [
Figure imgf000025_0001
[0094] [表 5] 穂重と植物体全体のビガ一に基づき選抜された形質転 ¾W物の例と対照植物
(世代： Τ0、 被選抜系統数： 1464)
区分 導入した 調査個体数 測定値の 導入断片の効果がないと 備考 ゲノム DNA断片 平均 (g) 仮定した場合にこのような
系統が存在しうる確率
選抜された Α036Α03 5 (K 98 0. 00005 独立した形質転換 形質転換植物 (SEQ ID NO : 17 植物の平均値
SEQ ID NO: 18)
選抜された A051E08 3 1. 17 0. 00001
形質転換植物 (SEQ ID NO: 19
SEQ 】D NO：20)
選抜された A023D09 2 1. 31 ひ. 00009
形質転換植物 (SEQ ID NO :21
SEQ ID NO：22)
対照植物 558 0. 55 標準偏差： 0. 30 [0095] [表 6] 穂長と植物体全体のビガ一に基づき選抜きれた形質転 物の例と対照植物
(世代： Τ0、 被選抜系統数： 1464)
Figure imgf000026_0001
[0096] さらに形質転 ^¾物の子孫の植物を栽培し、上記と同様に、植物の評価を行った。
また、 T1世代では、メンデルの法則にしたがって、導入したゲノム DNA断片を含む個 体と含まない個体が分離することが予想されるので、導入断片の有無について、 Polymerase Chain Reaction (PCR)法を用いて調査した。
[0097] 以下の表 7から 9に、選抜された植物の例と、導入されたゲノム DNA断片に付与した 名称を示す。これらの例では、同一の形質転 ^¾物に由来する複数の子孫植物に おいて、 PCR法により導入断片の存在が確認された植物がすべて同様な変異を示し 、PCR法により導入断片が検出されな力つた植物がすべてそのような変異を示さなか つた。また、下記の例では、いずれも植物体全体のビガ一、および、何らかの測定数 値に基づいて、選抜が行われたものである。
[0098] 下記の例では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。なお、対照植 物として、形質転換していないゆきひ力りを用いた。この正規分布にした力^、、導入 断片の効果がな 、と仮定した場合に、選抜された形質転換植物系統の測定値を示 すような系統が出現する確率を算出した。いずれの場合も、被選抜系統数に対する、 出現確率の数値は著しく小さいため、このような選抜系統が出現する期待値は 1.0を 大きく下回る。したがって、導入断片の効果がないとする仮定は棄却され、選抜系統 が有意な変異を示すことが、統計的に証明された。
[0099] [表 7] 4 01S743
移植後 14 H目の草丈と植物体全体のビガ一に基づき選抜された开さ質転 物の例と対照植物 (世代： Tl、 被選抜系統数 114)
Figure imgf000027_0002
[0100] [表 8]
移植後 21日目の草丈と植物体全体のビガ一に基づき選抜された形質転¾¾物の例と対 ¾植物 (世代 ： Π、 被選抜系統数 114)
Figure imgf000027_0003
[0101] [表 9] 移 ffi後 14日目から 21日目までの相対生長率と植物体全体のビガ一に基づき選抜された 形質転換植物の例と対照植物 （世代： Tl、 被選抜系統数： 114)
Figure imgf000027_0001
[0102] 実施例 4. 病害耐件評価等に某づく形皙転槺被物の選抜
実施例 2において作出した形質転換系統の T1世代の植物について、形質転換して Vヽな 、ゆきひ力りおよびコシヒカリを対照植物として比較し、 V、もち病抵抗性の評価を 行い、いもち病抵抗性関連形質に変異が認められた植物を選抜した。さらに、これら の植物に導入されたゲノム DNA断片を、作物に農業的に有益となりうる変異を起こす ことのできるゲノム DNA断片として選抜した。
[0103] 各系統を閉鎖系温室内で播種し、播種後 12日目の苗を移植し、コイトトロン ((株)小 糸製作所)で栽培した。対照品種は各 9個体、形質転換系統は系統当たり 5 ？ 9個 体について、イネいもち病菌 Magnaporthe grisea菌を接種し、罹病度を評価し耐性系 統を選定した。
[0104] 接種源の調整は下記の通り行った。イネいもち病菌株 TSU- 01の菌叢を 10 g/1のシ ョ糖を含むオートミール寒天培地 (Difco)に接種し、 26°C、暗黒下で 3週間培養した。 分生子形成のため、プレートに滅菌蒸留水 10 mlを加え、滅菌した絵筆で菌糸を切断 した後、照明下、 25°Cで 3日間培養した。滅菌蒸留水で 1/2濃度に希釈した LB液体 培地 (Difco) 8 mlをプレートに入れ、滅菌した絵筆で分生子を懸濁した。懸濁液を 2重 のガーゼで濾した後、分生子の濃度を約 2 X 106 conidia/mlに調整した。接種直前に 最終濃度が 0.01%となるように Silwet L-77を接種源に添カ卩した。
[0105] 接種は移植後 19日目の植物の展開した最上位葉に絵筆で接種源を塗布すること により行った。塗布後、直ちに接種葉をプラスチック製のチューブに通し、上下の開 口部に脱脂綿を詰め、蒸留水で十分に湿らせた。 14時間日長、 日中 25°C、夜間 20 °Cで 1週間栽培した。この間、 1日 1回チューブの開口部に詰めた脱脂綿を蒸留水で 湿らせた。接種した葉を切り取り、病斑の数および面積を 0 (無病徴） ？ 3 (葉の大半 に病斑が展開)の罹病度で評価した。
[0106] 罹病性品種の「コシヒカリ」は多くの葉が多数の病斑を形成した。罹病度の平均は 1.5であった。中程度のいもち病抵抗性を有する「ゆきひかり」は「コシヒカリ」に比べ病 斑の形成数が少なく、罹病度の平均は 0.8であった。
[0107] 導入断片の有無についてここでは、各個体力も採取した葉片のノ、イダロマイシン感 受性をもとに判別した。ハイグロマイシン抵抗性をもたない個体、すなわち導入断片 をもたな ヽ個体は分離個体として除き、形質転換個体の罹病度の平均を比較した。 形質転換系統の多くは形質転換していない対照の「ゆきひかり」と同程度の罹病度を 示した。以下に形質転換系統の 13系統について例を示す。 A014D1201、 A020E0401 、 A023F0303および A078C0102は対照の「ゆきひかり」に比べ有意に低い罹病度を 示した (図 4)。特に A078C0102の罹病度の平均は 0であり、導入されたオリザ レフィポ ゴンのゲノム断片により高度のいもち病抵抗性が付与された可能性が示された。 実施例 5.乾燥耐件評価に某づく形皙転槺被物の撰抜
実施例 2において作出した形質転換系統の T1世代 4872系統について、対照植 物として形質転換していないゆきひ力りおよび乾燥耐性品種としての報告がある水原 287 (農林省生物資源研究所から入手)と比較し、乾燥ストレス耐性の評価を行!ヽ、 乾燥ストレス耐性関連形質に変異が認められた植物を選抜した。各系統を閉鎖系温 室内の育苗箱に播種し、 10日後に切葉によるハイグロマイシン抵抗性の検定を行い 各個体ごとに導入断片の有無を調べた。ハイグロマイシン抵抗性を示した個体、すな わち導入断片を含んでいると推定される個体を直径 12cm、高さ 10cmのポリポット（（ 株)東海化成）に栽植した。培土には水稲用育苗土（(株)イングス)を用い、栽植個 体数はポットあたり形質転換体 6個体、対照植物 2個体の計 8個体とした。供試した個 体数は品種 ·系統あたり 12— 18個体 (2— 3ポット）であった。移植して 2週間後（播種し て 4週間後）に給水を中止し、乾燥ストレス処理を開始した。
[0108] 一週間後、形質転換植物の乾燥耐性度を評価した。評価は個体ごとに肉眼で 5段 階評価 (0 :枯死一 5 :完全に回復）とした。各ポット間でのデータのばらつきを補正す るため、各供試個体の評点を同一ポット内のゆきひ力りの評点で引いた値を、各個体 の評点とした。評価結果に基づき、上位 10%を作物に乾燥耐性を付与する可能性 が高 、ゲノム断片を含む植物として選抜した。
