CN101802205B - 晚疫病抗病基因和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新基因序列，组合物和方法，用于提高作物，特别是但不仅限于马铃薯，对由卵菌病原体致病疫霉(Phytophthora infestans)导致的晚疫病的抗病性。

Description

晚疫病抗病基因和方法

发明领域

用于提高作物对晚疫病(late blight)的抗病性的新基因、组合物和方法。

发明背景

马铃薯(Solanum tuberosum L.)在世界上最重要的作物中名列第四，并且是最重要的非谷类粮食作物。在马铃薯栽培中，限制产量的主要自然因素是由卵菌类(oomycete)病原体致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)deBary)导致的晚疫病。这种毁灭性的疫病若不加以控制，可导致作物产量绝收(and Zimnoch-Guzowska 2001)。杀真菌剂处理是目前控制晚疫病最常用的方法。然而，使用杀真菌剂的高额成本是一个问题，在发展中国家尤为如此。而且，因为使用杀真菌剂会对卫生和环境安全造成影响，所以化学药剂的使用正在受到限制。此外，病原体会快速进化，一些新的变体对普遍使用的杀真菌剂不敏感(Day and Shattock 1997；Goodwin et al1996)。因此，在栽培型马铃薯中引入遗传抗病性被认为是实现对晚疫病可持续抵抗的一种有价值的方法。

有人已经介绍了马铃薯中两种主要的晚疫病抗病类型(Umaerus andUmaerus 1994)。第一，一般抗性往往是基于一个主要数量性状位点(majorquantitative trait loci)(QTL)和少数次要QTL，产生部分的抗病性。第二，特异抗性是基于主要显性抗性(R)基因。上世纪前半叶的早期育种项目中，鉴定了11个来源于S.demissum的R基因(R1-R11)。9个R基因：R3(现已分离为R3a和R3b)和R5-R11，位于11号染色体上(Bradshaw et al.2006；El-Kharbotly 1994，1996；Huang et al.2004；Huang 2005)。其它S.demissum来源的R基因被定位到不同的位置，包括：R1位于5号染色体(El-Kharbotlyet al.1994；Leonards-Schippers et al.1992)，R2位于4号染色体(Li et al.，1998)。由于对原本抗病的宿主具有毒力的新菌株很快就进化出来，所有从S.demissum渗入到栽培型马铃薯的R基因均已经被病原体攻克(Umaerusand Umaerus 1994)。因此，人们曾认为由QTL赋予的部分抗病性比由单个R基因赋予的抗病性更加持久(Turkensteen 1993)。然而，部分抗病性与成熟类型(maturity type)的相关性强，增大了抗性育种的困难(Wastie 1991)。另外，QTL的遗传位置经常相应于R基因簇的区域(Gebhart and Valkonen 2001；Grube et al.2000)。

因此，近来鉴定晚疫病抗病性的努力集中在来源于多种野生茄属(Solanum)物种的、可提供广谱抗病性的主要R基因。除了S.demissum之外，其它野生茄属物种也被报道作为晚疫病抗病性的新资源，例如S.acaule，S.chacoense，S.berthaultii，S.brevidens，S.bulbocastanum，S.microdontum，S.sparsipilum，S.spegazzinii，S.，stoloniferum，S.sucrense，S.toralapanum，S.vernei和S.verrucosum(综述见Jansky 2000；Hawkes 1990)。迄今为止，来自S.bulbocastanum的三个R基因，RB/Rpi-blb1，Rpi-blb2和Rpi-blb3，已经被分别定位于8、6和4号染色体(Nasess et al.2000；Park et al.2005a；van derVossen et al.2003，2005)。另一个可能来源于S.bulbocastanum的R基因，Rpi-abpt，已经被定位在4号染色体上(Park et al.2005b)。还有人报道了位于7号染色体的来源于S.pinnatisectum的Rpi1(Kuhl et al.2001)，位于9号染色体的来源于S.mochiquense的Rpi-mcq1(Smilde et al.2005)和来源于S.phureja的Rpi-phu1(Sliwka et al.2006)。

通观本领域的现有技术，可以明显地看出，人们对于可赋予晚疫病抗病性的新基因、组合物和方法的仍然存在显著的需求。在本专利公开中，我们通过筛选野生茄属物种，并通过克隆新型Rpi抗病基因并将其导入到马铃薯中进行表达，满足了这一需求。

发明概要

我们分离、鉴定并表征了数种不同的晚疫病R基因，它们来源于马铃薯野生种S.okadae，以及来自S.mochiquense和S.neorossii。

本发明提供了用于增强作物，特别是，但不仅限于马铃薯，针对由卵菌病原体致病疫霉导致的晚疫病的抗病性的新基因序列、组合物和方法。

附图简述

图1.用于构建BAC文库的基因型世系。(a)：K39和(b)：K182。

图2.通过脉冲场凝胶电泳分析从两个BAC文库K39(a)和K182(b)随机选出的BAC克隆的插入大小。BAC克隆用NotI消化。7.5Kb处的条带来自于克隆载体pIndigoBAC-5。由lambda梯级(lambda ladder)(SigmaChemical)提供的分子量大小标记在图的右侧给出。

图3.晚疫病抗性基因：来自S.okadae的Rpi-oka1，Rpi-oka2和Rpi-oka3和来自S.neorossii的Rpi-nrs1，的定位位置。

图4.用于筛选两个BAC文库的SCAR标记图。用TaqI(a)消化的TG551连接于Rpi-oka1，用MwoI(b)和TG35(c)消化的TG551连接于Rpi-oka1，U296361(d)和TG591(e)连接于Rpi-mcq1。标明了1Kb大小的梯带(ladder)和亲本基因型(A624，A613，A618和A988)，其余是通过先后进行PCR和限制酶消化鉴定出的对某些标记为阳性的BAC池。抗性等位基因在每个图的右侧用‘＜＜’标明。

图5.从K39BAC文库鉴定的并且覆盖含Rpi-oka1和Rpi-oka2基因组区域的BAC克隆重叠群。

图6.来源于Solanum okadae和S.neorossii的Rpi基因的高分辨率精细尺度(fine scale)定位图。

图7.Rpi-oka1、Rpi-oka2和Tm-2²的推定蛋白序列的比对。显示了Rpi-oka1的完整氨基酸序列，点指示另外两个蛋白中相同的残基。在Rpi-oka2和Tm-2²来源的残基与Rpi-oka1不同之处，给出了这两个蛋白的残基。Rpi-oka1和Rpi-oka2之间的两个氨基酸差异用粗体标明。预测的卷曲螺旋域(coiled coil domain)用下划线标出，每个七联体重复(heptad repeat)中的第一和第四个疏水残基用双下划线标出。NB-ARC域中的保守基序用小写字母斜体标出。推定的富亮氨酸重复(LRR)在序列行上方标出。

图8.Rpi-oka1、Rpi-nrs1和Tm-2²蛋白序列的比对。CC、NB-ARC和LRR域分别用红、绿和桔红色突出显示。NB-ARC域内的保守基序用斜体下划线标出。

图9.分别在群体7698和7663中图定位的Rpi-oka1(a)和Rpi-nrs1(b)座位在染色体IX上的遗传连锁图。左侧的数字表示遗传距离(cM)。被图定的座位的相对位置用水平线表示。字母n代表每个群体的大小。

图10.来自S.mochiquense的晚疫病抗性基因Rpi-mcq1的图定位置。

图11.从K182BAC文库鉴定的、覆盖含Rpi-mcq1基因组区域的BAC克隆重叠群。

本发明优选实施方案详细说明

下面的序列作为本文所附的图12：

Sea ID Rpi序列

1a    oka1 nt

1b    oka2 nt

1c    oka1转基因，包括来自pSLJ21152nt的启动子和终止子

2a    mcq1.1 nt

2b    mcq1.2 nt

2c    mcq1.1转基因，包括来自pSLJ21153nt的启动子和终止子

2d    mcq1.2转基因，包括来自pSLJ21148nt的启动子和终止子

3     nrs1 nt

4a    oka1 aa

4b    oka2 aa

5a    mcq1.1 aa

5b    mcq1.2 aa

6     nrs1 aa

(nt＝核苷酸序列，aa＝多肽序列)

上述序列是相对于本申请要求优先权的GB0714241.7中公开的序列的延长序列。具体地，它们被延长的方式如下：

SEQ ID 1a-在起始部延长了99个额外碱基

SEQ ID 1b-在起始部延长了141个额外碱基

SEQ ID 3-在起始部延长了相同的141个额外碱基

SEQ ID 4a-在起始部延长了33个额外氨基酸

SEQ ID 4b-在起始部延长了47个额外氨基酸

SEQ ID 6-在起始部延长了相同的47个额外氨基酸

尽管如此，在先公开的主题并没有被放弃。因此，本发明在上述定义延长序列方面公开的任何方面或实施方案，均应理解为经过必要的修正或改变后可适用于在先公开的较短序列。因此，本发明这些方面或实施方案的每一个均是对如下的必要修正：

SEQ ID 1a-核苷酸100-2676

SEQ ID 1b-核苷酸142-2718

SEQ ID 3-核苷酸142-2718

SEQ ID 4a-氨基酸34-891

SEQ ID 4b-氨基酸48-905

SEQ ID 6-氨基酸48-905

如下序列是包含某些上述序列的表达盒：

在SEQ ID 1c(Rpi-oka1)中-Rpi-oka1启动子包含在碱基1-709中，包括从碱基627到709的5’非翻译区(UTR)。Rpi-oka1开放阅读框(ORF)位于碱基710-3382，终止子从碱基3383起。将其克隆到pSLJ21152中，然后用于转化马铃薯(S.tuberosum)和番茄(S.lycopersicum)，从而赋予针对致病疫霉的抗病性。

SEQ ID 2b(Rpi-mcq1.1)-Rpi-mcq1.1启动子包含在碱基1-2262中，Rpi-mcq1.1开放阅读框(ORF)位于碱基2263-4848，终止子从碱基4849起。将其克隆到pSLJ21153中，然后用于转化马铃薯和番茄，从而赋予针对致病疫霉的抗病性。

SEQ ID 2d(Rpi-mcq1.2)-Rpi-mcq1.2启动子包含在碱基1-1999中，Rpi-mcq1.2开放阅读框(ORF)位于碱基2000-4567中，终止子从碱基4568起。将其克隆到pSLJ21148中，然后用于转化马铃薯和番茄，从而赋予针对致病疫霉的抗病性。

如图8所示，Rpi-oka1和Rpi-nrs1序列亲缘关系极近。

如下文所述，我们认为Rpi-oka的序列实际上与Rpi-nrs1是相同的，但为了完整起见，仍把它们纳入本文。

然而，本文后面提及的Rpi-oka3序列与Rpi-oka2相同，因此不再明示。

最后，从S.mochiquense鉴定出了不同的候选Rpi基因，它们均在序列中示出。它们均被认为是具有不同识别特异性的功能R基因。

因此，在本发明的第一个方面中，公开了编码功能Rpi基因的分离核酸分子，它们可以任选地从S.okadae，S.mochiquense和S.neorossii中选择。

在特定的实施方案中，本发明提供了具有如本文SEQ.ID.1a，1b，2a，2b或3所提供的序列的分离Rpi抗性基因。

所提供的本发明的核酸分子可以是从其自然环境中分离和/或纯化的，处于基本上纯净或均一的形式，或者不含或基本上不含来源物种的其它核酸。在本文中使用时，术语“分离的”涵盖所有这些可能性。

核酸分子可以完全是合成的或部分地是合成的。特别地，它们可以是重组的，体现在：自然界中不会一起出现(不相邻)的核酸序列被连接起来或者用其它方式人工组合起来。

作为选择，可以直接合成它们(例如通过使用自动合成仪器)。

优选的核酸基本上由所讨论的基因组成，所述基因任选处于表达载体内，这将在下文有更详细的说明。

根据本发明的核酸可以包括cDNA、RNA、基因组DNA和经过修饰的核酸或核酸类似物。在具体说明DNA序列(例如参考附图)的时候，除非上下文需要，否则即涵盖RNA等价物，其中有T出现时替换为U。当本文中提及本发明核酸时，该核酸的互补体也包含在本发明中。给定核酸(序列)的“互补体”与该核酸(序列)长度一样，但与其100％互补。

在公开本发明的基因组核酸序列时，含有任意一个或多个(例如2个)来自这些序列中任一序列的内含子或外显子的核酸也包括在内。

在此语境下的抗性基因是控制对由致病疫霉导致的晚疫病的抗性的基因。这种基因所编码的多肽能够应答于所述病原体或其Avr基因产物的攻击(challenge)而在植物体内识别和激活抵抗应答。

第一个方面的核酸可以有利地在例如马铃薯中使用。

本发明的核酸可以编码上述氨基酸序列(4a，4b，5a，5b，6)的其中之一，例如与相应的核苷酸序列简并等价(degeneratively equivalent)。

在本发明进一步的方面中公开的核酸是第一个方面的序列的变体。

变体核酸分子与上述编码序列的全部或一部分具有同源性或者同一。一般来说，变体可以编码或者用于分离或扩增编码如下所述的多肽的核酸：所述多肽能够介导针对致病疫霉的应答，和/或可特异结合用上述多肽(4a，4b，5a，5b，6)激发产生的抗体。

本发明的变体可以是人工核酸(即含有非自然来源的序列)，本领域技术人员结合本公开内容能够制备这样的人工核酸。或者，它们可以是新的、天然存在的核酸，已经或者可以利用本发明的序列从例如S.mochiquense，S.okadae和S.neorossii中分离。

因此，变体可以是对应于所提供的序列的一部分的独特部分或片段(无论以何种方式产生)。片段可以编码多肽的特定功能部分，例如LRR区或末端。

同等地，所述片段可以用于探测或扩增所提供的序列或与之紧密相关的序列。用于这些过程的合适片段长度和条件在下文有更详细的讨论。

还包括在3’或5’端被延长的核酸。

天然存在的序列变体可以包括等位基因或其它同源物(其可以在一个或多个碱基处含有多态性或突变)。

本领域技术人员通过例如定点或随机突变，或者通过直接合成，可以制备人工变体(衍生物)。优选地，从具有所述第一个方面的序列之全部或部分的原始核酸直接或间接地产生变体核酸(例如通过一个或多个扩增或复制步骤)。优选地，它编码致病疫霉抗性基因。

本文使用的术语“变体”核酸包括全部这三种可能性。在多肽或蛋白质的语境下使用时，它指示变体核酸编码的表达产物。

本发明关于变体的一些方面将在下文有更详细的讨论。

计算核苷酸同一度如下：

          Rpi-oka1    Rpi-oka2    Rpi-nrs1    Rpi-mcq1.1    Rpi-mcq1.2

Rpi-oka1

Rpi-oka2      98％

Rpi-nrs1      98％        100％

Rpi-mcq1.1    84％        83％        83％

Rpi-mcq1.2    83％        82％        82％        87％

Tm2-2         80％        79％        79％        85％          84％

计算氨基酸同一度如下：

              Rpi-oka1    Rpi-oka2    Rpi-nrs1    Rpi-mcq1.1    Rpi-mcq1.2

Rpi-oka1

Rpi-oka2      98％

Rpi-nrs1      98％        100％

Rpi-mcq1.1    76％        75％        75％

Rpi-mcq1.2    76％        75％        75％        81％

Tm2-2         72％        71％        71％        77％          75％

上述多重比较的执行使用AlignX(Vector NTI Suite Invitrogen)，其使用基于CLUSTAL矩阵的引擎。

更一般地说，同源性(即相似性或同一性)可以用序列比较加以定义，使用Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin制作的Wisconsin Package10.0的GCG的BestFit和GAP程序。CLUSTAL也是BestFit使用的矩阵。参数优选地设定如下，使用缺省设置：缺口产生罚分(Gap Creation pen)：9；缺口延伸罚分(Gapext pen)：2。同源性可以是核苷酸序列水平和/或编码氨基酸序列水平。优选地，核酸和/或氨基酸序列与SEQ.ID.1a、1b、2a、2b或3或4a、4b、5a、5b、或6，视情况而定，具有至少大约50％、或60％、或70％、或80％同源性，最优选地至少大约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。

特别地，本发明提供了一种分离的Rpi抗性基因，其具有与本文作为SEQ.ID.1a，1b，2a，2b或3提供的序列至少大约80％同源的序列。

本发明进一步提供了一种分离的蛋白质，其具有与本文作为SEQ.ID.4a、4b、5a、5b或6提供的序列至少大约80％同源的氨基酸序列。因此，根据本发明的变体多肽在本文所示的序列中可以包含单个氨基酸或2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸改变，大约10、15、20、30、40或50个改变，或大于大约50、60、70、80、90、100、200、400个改变。除了所示氨基酸序列内的一个或多个改变之外，变体多肽可以在C端和/或N端包含额外的氨基酸。

