CN116064463B - 番茄基因SlPKG及其编码蛋白在抗病中的应用 - Google Patents

番茄基因SlPKG及其编码蛋白在抗病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了番茄基因SlPKG及其编码蛋白在抗病中的应用。本发明提供了PKG蛋白或其相关生物材料在如下中的应用：调控植物抗病性；调控植物对病原菌的抗性；所述PKG蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.2或4所示的蛋白质。本发明从番茄植物中克隆了抗病相关基因SlPKG，研究证实SlPKG基因在植物抗病反应中起正调控作用，该基因的超表达可以明显提高番茄的抗病性。进一步遗传学实验证明，沉默SlPKG同源基因的本氏烟植株对野火病菌的抗性明显降低。本发明所获得基因来源于植物本身，且该基因在植物中比较保守，能够获得稳定的抗性遗传。本发明在利用基因工程手段进行分子育种增强植物抗病性方面表现出潜在的应用价值。

Description

番茄基因SlPKG及其编码蛋白在抗病中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及番茄基因SlPKG及其编码蛋白在抗病中的应用。
背景技术
植物病害的发生和流行严重影响全球粮食产量和经济状态，每年30％的粮食减产几乎都是由于植物病原微生物的侵染导致。植物病害所造成的粮食安全和食物短缺等问题在很大程度上影响人们的生活。传统的病害防治主要是喷施化学药剂，但时常伴随抗药性以及农药残留等问题，不仅对粮食安全和生态环境造成很大影响，也严重制约农业健康发展。因此发掘和利用植物自身的抗病基因来改良植物的抗病性，对植物病害的绿色可持续防控具有重要意义。
植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两类：主效抗病基因和抗病相关基因。目前从植物中克隆了多个主效抗病基因，如番茄抗叶霉病基因Cf2、Cf4、Cf5、Cf9等，番茄抗细菌性斑点病基因Pto、Prf等，番茄抗晚疫病基因Ph-3。但是主效抗病基因资源有限，大多数主效抗病基因仅对一个或者少数的致病小种有抗性，抗病范围有限，加上主效抗病基因的克隆进度往往慢于病原菌的变异速度，因而严重限制了主效抗病基因在农业生产中的应用。
植物中除了主效抗病基因以外所有参与抗病反应的基因都称为抗病相关基因。它们编码的蛋白质参与合成植物体内的抗病信号分子、信号转导或防卫反应。根据已有报道，虽然大部分抗病相关基因在单独参与抗病时发挥的作用可能比主效抗病基因小，但是由于大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，且其产物不直接与病原菌相互作用，因此它们是一类具有持久抗性和广谱抗性的基因资源。目前，从番茄中鉴定到多个抗病相关基因，如SlPub24、SlRIPK、SlWRKY23、SlMYB12等基因，这些基因编码不同类型的蛋白质，通过调控番茄体内不同反应途径参与番茄对多种病原菌的抗病过程，这些抗病相关基因大多数具有广谱抗病性。
环鸟苷磷酸(Cyclic GMP,cGMP)作为第二信使在真核生物的多种信号途径过程中发挥重要作用。已有报道显示，cGMP在植物中参与NO信号、赤霉素介导的淀粉酶合成和种子萌发、花粉管生长、ABA介导的气孔关闭以及防卫反应等多种信号途径和生物学过程。cGMP依赖型蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG)在人和动物体内被认为是cGMP的靶标，能够识别cGMP从而介导下游信号途径。但是，植物中的cGMP依赖型蛋白激酶很少被鉴定，目前仅在水稻中鉴定到OsPKG参与赤霉素介导的种子萌发、节间增长以及花粉管形成。到目前为止，植物中的PKG基因在植物抗病反应中的作用尚未报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有抗病基因资源的不足，解决如何提高植物的抗病性这一技术问题。
第一方面，本发明要求保护PKG蛋白或其相关生物材料在如下(a1)或(a2)中的应用：
(a1)调控植物抗病性；
(a2)调控植物对病原菌的抗性。
所述相关生物材料为能够表达所述PKG蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达PKG的DNA，该DNA不但可包括启动PKG基因转录的启动子，还可包括终止PKG基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
构建含有所述PKG基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体或Gateway系统载体等，如pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用PKG构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)(如根癌农杆菌EHA105)，黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。
所述PKG蛋白可为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的蛋白质；