[0109] また上記の形質転換植物の中で有望と思われる 4系統については、乾燥処理直前 および処理 1週間後に、各個体の最上位葉の葉長を測定した。処理 1週間後の葉長 力 処理直前の葉長を引いた値を、各個体の乾燥ストレス処理条件下における葉の 伸長量とした。葉長測定後に再給水処理を行い、 4日後に回復度を調査し、ストレス 処理条件下における葉の伸長量を評価した。評価は上述と同様に行ったが、対照植 物として GUS遺伝子のみを導入したゆきひ力り（T2)も加えた。各系統の評点の分布 力 ゆきひかりの評点の分布と差があるかどうかをコルモゴロフ'スミルノフの検定を適 用して解析した。この結果に基づき、供試した 4系統の形質転換体から、ストレス処理 条件下において葉の伸長量が対照植物に比べ有意に多い 1系統を選定した（図 5)。 実施例 6.オリザ ·ルフィポゴン由来のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断 片によって形皙転椽されたトウモロコシの評価 、変異の牛.じた植物の撰
実施例 1にお 、て作成した、オリザ ·ルフィポゴン由来のゲノム断片を含むァグロバ クテリゥムを用いて、トウモロコシの形質転換を行った。形質転換の手法は、 Ishida et al 2003 (Plat Biotechnol. 20:57-66)に従った。導入品種はインブレッド品種 A188 (農 林水産省生物資源研究所より入手)である。また、ベクターとして pSB25UNpHmを用 いて、実施例 1と同様に、ゲノム DNAライブラリー、およびオリザ'ルフィポゴン由来の ゲノム DNA断片を含むァグロバタテリゥムを作成した。これを用いて、上記と同様にト ゥモロコシの形質転換を行った。その結果、上記ゲノム DNAライブラリーに含まれる計 108個のゲノム DNA断片を個別に導入した形質転,物が得られた。
pSB25UNpHmは、 Ishida et al. Nature Biotech 14:745-750, 1996に記載された pSB25 の bar遺伝子のプロモーターを、トウモロコシ由来のュビキチンプロモーターに置き換 え、さらに、 Nsp(7524)V切断部位、 I- Seel切断部位、ト Ceul切断部位を付与したベタ ターである。 pSB25UNpHmは、 pSB200と同様なクロー-ング能力があり、また、 bar遺 伝子を選抜マーカーとして、トウモロコシを始めとするさまざまな植物に遺伝子導入を することができる。
形質転換当代植物 (TO植物）は、イネの場合と同様に温室で栽培し、移植後 28日 目の草丈、 35日目の草丈、相対生長率（ ( (移植後 35日目草丈 移植後 28日目草丈） /7) Z移植後 28日目草丈)、着雌穂節の葉身長、最大穂重量、最大穂粒数、最大 穂全粒重、 1粒重 (最大穂全粒重 Z最大穂粒数)を調査することにより、導入したゲノ ム DNA断片の効果を調査した。なお、季節による生育のむらを補正するため、同一 鉢上げ日の全個体の平均値を算出し、（各個体の値 -平均値) Z平均値の式でデー タを標準化し解析した。また GUS遺伝子を形質転換したトウモロコシ (A188)を対照植 物とした。その結果、 T0植物の各形質の分散のうち、最大穂全粒重、および 1粒重に 関する分散は、対照植物の分散に比べ、有意に大き力つた。これにより、ゲノム DNA 断片を導入した植物の集団では、測定値の分布の広がりが大きくなることが示された
[0111] 下記の例（表 10— 13)では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。
この正規分布にしたがい、導入断片の効果がないと仮定した場合に、選抜された形 質転換植物系統の測定値を示すような系統が出現する確率を算出した。ここに例示 した系統は、いずれの場合も、被選抜系統数に対する、出現確率の数値は著しく小 さいため、このような選抜系統が出現する期待値は 1.0を大きく下回る。最大穂全粒 重について調査した 108系統のうち 5系統で期待値力 を下回る結果であった。した がって、導入断片の効果がないとする仮定は棄却され、選抜系統が有意な変異を示 すことが、統計的に証明された。
[0112] さらに、得られた形質転換トウモロコシを温室で栽培し、別途温室で育成したトウモ ロコシ品種 (A188)の花粉を授粉し種子を得た。この種子に由来する世代をここでは T1世代と記す。 T1世代について各系統につき 5から 8個体を温室内で栽培し、形質 について調査した。 T1世代では、メンデルの法則にしたがって、導入したゲノム DNA 断片を含む個体と含まな 、個体が分離することが予想されるので、導入断片の有無 について、 Polymerase Chain Reaction (PCR)法を用いて調査した。断片の有無は PCR法を用いて調べることができる。（詳細は実施例 16に記載)。断片の有無と調査し た形質の値を比較検討した結果、草丈及び相対生長率において、導入したゲノム DNA断片を含む個体の平均値がその系統の全個体の平均値を上回る系統を見出 すことができた (表 14)。
[0113] これらの結果をもとに、 1つまたは複数の形質について、変異の生じた形質転 ^¾ 物およびその子孫植物を選抜した。さらに、これらの植物に導入されたゲノム DNA断 片を、トウモロコシに農業的に有益となりうる変異を起こすことのできるゲノム DNA断片 として選抜した。
[0114] [表 10] 5743
相対生長率に基づき選抜された形質転換植物（トウモロコシ）の例
(世代 、非選抜系統数 、複数の鉢上げ曰にまたがったデータを統合して用いているためデータは標準化後のもの）
Figure imgf000032_0001
[0115] [表 11]
最大穗穂重に基づき運抜された形質転換 ffi物（トウモ□コシ）の例
(世代 TO.非選抜系铳数 108.複数の鉢上げ日にまたがったデータを統合して用いているためデータは標準化後のもの）
Figure imgf000032_0002
[0116] [表 12] 最大程全粒重に基づき選抜された形質 ¾換植物（トウモ πコシ）の例
〔世代 TU、非選抜系統数 108、複数の鉢上げ日にまたがつだデータを統合して用いているためデータは標準化後のもの）
Figure imgf000032_0003
[0117] [表 13] 最大穂粒数に基づき選抜された形質転換植物（トウモロコシ）の例と対照植物
(世代 TG、^選抜系統数1 、複数の鉢上げ日にまたがつナニデータを銃合して用いているためデータは標準化 ¾のもの）
Figure imgf000032_0004
[0118] [表 14] 選抜ゲノム DMA断片から作成され tマーカ一による該断片の有 Sと形質の閔係
4過目草丈 A0i9D09 断片有無 0 〇 〇 0 全個体平均 0個体平均
(nm) 63 S4 64 67 47 62 65.75 週目草丈 断片有無 ?( 0 0 〇 全個侔平均 O個体平均
(cm) 89 as B2 97 97 95 94 87 90.75 95.33
5遇目草丈 A019D09 断片有無 o 0 0 0 全個体平均 〇個体平均
Lcm) S8 94 95 94 110 76 92.83
6週目草丈 A0i9D09 断片有無 0 0 0 O 全個体平均 〇個体平均
105 1 18 116 132 ί 114 121
4 - 5遇相対生長率 新片有無 0 o Ό 全個体平均 0個体平均
0.06 ひ, 05 0.08 I 0.D66 0.074 遏相対生長率 A014A12 断片有無 0 0 全個^乎 ¾ 0個体平 ¾
0.02 0.03 0.04 0,04 0.02 0.04 0.032 0.04 [0119] 実施例 7.オリザ ·ルフィポゴン由来のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断 片によって形皙転椽されたタバコの評価 、変異の牛.じた植物の撰
実施例 1にお 、て作成した、オリザ'ルフィポゴン由来のゲノム DNA断片を含むァグ ロバクテリゥムを用いて、タバコの形質転換を行った。形質転換の手法は、 Komari Theor Appl
Figure imgf000033_0001
導入品種は SRI (Kodama et al. Plant Physiol 105:601- 605, 1994)である。