因此，在本发明进一步的方面中，公开了一种产生衍生核酸的方法，包括修饰本发明核酸的编码序列，例如SEQ.ID.1a，1b，2a，2b或3，的步骤。

改变序列以产生衍生物，可以通过如下的一种或多种方法实现：在核酸中添加、插入、删除或替换一个或多个核苷酸，导致在被编码的多肽中添加、插入、删除或替换一个或多个氨基酸。有多种原因可以导致需要改变，包括如下特征的引入或除去：限制性内切酶序列；密码子使用；其它翻译后修饰所需要的位点；所编码多肽中的剪切位点；所编码多肽中的基序(例如结合位点)。可以对表达蛋白添加或从其除去前导(leader)或其它靶序列，以决定其表达后的定位。所有这些都有助于以重组形式高效地克隆和表达活性多肽(如下文所述)。

其它理想的突变可以是随机或定点诱变，以改变所编码多肽的活性(例如特异性)或稳定性。改变可以采取保守变异的方式，即用一个疏水性残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，替换另一个疏水性残基，或者用极性残基彼此替换，例如用精氨酸替换赖氨酸，谷氨酸替换天冬氨酸，或谷氨酰胺替换天冬酰胺。如本领域技术人员所熟知的，通过保守替换改变多肽的一级结构可以不显著改变该肽的活性，因为插入到序列中的氨基酸的侧链可能能够形成与替换掉的氨基酸的侧链相似的键和接触。甚至当替换发生在决定肽构型的关键区域内时也是如此。

还包括具有非保守替换的变体。如本领域技术人员所熟知的，对于决定肽构象非关键的区域内的替换对其活性不会有大的影响，因为它们不会显著改变肽的三维结构。

在决定肽构型或活性的关键区域内，这些改变可以赋予多肽以有利的性质。事实上，改变，例如如上所述的改变，可能赋予肽以稍微有利的性质，例如改变的稳定性或特异性。例如，对本发明核酸所编码多肽的LRR区进行操作可允许产生新的抗性特异性，例如针对致病疫霉分离株(isolate)的抗性特异性。

LRR区也可以被移植到其他NBS区(例如来自其它抗性基因的)上。因此，用于产生新特异性的方法可以包括将来自相关抗性基因的序列混合或掺入到本文公开的Rpi序列中。其它备选的Rpi序列修饰策略可采用如下文所述的PCR(Ho et al.，1989，Gene 77，51-59)或DNA重排(Crameri et al.，1998，Nature 391)。

在下文的实施例中提供了对本发明一些ORF的详细分析，包括具有替换的变体的存在，和关注区域的鉴定。

在本发明进一步的方面中，提供了鉴定和/或从植物中克隆核酸变体的方法，该方法采用独特的Rpi核苷酸序列(例如，如SEQ.ID.1A、1B、2A、2B或3或其互补体中存在的序列，或者基于它们的简并引物)。

用于探测或扩增反应的寡核苷酸包括或者由长度为大约30个或更少的(例如18、21或24个)核苷酸组成。一般地，特异性引物的长度超过14个核苷酸。为了最佳特异性和成本效率，长度为16-24个核苷酸的引物可能是优选的。本领域的技术人员能熟练地进行用于PCR等过程的引物的设计。如果需要，可以用本文公开基因的整个限制片段进行探测，长度为数以百计(100’s)或者甚至数以千计(1000’s)的核苷酸。

优选地，探针/引物从下述意义上说是独特的：它存在于全部或某些本文公开的Rpi序列中，但不存在于现有技术的抗性基因序列中。

例如，本文提供的功能等位基因数据(见例如图10或图11)允许如下所述地鉴定功能Rpi等位基因。

在一个进一步的实施方案中，根据本发明的变体也可以通过如下的方法获得，该方法包括：

(a)提供核酸制备物，例如从植物细胞提供；

(b)提供核酸分子，其是如上所述的探针，

(c)在所述核酸分子与所述制备物中任何所述基因或同源物杂交的条件下，使所述制备物中的核酸与所述核酸分子接触，并根据其与所述核酸分子的杂交鉴定出所述基因或同源物(如果存在的话)。

探测可以采用标准Southern印迹技术。例如，可以从细胞提取DNA，用不同的限制酶加以消化。随后可以在琼脂糖凝胶上电泳来分离限制片段，然后使其变性并将其转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙上。可以使标记探针与滤膜上的DNA片段杂交，然后测定结合。可以用来自细胞的RNA制备物来制备用于探测的DNA。

可以从细胞以基因组DNA、cDNA或RNA，或者它们的任意混合物的形式来提供测试核酸，优选地作为存在于合适载体中的文库提供。如果使用基因组DNA，则可用探针来鉴定基因的非翻译区(例如启动子等)，例如下文所述。任选地，可以利用所谓“核酸芯片”的方法进行探测(综述见Marshall&Hodgson(1998)Nature Biotechnology 16：27-31)。

可以通过在低严格条件下进行杂交来进行预备实验。对于探测而言，优选的条件是：严格度足够高，从而存在这样的简单模式，其中只有少数杂交可被鉴定为阳性并可加以进一步研究。

例如，可以最先在如下条件下进行筛选：其包括：大约37℃或者更低的温度，小于大约50％的甲酰胺浓度，和中到低盐浓度(例如标准柠檬酸盐(“SSC”)＝0.15M氯化钠；0.15M柠檬酸钠；pH 7)。

或者，温度大约50℃或更低，高盐(例如“SSPE”0.180mM氯化钠；9mM磷酸氢二钠；9mM磷酸二氢钠；1mM EDTA钠盐；pH 7.4)。优选地，筛选在如下条件下进行：大约37℃，大约20％的甲酰胺浓度，和大约5XSSC的盐浓度，或温度大约50℃，盐浓度为大约2XSSC。这些条件将容许鉴定与探针序列具有显著程度(substantial degree)的同源性(相似性、同一性)的序列，而不必要求鉴定出稳定杂交体所需的完美同源性。

合适的条件包括，例如：对于同一性大约为80-90％的序列的检测，在42℃下在0.25M Na₂HPO₄、pH 7.2、6.5％ SDS、10％硫酸右旋糖酐中杂交过夜，并最终在55℃下用0.1XSSC、0.1％SDS清洗。对于同一性大于大约90％的序列的检测，合适的条件包括在65℃下在0.25M Na₂HPO₄、pH 7.2、6.5％ SDS、10％硫酸葡聚糖中杂交过夜，并最终在60℃下用0.1XSSC、0.1％SDS清洗。

逐渐增加杂交严格度直至仅有少数克隆保留是本领域众所周知的。当可以获得大量杂交片段而背景杂交较低时，即获得了合适的条件。

使用这些条件，可以对核酸文库，例如反映表达序列的cDNA文库，进行搜索。本领域的技术人员完全能够在考虑寡核苷酸长度和碱基组成、温度等因素的同时，采用具有期望严格度的合适条件进行选择性杂交。下面是一个用于计算具有给定序列同源性的核酸分子之间实现杂交所需的严格条件的常用公式(Sambrook et al.，1989)：

Tm＝81.5℃+16.6Log[Na⁺]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/#bp(以双链体形式)。作为上面公式的示例，使用[Na⁺]＝[0.368]和50-％甲酰胺，GC含量为42％，平均探针大小为200碱基，Tm为57℃。同源性每降低1％，DNA双链体的Tm降低1-1.5℃。因此，使用42℃的杂交温度可以观察到具有大于75％序列同一性的靶分子。这样的序列被认为与本发明的核酸序列基本上同源。

本领域技术人员可任意使用任何一种技术测量探针与核酸(例如DNA)的结合。例如，可以用放射性、荧光或酶标记探针。其它不采用探针标记的方法包括用PCR扩增(见下文)或RNA酶剪切。识别出成功的杂交之后，对杂交的核酸进行分离，这可以包括一步或多步PCR或在合适宿主中扩增载体。

因此，本发明这个方面的一个实施方案是这样的核酸，其包括或者基本上由如下核苷酸序列构成：所述核苷酸序列互补于能够同本文所提供的任何编码序列杂交的核苷酸序列。这一点从另一个角度看，就是根据本方面的核酸能够同本文所提供的任何编码序列的互补核苷酸序列杂交。当然，DNA一般是双链的，印迹技术，例如Southern杂交，经常在双链分离之后执行，不会区分两条链的哪一条是杂交链。优选地，能够杂交的核酸或其互补体编码能够影响植物的抗性特征(特别是Rpi抗性应答)的产物。

在一个进一步的实施方案中，核酸分子与变体的杂交可以间接地确定或鉴定，例如通过使用核酸扩增反应，特别是聚合酶链式反应(PCR)(见″PCRprotocols；A Guide to Methods and Applications″，Innis等人编，Academic Press，New York，(1990))。

还可以使用上述方法确定本发明的核苷酸序列之一在植物个体的遗传语境内的存在。这可以用于植物育种程序，例如用于直接在亲本植物或子代(例如杂交F1，F2等)中选择含有负责该植物物种的期望特征的等位基因的植物。

如下文中使用的，除非上下文另有要求，否则术语“Rpi核酸”意图涵盖任何如上文所述的本发明的核酸分子，包括功能变体。

在本发明的一个方面中，上述的Rpi核酸处于重组体，优选为可复制载体的形式。“载体”定义为包括任何质粒、粘粒、噬菌体或土壤杆菌(Agrobacterium)双元载体，及其它，呈双链或单链的线性或环状形式，可以或者不可以自我传输或移动，并可以转化原核或真核宿主，或是通过整合到细胞基因组内，或是存在于染色体之外(例如具有复制起点的自主复制质粒)。具体地包括穿梭载体，它的意思是天然地能够或者通过设计能够在两种不同宿主生物体内复制的DNA载体，所述宿主可以从放线菌和相关物种、细菌和真核生物(例如高等植物、酵母或真菌细胞)中选择。

包含根据本发明核酸的载体不需要包括启动子或其它调节序列，特别是如果该载体要用来将核酸导入到细胞内以重组进入基因组的话。

优选地，载体中的核酸受到合适启动子或其它调节元件的控制或者任意地与之相连，用于在宿主细胞，例如微生物如细菌或植物细胞中转录。载体可以是在多种宿主内发挥作用的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，可以包含其自身的启动子或其它调节元件，在cDNA的情况下，可以受到合适启动子或其它调节元件的控制以便在宿主细胞内表达。

“启动子”的意思是一段核苷酸序列，从它开始可以引发下游(即在双链DNA中有义链的3’方向)可操作连接的DNA的转录。“可操作连接”的意思是作为同一核酸分子的一部分连接，并合适地定位和取向，以便从启动子起始转录。与启动子可操作连接的DNA“受启动子的转录起始调节”。

因此，本发明的这个方面提供了基因构建体，优选地可复制的载体，其包括与本发明所提供核苷酸序列，例如SEQ.ID.1a、1b、2a、2b或3或者其变体，操作连接的启动子。

一般地说，本领域的技术人员完全能够构建载体并设计用于重组基因表达的实验方案。可以选择或构建合适的载体，其含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适的序列。更详细的内容见例如《分子克隆：实验室手册第二版》(Sambrook等，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)(或其更新版本)。

在Ausubel等主编的《当代分子生物学实验方法》(Current Protocols inMolecular Biology)第二版(John Wiley & Sons，1992)中详细介绍了许多用于核酸操作的已知技术和方案，例如核酸构建体的制备、诱变(见上面关于变体的讨论)、测序、将DNA引入到细胞内和基因表达、以及蛋白质分析。本文援引并入Sambrook等和Ausubel等的公开内容。

在本发明这一方面的一个实施方案中，提供了一种基因构建体，优选地，可复制的载体，其包括与本发明所提供核苷酸序列操作连接的可诱导启动子。本领域技术人员完全理解术语“可诱导的”在用于启动子时的含义。实质上，应答于被施加的刺激，可诱导启动子控制下的表达“开启”或增加。刺激的性质随启动子不同而不同。合适的可诱导启动子在没有合适的刺激时几乎不会导致表达或者仅导致不可检测水平的表达(或无表达)。其它的可诱导启动子在不存在刺激时可导致可检测的组成性表达。无论在没有刺激时表达的水平如何，在正确的刺激存在时，从任意可诱导启动子启动的表达均会增加。

在此语境中特别感兴趣的是充当植物载体的核酸构建体。下面的文献介绍了先前已在植物上广泛成功使用的具体程序和载体：Guerineau和Mullineaux(1993)(Plant transformation and expression vectors.In：PlantMolecular Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford，BIOS Scientific Publishers，pp 121-148)。

在植物体内工作的合适启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)。Lindsey & Jones(1989)“Plant Biotechnology in Agriculture”Pub.OU Press，Milton Keynes，UK第120页中公开了更多实例。可诱导的植物启动子包括乙醇诱导启动子，见Caddick等(1998)Nature Biotechnology 16：177-180。

纯粹作为举例，SEQ.ID.1c、2c和2d显示oka1，mcq1.1和mcq1.2的核苷酸序列，并且包括启动子和增强子序列，它们可用在用于转化马铃薯和番茄二者的构建体内。

使用强组成型启动子可能是理想的。如果期望，构建体中可以包括可选择的遗传标记，例如赋予可选择表型的标记，所述可选择表型例如针对抗生素或除草剂(例如卡那霉素、潮霉素、草铵膦(phosphinotricin)、氯磺隆(chlorsulfuron)、甲氨蝶呤、庆大霉素、大观霉素、咪唑啉酮和草甘膦(glyphosate))的抗性。

本发明还提供了包括将这样的构建体引入到宿主细胞内，特别是植物细胞内的方法。

在本发明进一步的方面中，公开了含有根据本发明的异源构建体的宿主细胞，特别是植物或微生物细胞。术语“异源”在本方面用于泛指已经使用遗传工程，即通过人为干预，将目标核苷酸的基因/序列(Rpi基因)引入到植物的所述细胞内或它们的祖先内。异源基因可以替换内源等价基因，即通常执行相同或相似功能的基因，或者所插入的序列可以附加于(be additionalto)内源基因或其它序列。

植物细胞的异源核酸可以天然地不存在于该类型、品种(variety)或物种的细胞中。因此，异源核酸可以包含这样的编码序列，它属于或衍生自特定植物细胞类型或植物物种或品种，并被置于不同类型的植物细胞或物种或品种的环境(context)中。另一种可能性是，核酸序列被置于细胞内，此细胞中天然存在该序列或同源物；但是，该核酸序列连接和/或毗邻于该细胞或该类型植物或物种或品种的细胞中天然不存在的核酸，例如可操作地连接于一个或多个用于控制表达的调节序列，如启动子序列。

宿主细胞(例如植物细胞)优选地被所述构建体转化，也就是说，构建体在细胞内确立，改变细胞的一个或多个特征，从而改变表型，例如针对致病疫霉的表型。

核酸可以用任何合适的技术转化到植物细胞内，例如由土壤杆菌携带的去甲Ti质粒载体，利用其天然的基因转移能力(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR 12(22)8711-87215 1984)，粒子或基因枪轰击(US5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)，显微注射(WO 92/09696，WO94/00583，EP 331083，EP 175966，Green et al.(1987)Plant Tissue and CellCulture，Academic Press)，电穿孔(EP 290395，WO 8706614 Gelvin Debeyser)，其它形式的直接DNA摄取(DE 4005152，WO 9012096，US 4684611)，脂质体介导的DNA摄取(例如Freeman et al.Plant Cell Physiol.29：1353(1984))，或涡旋法(例如Kindle，PNAS U.S.A.87：1228(1990d)Physical methods for thetransformation of plant cells are reviewed in Oard，1991，Biotech.Adv.9：1-11)。

纯粹作为举例，下文实施例6中提出了用于马铃薯、番茄和烟草的转化策略。其它的策略，特别是可用于茄属(Solanum)的策略，是本领域技术人员周知的(见例如Mansure and Magioli，Acta Botanica Brasilica，2005(Vol.19)(No.1)139-148)。转化技术的具体选择将取决于其转化特定植物物种的效率以及选用特定方法学实施本发明的人员的经验和喜好。对于技术人员显而易见的是，用于将核酸导入植物细胞内的转化系统的具体选择不是关键的，也不会构成对本发明的限制，植物再生技术的选择也是如此。因此，本发明一个进一步的方面提供了转化植物细胞的方法，包括将如上所述的构建体引入到植物细胞中，并导致或允许载体与植物细胞基因组之间发生重组，从而将根据本发明的核酸引入到基因组中。

本发明进一步包括被根据本发明的核酸或载体转化的宿主细胞，特别是植物或微生物细胞。在转基因植物细胞中(即相对于所讨论的核酸是转基因的)，转基因可以在基因组外(extra-genomic)载体上，或者是整合，优选稳定地整合到基因组中的。每个单倍体基因组可以有多于一个异源核苷酸序列。