(A2)氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的蛋白质；
(A3)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于番茄具有相同功能的蛋白质；
(A4)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于烟草具有相同功能的蛋白质；
(A5)与(A1)或(A3)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同一性且来源于番茄具有相同功能的蛋白质；
(A6)与(A2)或(A4)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同一性且来源于烟草具有相同功能的蛋白质；
(A7)与(A1)-(A4)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同一性，具有PP2C磷酸酶结构域和cGMP依赖型激酶结构域，并且具有相同功能的蛋白质；
(A8)在(A1)-(A7)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。所述75％以上的同源性可为至少76％、77％、78％、79％的同一性。
在本发明的一些案例中，所述PKG蛋白具体为SEQ ID No.2所示的蛋白质，来自于番茄，命名为SlPKG。在已公开的番茄植物全基因组序列数据库(https://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome)中，SlPKG的位点为Solyc05g018300.3。
在本发明的另一些案例中，所述PKG蛋白具体为SEQ ID No.4所示的蛋白质，来自于本氏烟，命名为NbPKG。
在所述植物中，所述PKG蛋白的表达量和/或活性升高，所述植物的抗病性增强，所述植物对病原菌的抗性增强。
在所述植物中，所述PKG蛋白的表达量和/或活性降低，所述植物的抗病性减弱，所述植物对病原菌的抗性减弱。
第二方面，本发明要求保护能够使植物中PKG蛋白的表达量和/或活性升高的物质在如下(b1)或(b2)中的应用：
(b1)提高植物抗病性；
(b2)提高植物对病原菌抗性。
所述PKG蛋白可为前文(A1)-(A8)中任一所示蛋白。
第三方面，本发明要求保护能够使植物中PKG蛋白的表达量和/或活性降低的物质在如下(c1)或(c2)中的应用：
(c1)降低植物抗病性；
(c2)降低植物对病原菌抗性。
所述PKG蛋白可为前文(A1)-(A8)中任一所示蛋白。
第四方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：一种培育抗病性提高和/或对病原菌抗性提高的植物的方法，可包括使受体植物中PKG蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述PKG蛋白可为前文(A1)-(A8)中任一所示蛋白。
方法II：一种培育抗病性降低和/或对病原菌抗性降低的植物的方法，可包括使受体植物中PKG蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述PKG蛋白可为前文(A1)-(A8)中任一所示蛋白。
所述方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。
第五方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法III：一种培育抗病性提高和/或对病原菌抗性提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达PKG蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性提高和/或对病原菌抗性提高。所述PKG蛋白可为前文(A1)-(A8)中任一所示蛋白。
方法IV：一种培育抗病性降低和/或对病原菌抗性降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中能够表达PKG蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比株抗病性降低和/或对病原菌抗性降低。所述PKG蛋白可为前文(A1)-(A8)中任一所示蛋白。
在所述方法III中，能够表达所述PKG蛋白的核酸分子是通过重组载体的形式导入所述受体植物中的；
在所述方法IV中，对所述受体植物中能够表达所述PKG蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。在本发明的具体实施方式中，具体是通过向所述受体植物中导入携带有SEQ ID No.3的第2395-2691位所示DNA片段的VIGS载体实现的。
在上述方法中，将所述重组载体(用于过表达)或所述VIGS载体(用于敲除)导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