[0120] 形質転換したタバコ細胞力 生じたカルスの重量を調査することにより、オリザ'ルフ イボゴンのゲノム DNA断片力 カルスの増殖に及ぼす影響を調査した。形質転換に おいては、タバコの葉をコルクボーラ一でくり貫き作成した葉片ディスクを用いた。な お、ハイグロマイシン耐性遺伝子と GUS遺伝子のみを持つベクター pSB134によって 形質転換したタバコ葉片ディスクを対照とした。ァグロパクテリゥムを接種し、培地で 20日間培養した後、カルス化した葉片ディスクの重量を測定した。図 6に示した通り、 対照に比べ旺盛なカルス増殖を示すゲノム DNA断片を選抜することができた。
[0121] 形質転換植物およびその子孫の植物は、イネ'トウモロコシの場合と同様に温室で 栽培し、植物体全体のビガ一、草丈、相対生長率、葉数、葉長、葉幅、葉重、地上部 重、収量、乾燥耐性、耐塩性、および、耐病性等を調査することにより、導入したゲノ ム DNA断片の効果を判定した。そして、これらの形質のうち、 1つまたは複数の形質 について、変異の生じた形質転,物およびその子孫植物を選抜した。さら〖こ、これ らの植物に導入されたゲノム DNA断片を、タバコに農業的に有益となりうる変異を起 こすことのできるゲノム DNA断片として選抜した。
[0122] 選抜された 14系統の形質転 ^¾物は、 4寸ポットに順ィ匕鉢上げ後、イネ'トウモロコ シの場合と同様に温室で栽培し、最大葉葉長 (鉢上げ後 2週間、 3週間）自然草高（ 鉢上げ後 3週間）、稈長について調査した。なお、 GUS遺伝子を形質転換したタバコ（ SR1)を対照植物とした。その結果、形質転換個体では鉢上げ 2週間後の最大葉葉長 の長いものが多かった。（カイ二乗検定、 P=0.00012)
[0123] [表 15] 形質転換植物（タバコ）の鉢上げ 2週間後の最大葉葉身長の度数分布
： E大葉葉身長 個体数
区分 ゲノム断片形質転換植物 対照
0-17 cm 218 22.673*
18- cm 14 5.23*
*は実際の分離比から求めた期待値
[0124] 下記の例 (表 16-18)では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。
この正規分布にした力 ヽ、導入断片の効果がないと仮定した場合に、選抜された形 質転換植物個体の測定値を示すような個体が出現する確率を算出した。ここに例示 した植物体は、いずれの場合も、被選抜個体数に対する、出現確率の数値は著しく 小さいため、このような選抜個体が出現する期待値は 1.0を大きく下回る。したがって 、導入断片の効果がないとする仮定は棄却され、選抜個体が有意な変異を示すこと 力 統計的に証明された。
[0125] [表 16] 移植 2週問後の最大葉葉長に基づき違抜された形質転換植物 (タバコ）の例と対照植物
(世代 T0、非選抜個体数 172、対照植物の上位 70%の分布に基づき計算）
(活着が悪い個体を含むと分布が歪むので下位 30>½は除外）
Figure imgf000034_0001
[0126] [表 17] 移植 3週間後の最大葉葉長に基づき選抜された形質転換植物（タバコ）の例と対照植物 (世代 Τ0、非選抜個体数 172、対照植物の上位 70%の分布に基づき計算）
(活着が悪い個体を含むと分布が歪むので下位 30%は除外）
Figure imgf000034_0002
[0127] [表 18] 移植 3週間後の自然草高に墓づき選抜され 形質転換植物（タ/ コ）の例と対照植物 (世代 TO,非選抜個体数 172、対照植物の上位 7C¾の分布に基づき計算）
(活着が悪い S体を含むと分布が歪むので下位 30«½は賒外〕
Figure imgf000035_0001
[0128] 実施例 8.ァラビドプシス由来のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断片に よって形皙転椽されたイネの評価 、変異の牛.じた植物の撰
オリザ ·ルフィポゴンの場合と同様に、ァラビドプシス（Arabidopsis thaliana)力らゲノ ム DNAを単離し、ゲノム DNAライブラリーを構築し、このゲノム DNAライブラリーを構成 するゲノムクローンを個別に、形質転換法によりイネ（ゆきひかり）に導入した。その結 果、上記ゲノム DNAライブラリーに含まれる計 1477個のゲノム DNA断片を個別に導 入した形質転換植物が得られた。用いたァラビドプシスのェコタイプは Columbiaであ り、この種子は、国際的なァラビドプシス遺伝資源バンク (例えば、 RIKEN
Bioresource Center)力も入手することができる。形質転^ ¾物およびその子孫の植 物は、オリザ'ルフィポゴン由来のゲノム DNAライブラリーの場合と同様に、温室で栽 培し、植物体全体のビガ一、草丈、相対生長率、穂数、地上部重、穂重、穂長、可稔 粒数、収量、葉数、葉長、葉幅、葉重、乾燥耐性、耐塩性、および、耐病性等を調査 することにより、導入したゲノム DNA断片の効果を判定した。なお、 GUS遺伝子を形質 転換したイネ（ゆきひかり）を対照植物とした。そして、これらの形質のうち、 1つまたは 複数の形質につ!、て、変異の生じた形質転換植物およびその子孫植物を選抜した。 選抜された植物に導入したゲノム DNA断片を、作物に農業的に有益となりうる変異を 起こすことのできる、ァラビドプシス由来のゲノム DNA断片として選抜した。
[0129] 下記の例（表 19)では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。この 正規分布にしたがい、導入断片の効果がないと仮定した場合に、選抜された形質転 掘直物系統の測定値を示すような系統が出現する確率を算出した。ここに例示した 系統は、いずれの場合も、被選抜系統数に対する、出現確率の数値は著しく小さい ため、このような選抜系統が出現する期待値は 1.0を大きく下回る。全穂重について 調査した 1477系統のうち 13系統で期待値力 を下回る結果であった。したがって、 導入断片の効果がな 、とする仮定は棄却され、選抜系統が有意な変異を示すことが 、統計的に証明された。
[0130] [表 19] 全穂重に基づき運抜された形質転換植物（イネ）の例と対照植物
(世代 TC、非選抜系統数 UT7)
Figure imgf000036_0001
[0131] ¾施例 9.ローズグラス由 のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断片によ つて形皙転椽されたイネの評価 、変異の牛.じた植物の選抜
オリザ.ルフィポゴンの場合と同様に、ローズグラス（Chloris gayana)からゲノム DNA を単離し、ゲノム DNAライブラリーを構築し、このゲノム DNAライブラリーを構成するゲ ノムクローンを個別に、形質転換法によりイネ（ゆきひかり）に導入した。その結果、上 記ゲノム DNAライブラリーに含まれる計 1450個のゲノム DNA断片を、個別に導入し た形質転換植物が得られた。用いたローズグラスの品種は、力リーデとして市販され ているものである。形質転換植物およびその子孫の植物は、オリザ'ルフィポゴン由 来のゲノム DNAライブラリーの場合と同様に、温室で栽培し、植物体全体の植物体全 体のビガ一、草丈、相対生長率、穂数、地上部重、穂重、穂長、可稔粒数、収量、葉 数、葉長、葉幅、葉重、乾燥耐性、および、耐病性等を調査することにより、導入した ゲノム断片の効果を判定した。なお、 GUS遺伝子を形質転換したイネ（ゆきひかり）を 対照植物とした。そして、これらの形質のうち、 1つまたは複数の形質について、変異 の生じた形質転換植物およびその子孫植物を選抜した。選抜された植物に導入した ゲノム DNA断片を、作物に農業的に有益となりうる変異を起こすことのできる、ローズ グラス由来のゲノム DNA断片として選抜した。
[0132] 下記の例（表 20)では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。この 正規分布にしたがい、導入断片の効果がないと仮定した場合に、選抜された形質転 掘直物系統の測定値を示すような系統が出現する確率を算出した。ここに例示した 系統は、いずれの場合も、被選抜系統数に対する、出現確率の数値は著しく小さい ため、このような選抜系統が出現する期待値は 1.0を大きく下回る。全穂重について 調査した 905系統のうち 23系統で期待値力 1.0を下回る結果であった。したがって、導 入断片の効果がな 、とする仮定は棄却され、選抜系統が有意な変異を示すことが、 統計的に証明された。