一般而言，转化之后，可以再生植株，例如从单细胞、愈伤组织或叶盘再生，这在本领域中是常规的。几乎任何植物均可从植物细胞、组织或器官完全再生。在下列文献中综述了各种技术：Vasil等，Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants，第I，II和III卷，Laboratory Procedures andTheir Applications，Academic Press，1984，和Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989。

还提供了包含根据本发明植物细胞的植物。

除了再生的植物之外，本发明还包括下述的全部：这样的植物的克隆、自交或杂交后代和后裔(例如F1和F2后代)以及上述任何一种的任何部分。本发明还提供了这样的植物的部分，例如任何可用于有性或无性生殖或繁殖的部分，包括插枝(cutting)、种子等，或者可作为商品的部分，例如块茎。

本发明进一步提供了影响或调节植物针对病原体，特别是致病疫霉，更特别地是对本文所讨论的任意分离株，的抗性程度的方法，该方法包括导致或允许上面所讨论的异源核酸序列在所述植物的细胞内表达的步骤。

在进行该步骤之前可以先进行将所述核酸引入到所述植物或其祖先的细胞内的步骤。

优选的用于转化的植物是茄科(Solanaceae)植物，更优选的是茄属(Solanum)植物。任选地，植物可以是马铃薯(马铃薯)或番茄(番茄)。

该方法还可包括对其它基因，例如可能参与抗性信号转导的或者参与产生抗性应答的基因，的操作。

因此，提供了影响(influence或affect)植物对致病疫霉的抗性的程度的方法，所述方法包括导致或允许上文描述的异源核酸在植物细胞内表达的步骤。

在优选方法中，将超过1个Rpi基因引入到植物中。根据其他策略，提供多个植物，各自具有不同的内源或异源Rpi基因(其中所述植物中的至少1个包括本发明的异源Rpi基因，即，是通过上述技术方法产生的)。可以将多个植物一起种植在单个区域内，以使作物对致病疫霉抗性的程度或持续时间最大化。或者，可以将多个植物在区域内相继地(例如轮流地(on arotation))种植，实现相同的效果。

上面的讨论一般地涉及本发明核酸用于在植物中产生功能性Rpi多肽，藉此提高其病原体耐受性的应用。纯粹为完整起见，我们指出，如果期望如此的话(例如在实验模型中)，本文公开的信息也可用于降低细胞中这些多肽的活性或水平。用于实施下调的核酸和相关方法学(例如互补序列)构成本发明的一部分。

如上文指出的，本发明还涵盖上文公开的任何Rpi(特别是功能性Rpi)核酸序列的表达产物，以及通过表达编码核酸从而在合适的条件下(可以在合适的宿主细胞内)制造表达产物的方法。

优选的多肽包括SEQ.ID.4a，4b，5a，5b，或6所示的氨基酸序列。然而，根据本发明的多肽可以是这些多肽的变体(等位变体(allele)、片段、衍生物、突变体或同源物等)。

同时，本发明还包括这样的多肽，其虽然明显与功能性Rpi多肽相关(例如它们可与多肽免疫交叉反应，或者它们与所述多肽具有同样的特征性序列基序)，但不再有Rpi功能。

表达后，如果需要，可以从表达系统分离重组产物。然而一般来说，本发明的多肽将在体内使用(特别是在植物中(in planta))。

对于通过表达编码核酸重组产生的、经纯化的本发明Rpi或变体蛋白，可以利用本领域的常规技术用于产生抗体。产生抗体的方法包括用蛋白或其片段免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子、马、山羊、绵羊或猴子)。可以用多种本领域已知技术中的任一种从被免疫的动物获得抗体，并可以对抗体进行筛选，优选地利用抗体与目的抗原的结合。例如，可以使用Western印迹技术或免疫沉淀(Armitage et al，1992，Nature 357：80-82)。抗体可以是多克隆或单克隆的。作为免疫哺乳动物的替代或补充，可以从重组产生的免疫球蛋白可变域表达文库获得具有合适结合特异性的抗体，例如使用在表面上展示功能性免疫球蛋白结合域的λ噬菌体或丝状噬菌体；例如见WO92/01047。

针对某个多肽或肽产生的抗体可用于鉴定和/或分离同源多肽，进而鉴定和/或分离编码基因。因此，本发明提供了鉴定或分离具有Rpi功能(根据本文公开的实施方案)的多肽的方法，包括用如下所述的多肽来筛选候选肽或多肽：该多肽包含抗体的抗原结合域(例如整个抗体或其片段)，所述抗体能够结合Rpi肽、多肽或片段、变体或其变体，或者优选地具有这种肽或多肽的结合特异性，例如具有本文鉴定的氨基酸序列。

本发明的进一步的方面是特异性的结合成员，例如如下所述的抗体和包含抗体抗原结合域的多肽：它们结合，优选特异地结合SEQ.ID.4a、4b、5a、5b或6的序列或其突变体、变体或衍生物，另外它们的用途和利用它们的方法也是本发明进一步的方面。

上面的说明一般地涉及Rpi基因中被翻译的和编码的部分。另外本发明还包括基因的非编码部分(UTR)。

因此，本发明进一步的方面是编码本文所述Rpi基因启动子或其它UTR(3′或5′)的分离核酸分子。

如上面指出的，SEQ.ID.1c，2c和2d显示了oka1，mcq1.1和mcq1.2的核苷酸序列，并且包括可以在构建体中使用，来转化马铃薯和番茄的启动子和终止子序列。

总之，可以看出，本发明人分离、鉴定和表征了来自马铃薯野生种S.okadae以及来自S.mochiquense和S.neorossii的数种不同晚疫病R基因。因此，本发明提供了新基因序列、组合物和方法，用于提高作物，特别是，但不仅限于马铃薯，对由卵菌病原体致病疫霉导致的晚疫病的抗性。

为了克隆这些晚疫病R基因，我们别出心裁地组合了多种方法学。如在下文的实施例中详述的，我们从这两个物种的基因组DNA构建了两个BAC文库。在本专利公开中，我们说明了两个这BAC文库的构建和分析。而且，我们利用在前期基因作图实验中开发的基于PCR的标记来鉴定和表征与晚疫病R基因关联的BAC克隆。该过程为下列程序提供了方便：R基因的精细(fine-scale)作图、向着靶基因的染色体步移、物理作图、乃至基因克隆。

带有大基因组DNA插入片段的文库的构建是基于作图的基因克隆策略的基本步骤之一。已经开发出了数种用于构建文库的方法，包括酵母人工染色体(YAC)、P1衍生人工染色体(PAC)、基于质粒的克隆(PBC)、植物可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome，TAC)、细菌人工染色体(BAC)和双元细菌人工染色体(BIBAC)(Feng等2006引用)。在过去数年里，从许多植物物种构建了BAC文库，包括粮食作物(staple crops)水稻、小麦和马铃薯(Tao et al.2002；Nilmalgoda et al.2003；Chen et al.2004)，以及其它物种，例如桃、大蒜、香蕉、糖用甜菜、大豆、花生和向日葵(Georgiet al.2002；Lee et al.2003；Vilarinhos et al.2003；McGrath et al.2004；Wu et al.2004；Yüksel et al.2005；Bouzidi et al.2006；Feng et al.2006)。

我们一直致力于用基于作图的基因克隆方法从野生种S.okadae和S.mochiquense分离出赋予马铃薯对晚疫病的抗性的基因。S.mochiquense来源的基因已经有报道，虽然它先前没有被分离出来；而且最近S.okadae来源的基因也已经被鉴定(Foster等，未发表的数据)。作为迈向这些R基因的图定克隆(map-based cloning)的一个步骤，我们从含有Rpi-oka1和Rpi-oka2的K39和含有Rpi-mcq1的K182构建了两个BAC文库。为了构建高质量的BAC文库，关键的是对部分消化的条件进行优化，和精确地按尺寸选择经部分消化的DNA片段。较小的片段往往产生转化效率高的较小插入克隆，而对于较大的片段，它产生的克隆中缺乏插入序列和转化效率较低的比例往往较高(Feng等，2006)。在本研究中，选择100-200Kb的片段用于BAC文库。

单倍体茄属物种的大小范围是800Mb-1,200Mb，取决于物种。Arumuganathan和Earle(1991)报道，S.berthaultii的单倍体基因组大小为840Mb，而马铃薯为800-930Mb。在本研究中，针对K39和K182文库，分别获得了平均插入序列大小为103.5Kb和85.5Kb的总共105,216和100,992个BAC克隆。假定马铃薯单倍体基因组大小为1,000Mb，我们估计，K39和K182文库分别包含大约10.9和8.6倍基因组当量。尽管我们选择的DNA片段范围是100-200Kb，但两个文库的平均插入大小小于预期。这种矛盾之处其他人也观察到了(Danesh et al.1998；Meksem et al.2000；Yüksel andPaterson 2005)，Frijters等(1997)提出这可能是由于在尺寸选择步骤中没有完全除去的较小片段的存在所导致的。从基因组覆盖率看，我们预期基因组的全部区域均应被充分代表。对此，我们用已知与R基因Rpi-oka1，Rpi-oka2和Rpi-mcq1连锁的基于PCR的标记进行了测试。

为了最大程度地减少所需PCR反应的数目，我们使用一种汇集(pooling)来策略筛选文库。先前已有数种不同的汇集策略被用于筛选BAC文库(Kleinet al.2000；Ozdemir et al.2004；Bouzidi et al.2006)。在我们的研究中，我们使用平板汇集(plate pooling)策略，结合平板池内的列汇集和行汇集策略。将每个384孔板汇集(pool)，并从每个汇集池制备质粒DNA。根据每个文库的基因组当量，我们在理论上预期，有11和9个汇集池会对特殊标记呈阳性，而且在用限制酶消化以鉴定抗性等位基因特异性标记之后，这些池中有一半会含有来自相应于每个基因的单元型的BAC克隆。

K39和K182文库中对基于PCR的标记呈阳性的BAC克隆与估计的基因组当量一致或者优于后者，并且鉴定出的平均数目分别为15和12.5。两个均略高于根据基因组当量预期的数目。这可能是由于马铃薯单倍体基因组大小被高估导致的，或者是由于所得BAC克隆的平均插入大小被低估导致的。另一方面，由于在我们的目标区域内HindIII位点过多或过少存在，我们构建的BAC文库可能有偏倚。为了实现更好的代表性，其他人使用两种或三种不同的限制酶，在构建BAC文库时富含A/T或GC(Chang et al.2001；Tao et al.2002；Chen et al.2004)。

根据用与Rpi基因连锁的PCR标记进行BAC筛选的结果，我们对每个文库的8个单独BAC克隆的BAC末端进行了测序。其中从K39和K182文库中都鉴定出一个克隆，它与番茄9号染色体上的番茄花叶病毒R基因Tm-2²(Lanfermeijer et al.2003)相似。此外，其它两个来自K182文库的BAC末端序列与数种不同的抗性蛋白相似。这些结果，以及我们在补充研究(Foster等，未发表；Zhu等，未发表)中构建的Rpi-oka1，Rpi-oka2和Rpi-mcq1遗传连锁图，它们结合起来表明，我们已经鉴定出了覆盖含有这些基因的基因组区的BAC克隆。

大插入BAC文库是染色体步移、BAC重叠群构建和在含R基因区域内物理作图的极有用工具。尽管我们还没有鉴定R基因的精确物理位置，如PCR法BAC筛选的结果和所选BAC克隆的BAC末端序列所示，但是通过从S.okadae和S.mochiquense构建覆盖10.9和8.6倍马铃薯单倍体基因组的BAC文库，不但方便了Rpi基因的克隆，并且对于需要进行基于作图的克隆步骤的进一步的马铃薯基因组研究也是有价值的。

上面对本发明进行了一般的公开，包括制作和使用可赋予晚疫病抗性的组合物的方法，下面提供的实施例用于提供本发明的书面描述，以使本发明，包括其最佳模式和等价物，能够完全实现。然而，本领域技术人员会意识到，本发明，如这些实施例所例示的，并不仅限于这里提供的具体的实施例。为了理解本发明的范围的目的，应当关注本公开所附的权利要求。

实施例

实施例1

从野生马铃薯种Solanum okadae和Solanum mochiauense构建BAC 文库和晚疫病抗性座位附近的克隆的鉴定

a.植物材料

用于构建这两个BAC文库的植物的世系如图1所示。S.okadae植物K39是反式杂合子(transheterozygote)，同时携带最初来自亲本A618的Rpi-oka1和来自A624的Rpi-oka2(Foster等.未发表数据)。S.mochiquense植物K182是Rpi-mcq1(先前命名为Rpi-moc1；Smilde等.2005)的杂合子，从一个BC1群体获得。

b.高分子量插入DNA的制备

用于高分子量(HMW)DNA制备的方法是Liu和Whittier(1994)和Chalhoub等(2004)的方法之上略微修改得到的。将植物材料体外培育于没有加蔗糖的Murashige和Skoog(MS)培养基上，收集幼叶组织并保存于-80℃。使用20克冷冻叶组织制备含有HMW DNA的DNA琼脂块(plug)。DNA琼脂块在0.7％inCert琼脂糖(Biozym，Oldendorf，Germany)中制备，用裂解缓冲液(1％十二烷基肌氨酸，0.2mg/ml蛋白酶K和3.8mg/ml二乙基二硫代氨基甲酸钠，溶解于0.5M EDTA，pH 8.5)清洗，并于4℃保存在0.5M EDTA中直到需要，而不会降低DNA的质量，如Osoegawa等(1998)所建议的。将保存的琼脂块浸泡在TE缓冲液中，切成小块，并用5单位HindIII部分消化1小时，这些条件是根据先前优化实验的结果确定的，优化实验显示这些条件可产生大小范围为50-300kb的DNA。

使用如Chalhoub等(2004)所述的三重尺寸选择(triple size selection)以改善插入物的大小和均匀性。第一次尺寸选择利用钳位均匀电场(CHEF)脉冲场凝胶电泳(Bio-rad，Hercules，USA)在1％ Seakem LE琼脂糖(Biozym，Oldendorf，Germany)上进行，在0.25x TBE缓冲液中1-40秒，120°，16小时和200V，然后直接在相同凝胶中进行第二次尺寸选择，在相同缓冲液中4-5秒，120°，6小时和180V。将含有100-200Kb的部分消化DNA的凝胶区域切下来，并分成两部分。对于第三次尺寸选择，将切下的凝胶片分别在1％Sea Plaque GTG低熔点琼脂糖(Biozym，Oldendorf，Germany)上电泳，3-4.5秒，120°，14小时和180V。将经过尺寸选择的DNA片段从凝胶上切下，并于4℃保存在0.5M EDTA(pH 8)中。利用BioRad电洗脱系统(Bio-rad，Hercules，USA)通过电洗脱将DNA回收在40μl 1x TAE缓冲液中。

c.BAC文库构建

连接和转化根据Allouis等(2003)和Chalhoub等(2004)所述的方法进行，并做了一些修改。对于从经尺寸选择的DNA片段得到的总洗脱DNA，将它在100μl反应体系中与10ng pIndigoBAC-5载体(EpiCentreBiotechnologies，Madison，USA)和800U T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs，Ipswich，USA)进行连接反应。连接反应物用Millipore膜(Millipore，Billerica，USA)在0.5xTE缓冲液中透析3小时。将3微升经透析的连接反应物与20μl ElectroMax DH10B电感受态细胞(Invitrogen，Paisley，UK)混合，冰上温育1分钟，并在180V、200欧姆和25μF条件下电穿孔。将转化细胞回收到1ml SOC培养基(Invitrogen，Paisley，UK)中，37℃温育1小时，涂布在含有17μg/ml氯霉素、125μg/ml IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和100μg/ml X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷)的选择性LB培养基上，并在37℃过夜培育。利用Q Pix装置(Genetix Ltd.，Dorset，UK)挑取白色克隆到384孔微滴定板(Genetix Ltd.，Dorset，UK)上，后者含有冰冷液(Freezingbroth)(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％ NaCl，0.63％ K₂HPO₄，0.045％柠檬酸钠，0.009％ MgSO₄，0.09％(NH₄)₂SO₄，0.18％ KH₂PO₄，4.4％甘油和17μg/ml氯霉素，pH 7.2)，37℃温育过夜，然后保存于-80℃。

d.BAC插入物尺寸测定(sizing)