在上述各方面中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。
进一步地，能够表达所述PKG蛋白的核酸分子可为如下任一：
(B1)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述PKG蛋白的DNA分子；
(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述PKG蛋白的DNA分子。
上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
本发明涉及的PKG基因序列可用于作物，特别是番茄抗病育种、转基因株系、基因新品种中的应用。
本领域普通技术人员可以很容易的采用已知的方法，例如RT-PCR，对本发明的编码PKG序列及其功能结构域进行克隆或者人工修饰，具有与本发明分离得到的PKG的核苷酸序列75％以上同源性的核苷酸，存在编码PKG及其磷酸酶结构域或者磷酸激酶结构域且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
第六方面，本发明要求保护前文第四或五方面所述方法在植物育种中的应用。
在上述各方面中，所述病可为番茄斑点病或者烟草野火病。
相应地，所述病原菌为番茄斑点病病原菌——丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringaepv.tomato)或烟草野火病病原菌——丁香假单胞烟草致病变种(P.syringaepv.tabaci)。
在上述各方面中，所述植物可为双子叶植物。
进一步地，所述双子叶植物可为茄科植物。
更进一步地，所述茄科植物可为茄属植物或烟草属植物。
更加具体地，所述茄属植物可为番茄，所述烟草属植物可为烟草。
本发明从番茄植物中克隆了抗病相关基因SlPKG，研究证实SlPKG基因在植物抗病反应中起正调控作用，该基因的超表达可以明显提高番茄的抗病性。进一步遗传学实验证明，沉默SlPKG同源基因的本氏烟植株对野火病菌的抗性明显降低。本发明所获得基因来源于植物本身，且该基因在植物中比较保守，能够获得稳定的抗性遗传。本发明在利用基因工程手段进行分子育种增强植物抗病性方面表现出潜在的应用价值。
附图说明
图1为番茄SlPKG和烟草NbPKG基因的克隆。
图2为PKG蛋白的结构域预测。上图和下图分别为番茄和烟草PKG蛋白的结构域预测示意图。
图3为SlPKG蛋白的表达纯化和检测。A为考马斯亮蓝染色结果，B为western blot检测结果。
图4为SlPKG激酶活性检测结果。Control为携带pET22b空载体的大肠杆菌裂解液过柱后的样品处理，SlPKG为SlPKG蛋白处理。*表示不同处理间数据统计分析具有显著性差异(t-test,p<0.05)
图5为SlPKG的亚细胞定位结果。PIP2A为细胞质膜共定位标记(参考文献：Wei,H.L.,Chakravarthy,S.,Worley,J.N.,&Collmer,A.(2013).Consequences of flagellinexport through the type III secretion system of Pseudomonas syringae reveal amajor difference in the innate immune systems of mammals and the model plantNicotiana benthamiana.Cellular Microbiology,15(4):601-618.)。
图6为本氏烟中SlPKG同源基因沉默效率检测结果。TRV-EC1为对照植株，TRV-NbPKG为NbPKG基因沉默植株。*表示不同处理间数据统计分析具有显著性差异(t-test,p<0.05)
图7为NbPKG基因沉默对植物PTI的影响。PTI检测指标为flg22诱导的胼胝质积累。TRV-EC1为对照植株，TRV-NbPKG为NbPKG基因沉默植株。
图8为NbPKG基因沉默降低烟草对野火疫病的抗性。A为丁香假单胞烟草致病变种(P.syringae pv.tabaci)侵染NbPKG基因沉默烟草以及大肠杆菌无功能基因沉默烟草的叶片，喷雾接种浓度为1×106CFU/ml。B为A图中相应处理的菌落数统计结果。TRV-EC1为对照植株，TRV-NbPKG为NbPKG基因沉默植株。*表示不同处理间数据统计分析具有显著性差异(t-test,p<0.05)
图9为SlPKG过表达番茄增强了对番茄斑点病的抗性。WT为野生型植株，SlPKG-OE为转SlPKG基因植株。A为丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringae pv.tomato)侵染不同植株后的发病症状；B为病情指数，喷雾接种浓度为1×106CFU/ml。**表示不同处理间数据统计分析具有极显著性差异(t-test,p<0.01)。
具体实施方式