[0133] [表 20] 全穂重に基づき選抜された肜 K転換植物（イネ)の例と対照植物
(世代 Τ0、非選抜系統数 905)
Figure imgf000037_0001
[0134] 実施例 10.ソルガム由来のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断片によつ て形皙転椽されたイネおよびトウモロコシの評価 、変異の牛.じた植物の撰
オリザ ·ルフィポゴンの場合と同様に、ソルガム (Sorghum bicolor)からゲノム DNAを単 離し、ゲノム DNAライブラリーを構築し、このゲノム DNAライブラリーを構成するゲノム クローンを個別に、形質転換法によりイネ（ゆきひ力り）、およびトウモロコシ (A188)に 導入した。その結果、それぞれ 2560個、 200個の上記ゲノム DNAライブラリーに含ま れるゲノム DNA断片を、個別に導入した形質転,物が得られた。用いたソルガム の品種は、ゴールドソルゴ一として市販されているものである。形質転^ ¾物および その子孫の植物は、オリザ'ルフィポゴン由来のゲノム DNAライブラリーの場合と同様 に、温室で栽培し、植物体全体のビガ一、草丈、相対生長率、穂数、地上部重、穂 重、穂長、可稔粒数、収量、葉数、葉長、葉幅、葉重、乾燥耐性、および、耐病性等 を調査することにより、導入したゲノム DNA断片の効果を判定した。そして、これらの 形質のうち、 1つまたは複数の形質について、変異の生じた形質転換植物およびそ の子孫植物を選抜した。選抜された植物に導入したゲノム DNA断片を、作物に農業 的に有益となりうる変異を起こすことのできる、ソルガム由来のゲノム DNA断片として 選抜した。
[0135] 下記にイネの全穂重についての例を示す (表 21)。下記の例では、対照植物の測 定値の分布を正規分布にあてはめた。なお、 GUS遺伝子を形質転換したイネ（ゆきひ かり）を対照植物とした。この正規分布にしたがい、導入断片の効果がないと仮定し た場合に、選抜された形質転換植物系統の測定値を示すような系統が出現する確 率を算出した。ここに例示した系統は、いずれの場合も、被選抜系統数に対する、出 現確率の数値は著しく小さいため、このような選抜系統が出現する期待値は 1.0を大 きく下回る。全穂重について調査した 2504系統のうち 43系統で期待値力 を下回る 結果であった。したがって、導入断片の効果がないとする仮定は棄却され、選抜系統 が有意な変異を示すことが、統計的に証明された。
[0136] [表 21] 全穗重に基づき選抜された形質転換植 (イネ)の例と対照植物
(世代 T0、 選抜系統数 2504)
Figure imgf000038_0001
[0137] また、ソルガムの断片を導入したトウモロコシについて、形質転換当代植物の移植 後 28日目の草丈、 35日目の草丈、相対生長率（（ (移植後 35日目草丈 移植後 28日 目草丈) /7) Z移植後 28日目草丈)、着雌穂節の葉身長、最大穂重量、最大穂粒 数、最大穂全粒重、 1粒重 (最大穂全粒重 Z最大穂粒数)の分散について検討した 結果、相対生長率、最大穂粒数、 1粒重に関する分散は、対照植物の分散に比べ有 意に大きいことが判明した。なお、季節による生育のむらを補正するため、同一鉢上 げ日の全個体の平均値を算出し、（各個体の値 -平均値) Z平均値の式でデータを 標準化し解析した。
[0138] 下記の例（表 22— 27)では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。
なお、 GUS遺伝子を形質転換したトウモロコシ (A188)を対照植物とした。この正規分 布にしたがい、導入断片の効果がないと仮定した場合に、選抜された形質転,物 系統の測定値を示すような系統が出現する確率を算出した。ここに例示した系統は、 いずれの場合も、被選抜系統数に対する、出現確率の数値は著しく小さいため、こ のような選抜系統が出現する期待値は 1.0を大きく下回る。調査した 150系統のうち相 対生長率については 7系統で、最大穂粒数については 8系統で期待値が 1.0を下回 る結果であった。したがって、導入断片の効果がないとする仮定は棄却され、選抜系 統が有意な変異を示すことが、統計的に証明された。
[0139] これらの結果に基づき、ソルガムに由来するゲノム DNA断片を、トウモロコシに農業 的に有益となりうる変異を起こすことのできるゲノム DNA断片として選抜した。
[0140] [表 22] 移植後 28ョ目草丈に基づき選抜された形質転換植物（トウモロコシ）の例
(世代 T0、非選抜系統数 150、複数の鉢上げ曰にまたがったデータを統合して用いているため亍一タは標準化後のもの〕
Figure imgf000039_0002
[0141] [表 23] 相対生長率に基づき選抜された形質転換植物（トウモロコシ）の例
(世代 Τ 非選抜 ¾铳数 150、複数の鉢上げ日にまたがつ fcデータを铳合して用いている めデータは標準化後のもの）
Figure imgf000039_0003
[0142] [表 24] 最大 ¾穗重に fiづき選抜された形質転換植物（トウモロコシ）の例
(世代 TO,非選抜系統数 ί 50、複数の鉢上げ曰にまたがったデータを統合して用いているためデータは標準化 ¾のもの）
Figure imgf000039_0004
[0143] [表 25] 最大穂全粒重に基づき選抜された形質転換植物 (トウモロコシ)の例
(世代 TO、非選抜系統数 1 S0.複数の鉢よげ曰にまたがったデータを統合して用いているためテ―タは標準化 のもの）
Figure imgf000039_0001
[0144] [表 26] 最大穂粒数に基づき S抜された形質転換植物 (トウモロコシ)の例
(世代 TO、非遷抜系铳数 150、複数の鉢上げ日【こまたがったデータを統合して用いているため丁—タは標 匕後のもの）
Figure imgf000040_0001
[0145] [表 27] 葉身長に基づき選抜された形質転換植物 (トウモロコシ)の例
(世代丁 0、非選抜系統数 150、複数の鉢上げ日にまたがったデータを統合して用いているため丁—タば標準化後のもの）
Figure imgf000040_0002
[0146] 実施例 11.テオシント由 のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断片によ つて形暂転橼されるイネの評価 里の牛じた槭物の選
オリザ'ルフィポゴンの場合と同様に、テオシン KZea diploperenis)からゲノム DNAを 単離し、ゲノム DNAライブラリーを構築し、このゲノム DNAライブラリーを構成するゲノ ムクローンを個別に、形質転換法によりイネ（ゆきひかり）に導入した。その結果、上記 ゲノム DNAライブラリーに含まれる計 1608個のゲノム DNA断片を、個別に導入した 形質転換植物が得られた。用いたテオシントの品種は、牧草用テオシントとして巿販 されているものである。形質転^ t物およびその子孫の植物は、オリザ.ルフィポゴン 由来のゲノム DNAライブラリーの場合と同様に、温室で栽培し、植物体全体のビガ 、草丈、相対生長率、穂数、地上部重、穂重、穂長、可稔粒数、収量、葉数、葉長、 葉幅、葉重、乾燥耐性、および、耐病性を調査することにより、導入したゲノム DNA断 片の効果を判定した。そして、これらの形質のうち、 1つまたは複数の形質について、 変異の生じた形質転換植物およびその子孫植物を選抜した。選抜された植物に導 入したゲノム DNA断片を、作物に農業的に有益となりうる変異を起こすことのできる、 テオシント由来のゲノム DNA断片として選抜した。なお、 GUS遺伝子を形質転換した イネ（ゆきひかり）を対照植物とした。テオシントのゲノム断片導入後のイネの栽培状 況を図 7に示す。 実施例 12.スーダングラス由来のゲノム DNAライブラリ一に含まれるゲノム DNA断片 によって形皙転椽されたイネの評価 、変異の牛.じた植物の撰