为了确定BAC克隆的插入尺寸，随机选择BAC克隆，在3ml含有17μg/ml氯霉素的LB中37℃过夜培养。用略加改变的Qiagen质粒抽提试剂盒的方法(Qiagen Ltd，Crawley，UK)分离BAC DNA，并用NotI消化3小时，以便从载体释放插入的DNA。消化的DNA用CHEF凝胶电泳(Bio-rad，Hercules，USA)在1％琼脂糖凝胶上分离，参数为5-15秒、120°、16小时和200V，在0.5xTBE缓冲液中进行。

e.BAC文库筛选和BAC克隆的表征

将保存在各别384孔板中的BAC克隆汇集起来，并从每个汇集池制备质粒DNA。用8种已知与已鉴定的Rpi基因连锁的基于PCR的标记(表1a)对汇集后的DNA进行筛选。一旦用特定的标记引物鉴定出阳性汇集池，即利用高密度复制工具将该文库的原始384孔文库板复制到固体LB培养基上，并用与选择单个阳性克隆相同的引物通过PCR对克隆的行和列进行筛选。对选出的阳性克隆，用Big Dye v.3.1循环测序试剂(Applied Biosystems，Foster City，USA)进行BAC末端测序。测序反应在John Innes中心基因组实验室(Norwich，UK)的ABI 3730上运行。

此外，将从K39文库BAC池汇集得到的质粒DNA斑点印迹(spot-blotted)到Hybond-N+膜上，并用³²p-标记的okaNBS-Hae标记作为探针通过杂交进行探测。然后，对于用该探针鉴定出的池，将与之相应的384孔BAC板双点印迹(double spot)到Hybond-N+膜上，并与相同的探针杂交，以从池中鉴定出各个BAC克隆。从鉴定出的BAC克隆中分离出BAC DNA，并对其进行SNaPshot指纹分析，从含有该探针的同源序列的BAC构建出重叠群。该SNaPshot分析中也包括了使用选定的标记引物(marker primers)(TG551和TG35)PCR结果显示为阳性的选定BAC克隆。

f.结果

BAC文库的构建和表征

为了分离马铃薯晚疫病R基因，我们构建了来自两种植物K39和K182的两个BAC文库(图1)。与一种易感S.okadae基因型异交的结果表明，K39是Rpi-oka1和Rpi-oka2的反式杂合。对来自K182家系的植物的表型和基因型分析表明，K182对于Rpi-mcq1是杂合的。

从HindIII部分消化的马铃薯DNA构建了两个BAC文库。来自K39和K182的文库分别包含105,216和100,992个克隆，分别保存在274x384和263x384孔微滴定板中。从K39和K182文库分别随机选择38和40个克隆，NotI消化得到DNA，对DNA进行脉冲场凝胶分析来估计平均插入物的尺寸。来自两个文库的经NotI消化的克隆的图谱如图2所示。对K39文库，估计插入物尺寸范围是60-165Kb，平均为103.5Kb，对于K182文库，插入物尺寸范围是50-130Kb，平均为85.5Kb。马铃薯的单倍体基因组大小估计为大约1,000Mb，因此预期K39和K182文库的基因组当量分别为10.9X和8.6X。

实施例2

来自Solanum okadae和S.neorossii的Rpi基因的鉴定、作图和克隆

a.植物培育条件

12批(accession)Solanum okadag种子和4批S.neorossii种子(表1b)获自荷兰Wageningen的遗传资源中心(Centre for Genetics Resources，CGC)。将种子在70％乙醇中表面灭菌1分钟，1.5％次氯酸盐消毒5分钟，在灭菌蒸馏水中漂洗3次，并置于含有3％蔗糖的固体MS(murashige and Skoog)培养基(2％琼脂糖)上进行萌发。将萌发的幼苗转移到温室，并定期用杀真菌剂和杀虫剂进行处理，以控制蓟马、蚜虫、叶螨、白粉病和早疫病(Alternariasolani)。

b.致病疫霉菌株、接种和抗病性评分(pathotest scoring)

致病疫霉分离株98.170.3(小种(race)1.3.4.10.11；Smilde等2005)由Bangor大学David Shaw博士提供，UK分离株90128(小种1.3.4.7.8.9.10.11)、IPO-0(毒力谱未知)和EC1(小种3.4.7.11)由荷兰Wageningen Plant Research International的Edwin van der Vossen博士提供。“SuperBlight”分离株由UK Dundee SCRI的Paul Birch博士提供，是一种目前对英国和欧洲大陆的大量产业化种植的马铃薯栽培种具有致病性的分离株。分离株MP324、MP717、MP778、MP674、MP622、MP618和MP650从波兰IHAR获得。

将这些分离株在Rye B琼脂上18℃保存。以2周一循环的频率将新鲜的孢子囊亚传代到新平板上来产生孢子囊。周期性地在合适的敏感性植物的离体叶片上确认分离株感染宿主材料的能力。在Rye B培养基上培育10天后，通过用无菌去离子水冲洗平板收集新鲜的孢子囊，并使收获的孢子悬浮液在新鲜的培养皿内保持20分钟。在此之后，大部分孢子囊粘附到平皿的塑料表面上。用新鲜的冷水替换原始悬浮液的水，将孢子囊重新悬浮，并在4℃温育1-4小时，以诱导游动孢子释放。

使用一种离体叶片测定法来筛选针对致病疫霉的抗病性(在(Vleeshouwers等1999)的方法的基础上加以修改)。每株植物摘下两片叶子，插入到一小块湿的花型海绵(florist sponge)内，并置于9cm培养皿内。叶片接种10μl游动孢子悬浮液(20,000-50,000个游动孢子ml^-1)，用画笔(artist′sbrush)将接种体轻柔地铺散在背轴的(abaxial)叶片表面。将平皿用塑料膜包裹起来，并在受控的环境条件下(18℃；18h光照/6h黑暗循环)温育7-12天，随后对表型进行评分。将有叶子显示孢子形成病变的植物评为易感型；而没有孢子形成并且没有显示可见的症状或坏死的叶子的植物则评为抗性型。若两个叶片没有显示相同的反应，则把这种表型看作中间型(弱抗性型)。为了确认这些中间表型，至少进行三次独立的接种。对于区分鲜明的表型(两个叶片均为抗性或者均为易感)，认为两轮独立的接种就足够了。

c.DNA分离

从植物材料分离DNA使用DNeasy 96植物试剂盒(Qiagen)或者Park等2005的实验方案。简而言之，将大约50mg叶片材料收集到250μl核裂解缓冲液中(200mM Tris-HCl pH 7.5，50mM EDTA，2M NaCl，2％CTAB)，向其中添加200μl DNA提取缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5，350mM山梨醇，20mM亚硫酸氢钠)。然后用具有2个3mm钢球轴承(steel ball bearing)的Retsch MM300研磨器粉碎每个样品的叶片材料，并在65℃温育1小时。添加250微升的冰冷氯仿，混合样品并以3500rpm离心10分钟。将上清转移到新试管内，通过添加等体积的异丙醇沉淀DNA，随后3500rpm离心60min。将沉淀的DNA风干，并重新悬浮在100μl TE中。

d.AFLP和SSR分析及基于PCR的作图

对PstI/MseI消化后的模板DNA进行AFLP，方法基本上如(Thomas等1995)和(Vos等1995)所述，用PstI+0和MseI+1引物进行预扩增步骤，然后用PstI+2和MseI+3引物进行选择性扩增步骤。将AFLP反应产物变性，并在4.5％丙烯酰胺/7.5M尿素/0.5xTBE(45mM Tris-硼酸盐，1mM EDTA)凝胶上100W电泳2.5h来加以分离。电泳后，将凝胶转移到Whatman 3MM纸，干燥但不固定，并暴露于X射线薄膜(X-OMATAR，Kodak)1-7天。

从胶上切下可指示信息(informative)的AFLP条带，在TE(10mMTris-HCl pH 8.0，0.1mM EDTA)中重新水化。然后将凝胶片转移到新鲜的TE中，粉碎，并通过14000g离心1min除去碎片。为了克隆，首先用PCR再扩增AFLP片段，使用2μl上清液，并使用与最初扩增相同的循环条件和引物。根据制造商的使用说明将终产物克隆到pGEM-T Easy(Promega，Madison，Wisc.)中，并用ABI PRISM Big Dye(v.3.1)Terminator CycleSequencing Ready Reaction kit(PE Applied Biosystems)试剂盒根据制造商的使用说明进行测序。

SSR PCR反应在25μl反应体积中完成，其含有20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，dCTP、dTTP和dGTP各0.4mM，0.012mM非标记dATP，370kbq[γ-³³P)]dATP(Amersham Biosciences，)，每种引物各0.4μM，1U Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)和100ng模板DNA。热循环条件包括首先在94℃变性4min的步骤，随后是2min的引物退火步骤(50℃或55℃，根据所用的引物对；见表2)，和72℃延伸90s的步骤。随后的循环如下：29个循环的94℃ 1min、引物退火温度2min，72℃ 90s，然后是72℃ 5min的最终延伸步骤。通过添加等量的终止溶液(含有溴酚蓝和二甲苯蓝的95％甲酰胺)使扩增产物变性并加热到98℃ 10min。将2-5微升反应物在含有6M尿素的6％致变性聚丙烯酰胺上100W运行2-4小时。将凝胶干燥，并暴露于X-ray膜，与AFLP反应相同。

常规的PCR在15μl反应体积中完成，其含有20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，每种dNTP各200μM，每种引物各0.4μM，0.5UTaq聚合酶(Invitrogen)和10-100ng模板DNA。热循环条件典型地包括首先在94℃变性2min的步骤，随后是35个循环的94℃ 15s，引物退火温度(表2)30s，72℃ 1min/kb扩增产物，然后是72℃ 10min的最终延伸步骤。为了测序，在37℃用1.2U外切核酸酶I和x1.2U SAP温育30min来从PCR产物中除去引物和dNTP，随后在80℃温育20min使酶变性。测序使用ABI PRISM Big Dye(v.3.1)Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(PE Applied Biosystems)试剂盒根据制造商的使用说明完成。对序列进行检查，寻找抗性和敏感单元型之间的单核苷酸多态性(SNP)，这些SNP能够用于开发用于在分离群体中作图的CAPS(剪切扩增多态序列)标记。

e.结果

各批CGN中致病疫霉抗性的变异

用致病疫霉分离株98.170.3在离体叶片测定中对12批S.okadae进行筛选显示，在6批中存在抗性表型变异(表1b)。其余的6批均对这种分离株敏感，尽管有CGN数据表明它们中至少有3批对致病疫霉有中等或很强的抗性。抗性是显著的，因为自接种后第4天起(from 4 days post inoculation)叶片组织上完全没有芽孢形成，而敏感性个体的叶片上明显有大量菌丝生长(图1)。敏感性叶片往往到接种后第7天为止完全变黑。

S.okadae和S.neorossii作图群体的开发

将来自S.okadae中的5批的抗性个体与来自相同或不同批(表3)的敏感性个体杂交。在每个杂交中，对致病疫霉的抗性在所得的子代中1∶1分离，表明在抗性亲本中存在潜在的5个杂合Rpi基因。在易感性S.okadae植物与抗性S.neorossii植物之间进行种间杂交。所得子代中的抗性分析表明存在一个以1∶1比例分离的显性Rpi基因。

S.okadae中Rpi基因的作图

Rpi-oka1

使用总共72种AFLP引物组合来筛选Soka014抗性和敏感性池，以获得与Rpi-oka1连锁的片段。引物组合PstI+CT/MseI+AGA产生了一个97bp片段，它仅从Soka014群体的抗性亲本和抗性池中被扩增出来。该片段的序列与来自番茄组合EST文库(http://www.sgn.cornell.edu)的表达序列标签(EST)SGN-U214221相似。从SGN-U214221的序列设计PCR引物，用它们从番茄(Solanum lycopersicum)(先前称作Lycopersicon esculentum，Le)和潘那利番茄(S.pennellii)(先前称作L.pennellii，Lp)扩增出一条大约2kb的条带，该条带用AluI消化时显示在两个物种之间的多态性。通过对Le/Lp渗入系(introgression lines)中该多态性的分析(Eshed and Zamir 1994)，这个标记被定位在IL 9.2中，表明该标记可能位于染色体IX的任一个臂上。在与IL9.2基本上重叠的IL 9.1中没有该多态性，提示该标记紧邻于任一染色体臂的着丝粒。使用不同的PCR引物(SokaM2.9LF5和SokaM2.9LR5)和DdeI消化，在Soka014群体中对该标记(SokaM2.9L)进行了作图，结果其与Rpi-oka1的距离为大约6cM(48个分离子中有3个重组体)(图3)。

根据SGN数据库中已知的染色体IX RFLP标记序列设计PCR引物，对从抗性和敏感性亲本DNA扩增的PCR产物进行测序，并鉴定能够用于CAPS标记的SNP(表2)，用这样的方法开发了更多的标记。以此方式，Rpi-oka1被图定于在染色体IX的6.0cM区，由标记C2_At4g02680和TG186划界。标记TG551和TG35被发现与Rpi-oka1共分离(图3)。

Rpi-oka3

用总共48种AFLP引物组合对Soka040群体的抗性和敏感性池进行筛选。引物组合PstI+AT/MseI+GCT产生了一个108bp的连锁片段。对于该片段没有发现显著的序列相似性，并且尽管可以用根据该序列设计的PCR引物从Le和Lp扩增一个片段，但是没有发现可以用来在渗入系中图定该标记的多态性。然而，在Soka040群体的亲本之间存在一个DdeI多态性，这使经变换的(converted)PCR标记(M6.44)得以被图定在距Rpi-oka3大约23cM处(图3)。

AFLP引物组合PstI+AA/MseI+GTC产生了一个大约260bp的连锁片段。从该序列设计的引物从Le和Lp扩增了一个片段，用HaeIII或Sau3AI消化时它显示了多态性。该多态性存在于渗入系IL9-2中。在Soka040群体的亲本之间没有发现多态性，因此该标记不能相对于Rpi-oka3来图定。

为了确认Rpi-oka3在染色体IX上的位置，研究了4个SSR标记(Stm0010，Stm 0017，Stm 1051 and Stm 3012；(Milbourne等1998))与Rpi-oka3的连锁。Stm0017未能成功地从敏感性亲本扩增，因此不能用于作图。Stm0010，Stm1051和Stm3012都被图定在染色体IX的短臂(Milbourne等1998)上，它们均在抗性与敏感性的亲本和池之间显示多态性，进一步证明该基因位于染色体IX上(图3)。

Rpi-oka2

使用总共72种AFLP引物组合来筛选Soka013抗性和敏感池，以获得与Rpi-oka1连锁的片段。AFLP引物组合PstI+AA/MseI+CAT产生一个连锁片段，其被变换成大约200bp的基于PCR的等位基因特异性标记(PCR-basedallele specific marker)(Soka13M5.17)。该标记被图定在距Rpi-oka2大约6.5cM处(图3)。

此外，在Rpi-oka2连锁图中设置了另外3个AFLP标记(P12M44_103，P13M42_228和P17M33_472)(图3)。

因为Rpi-oka1和Rpi-oka3显示与染色体IX标记TG551和TG35紧密连锁，所以也考察了这些标记与Rpi-oka1的连锁情况。在Soka013群体中，TG551和TG35被图定在染色体IX上Rpi-oka2近着丝粒方向(centromeric of)0.7cM处(图3)，侧翼是标记T1421。

在S.neorossii中对Rpi基因进行作图

Rpi-nrs1

总共11个AFLP标记被定位在Rpi-nrs1连锁图上(图3)。有人尝试过将这些标记转换成SCAR标记，以便研究能够用来将这些标记定位在Le/Lp渗入系上的多态性(Eshed和Zamir 1994)。然而，这些标记都没有给出信息，因此未能利用这些标记确认Rpi-nrs1的染色体定位。标记TG551确实显示与Rpi-nrs1紧密连锁，因此我们得出结论，Rpi-nrs1也位于染色体IX上，可能与Rpi-oka13位于相同的座位。

与Rpi-oka1，2，3和Rpi-nrs1紧密连锁的NBS标记在作图中的使用

将NBS标记NBS3B(见实施例3)转换成基于PCR的SCAR标记，它可以用引物okaNBSHae-F和okaNBSHae-R(表2)加以扩增。这些标记从含有Rpi-oka1，Rpi-oka2和Rpi-nrs1的抗性植物扩增出了一个555bp的片段(标记okaNBSHae)。在每个群体中，这个标记显示与抗性基因共分离(图3)。对于Rpi-oka3，从抗性植物和易感植物均扩增出了PCR产物。然而，通过用MaeIII消化将该标记转换成了CAPS标记。该CAPS标记在Soka040群体中显示与Rpi-oka3共分离(图3)。

BAC文库筛选和重叠群构建

我们使用了9个与Rpi-oka1，Rpi-oka2和Rpi-mcq1连锁的PCR标记对BAC文库进行筛选。如表1a所示，TG551、TG35和TG186与Rpi-oka1连锁。TG551也与Rpi-oka2连锁。标记okaNBSHae同时与Rpi-oka1和Rpi-oka2连锁。尽管TG551与来自S.okadae的两个基因均连锁，但是来自Rpi-oka1和Rpi-oka2单元型的该标记的等位基因可以通过如表1a所示的限制性消化加以区分。U282757、U296361、TG591和U279465均与Rpi-mcq1连锁。显示对这些标记呈阳性的BAC池的数目，对于K39文库为11-17个不等，对于K182文库为9-14个不等(表1a)。