本发明技术方案如下：首先采用PCR技术从番茄中获得完整的SlPKG基因序列，序列长度3243bp，序列如SEQ ID No.1所示，该基因编码1081个氨基酸，氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；对序列进行分析表明，SlPKG编码的蛋白质具有保守的PP2C磷酸酶结构域和cGMP依赖型激酶结构域。然后在大肠杆菌中表达SlPKG蛋白，证明了SlPKG蛋白具有激酶活性。亚细胞定位分析结果显示SlPKG定位在细胞质膜，暗示SlPKG在质膜发挥生物学功能。随后通过同源性比较分析，从烟草植物的全基因组序列数据库(https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_benthamiana/genome)中，鉴定到SlPKG的同源基因，命名为NbPKG，位点为Niben101Scf04103g09001.1。NbPKG基因序列长度3729bp，序列如SEQ ID No.3所示，该基因编码1243个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；利用VIGS技术在本氏烟中沉默NbPKG基因，发现沉默NbPKG基因的本氏烟植株对野火病的抗性降低，同时，flg22诱导的胼胝质积累明显降低。进一步采用土壤杆菌介导的遗传转化方法在番茄中超表达SlPKG基因，对遗传转化植株进行抗病分析，证明了超量表达SlPKG基因可以增强番茄的抗病性。
本发明中涉及的番茄和烟草中的PKG基因在番茄和烟草上的功能分析均为首次报道。序列分析显示表明，该基因在多种植物中存在同源基因。涉及水稻的PKG基因同源序列在“Shen Q,Zhan X,Yang P,et al.Dual Activities of Plant cGMP-Dependent ProteinKinase and Its Roles in Gibberellin Signaling and Salt Stress.Plant Cell,2019,31(12):3073-3091.”中公开；其他植物PKG基因同源序列，如拟南芥(AT2G20050)，高粱(SORBI_3004G127800)，蓖麻(RCOM_1050860)，苔藓(PHYPADRAFT_185240)，葡萄(VIT_11s0016g03430)，卷柏(SELMODRAFT_443005)，均可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UniPtrotKB(https://www.uniprot.org/)数据库中发现，但都没有证据显示其在抗病反应中起作用。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。例如：Sambrook等编写的《MolecularCloning：A Laboratory Manual》所述条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、SlPKG和NbPKG基因的克隆
本实施例克隆番茄和烟草PKG基因的全长。以番茄品种moneymaker(本实验室保存，记载于“Wei,H.L.,Chakravarthy,S.,Worley,J.N.,&Collmer,A.(2013).Consequencesof flagellin export through the type III secretion system of Pseudomonassyringae reveal a major difference in the innate immune systems of mammalsand the model plant Nicotiana benthamiana.Cellular Microbiology,15(4):601-618.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)的cDNA为模板，设计引物En-SlPKG-F(5’-CACCATGGGTTGTGTTTATTCAAG-3’)和En-SlPKG-R(5’-CTACCAGTCTTGAAGCC ACT-3’)，利用Q5高保真DNA聚合酶(NEB)，采用PCR技术扩增SlPKG的全长cDNA片段(核酸序列如SEQ ID No.1所示)，所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可获得符合预期大小的条带(图1)，然后切胶回收产物，并将回收产物与pENTRTM/SDD/D-(Invitrogen，货号：2360689)入门载体片段过夜连接。第二天将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养后，选取单克隆进行PCR验证，验证正确的克隆摇菌提取质粒，并进一步测序验证，从而获得pENTRY-SlPKG入门克隆载体，用于后续实验。
利用番茄SlPKG基因编码的氨基酸(SEQ ID No.2)在本氏烟全基因组数据库(http://solgenomics.net/organism/Nicotiana_benthamiana/genome)中进行比对，获得单拷贝基因位点，命名NbPKG。NbPKG蛋白(SEQ ID No.4)和SlPKG蛋白(SEQ ID No.2)的序列一致性为77.6％。以本氏烟cDNA为模板扩增NbPKG全长片段(核酸序列如SEQ ID No.3所示)，所用引物为En-NbPKG-F(5’-CACCATGGGTTGTGTTTATTCAAG-3’)和En-NbPKG-R(5’-CCAGTCTTCAAGCCACTCTG-3’)；采用上段克隆方法将烟草NbPKG的全长片段克隆到pENTRY-TOPO入门载体，最终经测序验证正确后获得pENTRY-NbPKG入门克隆载体。