オリザ.ルフィポゴンの場合と同様に、スーダングラス (Sorghum Sudanese)からゲノム DNAを単離し、ゲノム DNAライブラリーを構築し、このゲノム DNAライブラリーを構成す るゲノムクローンを個別に、形質転換法によりイネ（ゆきひかり）に導入した。その結果 、上記ゲノム DNAライブラリーに含まれる計 2644個のゲノム DNA断片を、個別に導 入した形質転換植物が得られた。用いたスーダングラスの品種は、牧草用として市販 されているものである。形質転^ ¾物およびその子孫の植物は、オリザ'ルフィポゴン 由来のゲノム DNAライブラリーの場合と同様に、温室で栽培し、植物体全体のビガ一 、草丈、相対生長率、穂数、地上部重、穂重、穂長、可稔粒数、収量、葉数、葉長、 葉幅、葉重、乾燥耐性、耐塩性、および、耐病性等を調査することにより、導入したゲ ノム DNA断片の効果を判定した。そして、これらの形質のうち、 1つまたは複数の形質 について、変異の生じた形質転換植物およびその子孫植物を選抜した。選抜された 植物に導入したゲノム DNA断片を、作物に農業的に有益となりうる変異を起こすこと のできる、スーダングラス由来のゲノム DNA断片として選抜した。
[0147] 下記の例（表 28)では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。なお 、 GUS遺伝子を形質転換したイネ（ゆきひかり）を対照植物とした。この正規分布にし たがい、導入断片の効果がないと仮定した場合に、選抜された形質転換植物系統の 測定値を示すような系統が出現する確率を算出した。ここに例示した系統は、いずれ の場合も、被選抜系統数に対する、出現確率の数値は著しく小さいため、このような 選抜系統が出現する期待値は 1.0を大きく下回る。全穂重について調査した 2644系 統のうち 21系統で期待値が 1.0を下回る結果であった。したがって、導入断片の効果 カ いとする仮定は棄却され、選抜系統が有意な変異を示すことが、統計的に証明 された。
[0148] [表 28] 全 ¾重に基づき選抜された形質耘換植物:イネ）の例と対照植物
Figure imgf000042_0001
[0149] 実施例 13.ミレット由夹のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断片によって 形皙転橼されたイネの評価 栾虽の牛 た槭物の撰
オリザ.ルフィポゴンの場合と同様に、ミレット (Seteria italica)からゲノム DNAを単離し 、ゲノム DNAライブラリーを構築し、このゲノム DNAライブラリーを構成するゲノムクロ ーンを個別に、形質転換法によりイネ（ゆきひかり）に導入した。その結果、上記ゲノ ム DNAライブラリーに含まれる計 2952個のゲノム DNA断片を、個別に導入した形質 転 m¾物が得られた。用いたミレットの品種は、牧草用として市販されている極早生 イタリアンミレット Rである。形質転換植物およびその子孫の植物は、オリザ'ルフイボ ゴン由来のゲノム DNAライブラリーの場合と同様に、温室で栽培し、植物体全体のビ ガー、草丈、相対生長率、穂数、地上部重、穂重、穂長、可稔粒数、収量、葉数、葉 長、葉幅、葉重、乾燥耐性、および、耐病性等を調査することにより、導入したゲノム DNA断片の効果を判定した。そして、これらの形質のうち、 1つまたは複数の形質に ついて、変異の生じた形質転換植物およびその子孫植物を選抜した。選抜された植 物に導入したゲノム DNA断片を、作物に、農業的に有益となりうる変異を起こすこと のできる、ミレット由来のゲノム DNA断片として選抜した。
[0150] 下記の例（表 29)では、対照植物の測定値の分布を正規分布にあてはめた。なお 、 GUS遺伝子を形質転換したイネ（ゆきひかり）を対照植物とした。この正規分布にし たがい、導入断片の効果がないと仮定した場合に、選抜された形質転 m«物系統の 測定値を示すような系統が出現する確率を算出した。ここに例示した系統は、いずれ の場合も、被選抜系統数に対する、出現確率の数値は著しく小さいため、このような 選抜系統が出現する期待値は 1.0を大きく下回る。全穂重について調査した 1126系 統のうち 15系統で期待値力 S1.0を下回る結果であった。したがって、導入断片の効果 カ いとする仮定は棄却され、選抜系統が有意な変異を示すことが、統計的に証明 された。
[0151] [表 29] 全穂重に基づき選抜された形質転換植物 (イネ)の例と対照植物
(世代 T 非選抜系統数 1 126)
Figure imgf000043_0001
[0152] ¾施例 ί4.ギ-ァグラス由 のゲノム DNAライブラリーに含まれるゲノム DNA断片に よって形皙転橼された ti 物の評^^、 虽の牛じた ti 物の撰
オリザ ·ルフィポゴンの場合と同様に、ギ-ァグラス (Panicum maximum)からゲノム DNAを単離し、ゲノム DNAライブラリーを構築し、このゲノム DNAライブラリーを構成す るゲノムクローンを個別に、形質転換法によりイネ、トウモロコシ、および、タバコに導 入した。用いたギ-ァグラスの品種は、牧草用として市販されているカラードギ -ァグ ラスである。形質転^ ¾物およびその子孫の植物は、オリザ'ルフィポゴン由来のゲノ ム DNAライブラリーの場合と同様に、温室で栽培し、植物体全体のビガ一、草丈、相 対生長率、穂数、地上部重、穂重、穂長、可稔粒数、収量、葉数、葉長、葉幅、葉重 、乾燥耐性、耐塩性、および、耐病性等を調査することにより、導入したゲノム DNA断 片の効果を判定した。そして、これらの形質のうち、 1つまたは複数の形質について、 変異の生じた形質転換植物およびその子孫植物を選抜した。選抜された植物に導 入したゲノム DNA断片を、イネ、トウモロコシ、または、タバコに、農業的に有益となりう る変異を起こすことのできる、ギ-ァグラス由来のゲノム DNA断片として選抜した。 実施例 15 選抜されたゲノム DNA断片を铸型とした PCRによるゲノム DNA断片の製 選抜されたゲノム DNA断片（AS4(A011D07)、 AS8(A014E08)、 AS19(A010B03)、 AS20(A011C02)、 AS22(A014D12)、 AS27(A012D12)、 AS28(A015C06)、
AS30(A016D02))について、末端塩基配列を解読した。解読した配列およびベクター 配列に対してプライマーを設計し、大腸菌力 単離したプラスミド DNAをテンプレート に用いて、 T-DNA領域の両末端部が存在することを確認するための PCR (図 8の PCR1および PCR3)を行った。
[0153] PCR1および PCR3に用いたベクター領域プライマーの配列は、それぞれ、
5' - CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG - 3'
および
5' - AACTGCACTTCAAACAAGTGTGAC - 3'
である。
[0154] PCR1に用いたゲノム DNA断片特異的プライマーの配列は、
AS4： 5' - GATTCCGACCTCTACACGAACAAC - 3'
AS8： 5' - AGAAACCCTAGCCGTCACTTCCCT - 3'
AS19： 5' - TCAAGTCATTTCACAAAGTCGGAC - 3'
AS20： 5' - GCTTAGAGGTGAAAATGGTAACGG - 3'
AS22： 5' - TTCTGTCCTTGTTCGATTTGTCAG - 3'
AS27： 5' - CCGGATTCACCGTGGTACGAAAGG - 3'
AS28： 5' - TTCCAATTACCAGACACTAAAGCG - 3'
AS30： 5' - TGGCACCAGACTTGCCCTCCAATG - 3'
である。
[0155] PCR3に用いたゲノム DNA断片特異的プライマーの配列は、
AS4： 5' - GTACGGCCTGGGTCACTCACTGTC - 3'
AS8： 5' - TCATCATCCTGTTATCTAGACTCC - 3'
AS19： 5' - TACTTATTCCGTGAGTCGGAAGCG - 3'