在K39文库中，从17个池扩增出了TG186标记。确定该标记扩增自哪个单元型(Rpi-oka1或Rpi-oka2)是不可能的。TG186尽管是CAPS标记，但与Rpi-oka1相斥连锁，并且Rpi-oka1单元型中存在的等位基因不能与Rpi-oka2单元型中的等位基因区分。从18个池扩增出了标记okaNBSHae。由于该标记在Rpi-oka1和Rpi-oka2单元型之间没有多态性，所以不可能根据该标记来指定这些BAC的单元型。通过PCR从16个池扩增出了TG551，限制酶消化显示有6个池对Rpi-oka1单元型呈阳性，7个对Rpi-oka2单元型呈阳性。通过PCR从11个池扩增出了TG35，经过限制性消化，其中8个显示来自Rpi-oka1单元型，提示其余3个来自Rpi-oka2单元型。图4a-4c所示的是基于PCR的标记及它们的相关限制图谱的凝胶图像。

通过用okaNBSHae探针与合并的BAC DNA杂交，总共鉴定了有67个池含有具备同源序列的BAC克隆。从含有来自已鉴定池的每个单个BAC克隆的高密度双重斑点膜(high density double-spotted membrane)的筛选中，总共鉴定了85个BAC克隆，分离了DNA并进行BAC SNaPshot指纹图谱，还有10个选定的对TG551和/或TG35标记呈阳性的克隆。在所产生的多个重叠群中，有1个重叠群含有通过如下方法鉴定的BAC克隆，a)使用连锁标记TG551，TG35和共分离标记okaNBSHae进行基于PCR的筛选，和b)用okaNBSHae标记作为探针进行杂交。该BAC重叠群如图5所示。

表1a用与晚疫病抗性座位连锁的基于PCR的标记对BAC池进行筛选

a PCR显示对标记呈阳性的池的数目

b导致抗性等位基因和易感等位基因之间出现多态性的限制酶

c用特定酶消化后对标记呈阳性的池的数目

d由于标记系排斥连锁或者在抗性和易感等位基因之间无多态性而不适用

从K39文库随机选择了一些对标记TG551、TG35或okaNBSHae呈阳性的池，TG551、TG35是与Rpi-oka1或Rpi-oka2紧密连锁的标记，而okaNBSHae与Rpi-oka1或Rpi-oka2共分离。将每一个所述BAC文库的原始384孔板复制到固体LB培养基上。从每个板上按行和列刮取菌落，并以相关标记的存在为准加以筛选。从384孔板选取单个克隆。

在选取单个克隆之后，分离BAC DNA，并对BAC末端进行测序。BLAST同源搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)显示，在来自K39文库的克隆中，有两个克隆(K39_272N11和K39_256M23)的BAC末端序列彼此之间高度相似而且与番茄花叶病毒R基因Tm-2²(Lanfermeijer等2003)极为近似。

根据所得的每个BAC末端序列设计PCR引物，并利用它们从Rpi-oka1和Rpi-oka2亲本基因型扩增产物。对PCR产物进行测序，并分析它们中是否存在这样的SNP，使得这些PCR产物可以用作各自群体内的标记。将转换成功的标记置于Rpi-oka1(1213个体)和Rpi-oka2(1706个体)的高分辨率遗传图谱上。这些标记相对于Rpi-oka1和Rpi-oka2的位置如图6所示。

Rpi-oka1的高分辨率作图和克隆

从由1214个个体组成的Rpi-oka1群体Soka014中筛选SokaM2.9L和TG186两种标记的重组体。总共鉴定了169个重组体，覆盖14cM的遗传间隔。对这些用于疾病表型的重组体的最初筛选表明，抗性座位定位于标记TG35的南部(south)。因此，从较大的重组体亚系列中选择了一个包含53个标记TG35和TG186之间的重组体的亚系列。对这些重组体筛选对致病疫霉的抗性或易感性，并使用根据BAC末端序列开发的标记进行筛选。结果表明，Rpi-oka1位于一个以标记TG35和185L21R(BAC末端标记)为边界的0.33cM的遗传间隔内(图5、6)。参考由PCR构建的物理图和对来自K39文库的BAC克隆的指纹图谱分析(图5)，预测Rpi-oka1存在于被BAC克隆K39_148P20和K39_266I9覆盖的物理区域中。对这两个BAC克隆进行测序，为Rpi-oka1鉴定了一个候选ORF。

Rpi-oka2的高分辨率作图和克隆

为了构建高分辨率图，我们使用两个侧翼的基于PCR的标记(TG551和T1421；图1a)来筛选一个大(expanded)群体，以选择抗性座位周围的重组体。从具有1706种基因型的大群体选择了46个重组体，它们代表了两个PCR标记之间2.9cM的间隔。确定了这些重组体对晚疫病抗性的表型，并使用来自所述BAC重叠群的BAC末端标记确定了它们的基因型。结果表明，Rpi-oka2位于以BAC末端标记266I9F和185L21R为边界的0.12cM的遗传间隔内(图5、6)。参考由PCR构建的物理图和对来自K39文库的BAC克隆的指纹图谱分析(图5)，预测Rpi-oka2存在于为Rpi-oka1鉴定的同一物理区域中。然而，除了BAC克隆K39_272N11(它的一个末端包含Tm2²同源的一部分)之外，在文库中不能鉴定出覆盖与Rpi-oka1相同的物理区域的克隆(图5)。作为另一种备选方法，使用为了扩增完整的Rpi-oka1 ORF而设计的引物与来自Rpi-oka2群体的亲本植物的DNA进行PCR反应。将所得的PCR产物克隆到pGEM-T Easy内，对4个克隆进行测序，以获得Rpi-oka2候选物的共有序列(consenus sequence)。

Rpi-nrs1的高分辨率作图

为了构建高分辨率图，我们使用3个侧翼基于PCR的标记(SneoM2.9a，TG551和TP25；图3)筛选大群体(expanded population)，并选择Rpi-nrs1抗性座位周围的重组体。TP25是从AFLP标记P13M34_370[R]转换得到的。来自具有1402种基因型的扩展群体最初选择了323个重组体，产生了一个SneoM2.9a和TP25之间的遗传距离23cM的间隔。同时，开发了更靠近Rpi-nrs1的PCR标记(U317500和U270442)。结果选择了40个重组体，并确定了这些重组体对晚疫病的抗性表型。名为okaNBSHae的RGA标记被图定于与Rpi-nrs1相同的遗传位置，并从来自K39 BAC文库的Rpi-oka1/2重叠群开发了数个基于BAC末端序列的PCR标记，它们允许构建Rpi-nrs1周围的精细尺度的遗传图。此外，用三种不同的分离株测试这些重组体的抗性，结果表型以不同的方式分离，这表明在该群体中存在多个基因。第二个基因指定的Rpi-nrs1b被预期位于Rpi-nrs1a的南部(south)(图6)。

Rpi-oka1，Rpi-oka2和Rpi-oka3的分析

Rpi-oka1 ORF长度为2673bp，并被翻译成一个891个氨基酸的蛋白序列，计算分子量为102kDa，pI为8.05。Rpi-oka2 ORF包括2715bp，并翻译成一个905个氨基酸的蛋白序列，计算分子量为103.6kDa，pI为8.16。从含有Rpi-oka3的材料扩增出的PCR产物的序列与Rpi-oka2的相同。Rpi-oka1蛋白包含卷曲螺旋核苷酸结合区-富亮氨酸重复(CC-NB-LRR)类抗性蛋白的全部特征。在蛋白N端部分最先215个氨基酸内有4个区域，每一个区域都具有3个预测的七肽重复基序，这种基序是卷曲螺旋域的典型特征(图7)。所有的NB-ARC域(van der Biezen和Jones 1998)均位于氨基酸序列216-505内。NB-ARC域之后是一个包含一系列15个不规则LRR基序的区域，它们可根据共有序列进行比对：LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(x)LxxLPxx(其中L可以是L、I、M、V、Y或F，x任意氨基酸)(McHale et al.2006)。

Rpi-oka2序列与Rpi-oka1不同之处在于在基因5’端插入了42个核苷酸(图7)。结果得到的存在于Rpi-oka2相应区域中的额外14个氨基酸不影响任何预测的卷曲螺旋域。在Rpi-oka1和Rpi-oka2之间还存在3个单核苷酸多态性(SNP)；A1501T，T1767C和G2117A(图7)。这些核苷酸差异导致Rpi-oka1和Rpi-oka2之间2个氨基酸的不同(图7)。501位的差异位于NB-ARC域的末端，恰好在LRR区之前，导致Rpi-oka1中的天冬氨酸变为Rpi-oka2中的酪氨酸。这个氨基酸变化不影响任何已表征的NB-ARC域。在第九个LRR中的706位置，Rpi-oka1中的精氨酸在Rpi-oka2中变成赖氨酸；这两个残基都是带正电荷的极性氨基酸，因此可被看作是同义改变。

Rpi-oka1和Rpi-oka2在核酸水平上与Tm-2²分别有80.9％和79.7％的同一度。在氨基酸水平上，这相当于72.1％和71.1％的同一度。如所预期的，考虑到LRR域在识别特异性中的作用，在LRR域中相似性百分比最低，Rpi-oka1/2和Tm-2²仅有57.5％的相似性。与之形成对照的是，Rpi-oka1/2和Tm-2²在整个卷曲螺旋和NB-ARC域内的序列相似性为81.8％和79.7％；在NA-ARC区保守域内，Tm-2²和Rpi-oka1仅相差1个氨基酸。

使用引物oka1long-F和oka1long-R(表2)从含有Rpi-oka3的亲本材料扩增出Rpi-oka1同源序列。将所得的PCR产物克隆到pGEM-T中，并测序。所得序列与Rpi-oka2相同。

从易感性S.okadae亲本A613不可能扩增出全长的Rpi-oka1侧向同源物(paralogues)。这个观察结果与okaNBSHae标记仅能从抗性基因型扩增出来的事实共同提示：导致易感表型的原因是Rpi-oka1的缺失，而非无功能的拷贝。

Rpi-oka1也存在于抗性S.neorossii基因型中，并是Rpi-phu1的直向同源物。

在来自于S.neorossii CGN1800批的抗性个体的分离群体中对Rpi基因作图，也显示在已鉴定基因(Rpi-nrs1)和标记TG551之间有紧密连锁，表明该基因位于和Rpi-oka1相同的区域。类似地，有报道称来自S.phureja的Rpi-phu1也被图定在该区域(Sliwka等2006)。在一个对Rpi-phu1分离的149株马铃薯群体中，Rpi-oka1标记okaNBSHae-F/R与抗性共分离。从3个含有Rpi-phu1的抗性基因型的DNA扩增全长Rpi-oka1侧向同源物。得到了单个产物，测序显示其与Rpi-oka1相同。类似地，对抗性S.neorossii材料进行的扩增显示，Rpi-oka2存在于该材料中，并且在40个预先选择的重组体中，该基因的存在与抗性相关。含有Rpi-nrs1或Rpi-phu1抗性的植物材料也显示对本研究使用的所有致病疫霉分离株(EC1除外)有抗性。因此我们得出结论：Rpi-oka1＝Rpi-phu1；且Rpi-oka2＝Rpi-oka3＝Rpi-nrs1。

表1b 12批Solanum okadae和4批S.neorossii对致病疫霉的反应

a限制酶表示该标记是CAPS标记，即指示等位基因特异标记，[R]指示该标记以互斥相(repulsion phase)连锁，SSR指示该标记是简单序列重复标记，空白指示该标记没有多态性或者未针对Rpi基因进行检测。

表3 S.okadae内的杂交及它们的后代中晚疫病抗病(R)和敏感(S)分离体

^a植物标识号后面是其保藏批号(accession number)及对致病疫霉接种的反应：CGN荷兰遗传资源中心；BGRC，Braunschweig遗传资源中心。

^b显示抗性(R)或敏感(S)表型的植物数目

实施例3

使用候选基因/等位基因发掘方法对Rpi-oka1和RPI-nrs1进行作图和克隆

迄今为止，R基因的克隆典型地是通过定位克隆策略实现的。一旦从特定R座位克隆了功能基因，就可以尝试从相同或不同物种克隆功能等位基因，以确定给定座位的等位基因频率和等位变异。这里我们证明，NBS谱分析(profiling)(Linden等，2004)与集群分离分析法(bulked segregantanalysis)(BSA)(Michelmore等，1991)的组合是一种强有力的工具，用来产生能够预测所研究R座位位置的候选基因标记，同时在此过程中为通过功能等位基因发掘策略克隆基因提供了出发点。

植物材料

从荷兰Wageningen的遗传资源中心(CGN)获取多个批次的Solanumokadae和Solanum neorossii。用致病疫霉筛选之后，使用来自特定批次的抗性基因型制作种间或种内作图群体。Rpi-oka1作图群体7698通过使OKA7014-9(OKA367-1和OKA366-8之间杂交而得到的抗性F1代植物，OKA367-1和OKA366-8两者均来自CGN18108批次)与易感植物NRS735-2(CGN18280)杂交而产生。全部的S.okadae基因型均来自批次CGN18108。Rpi-nrs1作图群体7663通过使抗性植物NRS365-1(CGN18000)与NRS735-2杂交产生。

疾病测定

茄属物种的离体叶片测定(DLA)按照Vleeshouwers等(1999)的叙述进行。叶子在背轴侧用10μl的接种体液滴(5x10⁴个游动孢子/ml)接种，并在16h/8h白天/黑夜光周期的气候箱中15℃温育6天。接种6天后，将显示孢子形成的叶子评价为易感性，而未显示症状或坏死斑的叶片评价为抗性。

标记开发

从茄科(Solanaceae)基因组网络(Solanaceae Genomics Network)(SGN)数据库选择合适染色体位置的标记，然后把它们开发成各个相关作图群体中的多态性标记。通过van der Linden等(2004)介绍的NBS谱分析法开发了其它的候选基因标记。通过用限制酶MseI、HaeIII、AluI、RsaI或TaqI限制性消化基因组DNA产生模板。将限制片段连接上衔接头(adapter)。通过根据NBS域的保守域(P-环、激酶-2和GLPL基序(Calenge，2005；Syed，2006)设计的放射性标记引物(nbs1，nbs2，nbs3，nbs5a6或nbs9)产生PCR片段。

候选R基因的PCR扩增

用Taq聚合酶或Pfu Turbo聚合酶进行长程PCR(Long range PCR)制备50μl反应混合物，其包含50ng gDNA、1μl正向引物(10μM)、1μl反向引物(10μM)、0.8μl dNTP(每种5mM)、5μl 10X缓冲液、5单位Taq聚合酶(PerkinElmer)或1μl pfu Turbo(Invitrogen)。使用如下的PCR程序：94℃ 3min、94℃30sec、55℃ 30sec、72℃ 4mins、72℃ 5min，29个循环。

基因组步移

通过克隆侧翼DNA片段来延伸标记序列。克隆利用ClonTech基因组步移试剂盒根据制造商的使用说明来进行，使用包含如下互补序列的平末端衔接子(blunt adapter)：5-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGA-3和5’-PO₄TCCAGCCC，以及衔接子特异引物AP1(5’-TAATACGACTCACTATAGGGC)和AP2(5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT)。进行同时限制酶切-连接(simultaneous restriction-ligation)反应，然后进行2轮PCR。制备50μl限制酶切-连接(RL)混合物，其含有250ng基因组DNA、5单位平末端切割酶(Bsh1236I、AluI、DpnI、HaeIII、RsaI、HincII、DraI、ScaI、HpaI或SspI)，1μl基因组步移衔接子(25μM)、10mM ATP、10μl 5X RL缓冲液、1单位T4 DNA连接酶(Invitrogen 1U/μl)。将消化混合物在37℃温育3小时。样品在PCR之前稀释50倍。对于第一轮PCR，制备20μl反应混合物，其含有5μl稀释的RL DNA、0.6μl特异性正向引物1(10μM)、0.6μl AP1(10μM)、0.8μl dNTP(每种5mM)、2μl 10X缓冲液(Perkin Elmer)、5单位Taq聚合酶(Perkin Elmer)。第一次PCR使用如下的循环程序：94℃ 30sec作为变性步骤、56℃ 30sec作为退火步骤、72℃ 60sec作为延伸步骤。执行35个循环。第二次PCR与第一次的条件相同，使用特异引物2和AP2，以及5μl 50倍稀释的第一次PCR的产物。取5μl第二次PCR产物在凝胶(1％琼脂糖)上检查，将最大的扩增子从Promega克隆到-T Easy载体中，并测序。