实施例2、PKG蛋白结构域预测及原核表达纯化
1、PKG蛋白结构域预测
将SlPKG和NbPKG的编码氨基酸分别在smart网站(http://smart.embl.de)进行结构预测，结果显示SlPKG和NbPKG蛋白结构具有很高的相似性，均包含cGMP依赖型激酶结构域和PP2C类磷酸酶结构域(见图2)。
2、SlPKG蛋白的原核表达纯化
以番茄cDNA为模板，采用PCR方法将SlPKG序列克隆至原核表达载体pET22b载体(上海庄盟生物科技有限公司)，所采用的PCR扩增引物为22bPKG-F(5’-AAGAAGGAGATATACA TATGGGTTGTGTTTATTCAAG-3’，下划线部分为pET22b载体插入位点左侧同源序列)和22bPKG-R(5’-GTGGTGGTGGTGGTGCCAGTCTTGAAGCCACTCTG-3’，下划线部分为pET22b载体插入位点右侧同源序列)。产物回收后，利用无缝克隆重组酶(中美泰和生物科技有限公司)将相应片段重组至线性化的pET22b载体。获得的pET22b-SlPKG载体转化至大肠杆菌表达菌株DE3，通过IPTG诱导表达、镍柱纯化、SDS-PAGE电泳检测，获得了可溶性SlPKG蛋白，大小约120KD，与预期大小一致(图3中A)，Westernblot进一步验证了所表达蛋白的准确性(图3中B)。
实施例3、SlPKG蛋白激酶活性检测
利用Kinase-Gloplus luminescent kinase assay(V3771,Promega)试剂盒检测SlPKG的激酶活性。具体方法为：将1μg SlPKG蛋白(实施例2制备)与50μl反应液(配方：25mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，1μg/μL组蛋白，1μM ATP)混合均匀，30℃孵育15min后加入Kinase-Glo试剂中止反应，室温放置10min后利用TECAN发光检测仪检测化学信号，以ATP的消耗量来计算SlPKG蛋白的激酶活性，以携带pET22b空载体的大肠杆菌裂解液过柱后的样品处理为对照。检测结果显示，SlPKG消耗ATP的能力明显强于对照，表明SlPKG具有激酶活性(见图4)。暗示SlPKG在植物抗病的生化机制上可能发挥重要作用。
实施例4、SlPKG亚细胞定位检测
利用Gateway同源重组技术，将实施例1构建的pENTRY-SlPKG入门载体与携带GFP标签的pEarleyGateS101双元载体(本实验室保存，记载于“Wei,H.L.,Chakravarthy,S.,Worley,J.N.,&Collmer,A.(2013).Consequences of flagellin export through thetype III secretion system of Pseudomonas syringae reveal a major differencein the innate immune systems of mammals and the model plant Nicotianabenthamiana.Cellular Microbiology,15(4):601-618.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)发生LR反应，过夜反应后，将重组产物转化至大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养后，选取单克隆进行PCR验证，验证正确的克隆摇菌提取质粒，进一步测序验证，从而获得pEarleyGateS101-SlPKG载体，随后转化至土壤杆菌GV3101。将携带pEarleyGateS101-SlPKG载体的土壤杆菌菌株与分别含有细胞质膜、内质网和高尔基体等定位标记(RFP标签)的土壤杆菌共同注射本生烟，48h后通过荧光共聚焦显微镜观察SlPKG在植物上的亚细胞定位。结果如图5所示，SlPKG定位在植物细胞质膜。
实施例5、SlPKG基因沉默的烟草植株构建
本实例通过病毒介导的基因沉默技术来沉默烟草的NbPKG基因。利用VIGS在线设计工具(http://vigs.solgenomics.net)设计沉默PKG的区段，采用VIGS-F(5’-AATCAGGAACCTATGGGCCTATACATT-3’)和VIGS-R(5’-GAGCTTTGCCAAAGAACCC ACAA-3’)扩增沉默区段(SEQ ID No.3的第2395-2691位)，利用PCR扩增沉默区段，切胶回收后，利用8/GW/TOPO克隆试剂盒(Invitrogen，货号2309811)，将相应片段连接至/>8/GW/TOPO载体(Invitrogen)，经测序验证正确后得到的重组载体命名为pCR8-PKG。将获得的pCR8-PKG与目的载体pTRV2(本实验室保存，记载于“Wei,H.L.,Chakravarthy,S.,Worley,J.N.,&Collmer,A.