AS20： 5' - TCCAGTGTTATGATGTTTGGGCTG - 3'
AS22： 5' - AACTCATCTTTAATCCCAGTTTGC - 3'
AS27： 5' - TAACGCCATAAACAAGTGTCACTC - 3'
AS28： 5' - GAACTGTGAAACTGCGAATGGCTC - 3'
AS30： 5' - AAATCCACACGACTCTCGGCAACG - 3'
である。 [0156] また、 AS4、 AS8および AS22については、断片中央部が存在することを確認するた めの PCR (図 8の PCR2)も行った。用いたプライマーの配列は、以下の通りである。 AS4： 5' - TGGGCTCCAGCAGAAACGAACCCT - 3' および 5' - CTTATATTTAGGAACGGAGTGAGT - 3'
AS8： 5' - AAGCGAAGGCACCCCTTCACAT - 3' および 5' - ACGAGGAGCCCGACAAGGAGAC - 3'
AS22： 5' - TGAAATACCACTCATGAACTTCCG - 3' および 5' - ATTATCTGTTGTGTCCGAAATGTG - 3'
いずれの PCRも、 Takara ExTaq (TAKARA社）または Takara LA Taq (TAKARA社）を 用いて、熱変性 (94°C、 30秒間）、アニーリング (58°C、 30秒間）および伸長反応（72°C 、 30秒間）からなるサイクルを 30回または 35回繰り返した。 PCR産物は、ァガロースゲ ル電気泳動により、解析した。
[0157] PCR解析の結果を、図 9に示す。 PCR1、 PCR2および PCR3のいずれについても、各 ゲノム DNA断片のプラスミド DNAをテンプレートに用いた場合には、 目的の大きさの PCR産物が観察された。一方、 pSB200をテンプレートに用いた場合には、当該産物 は観察されな力つた。これらの結果から、 pSB200に導入された各ルフィポゴン断片を 、 PCRにより製造できることが示された（図 9)。
¾施例 ί6 撰 された断片のマーカー しての禾 II用
実施例 3により評価され、イネに変異を生じさせたゲノム DNAを、実施例 6によりトウ モロコシに形質転換した。得られた形質転換トウモロコシを温室で栽培し、別途温室 で育成したトウモロコシ品種 A188の花粉を形質転換トウモロコシに授粉した。得られ た後代種子は、オリザ'ルフィポゴンのゲノム DNA断片を含む個体と含まな 、個体が 分離してくることが予想される。そこで導入されたゲノム DNA断片の T-DNAの境界配 列部分をマーカーとし、 PCR法により増幅しオリザ'ルフィポゴン由来のゲノム DNA 断片の有無を調べた。その結果、該マーカーを有する植物個体は、品種育成に適し 、さらなる育種工程に利用可能と判断され、該マーカーを有しない植物個体は品種 改良に不適と判断された。
[0158] 表 30に導入ゲノム DNA断片の有無と形質の測定値の関係を示す。 [0159] [表 30] 抜ゲノム 断片から作成されたマーカーによる該靳片の有無と形質の関係
Figure imgf000046_0001
[0160] 実施例 1 7 大腸菌》用いた遝 fe^れたゲノム DNA断片の製诰方法
形質転換されたゲノム DNA断片を含むクローユングベクター (PSB200)を含む大腸 菌が個別に 80度で保存されたグリセロールストックから、大腸菌をかきとり、 LA(Sp50 )プレート上、 28°Cで 3日間培養を行い、シングルコロニーを生育させた。生育したシ ンダルコ口-一を LB (Sp50)液体培地 2mlに植菌し、 28°Cでー晚振とう培養後、培養 液を 1.5mlのマイクロチューブに移し、 15000rpmで 2分間遠心操作を行い、集菌を行 つた。上清を捨て、菌のペレットから常法 (アルカリ法）に従ってプラスミドを単離し、 ΤΕ40 μ 1にプラスミド DNAを溶解させ、選抜されたゲノム DNA断片並びにクローニン グベクターを含むゲノム DNA断片を得た。
実施例 18 製诰されたゲノム DNA断片 制限分解する丁-程を含す eDNA断片の製 i告 去
実施例 17で調整したプラスミド DNA (クローン名： AS88、 AS90、 AS95— AS102、 AS104— AS106)を使用し、以下の成分からなる反応液を調整した。
[0161] 各プラスミド DNAは、次のゲノム DNA断片をそれぞれ含むものである。 (A018D06,
A047C01, A082B03, A082B06, A083A01, A083A02, A083H04, AO84H05, A088A12, A091E11, A049B03, A080C09, A088C09)
プラスミド DNA 4 μ 1
ΙΟχ Μバッファ^ (タカラ） 2 μ 1
Hindlll 0.5 μ 1
Sacl 0.5 μ 1 RNaseA 0.1 ^ 1
滅菌水 12.9 u l
トータル 20 μ 1
37°Cで 1時間反応した後、反応液に 6x色素を 4 1カ卩えて混合し、 6 1を用いて 0.7% ァガロースゲルによる電気泳動（100V、 1時間）に供試した。泳動終了後、ゲルを EtBr で染色し、各ゲノムクローン力も生じる制限酵素断片を得た。その 1例を図 10に示す 実窗列 19 大腸菌を用いて 告されたゲノム DNA断片の形皙転椽用ベクター (DSB200)への組み込み
大腸菌より単離'精製したプラスミド DNA (ゲノム DNA断片 G001A03)を用いて、 GATEWAYテクノロジー (Invitrogen社）キット添付のプロトコールに従って BP反応（25 。C、ー晚）を行い、 Proteinase K処理後、エタノールをカ卩えてプラスミド DNAを沈殿さ せた。遠心（15000rpm)処理後、得られた沈殿を 70%エタノールで洗浄し、 TE10 μ 1で 溶解させた。このうちの 2 1を用いてエレクト口ポレーシヨンによりプラスミドを大腸菌 DB3.1に導入し、 LA (Sp50Cm30)にプレーティングして 28°Cで 3日間培養を行った。 生育したシングルコロニーを LB (Sp50Cm30) 2mlで培養し、定法（アルカリ法）に従つ てプラスミド DNAを単離し、 Hindlllおよび Saclを用いてフラグメント解析を行い、 目的 プラスミドの選抜を行つた。 BP反応により aatB 1 - HPT- aatB2断片は
aatRl- ccdB- Cm- aatR2断片に置換されてベクターサイズが 9.8kbから 10.4kbへと変 わるため、これを指標にして組換プラスミド（G001A03DEST)の選抜を行った（図 11レ ーン 2)。
次に、上記で選抜したプラスミド G001A03DESTを用いて、 BP反応と同じ条件で LR 反応を行 、、薬剤選抜マーカー遺伝子が置換されたクローン G001A03barの選抜を 行つた。 LR反応により aatRl- ccdB- Cm- aatR2断片は aatB lbar- aatB2断片に置換され てベクターサイズが 10.4kbから 9.3kbへと変わるため、これを指標にして G001A03bar の選抜を行った（図 11レーン 3)。以上により、 目的とする選抜断片を植物へ形質転 換可能なベクターに組み込むことに成功した。
実施例 20.撰抜されたゲノム DNAクローンの解析 選抜されたゲノム DNA断片の両端 280— 500塩基分の塩基配列を調査した。その 結果も表 1から 9および図 3の各々のゲノム DNA断片に対応する配列番号により示さ れている。また、これらの断片を PCR法により検出することのできる、 PCR用プライマー ペアの配列を以下の表 31に示す。
[表 31- 1] 選抜された、 オリザつレフィポゴンのゲノムに由来するゲノム DNA断片の例と、 それを検出す ることができる KR用プライマ一ペア
選抜され 検出用プライマーペア I 検出用プライマ一ペア 2
たゲノム
DNA断片
A029B04 5 ' -TCGAATTTGACCATGAGATACAGA- 3 ' 5 ' - TCGAGCTAATTAACTAGCCAAGTG - 3 '
(配列番 47) (配列番号 49)