用法将候选R基因克隆到双元表达载体中

根据制造商的说明使用克隆技术高效地将候选基因与合适的启动子和终止子序列一起克隆到双元载体pKGW-MGW中。在质粒pKGW中，gateway盒子被交换为pDESTr4r3扩增的多元gateway盒子，产生pKGW-MGW。在本研究中，我们使用Rpi-blb3(Lokossou等，论文准备中)的启动子和终止子，它们被分别克隆到pDONR载体pDONRP4P1R和pDONRP2RP3中，产生pENTR-Blb3P和pENTR-Blb3T。将用Pfu Turbo聚合酶产生的PCR扩增子克隆到pDONR221中，产生pENTR-RGH克隆，随后利用多重克隆试剂盒(Invitrogen)将其与Rpi-blb3启动子和终止子片段一起克隆到pKGW-MGW中。通过过夜进行BP反应II产生pENTR。(http://www.untergasser.com/lab/protocols/bp_gateway_reaction ii_v1_0.shtml)。通过用5μl BP反应II混合物热激转化DH5α感受态细胞(Invitrogen)。细胞在含有50mg/ml卡那霉素的LB培养基上进行筛选。通过菌落PCR检查菌落中是否存在相关的插入。从大肠杆菌(E.coli)提取出合适的pENTR克隆的DNA，用它来进行多重LR克隆反应，以产生最终的双元表达克隆(http://www.untergasser.com/lab/protocols/lr_multiple_gateway_reaction_vl_0.shtml)。用5μl BP反应II混合物热激转化DH5α感受态细胞(Invitrogen)。细胞在含有50mg/ml壮观霉素的LB培养基上进行筛选。通过PCR对克隆进行检查，考察是否存在正确插入。将阳性克隆在补充有100mg/ml大观霉素的LB培养基上过夜培养。通过电穿孔将最终的表达载体转移到土壤杆菌菌株COR308中。在补充有100mg/ml大观霉素和12.5mg/ml四环素的LB培养基上30℃过夜筛选克隆。

测序

对用Taq聚合酶(Perkin Elmer)或Pfu Turbo聚合酶(Invitrogen)产生的克隆片段或PCR产物测序如下：用5μl PCR产物或5ng质粒、3μl缓冲液、1μlDETT(Amersham)和1μl正向或反向引物制备10μl测序反应混合物。所用的PCR程序如下：25个循环的94℃ 20sec、50℃ 15sec、60℃ 1min。序列用ABI 3730XL测序仪生成。

结果

S.okadae和S.neorossii批次中晚疫病抗性的遗传基础和谱

为了确定S.okadae和S.neorossii中晚疫病抗性的遗传基础，用复合(complex)致病疫霉分离株IPO-C进行离体叶片测定(DLA)，分别对14和5个批次进行筛选。分别利用选自oka批次CGN18108和nrs批次CGN18000的抗性基因型产生S.okadae和S.neorossii作图群体7698[oka7014-9(oka367-1xoka366-8)xnrs735-2)和7663(nrs365-1xnrs735-2)。用群体7698的50个F1子代植株进行DLA之后，有30个被评价为抗性，22个被评价为易感，提示存在一个单一的显性R基因，我们将其命名为Rpi-oka1。在从群体7663选择的60个F1子代植物中，有24个被评价为抗性，36个评价为易感，提示nrs365-1也含有一个单一的显性R基因，我们将其命名为Rpi-nrs1。

通过用数种具有不同复杂性(complexity)和侵袭性(aggressiveness)的分离株(表4)进行刺激，分析这两个基因的抗性谱。Rpi-oka1和Rpi-nrs1似乎具有相同的特异性。菌株EC1是唯一能够同时克服这两种R基因的菌株。

Rpi-oka1和Rpi-nrs1在染色体IX上的作图

为了确定在群体7698中分离的Rpi-oka1基因是否在染色体IX上，我们尝试在群体7698的最初50个F1子代植株中开发并定位染色体IX特异标记TG35、TG551、TG186、CT183和T1421。发现仅有TG35和TG186在亲代基因型之间具有多态性，而且它们确实与Rpi-oka1连锁(图9)。在尝试开发额外的Rpi-oka1标记以及Rpi-nrs1标记时，我们在两个作图群体中进行了集群分离分析(BSA)并结合进行了NBS谱分析。结果在7698中为Rpi-oka1鉴定了9个集群特异标记(bulk specific marker)，在7663中为Rpi-nrs1鉴定了8个集群特异标记。最后，在7698和7663群体最初的50和60个F1子代植物中，只有两个集群特异片段分别与抗性发生了共分离，其中一个是用NBS2/RsaI引物-酶组合产生的，另一个是用NBS3/HaeIII产生的。因此，克隆这些片段并进行了测序。当进行BLAST分析时，两个片段均显示与番茄染色体IX上的Tm-2²基因高度相似(Lanfermeijer等，2003；2005)。所克隆的NBS2/RsaI和NBS3/HaeIII片段的大小为350和115bp，与Tm-2²具有88.3％和80.3％的DNA序列同一性。这些发现提示，Rpi-nrs1在染色体IX上定位的区域可能与Rpi-oka1相同。为了确认这一点，针对每个片段设计了特异的引物，并利用它们在Rpi-oka1作图群体和Rpi-nrs1作图群体二者中开发SCAR标记。这样，分别为群体7663和7698开发了两个NBS谱分析衍生标记NBS3A和NBS3B。随后，在Rpi-nrs1作图群体7698中确定了这些标记相对于Rpi-nrs1及染色体IX特异标记TG35和TG551的位置。TG35、TG551和NBS3B在60个个体的最初F1群体中与Rpi-nrs1共分离，证明Rpi-nrs1在染色体IX上定位的区域确实与Rpi-oka1相同(图9)。

为了开发用于重组分析的侧翼标记(flanking marker)，从SGN选择了与TG35或TG551连锁的标记，并在这两个群体中对它们加以筛选。尽管多态性水平较低，但开发了基于EST的标记U276927和U270442I，并分别在群体7698和7663中进行了作图(表4和图9)。U276927被图定在Rpi-oka1北侧2cM处，而U270442I被图定在Rpi-nrs1南侧3.5cM处。随后，分别使用侧翼标记U276927/TG186和NBS3B/U270442在群体7663的后代群体7698和1005的500个后代中进行重组分析。结果，Rpi-oka1和Rpi-nrs1分别被图定在4cM和3.6cM的遗传间隔之内(图9)

在S.okadae和S.neorossi中进行基于Tm-2²的等位基因发掘

本发明人采用基于同源性的等位基因发掘策略来克隆Rpi-oka1和Rpi-nrs1。

第一个步骤是设计这样的简并引物，它们带有位于Rpi-oka1和Rpi-nrs1座位上候选Tm-2基因同源体(Tm2GH)的推定起始和终止密码子。根据公共序列数据库中所有可得的马铃薯和番茄来源的类Tm-2²序列的比对结果，我们设计了引物ATG-Tm2-F和TGA-Tm2-R(表5)。然而，当针对两个作图群体的亲本基因型用该引物系列进行测试时，没有产生预期大小的扩增子。因为ATG-Tm2-F引物序列存在于共分离的来源于NBS谱分析的标记序列内，所以在原来的TGA-Tm2-R引物上游100bp处(该区域在所有被比对的类Tm-2²序列中是保守的)设计了三个新的反向引物(REV-A、-B和-C)。当与ATG-Tm2-F或NBS3B-F组合时，仅从抗性亲本基因型，即oka7014-9和nrs365-1，特异扩增出了一个单一的大约2.5kb扩增子。将这些片段克隆到-T Easy载体中，并用引物步移策略对来自每个基因型的大约96个单个克隆进行了测序。得到所有的序列都与Tm-2²具有75-80％的相似度。在来源于oka7014-9的序列中可以区分出总共5种不同的类型，而nrs365-1序列仅能分成3个不同的类型。随后，根据与NBS3B序列的同源性程度将这些不同的类型命名为NBS3B样或非NBS3B样(表6)。

为了恢复(retrieve)所扩增的Tm2GH中丢失的C端部分，我们用引物GSP1-1、GSP1-2和GSP2(表5)进行3’-基因组步移，这些引物在REV-A、-B和-C引物的大约100bp上游设计，以便在所克隆的类NBS3B序列和用基因组步移产生的克隆之间产生100bp的重叠。从oka7014-9获得了3个～200bp的扩增子，从nrs365-1获得了一个～1kb的扩增子。在克隆、测序和与已克隆的Tm2GH比对之后，全部4个克隆似乎均与克隆Tm2GH-nrs8bis匹配，因为重叠的100bp是精确匹配的。为了能够随后从Rpi-oka1和Rpi-nrs1座位扩增全长Tm2GH，我们根据全长Tm2GH-nrs8bis序列与来自番茄的Tm22序列的比对(图2)，设计了新的反向引物(TAA-8bis-R)(表5)。由于原始的TGA终止密码子不存在于Tm2GH-nrs8bis序列中，我们包含了下游12bp的下一个框内终止密码子(TAA)(in-frame stop-codon)。

随后用高保真Pfu Turbo聚合酶和引物ATG-Tm2-F和TAA-8bis-R，从oka7014-9和nrs365-1进行Tm2GH全长扩增。将～2.6kb的扩增子克隆到-T Easy载体中并测序。从OKA7014-9获得了三种不同类型的克隆，其中一个具有预期大小的ORF(Tm2GH-oka1bis)。从NRS365-1获得的全部克隆均彼此相同，并且也包含预期的ORF。选择克隆Tm2GH-nrs1.9，与Tm2GH-oka1bis一起用于进一步的遗传分析。

在以Tm2GH-oka1bis和Tm2GH-nrs1.9作为目标进行互补分析之前，我们需要确认所选的Tm2GH确实图定在Rpi-oka1和Rpi-nrs1座位上。当在最初的作图群体中作为SCAR标记进行测试时，这两个标记均与抗性共分离。在限定Rpi-oka1和Rpi-nrs1座位的重组体的集合中扩增ATG-Tm2-F和TAA-8bis-R时，确实仅从晚疫病抗性重组体中产生了具有预期大小的扩增子，这证明上述两种Tm2GA均确实是Rpi-oka1和Rpi-nrs1的良好候选。然而，有抗性重组体没有给出预期的PCR产物，在Rpi-oka1作图群体中有2个，在Rpi-nrs1作图群体中有1个，提示两个座位可能实际上都含有由两个功能R基因构成的串联。

Rpi-oka1和Rpi-nrs1 ORF的分析

Rpi-oka1和Rpi-nrs1的基因结构

通过比较扩增子序列与通过cDNA末端5’快速扩增(RACE)产生的cDNA片段，确定了Rpi-oka1和Rpi-nrs1的5’端结构。RACE鉴定了包括83个核苷酸(nt)(对于Rpi-oka1)和5nt(对于Rpi-nrs1)的5’-非翻译区的5’Rpi-oka1和Rpi-nrs1特异cDNA片段。两个基因都没有内含子。Rpi-oka1和Rpi-nrs1的开放阅读框分别编码891个和905个氨基酸的预测肽。除了在Rpi-nrs1的N端区域内的14个氨基酸插入之外，Rpi-oka1和Rpi-nrs1之间仅有2个其它的氨基酸差异。在548和753位，Rpi-oka1具有天冬酰胺和精氨酸残基，而Rpi-nrs1的相应残基分别是酪氨酸和赖氨酸(图8)。然而，被替换的残基具有相同的性质。天冬酰胺和酪氨酸属于疏水残基族，而精氨酸和赖氨酸是带正电荷残基。两个基因的蛋白序列均具有CC-NBS-LRR类R蛋白的数个保守基序(图8)。所述蛋白的N端部分存在一个卷曲螺旋(CC)域，对于Rpi-oka1而言在氨基酸1-183之间，对于Rpi-nrs1而言在1-198之间。在最初的183或198个残基中，在Rpi-oka1和Rpi-nrs1序列中分别可以找出4对推定的由疏水残基构成的七联体基序。在残基183或198与472或486之间的氨基酸序列段中分别可以识别出一个NB-ARC(核苷酸结合位点，细胞凋亡，R基因产物，CED-4)域(Ploop，Kinase-2，GLPL)(Van derBierzen和Jones 1998)。Rpi-oka1和Rpi-nrs1的C端的一半包括一系列大小不规则的15LRR基序，它们可以依照共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(x)LxxLPxx(其中x是任何氨基酸)(McHale等.2006)比对。PROSITE分析(Hofmann等.1999)鉴定了4个N-糖基化位点，7个酪蛋白激酶II磷酸化位点，10个蛋白激酶C磷酸化位点，6个N-豆蔻酰化位点和1个Camp-和Cgmp-依赖的蛋白激酶磷酸化位点。

在蛋白水平上，Rpi-oka1和Rpi-nrs1与Tm-2²蛋白序列具有75％的氨基酸同一性。有趣的是，发现同源性最低的地方是在LRR域内，在那里Tm-2²与Rpi-oka1和Rpi-nrs1仅有62％的同一性。相比之下，Rpi-oka1和Rpi-nrs1的卷曲螺旋和NB-ARC域与Tm-2²的相同区域具有87％的氨基酸序列同一性。

表4：用于确定Rpi-oka1和Rpi-nrs1特异性的致病疫霉分离株的特征

表5A.用于Rpi-oka1和Rpi-nrs1作图的标记的概览

a.s.：等位基因特异

(c)：互引相(coupling phase)

(r)：互斥相(repulsing phase)

表5b.用于根据NBS3B样序列进行基因组步移的引物，靶定Rpi-oka1和Rpi-nrs1的起始和终止密码子的引物和5’RACE引物的概览

表6.对从抗性亲本S.neorossii(1a)和S.okadae(1b)扩增的Tm2同源物根据限制图和NBS3B同源性(同时与两个R座位紧密连锁的标记)所作的分类

实施例4A

在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中瞬时互补

取决于相关遗传作图研究的分辨率和候选基因家族的大小，等位基因发掘法可以产生许多候选基因，需要对它们的功能进行分析。迄今为止，对于候选R基因同源物(RGH)的功能分析而言，需要稳定转化易感基因型用于互补的目的。这是一种耗时并且低效的方法，因为最少需要花费数个月时间方能产生可进行功能分析的转基因植物。在本研究中，但我们利用对本氏烟易感致病疫霉(尽管与前人的报道(参考文献Kamoun等，1998)不同)的这一发现，开发了一种土壤杆菌瞬时互补测定法(ATCA)，用于检测赋予针对致病疫霉的抗性的R基因。

土壤杆菌瞬时转化测定(ATTA)

在烟草中进行土壤杆菌瞬时转化测定(ATTA)，随后用合适的致病疫霉分离群进行离体叶片测定。用带有推定的R基因候选物的土壤杆菌菌株COR308(Hamilton等，1996)溶液浸润(infiltrate)4周龄大小的植物。浸润前2天，使土壤杆菌在含有四环素(12.5mg/ml)和大观霉素或卡那霉素(分别为100mg/ml和50mg/ml)的LB培养基中30℃过夜生长。生长16小时后，测量OD₁，并用xμl LB培养物接种50ml YEB培养基，随后在30℃过夜生长，以便下一天的OD2达到0.8[x＝z/OD1，z＝80000(2^(Δt/2)]。翌日，将45ml YEB培养物在4000rpm离心8min。将离心沉淀用含有1ml/L乙酰丁香酮(acetosyringone)的yml MMA重悬浮。Y＝22xOD2，从而可以将不同的培养物标准化为OD32.0。将每个重悬的离心沉淀在室温下温育1小时。然后，用2ml注射器用OD4为0.1的MMA培养物浸润叶片的下方一侧。浸润2天后，如上所述地进行DLA。在接种后4-7天评估感染表型(抗性或易感)。

离体叶片测定如Vleeshouwers等(1999)所述进行，使用两种致病疫霉分离株：IPO-复合物，其对Rpi-oka1、2和Rpi-nrs1均无毒力；和EC1分离株，其对所有三种基因均有毒力。将致病疫霉接种物以10μl(5x10⁴个运动孢子/ml)液滴接种在叶片的背轴侧，并在16h/8h白天/黑夜的光周期气候箱中在15℃温育6天。在接种后6天，显示芽孢形成的叶子评价为易感，而没有显示症状或坏死性损害的叶片评价为抗性。用两种分离株各进行3次独立的瞬时互补测定，每次有三个重复。对于每一个重复，将从植株底部数起的第4，5和6片叶子用土壤杆菌浸润，随后用致病疫霉攻毒。用IPO-C接种5天后，瞬时表达候选Rpi-oka1或Rpi-nrs1基因的叶片有60-70％显示了典型的HR应答，与瞬时表达功能性Rpi-sto1基因的阳性对照植物一样(Vleeshouwers等，2008)，尽管在后者中互补效率显著更高(80-90％的被攻毒的叶片显示了HR)。相比之下，表达abptGH-a——Rpi-abpt的一种非功能性侧向同源物(Lokossou等，论文准备中)——的叶片完全为易感性。在EC1的场合，所有经土壤杆菌浸润的叶片均是易感的，除了那些用Rpi-sto1——它赋予EC1的抗性——浸润过的叶片除外。这些数据与Rpi-oka1和Rpi-nrs1的抗性谱一致，因此提示所述候选基因就是Rpi-oka1和Rpi-nrs1。