(2013).Consequences of flagellin export through the type IIIsecretion system of Pseudomonas syringae reveal a major difference in theinnate immune systems of mammals and the model plant Nicotianabenthamiana.Cellular Microbiology,15(4):601-618.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)发生LR反应，获得pTRV-PKG基因沉默载体。然后将pTRV-PKG基因沉默载体转化至土壤杆菌GV3101，之后将含有相应载体的土壤杆菌注射2-3周大的烟草幼苗，利用病毒系统瞬时沉默烟草中的NbPKG基因，以大肠杆菌片段(Escherichia coli fragment,EC1)为对照(烟草植物中没有大肠杆菌EC1片段的同源序列，以此为对照对烟草植株进行VIGS，被认为对烟草的基因没有影响。EC1片段具体文献来源为Rosli,H.G.,Zheng,Y.,Pombo,M.A.,Zhong,S.,Bombarely,A.,Fei,Z.,...&Martin,G.B.(2013).Transcriptomics-based screen for genes induced by flagellin andrepressed by pathogen effectors identifies a cell wall-associated kinaseinvolved in plant immunity.Genome biology,14(12),1-15.)。注射后3周的烟草植株利用荧光定量PCR进行沉默效率检测，所用引物为qNbPKG-F(5’-GTCATGCGGCATTCTTGATG-3’)和qNbPKG-R(5’-TTGAATCGCCCGAATTAGCA-3’)。结果如图6所示，NbPKG基因沉默烟草植株体内的NbPKG基因表达量明显降低。
实施例6、NbPKG基因沉默的烟草植株对PTI的响应分析
病原相关分子模式介导的免疫反应(PAMP triggered immunity,PTI)是植物先天免疫的第一道防线。本实施例检测NbPKG基因沉默对PTI的影响，具体指标为flg22诱导的胼胝质积累。以上述获得的NbPKG基因沉默烟草植物和EC1对照植株为材料，分别接种1μMflg22(Phyto Technology Laboratories,AKR6622004A)，于6h后用直径0.6cm的打孔器收集接种部位的叶片，置于12孔微量滴定板，每孔加入2mL 95％的乙醇，之后37℃孵育，使叶片脱色至完全透明。脱色后的叶片用70％乙醇洗涤2次，然后用去离子水洗涤3次，随后加入0.1％的苯胺蓝溶液，黑暗条件下放置1h。将着色后的叶片置于载玻片上，利用60％甘油固定，之后使用Leica TCS SP5荧光显微镜观察染色结果。结果显示，flg22处理后的对照植株胼胝质大量积累，而处理NbPKG基因沉默植株胼胝质的积累明显减少(图7)。表明NbPKG基因在植物先天免疫中发挥重要功能。
实施例7、NbPKG基因沉默烟草植株抗病性检测
以上述获得的PKG基因沉默烟草植物和EC1对照植株为材料，分别喷雾接种烟草野火疫病菌——丁香假单胞烟草致病变种(P.syringae pv.tabaci)(本实验室保存，记载于“Gu,Y.,Wang,J.,Xia,Z.,&Wei,H.L.(2020).Characterization of a versatile plantgrowth-promoting rhizobacterium Pseudomonas mediterranea strainS58.Microorganisms,8(3),334.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)，接种浓度为1×106CFU/ml(喷叶片背部，以表面湿润但接种液不滴下来为标准)，4-6天后观察发病情况并统计病原菌增殖量。每个供试株系36株，结果取均值。
结果显示，NbPKG基因沉默后的烟草对野火疫病的抗性明显降低，表现为NbPKG基因沉默烟草上的病斑明显多于对照(图8中A)，且病原菌的增殖量也显著高于对照(图8中B)。说明NbPKG在植物抵抗病原菌侵染过程中起到重要作用。
实施例8、SlPKG超表达番茄增强了对番茄斑点病的抗性
1.SlPKG基因超表达番茄的获得及鉴定
利用Gateway同源重组技术，将实施例1构建的pENTRY-SlPKG入门载体与pH7WG2D.1(本实验室收集，记载于“Arthikala,M.K.,Sánchez-López,R.,Nava,N.,Santana,O.,Cárdenas,L.,&Quinto,C.(2014).RbohB,a Phaseolus vulgaris NADPHoxidase gene,enhances symbiosome number,bacteroid size,and nitrogen fixationin nodules and impairs mycorrhizal colonization.New Phytologist,202(3),886-900.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)发生LR反应，经测序验证正确后获得pH7WG2D.1-PKG番茄转化超表达载体。