5 ' -AAGAAAAAAATGCTTGTGTACTGA- 3 ' 5 ' -AAGTAACATGAGAAAAAAAAACAT-3 '
(配列番¾ 48) (配列番号 50)
A028C04 5 ' -TCGATTAAGACAGCAGGACGGTGG- 3 ' 5 ' - TCGAGGGCGTTGCGCCCCCGATGC - 3 '
(配列番号 51) (配列番号 53)
5 ' -GCAAGTGCCGTTCACATGGAACCT- 3 ' 5 ' -CCGTCTTGAAACACGGACCAAGGA-3 '
(配列番号 52) (配列番号 5 )
A048F12 5 ' -TCGATGTAGTCCTCCTCGAGGCCG- 3 ' 5 ' - TCGAGTGGTCGGCGTCCCCCGGCC - 3 '
(配列番号 55) (配列番号 57)
5 ' -CAACAACCGAGCAATACAGTTCAA- 3 ' 5 ' - CCGGAGTTCACCATGCCCCGGGGC - 3 *
(配列番 56) (ffi列番号 58)
A049A01 5 ' -TCGAACTAACGCTAACAACGTGCA- 3 ' 5 ' -TCGAGTGCCATCCTCTTCTCAATG-3 '
(配列番号 59) (配列番号 61)
5 ' -ATTTGGCGCATCTGAACACTGAAC- 3 ' 5 ' -GTTTTTGTTCGTTACAATGAGAAC - 3 '
(配列番号ら ώ (配列番号 62)
A046A06 5 ' -TCGAACTACCGAGCTCCCCCTAAT- 3 ' 5 ' - TCGAACTTGTCTTCCAATTTGCG - 3 '
(配列番^ 63) (配列番号 65)
5 ' -GTAGCTGAAAGGCGTAACCGTACC- 3 ' 5 ' - AACCCCGAACTTCAATCAAGTCCC - 3 ' 翻番号 64) (配列港号 6 S)
AO漏 9 5 ' -TCGACGACGACGCGGCGAAGCCGA- 3 ' 5 ' - TCGAGGATGCCTGTGGAG GGTGT - 3 '
(ffi列番号 67) (配列番号 69)
5 ' -CCGCCGCATCCCGCCGTCCCCGCG- 3 ' 5 ' - CCGTGGACCGCCGCTTCGTTTCCC - 3 ' 列番号 68) (ffi列番号 70)
AO棚 7 5 ' -TCGAGCAGTCCGCCGGCAGCCGAC- 3 ' 5 ' -TCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCC-3 '
(細番号 71) (配列番号 73)
5 ' -ATTTCCCGAGCCGGGACGTGGCGG- 3 ' 5 ' -GCTTCAGCGCCATCCATTTTCGGG-3 '
(配列番号 72) (配列番号 74〕 [0164] [表 31- 2]
Figure imgf000049_0001
[0165] [表 31-3] 選抜され 検出用プライマーペア 1 検出用プライマーペア 2
たゲノム
腿断片
A011 C02 5 ' - TCGAGTTAGGGAT TGATTG - 3 ' 5 ' -TCGAAGGTGGTGTCAAATTA- 3 "
(配列番号 107) (配列番号 109)
5 ' -AATTTGTAATGCTGCGATCT- 3 ' 5 ' -GTTGTCGCTGCCACCTGATC- 3 '
(配列番号 108) (配列番号 110)
A010B03 5 ' - TCGAACAGCCGACTCAGAAC - 3 ' 5 ' - TCGAAGGATCAAAAAGCAAC - 3 ,
(配列番号 111) (配列番号 113)
5 ' -CCCGGATCGGCCCGAGGGAC-3 ' 5 ' - GGCTTGGCGGAATCAGCGGG - 3 '
(配列番 12) (配列番号 114)
AO09F06 5 ' -TCGAGTTTGATTCGGATTCG- 3 ' 5 ' -TCGAATAGCCGTGCCCGCGG - 3 '
(配列番号 115) (配列番弓 ·117)
5 ' -GGCGGCGGCGGCTCGGCGGA-3 ' 5 ' -TCTAAGCAGCGGAAAATAAA- 3 '
(配列番号 116) (配列番号 118)
A009E11 5 ' - TCGAGT GGAGCACGCCTGT - 3 ' 5 ' -TCGAGGCGGCCGGCCGCGGC-3 '
(配列番号 119) 〔配列番号 121)
5 ' - GTTGrTACACACTCCTTAGC - 3 ' 5 ' -CCTATCGATCCT TAGACCT- 3 '
(配列番号 120) (配列番号 122)
A008B02 5 ' -TCATATATTAATTCTCTCTCTCTA- 3 ' 5■ -TCGAAGACGCGGAATGGTAGTGAA- 3 '
(配列番 S 123) (配列番号 125)
5 ' -TCATGATAGTCAATArGGGCCCTC- 3 ' 5 ' -GGATAGAGATATGGTATAAGAAAT- 3 ' (配列番 124) (配列番号 U 6)
A083G04 5 ' -TCGATGGTAGGATAGGGGCCTACC - 3 · 5 ' -TCGAGTTATCATGAATCATCGGAT- 3 '
(配列番号 127) (配列番号 129)
5 ' -TTAAGGCCAGGAGCGCATCGCCGG- 3 ' 5 ' -GACAGCCCGCCCGGCCGCCGCCGT-3 '
(配列番号 128) (配列番号 130)
A088E02 5 ' -TCGAGCCTCCACCAGAGTTTCCTC - 3 ' 5 - - CCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTA- 3 '
(配列番号 131) (配列番 - 133)
5 ' -CGGCTGGTCCGCCGATCGGCTCGG- 3 ' 5 ' - GCAATGATCTATCCCCATCACGA- 3 ,
(配列番号 U2) (配列番号 134)
A089F12 5 ' -TCGAGCAGTCCGCCGGCAGCCGAC - 3 ' 5 ' - CGAACAGCCGACTCAGAACTGGT - 3 '
删番号 135) (配列番号 137)
5 ' -ATTTCCCGAGCCGGGACGTGGCGG- 3 ' 5 ' - CTCAAGTCATTTCACAAAGTCGGA- 3 '
(配列番号 136) (配列 Φ号 138〕 実施例 21.潠抜されたゲノム DNA断片の槠物への ¾人
実施例 3— 14において選抜されたゲノム DNA断片を、実施例 2、実施例 6、または、 実施例 7記載の方法により、イネ、トウモロコシ、およびタバコに導入した。得られた形 質転換植物、およびその子孫植物を、実施例 3— 14と同様に評価した。そして、評 価した形質のうち、 1つまたは複数の形質について、変異の生じた形質転換植物およ びその子孫植物を選抜した。選抜された植物に導入したゲノム DNA断片を、作物に 、農業的に有益となりうる変異を起こすことのできるゲノム DNA断片として選抜した。
[0167] 2次選抜の結果、再度植物に導入しても農業上有益な変異をもたらすことができる ことが確認されたゲノム DNA断片や、他の植物にも農業上有益な変異をもたらすこと ができることが確認されたゲノム DNA断片が選抜された。したがって、 1次選抜のみの 場合よりも、より価値の高いゲノム DNA断片が選抜されたことになる。
[0168] このようにして選抜されたゲノム DNA断片の例を表 32に示す。
[0169] [表 32]
2次選抜で選抜されたゲノム D N A断片
Figure imgf000051_0001

Claims

請求の範囲 [1] 以下の工程を含むことを特徴とする、植物に農業上有益となりうる変異をもたらすこ とができるゲノム DNA断片の選抜方法：
(1)植物からゲノム DNAを調製し、クローユングベクターを用いて、ゲノム DNAライブラ リーを構築する；
(2)ゲノム DNAライブラリーを構成する複数のゲノムクローンの各々に含まれるゲノム 断片を、個別に植物に導入し、形質転換植物を作出する；