实施例4B

通过稳定转化底西瑞栽培种(cv.Desiree)的互补分析

为了确认在本氏烟中瞬时互补测定获得的结果，通过土壤杆菌介导的转化，将带有Tm2GH-oka1b和Tm2GH-oka1.9的双元Gateway构建体转移到易感性的马铃薯底西瑞栽培种中。作为对照，我们还用构建体pSLJ21152转化了底西瑞栽培种，pSLJ21152是一种带有携带假定Rpi-oka1启动子、ORF和终止子序列的4.3kb片段的双元构建体(见实施例6)。对具有目的转基因的原代转化体(primary transformants)进行离体叶片测定，测试其对致病疫霉的抗性。令人惊讶的是，只有携带4.3kb Rpi-oka1片段的遗传构建体能够补全易感表型；9个原代转化体中有8个是抗性的。含有原代转化体的22个Tm2GH-oka1b和17个Tm2GH-oka1.9全部对致病疫霉易感。

Tm2GH-oka1b和Tm2GH-oka1.9序列与4.4kb Rpi-oka1片段的比对显示，在最初用作等位基因发掘实验基础的起始密码子的上游99nt处还存在一个合框的(in-frame)ATG起始密码子。这个发现与用Tm2GH-oka1b和Tm2GH-oka1.9获得的阴性互补结果以及用4.3kb Rpi-oka1片段获得的阳性互补结果一起提示，最5’侧的那个起始密码子是功能Rpi-oka1和Rpi-nrs1ORF的真正起点。

使用5’延伸的等位基因发掘产物进行瞬时互补测定

为了试图分别从oka7014-9 nrs365-1发掘出推定的全长Rpi-oka1和Rpi-nrs1基因，用引物ATG2-Tm2F和TAA-8bR(表2)对两种基因型的基因组DNA进行了长程PCR。将具有预期大小的扩增子克隆到-T Easy载体中并加以测序。从oka7014-9获得的克隆全部相同，并且与pSLJ21152中的相应序列相同(见实施例6)。从nrs365-1获得的克隆也全部相同，但与从oka7014-9获得的克隆相比，在5’延长区含有一个42nt的插入。随后将两个片段插入到双元表达载体中Rpi-blb3基因的调节元件之间(Lokossou等，论文准备中)，并以它们作为靶标，结合原来的Tm2GH-oka1b和Tm2GH-oka1.9构建体及pSLJ21152一起在烟草中进行瞬时互补测定。全长基因和4.3kb的Rpi-oka1基因均显示与阳性对照Rpi-sto1相当的抗性水平(80-90％的被攻毒的叶片显示了HR应答)，而较短的基因构建体再次显示显著更低水平的抗性(60-70％HR)，表明来自oka7014-9和nrs365-1的全长扩增子分别是Rpi-oka1和Rpi-nrs1。

实施例5-来自S.mochiquense的Rpi基因的鉴定、作图和克隆

在S.mochiquense中Rpi基因的图定

Rpi-mcq1

Rpi-mcq1先前被粗略地图定到染色体IX长臂的底部(Smilde等，2005)，但没有公开精细的作图和表征。除了一种在68个个体的群体中与Rpi-mcq1共分离的标记(TG328)之外，还开发了跨20cM距离的侧翼标记。为了精细地图定Rpi-mcq1，使用总共72个AFLP引物组合寻找更紧密连锁的标记。鉴定了一个多态性条带P13M32_472，其图定在该基因的南侧(southernside)。根据番茄BAC克隆C09HBa0165P17的发布序列以及SGN数据库中染色体IX的其它已知RFLP标记开发了额外的5个CAPS标记(表7)。这样，将Rpi-mcq1图定在一个11.6cM的、侧翼为标记T0156和S1d11的区域中，并且它与CAPS标记TG328，U286446，U296361和TG591共分离(图10)。

Rpi-mcq1的高分辨率作图和克隆

BAC文库筛选

在K182文库中，从9个池(表1a)扩增标记U279456。该标记是等位基因特异的，并且在K182中与易感单元型连锁。其它三个标记(U282757、U296361和TG591)是CAPS标记，因此使用限制性消化来为已鉴定的BAC指定单元型。对这三个标记的分析显示，有3-7个BAC池所含的BAC克隆具有来自抗性单元型的标记等位基因(表1a，图4d-4e)。

Rpi-mcq1的高分辨率作图和克隆

从K182文库随机选择了8个对与Rpi-mcq1紧密连锁的标记U282757、U296361、TG591或U279465呈阳性的BAC池。将每个BAC文库的原始384孔板复制到固体LB培养基上。从每个板按行和列刮取菌落，并筛选相关标记是否存在。从384孔板选择了单克隆。从K182文库选择的克隆的一个BAC末端序列与基因Tm-2²高度相似。此外，K182文库中有2个BAC末端序列与在马铃薯(Solanum tuberosum)，山荆子(Malus baccata)，香脂杨(Populus balsamifera)，毛果杨(Populus trichocarpa)，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和兵豆(Lens culinaris)中鉴定的数种不同抗性蛋白相似。

使用由2502个个体组成的大群体鉴定侧翼标记T0156和S1d11之间的重组体。总共发现了163个重组体，用它们来分析共分离标记TG328、U286446、U296361和TG591。结果，Rpi-mcq1被图定在染色体IX的一个0.32cM区域中，两侧是标记U286446和9C23R(从BAC末端序列开发的标记)，并且与标记U272857和TG591共分离(图10)。根据所述CAPS标记的次序确定相应的BAC克隆的次序，并使用它们构建一个跨越9C23R-TG328的重叠群(图11)。预期含有Rpi-mcq1的区域被两个从抗性单元型鉴定的重叠BAC克隆——9C23和43B09所覆盖。对这两个BAC克隆测序，并通过用Sau3AI部分消化把它们亚克隆到双元粘粒载体pCLD04541中。BAC序列分析表明，它含有2个完整的ORF和2个不完整的ORF，与针对ToMV的Tm2²抗性基因相似。所述2个完整的ORF被预测是Rpi-mcq1的候选物，并鉴定了含有这两个ORF的粘粒克隆(Rpi-mcq1.1和Rpi-mcq1.2)，并通过土壤杆菌介导的转化引入到易感马铃薯品种底西瑞、番茄栽培种Moneymaker和本氏烟中。

Rpi-mca1 ORF分析

我们测序了两个候选BAC克隆9C23和43B09。BAC克隆K182_43B09长度为103,863bp，并且已被完全测序。BAC克隆K182_9C23已被测序到3个重叠群：K182_9C23_2699(62,389bp)、K182_9C23_2732(22,072bp)和K182_9C23_2737(10,119bp)。在对这些BAC序列之间进行比对之后，发现K182_43B09含有K182_9C23_2737的全部，和K182_9C23_2732的大约一半，这指示了两个BAC克隆的重叠区域。

K182_9C23_2699被发现含有3个ORF，而K182_9C23_2732和K182_9C23_2737各自含有1个长度超过300bp的ORF。来自K182_9C23_2732和K182_9C23_2737的ORF与来自K182_43B09的第一个和第二个ORF相同。K182_9C23_2699的第一个ORF编码一个推定的NAD依赖的差向异构酶(与CAPS标记U272857相同的基因)。第二个ORF编码一个完全的CC-NBS-LRR型植物抗性基因蛋白，其与ToMV抗性基因Tm2²高度相似，因此是Rpi-mcq1的候选基因(Rpi-mcq1.1)。第三个ORF编码一个不完全的Tm2²样蛋白，其含有部分NBS基序和完全的LRR基序。另外从K182_43B09的序列出发预测了其它5个ORF。预测第一个和第三个ORF可能编码指向RNA的DNA聚合酶和逆转录转座子蛋白，第五个ORF编码与CAPS标记U296361相同的基因。它们均没有被考虑作为Rpi-mcq1候选物，因为这些蛋白与植物抗性基因功能无关。第二个和第四个ORF与抗性基因Tm2²相似。第二个ORF编码一个完整基因，其中出现了全部的CC、NB和LRR域；它被认为是Rpi-mcq1的第二个候选物(Rpi-mcq1.2)。第四个ORF被预测编码一个截短的蛋白，因为在第110位氨基酸处具有提前终止密码子。

将Rpi-mcq1的两个候选基因亚克隆到双元粘粒载体pCLD04541中。Rpi-mcq1.1长度为2,589bp，并且被预测编码一个862个氨基酸的CC-NB-LRR蛋白，其计算分子量为98.2kDa，pI为7.75。卷曲螺旋(CC)域位于该蛋白N端的氨基酸1-173的部分。在这最先的173个残基中，可以识别出12个推定的由疏水残基构成的七联体基序。在氨基酸序列173-478中存在一个含有所有已表征基序的NB-ARC域(van der Biezen & Jones，1998)。LRR域存在于氨基酸序列479-862中，其包括一系列大小不规则的15个LRR基序，它们可以根据共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(x)LxxLPxx(其中x是任意氨基酸)(McHale等，2006)比对。NB-ARC第5基序(第481-485位氨基酸)与LRR域的起点重叠。

Rpi-mcq1.2长度为2,571bp，预测它编码一个856个氨基酸的CC-NBS-LRR蛋白，该蛋白的计算分子量为98.0kDa，pI为7.81。卷曲螺旋(CC)域位于该蛋白N端第1-170位氨基酸的部分。NB-ARC域位于氨基酸序列171-476中，并且包含全部已被表征的基序(van der Biezen & Jones，1998)。LRR域位于氨基酸序列477-856中，其包括一系列大小不规则的15个LRR基序，它们可以根据共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(x)LxxLPxx(其中x是任意氨基酸)(McHale等，2006)比对。NB-ARC第5基序与LRR域的起点重叠。

Rpi-mcq1.1和Rpi-mcq1.2与Tm2²蛋白在氨基酸水平上分别有大约77％和75％的同一性，二者彼此之间则有81％的同一性。

实施例6

将新抗性基因引入到对致病疫霉易感的马铃薯和番茄基因型中以及引 入到本氏烟中

具有在其自身启动子和终止子(原始基因)控制下的Rpi-oka1基因的双 元载体

使用引物oka1longF(5’-AGTTATACACCCTACATTCTACTCG-3’)和oka1longR(5’-CTTTGAAAAGAGGCTTCATACTCCC-3’)通过PCR从BAC克隆K39_266I9扩增携带Rpi-oka1启动子、开放阅读框(ORF)和终止子的4.3kb片段(SEQ.ID.No.1c)。将该片段克隆到pGEM-T Easy(Promega)中，并测序以确认在PCR期间没有引入错误。用EcoRI消化最终的质粒，将含有原始基因的片段克隆到pBin19的EcoRI位点。所得的质粒被命名为pSLJ21152。将质粒pSLJ21152引入到土壤杆菌菌株AGL1中。

具有在其自身启动子和终止子(原始基因)控制之下的Rpi-mcq1.1和 Rpi-mcq1.2基因的双元载体

通过用Sau3AI部分消化将BAC克隆K182_9C23和K182_43B09亚克隆到双元粘粒载体pCLD04541的BamHI位点。用GigaPack Gold(Stratagene)包装重组粘粒载体，并引入到大肠杆菌DH5菌株中。使用引物TG591-F和TG591-R通过PCR从所得的克隆中筛选鉴定含有Rpi-mcq1候选物的克隆，选择阳性克隆用于末端测序。通过参考BAC克隆K182_9C23和K182_43B09的完全BAC序列，选出了携带两个Rpi-mcq1候选物的克隆。克隆pSLJ21153携带Rpi-mcq1.1的全序列，包括启动子和终止子序列(SEQ.ID.No 2c)。该克隆也含有一个额外的抗性基因同源物，其缺少卷曲螺旋域和部分的NBS域，因此推测是没有功能的。为了确认这一点，鉴定了另一个克隆，其命名为D5，含有这种截短的基因，而没有Rpi-mcq1.1。克隆pSLJ21148载有Rpi-mcq1.2的完全序列，包括启动子和终止子序列(SEQ.ID.No 2d)。将带有全长候选Rpi-mcq1基因和截短基因的克隆引入到土壤杆菌菌株AGL1和LBA4404中。为了确保没有发生质粒重排，从所得的反式接合体(transconjugant)分离质粒，将其转化回大肠杆菌菌株DH10-β，消化后，与原始质粒储液的消化物进行比较。

马铃薯的转化

建立具有合适抗生素选择域(selection regime)的土壤杆菌培养物，在28℃震荡培育24小时。从生长在MS培养基(2％蔗糖)上无菌培养的4-6周龄马铃薯底西瑞栽培种植株收集茎节间段切片(Stem internode sections)(不带节点)。将节间段切成1cm切片，并置于20ml LSR液体培养基中。向干节添加100ul土壤杆菌过夜培养物，在24℃以40rpm黑暗温育20分钟。从土壤杆菌悬液取出茎切片，吸干，并在低光条件下在LSR1固体培养基上(每个盘上铺布大约15-20个外植块(explant))18℃温育3天。然后将这些共培养的茎切片转移到含有选择抗生素的LSR1培养基上，每盘大约10个外植块。每7-10天将茎切片亚培养到新鲜LSR1培养基上大约3-6周，或者直到出现第一个小愈伤组织。一旦愈伤组织充分发育后，便将茎切片转移到含有选择抗生素的LSR2培养基上。每7-10天将茎切片亚培养一次，直到开始发芽。芽在转化开始后2个月内出现。用锋利的手术刀(sharp scalpel)将芽切下，并植入到含有选择抗生素的MS2R固体培养基内。具有合适抗生素或除草剂抗性基因的转基因植物通常在2周内开始生根，逐渐停止(wean out of)组织培养物供应，代之以无菌泥炭块(peat block)，然后移植到温室中。

培养基

用于马铃薯植块的MS培养基

1X MS培养基

2％蔗糖

0.6％琼脂糖

100mg/L酪蛋白酸水解物

pH 5.7

LSR液体培养基

1X MS培养基

3％蔗糖

pH 5.7

LSR1培养基

1X MS培养基

3％蔗糖

2.0mg/L玉米素核苷(zeatin riboside)

0.2mg/l NAA

0.02mg/L GA₃

0.6％琼脂糖

pH 5.7

LSR2培养基

1X MS培养基

3％蔗糖

2.0mg/L玉米素核苷

0.02mg/l NAA

0.02mg/L GA3

0.6％琼脂糖

pH 5.7

MS2R

1X MS培养基

2％蔗糖

100mg/L肌醇

2.0mg/L甘氨酸

0.2％固化剂

pH 5.7

培养基    土壤杆菌    抗生素         T-DNA     选择抗生素

          菌株                       标记      /除草剂/

LSR1/     GV3101/     头孢噻肟       nptII     卡那霉素

LSR2/     LBA4404     (Cefotaxime)/            100mg/L

MS2R                  沃格孟汀

                      (Augmentin)

                      250mg/L

          Agl1        泰门汀         bar       草丁磷

                      (Timentin)               (Phoshinothricin)