(3)形質転 ^¾物、または、その子孫の植物を栽培し、表現型に農業上有益となりう る変異の生じた植物を選抜する；
(4)工程 (3)において選抜された植物に、工程 (2)において導入されていたゲノム DNA断片を、 目的とするゲノム DNA断片として選抜する；
(5)場合により、工程 (4)で選抜されたゲノム DNA断片の全部または一部を植物に導 入して、工程 (3)および (4)を繰返し、各繰返しの度に表現型に農業上有益となりうる 変異の生じた植物を与えたゲノム DNA断片を、 目的とするゲノム DNA断片として選抜 する。
[2] 選択されるゲノム DNA断片のサイズ力 クローニングベクターに導入可能な大きさ の範囲で、 lkb以上である請求項 1の方法。
[3] 工程 (2)力 植物細胞もしくは組織のゲノムへのゲノム断片の導入、該植物細胞か らの植物体への再生、再生した植物の栽培、の各工程を含む、請求項 1または 2の 選抜方法。
[4] 植物細胞もしくは組織のゲノムへのゲノム DNA断片の導入力 生物的導入法、物理 的導入法、化学的導入法からなる群から選択される方法により行われる、請求項 3の 選抜方法。
[5] 植物に農業上有益となりうる変異が、通常の栽培条件下で植物体およびその含有 成分の少なくとも一部について、変異がない植物に比べて量的な増大または減少、 または、その生長速度の増大をもたらす変異、または病虫害抵抗性をもたらす変異 である、請求項 1一 4のいずれか 1項の選抜方法。
[6] 植物に農業上有益となりうる変異が、通常より植物にストレスが付加される栽培条件 下で植物体およびその含有成分の少なくとも一部について、変異がない植物に比べ て量的な増大または減少、または、その生長速度の増大をもたらす変異、または病 虫害抵抗性をもたらす変異である、請求項 1一 4の ヽずれか 1項の選抜方法。
[7] 工程 (2)で形質転換される植物が、工程 (1)でゲノム DNAの供給源とされた植物と 同じ種の植物である、請求項 5または 6の選抜方法。
[8] 工程 (2)で形質転換される植物が、工程 (1)でゲノム DNAの供給源とされた植物と 異なる種の植物である、請求項 5または 6の選抜方法。
[9] 場合により工程 (5)でゲノム DNA断片を導入する植物が、工程 (2)で形質転換され た植物と同じ種の植物である請求項 7または 8の選抜方法。
[10] 場合により工程 (5)でゲノム DNA断片を導入する植物が、工程 (2)で形質転換され た植物と異なる種の植物である請求項 7または 8の選抜方法。
[11] 場合により工程 (5)でゲノム DNA断片を導入する植物が、工程 (2)で形質転換され た植物と同じ栽培条件下で栽培される請求項 9または 10の選抜方法。
[12] 場合により工程 (5)でゲノム DNA断片を導入する植物が、工程 (2)で形質転換され た植物と異なる栽培条件下で栽培される請求項 9または 10の選抜方法。
[13] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法により選抜されたゲノム DNA断片を含むクロー ユングベクターを含む大腸菌を培養する工程および、大腸菌中で増幅したゲノム
DNA断片を含むクローユングベクターを調製する工程を含むことを特徴とする、植物 に農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断片の製造方法。
[14] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法によって選抜されたゲノム DNA断片を铸型とし て、生化学的増殖法による増殖を行うことを特徴とするゲノム DNA断片の製造方法。
[15] 請求項 13または 14の方法によって製造されたゲノム DNA断片を制限分解するェ 程を含む DNA断片の製造方法。
[16] 請求項 13— 15のいずれか 1項の方法により製造された DNA断片。
[17] 請求項 1一 16のいずれか 1項の方法により選抜または製造されたゲノム DNA断片 を含むクロー-ングベクターを含む大腸菌を培養する工程および、大腸菌中で増幅 したゲノム DNA断片を含むクローユングベクターを調製する工程を含むことを特徴と する方法で製造した、農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断 片を、植物に導入する工程を含む、農業上有益となりうる変異を有する植物の製造 方法。
[18] 農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断片を、植物に導入す る工程が、植物細胞もしくは組織へのゲノム断片の導入、該植物細胞からの植物体 への再生、再生した植物の栽培、の各工程を含む、請求項 17の農業上有益となりう る変異を有する植物の製造方法。
[19] 植物細胞もしくは組織へのゲノム DNA断片の導入が、生物的導入法、物理的導入 法、化学的導入法からなる群から選択される方法により行われる、請求項 18の植物 の製造方法。
[20] 農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断片を導入する植物が
、該ゲノム DNA断片が由来する植物と同じ種の植物である、請求項 17— 19のいず れカ 1項の植物の製造方法。
[21] 農業上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断片を導入する植物が
、該ゲノム DNA断片が由来する植物と異なる種の植物である、請求項 17— 19のいず れカ 1項の植物の製造方法。
[22] 請求項 17— 21の 、ずれか 1項の方法により製造した植物。
[23] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法により選抜されたゲノム DNA断片を含むクロー ユングベクターを含む大腸菌を培養する工程および、大腸菌中で増幅したゲノム DNA断片を含むクロー-ングベクターを調製し、クロー-ングベクター中の植物ゲノ ム DNA断片のヌクレオチド配列を解読する工程を含むことを特徴とする、植物に農業 上有益となりうる変異をもたらすことができるゲノム DNA断片の分析方法。
[24] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法によって選抜されたゲノム DNA断片を制限分 解する工程を含む DNA断片の分析方法。
[25] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法によって選抜されたゲノム DNA断片を铸型とし て、生化学的増殖法による増殖を行うことを特徴とする DNA断片の分析方法。
[26] 分析が、ゲノム DNA断片の制限分解産物または生化学的増殖法による増殖産物の ヌクレオチド配列を解読する工程を含む、請求項 24または 25の分析方法。
[27] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法によって選抜されたゲノム DNA断片を、植物 の品
種改良におけるマーカーとして使用する方法。
[28] 請求項 1一 12のいずれ力 1項の方法によって選抜されたゲノム DNA断片をマーカ 一とし、該マーカーをゲノム DNA中に有する植物個体は品種改良に適すると判断し 、該マーカーを有しない植物個体は品種改良に不適であると判断することからなる、 請求項 27の方法。
[29] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法によって選抜されたゲノム DNA断片を有する ことが知られている植物と、品種改良をすべき植物とを掛け合わせて得られた、後代 植物個体カゝらゲノム DNAを調製し、前記ゲノム DNA断片を有する後代植物個体を、 品種改良のさらなる工程に使用できると判断することからなる、請求項 28の方法。
[30] 請求項 1一 12のいずれか 1項の方法によって選抜されたゲノム DNA断片を有する ことが知られている植物力 請求項 22の植物である、請求項 29の方法。
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