                      320mg/L                  2.5mg/L

          番茄转化

将番茄种子在70％乙醇中表面灭菌2分钟，以使凝胶状的种皮松弛，然后用灭菌水冲洗一次。然后将种子在10％家用漂白水(例如Domestos/Vortex)溶液中震荡灭菌3小时，并在灭菌水中清洗4次。将种子置于含有萌发培养基的盆中(20-30粒种子/盆)，并在培养室(16小时光周期，装备Gro-Lux或白炽灯)中25℃温育。嫩芽培育7-10天，当子叶尚嫩、仍在伸展过程中、并且没有可见的真实叶片形成时使用。用土壤杆菌菌株LBA4404接种10毫升含有合适抗生素的基本A培养基，28℃振荡培养。将1毫升细烟草悬浮培养物(fine tobacco suspension culture)置于含有用0.6％琼脂糖固化的细胞悬浮培养基或添有0.5mg/L 2，4-D和0.6％琼脂糖的MS培养基的平板上。将细胞分散成一个均匀的层，平板不密封，堆放在25℃培养室中低光下，直到翌日。在营养板(feeder plates)的上面放置一片Whatman1号滤纸，小心排除所有气泡，确保滤纸完全润湿。转化使用子叶进行，因为下胚轴会产生大量四倍体。在培养皿中，切去子叶的尖端，然后再进行另外的两次横切，从而产生两个大约0.5cm长的外植体。将外植体转移到有水的新培养皿中，以防止在进一步的切割中产生任何损伤。收集若干外植体汇总后，将它们在灭菌滤纸上吸干，并将大约30-40块置于一个营养板上，使背轴表面(abaxil surface)在最上面(倒置)。将培养基非密封布置，并堆放在25℃培养室中低光下8小时。将土壤杆菌培养物离心下来，并重新悬浮在含有3％蔗糖的MS培养基中，使OD₆₀₀为0.4-0.5。将细菌悬液转移到培养皿，并将来自一个营养板的外植体浸没在该悬液中。然后取出它们，在灭菌滤纸上吸干，再将它们返回到原来的营养板上，同样注意不要损伤组织。对置于细菌中的时间没有特定的要求，只要时间足够确保薄片被完全浸没即可。将平板返回到与预处理阶段所用的相同的条件下(25℃，低光强)共培养40小时。将来自所述营养层的外植体(每个培养皿12个外植体)放置在含有500ug/ml沃格孟汀或羧苄青霉素和100ug/ml卡那霉素的番茄再生平板上，选择T-DNA转化标记。将子叶右侧朝上放置，从而使它们卷曲伸入培养基中，确保叶片的切割边缘与培养基中的营养物和抗生素良好接触。使用琼脂糖凝胶作为硬化剂(setting agent)，因为它可形成柔软的介质，能够将薄片轻柔地推入其中。平板左侧不密封，将它们返回到先前的培养条件(25℃，低光强)。每2-3周将外植体转移到新鲜的培养基上。一旦再生材料相对于培养皿而言过大时，便将其放入更大的螺纹旋盖玻璃瓶(screwcapped glass jar)内。将芽从外植体切下，放入具有200ug/ml沃格孟汀和50ug/ml卡那霉素的生根培养基中。为了转移到土壤中，通过在流水中轻柔地冲洗根尽可能多地除去培养基。小心地将植物转移到含水的(hydrated)、经高压灭菌的苗钵(Jiffy pot)(泥炭锅)中，保持密封以便在生长室中维持高湿。逐渐降低湿度。一旦能够看见根生长穿透苗钵，即将植物转移到温室。

再生

/升

MS盐                                    1x

肌醇                                    100mg

Nitsch氏维生素(Nitsch’s vitamins)      1ml 1000X储液

蔗糖                                    20g

琼脂胶(Agargel)                         4g

pH 6.0(KOH)

高压灭菌

玉米素核苷(反式异构体)                  2mg

(过滤灭菌并在高压灭菌后添加)

Nitsch氏维生素

                                        终浓度

                mg/l                    1000x储液(mg/100ml)

硫胺            0.5                     50

甘氨酸          2.0                     200

烟酸            5.0                     500

盐酸吡哆醇      0.5                     50

叶酸            0.5                     50

生物素          0.05                    5

在1000x下，不是所有维生素都会溶入溶液。4℃保存，使用前摇匀。

生根

                                        /升

MS培养基            0.5X

蔗糖                5g

固化剂              2.25g

pH 6.0(KOH)

培养基

种子萌发

                    /升

MS培养基            1x

葡萄糖              10g

琼脂糖              6g

pH 5.8

倾倒入Sigma“人造黄油”(‘margarine’)盆中

基本培养基A        /升

K_□HPO₄            10.5g

KH₂PO₄             4.5g

(NH₄)₂SO₄          1.0g

柠檬酸钠.2H₂O      0.5g

990ml高压灭菌

使用前添加；1.0ml 1M MgSO₄.H₂O

            10ml 20％葡萄糖

平板用：

制备上述溶液500ml并高压灭菌。

15g细菌琼脂溶于490ml H₂O中单独高压灭菌

添加MgSO₄和葡萄糖并混合

本氏烟转化

将本氏烟植株培育至10-20cm高，但开始开花之前为止。用合适的抗生素选择方案启动土壤杆菌培养，并在28℃振荡生长24小时。第二天，将土壤杆菌离心沉淀下来，并重新悬浮在含有3％蔗糖的MS培养基中。收集幼嫩的本氏烟叶(最大直径为10cm)，并在含有数滴作为表面活性剂的吐温20的1％新鲜次氯酸钠中表面灭菌20分钟。然后，将叶片在灭菌水中充分清洗，用锋利手术刀切成1-2cm见方，浸没在土壤杆菌悬浮液中。确保全部的叶子均被完全润湿，然后迅速将它们吸干，并置于共培养培养基上3天。之后，将共培养后的叶块转移到含有合适抗生素的选择培养基上，每个皿上大约10个外植体。每7-10天将外植体亚培养到新鲜的培养基上，历时大约1-2个月，直到出现初芽。用锋利手术刀将芽切下，并植入含有选择抗生素的生根培养基内。带有合适的抗生素或除草剂抗性基因的转基因植物通常会在2周内开始生根，可以对它们逐渐停止(wean out of)组织培养物供应，代之以无菌泥炭块(peat block)，然后移植到温室中。

MS液体培养基

1X MS培养基

3％蔗糖

pH 5.7

共培养培养基

1X MS基础盐混合物

1X Gamborg’s B5维生素

3％蔗糖

0.59g/L MES

1.0mg/L BAP

0.1mg/l NAA

0.6％琼脂糖

pH 5.7

选择培养基

1X MS基础盐混合物

1X Gamborg’s B5维生素

3％蔗糖

0.59g/L MES

1.0mg/L BAP

0.1mg/l NAA

0.4％琼脂糖

pH 5.7

生根培养基

1/2强度MS培养基

0.5％蔗糖

0.25％结冷胶(Gelrite)

pH 5.8

互补分析(Rpi-oka1)

选择能够在卡那霉素上生长的总共37个马铃薯底西瑞栽培种植株作为推定的Rpi-oka1转化体。在转移到温室之后，切下叶片，用来进行致病疫霉分离株90128和‘Superblight’的离体叶片测定，以确定该转基因是否赋予晚疫病抗性。在37个转化体中，31个被确认为是抗性的，没有显示任何晚疫病感染迹象。一些植物在接种局部显示超敏感应答迹象。其余6个植株对两种分离群都易感，与对照(未被转化的底西瑞)相同。转基因植物的表型与Rpi-oka1 ORF的PCR扩增精确相关：所有可以扩增出Rpi-oka1的植物均被确认是抗性的。Rpi-oka1转基因还赋予针对多种致病疫霉分离株的抗性，详见表6.1。所有的测试转基因植物均对分离群EC1易感，表明Rpi-oka1的特异性在转基因植株中仍得以保持，并且该抗性表型不是由于转基因对防御通路的组成性活化而导致的。

携带Rpi-oka1的转基因番茄Moneymaker栽培种植株也显示对致病疫霉分离株90128有抗性。选择了能够在卡那霉素上生长的总共21个番茄Moneymaker栽培种植株作为推定Rpi-oka1转化体。在转移到温室之后，切下叶片用于致病疫霉分离株90128的离体叶片测定，以确定该转基因是否赋予晚疫病抗性。在21个转化体中，13个被确认为是抗性的，没有显示任何晚疫病感染迹象。一些植株在接种局部显示了超敏感应答迹象。其余8个植株对分离群90128易感，与对照(未被转化的Moneymaker)相同。转基因植株的表型与Rpi-oka1 ORF的PCR扩增大体相关，大多数能扩增出Rpi-oka1的植株被确认是抗性的。然而，2个经PCR确定含有Rpi-oka1的植株仍然是易感的，表明转基因被沉默了，或者插入到了受体番茄基因组的无转录活性区域中。Rpi-oka1转基因还赋予针对多种致病疫霉的抗性，详见表6.1。所有没有扩增出Rpi-oka1的植株均对致病疫霉易感。

Rpi-oka1赋予的针对致病疫霉分离株的抗性谱

将带有Rpi-oka1的转基因马铃薯底西瑞栽培种的离体叶片与多种致病疫霉分离株(表6.1)温育，以确定Rpi-oka1赋予抗性的分离株的范围。11个被测试的分离株中，只有来自厄瓜多尔的EC1分离株能够克服Rpi-oka1，在温育植物上致病。

互补分析(Rpi-mcq1.1和Rpi-mcq1.2)

用pSLJ21153(Rpi-mcq1.1)和pSLJ21148(Rpi-mcq1.2)转化后，分别获得了总共22和20个推定的马铃薯底西瑞栽培种转基因系。在转移到温室后，用致病疫霉分离株90128、EC1、Hica和IPO-complex进行离体叶片测定。对于构建体pSLJ21153，有12个转基因系显示对分离株90128和EC1抗性，但对Hica和IPO-complex易感。对于构建体pSLJ21148，有10个转基因系显示当低浓度(1x10⁴个游动孢子ml^-1)接种时对Hica有更高的抗性，但对90128、EC1和IPO-complex易感。存在于此构建体中的Rpi-mcq1.2也赋予针对分离株‘Superblight’和MP618(表6)的部分抗性。用粘粒D5(其含有同样存在于pSLJ21153上的截短的抗性基因同源物)转化的转基因马铃薯系则对所有测试致病疫霉分离株表现易感。

将分别携带Rpi-mcq1.1和Rpi-mcq1.2的两个构建体(pSLJ21153和pSLJ21148)转化进番茄Moneymaker栽培种中。通过使用基因特异引物PCR鉴定了2个对Rpi-mcq1.1呈阳性的系和11个对Rpi-mcq1.2呈阳性的系。两个携带Rpi-mcq1.1的转基因系赋予针对90128和EC1的抗性。携带Rpi-mcq1.2或者携带同样存在于具有Rpi-mcq1.1的构建体pSLJ21153上的截短R基因同源物(粘粒D5)的转基因Moneymaker系对90128和EC1易感。

Rpi-mcq1.1和Rpi-mcq1.2赋予的针对致病疫霉分离株的抗性谱

对多种致病疫霉分离株进行测试，以确定它们对Rpi-mcq1.1和Rpi-mcq1.2的毒力/无毒力(表6.1)。在测试的12个分离株中，Rpi-mcq1.1赋予了针对6个分离株的抗性，Rpi-mcq1.2赋予了针对3个分离株的部分抗性(表6.1)。

实施例7

避免对新基因产生抗性的方法和组合物

野生群体中的抗性基因通常是高度多态性的(Jones 2001，Dangl和Jones2001，Bergelson等，2001)，这种异质性可能对于它们的有效性是至关重要的，因为它们会受到频率依赖性的选择(如果任何一个R基因占主导地位，针对能够克服它的病原体种族的选择加强)。在农业上，单作是常态，这方便了任何能够在特定作物品种上生长和快速繁殖的病原体的流行。我们建议，如果能够鉴定足够的R基因，并且混合配置(deploy in mixtures)在原本具有均一的农艺和消费性状的遗传背景中，那么就可能在作物中实现持久的抗性(Pink和Puddephat 1999，Jones 2001)。为了使这一策略发挥作用，并应对与以R基因为基础的抗性的克服和进化相关的问题，分离尽可能多的新Rpi基因是重要的。

这可以根据本发明加以实现，通过从马铃薯野生亲缘种分离多种Rpi基因，将这些基因分别引入到一个品种内，混合(mix)并种植所得的品系。这个策略可以规避了这样的问题，即就单一栽培的品种而言，对于任何能够克服该品种内特定Rpi基因的晚疫病类型，该品种将变得完全易感，结果使得该种类在寄生物群体中占主导地位。而如果混合使用3个Rpi基因，任何能够克服这些Rpi基因之一的晚疫病类型仅能在田间33％的植物上生长。根据本发明的一个可选择策略包括使用相同的品种，但是每年携带不同的Rpi基因。在此情形下，在某一年能成功克服的病原体种类，在下一年就会不能成功克服或者不能完全成功克服，从而降低损失。我们具体设想：

1.流行减慢

如果对某一种R基因有毒力的致病疫霉菌株进入作物，那么该菌株的扩散被限制在携带该R基因的植物之内，其它带有不同R基因的植物仍然保持抗性，因此限制病原体的扩散和整体损失。对于病原体而言，发展出针对多个R基因的毒力是更加困难的，因此将极大地降低对多于一种R基因有致病能力的菌株的发展。由于具有不同R基因的植物将被杂交，具有相同R基因的植物之间会出现空间隔离，这将限制该菌种在田间的扩散。

2.对多于一种Rpi基因的毒力与仅对一种基因的毒力相比导致适应性降低

植物R基因通过识别由植物病原体的特定菌株产生的分子而发挥作用。目前被接受的假说是，病原体通常需要某种效应分子以克服宿主防御应答，而该效应分子通常被植物R基因所识别；病原体的毒力是通过丧失编码该效应分子的基因而获得的。因此，为了对超过1种R基因产生毒力，病原体需要丧失多于1种效应分子。当在含有不同R基因补充的宿主上生长时，这样病原体菌株与没有丧失或者仅丧失一种效应分子的菌株竞争时，其内在适应性降低。

3.不相容的种类可触发系统性获得性抗性

除了R基因介导的抗性应答之外，植物具有产生非特异性防御应答，称作系统性获得性抗性(SAR symtemic acquired resistance)，的能力。在识别病原体之后，植物能够启动防御应答，此类反应对对多种病原体有效，不仅限于由R基因识别的病原体菌株。因此，导入的R基因对特定的病原体菌株的识别也可以有助于防御其它不一定被任何导入的R基因识别的菌株。

4.对影响稀有Rpi基因的毒力的正选择(selection for)微弱

在群体内分布稀少的Rpi基因，对病原体施加的克服该抗性的选择压力较小。这种策略可用于保护有价值的R基因，并可以通过用合理的方式配置R基因，使病原体群体不会暴露于大量具有这些R基因的作物。从而确保这些R基因的长寿性(longevity)，关于相应致病等位基因在病原体群体中的频率的知识可以帮助人们来进行这样的合理配置。

参考文献

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Claims (15)

1.分离的Rpi抗性基因，其由本文中表示为SEQ.ID.1的核酸序列或其核苷酸100-2676组成。

2.分离的Rpi抗性基因，其由本文中表示为SEQ.ID.7的核酸序列或其核苷酸142-2718组成。

3.一种分离的Rpi抗性基因，其由本文中表示为SEQ.ID.8的核酸序列组成。

4.分离的蛋白，其由本文中表示为SEQ.ID.4的氨基酸序列或其氨基酸34-891组成。

5.分离的蛋白，其由本文中表示为SEQ.ID.12的氨基酸序列或其氨基酸48-905组成。

6.一种分离的蛋白，其由本文中表示为图8中的Rpi-nrsl的氨基酸序列组成。

7.一种分离的基因，其编码如权利要求4-6任一项所述的蛋白。

8.一种产生晚疫病抗性增强的转基因植物的方法，该方法包括向所述植物的细胞或所述植物的部分导入根据权利要求1-3中任一项的基因，和从所述细胞或从所述植物的所述部分产生完整的植物，其中所述植物是马铃薯。

9.一种组合物，其包含根据权利要求1-3中任一项的基因以及合适的调节序列，所述调节序列与所述基因可操作连接以便在置于合适的体外或体内系统时可实现其表达。

10.一种用于在马铃薯中提供持续的疾病抗性的方法，其包括从马铃薯的野生亲缘种分离多个Rpi基因，将所述基因分别导入到马铃薯商业品系或品种中，混合如此产生的品系并种植所得的品系混合物，其中所述Rpi基因如权利要求1-3中任一项限定。

11.一种用于在马铃薯中提供持续的疾病抗性的方法，包括从马铃薯的野生亲缘种分离多个Rpi基因，将所述基因分别导入到马铃薯商业品系或品种中，并每年种植携带不同Rpi基因的品种，其中所述Rpi基因如权利要求1-3中任一项限定。

12.一种产生晚疫病抗性增强的转基因植物的方法，该方法包括向所述植物的细胞或所述植物的部分导入根据权利要求7的基因，和从所述细胞或从所述植物的所述部分产生完整的植物，其中所述植物是马铃薯。

13.一种组合物，其包含根据权利要求7的基因以及合适的调节序列，所述调节序列与所述基因可操作连接以便在置于合适的体外或体内系统时可实现其表达。

14.一种用于在马铃薯中提供持续的疾病抗性的方法，其包括从马铃薯的野生亲缘种分离多个Rpi基因，将所述基因分别导入到马铃薯商业品系或品种中，混合如此产生的品系并种植所得的品系混合物，其中所述Rpi基因如权利要求7限定。

15.一种用于在马铃薯中提供持续的疾病抗性的方法，包括从马铃薯的野生亲缘种分离多个Rpi基因，将所述基因分别导入到马铃薯商业品系或品种中，并每年种植携带不同Rpi基因的品种，其中所述Rpi基因如权利要求7限定。