随后将pH7WG2D.1-PKG超表达载体转化至土壤杆菌GV3101用于转化番茄品种Moneymarker的愈伤组织中。具体转化方法参见文献“Zhang XF,Li N,Liu X,Wang JJ,Zhang YX,Liu D,Wang YQ,Cao HP,ZhaoBM,Yang WC.Tomato protein Rx4 mediates the hypersensitive response toXanthomonas euvesicatoria pv.perforans race T3.Plant Journal,2021,105:1630-1644”。进一步经过潮霉素抗性筛选后，利用上述test-SlPKG-F(5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’)和En-SlPKG-R(5’-CTACCAGTCTTGAAGCC ACT-3’)对得到的阳性转化子进行分子检测，PCR扩增产物为3430bp的片段即为转基因阳性植株，经上述PCR鉴定，将其中转入pH7WG2D.1-PKG的转基因番茄株系记做T0代转SlPKG番茄株系SlPKG-OE。
实验同时设置向野生型Moneymarker中转入pH7WG2D.1的空载对照。
2.SlPKG基因超表达番茄抗病性检测
以上述获得的T0代转SlPKG番茄株系SlPKG-OE、野生型Moneymarker和空载对照植株为材料，按照常规方法在温室种植，4-5周后进行番茄斑点病菌接种实验。具体方法为将1×106CFU/ml的番茄斑点病病原菌——丁香假单胞番茄致病变种(P.syringae pv.tomato)喷雾接种至转SlPKG番茄株系、野生型Moneymarker和空载对照植株(喷叶片背部，以表面湿润但接种液不滴下来为标准)，5d后观察发病情况，并计算病情指数。每个供试株系36株，结果取均值。
病情指数分级标准为：0级：叶片无病斑；1级：0＜病斑面积占总叶片面积≤10％；2级：10％＜病斑面积占总叶片面积≤25％；3级：25％＜病斑面积占总叶片面积≤50％；4级：50％＜病斑面积占总叶片面积≤75％；5级：75％＜病斑面积占总叶片面积≤100％。计算方法如下：病情指数＝Σ(各级发病数×各级代表值)/(调查总叶数×最高代表值)×100％。病情指数标准和统计方法参见文献“冯中红,王玉琴,杨成德,薛莉,陈秀蓉.番茄细菌性叶斑病菌的拮抗菌筛选、鉴定及其拮抗性能评.草业学报,2015,24(08):166-173.”。
结果显示，转SlPKG番茄株系对番茄斑点病的抗性明显增强，表现为病斑数量明显少于野生型番茄植株(图9中A)。同时调查了病原菌处理后转基因和野生型番茄植株的病情指数，结果如图9中B所示，转SlPKG番茄植株和野生型植株的病情指数分别为17.23％和56.37％，表明SlPKG超表达番茄增强了对番茄斑点病的抗性。空载对照植株的发病情况与野生型Moneymarker基本一致，无统计学差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1. SIPKG蛋白在如下（a1）或（a2）中的应用：
（a1）调控植物抗病性；
（a2）调控植物对病原菌的抗性；
所述SIPKG蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
所述调控为：在所述植物中，所述SIPKG蛋白的表达量升高，所述植物的抗病性增强，所述植物对病原菌的抗性增强；
所述病为番茄斑点病；
所述病原菌为丁香假单胞番茄致病变种；
所述植物为番茄。
2. NbPKG蛋白在如下（a1）或（a2）中的应用：
（a1）调控植物抗病性；
（a2）调控植物对病原菌的抗性；
所述NbPKG蛋白为如下任一：
（A3）氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的蛋白质；
（A4）在（A3）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
所述调控为：在所述植物中，所述NbPKG蛋白的表达量降低，所述植物的抗病性减弱，所述植物对病原菌的抗性减弱；所述NbPKG蛋白的表达量降低是通过向所述植物中导入携带有SEQ ID No.3的第2395-2691位所示DNA片段的VIGS载体实现的；
所述病为烟草野火病；
所述病原菌为丁香假单胞烟草致病变种；
所述植物为烟草。
3.一种培育抗病性提高和/或对病原菌抗性提高的植物的方法，包括使受体植物中SIPKG蛋白的表达量提高的步骤；
所述SIPKG蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
所述病为番茄斑点病；
所述病原菌为丁香假单胞番茄致病变种；
所述植物为番茄。
4. 一种培育抗病性降低和/或对病原菌抗性降低的植物的方法，包括使受体植物中NbPKG蛋白的表达量降低的步骤；使所述受体植物中NbPKG蛋白的表达量降低是通过向所述受体植物中导入携带有SEQ ID No.3的第2395-2691位所示DNA片段的VIGS载体实现的；
所述NbPKG蛋白为如下任一：
（A3）氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的蛋白质；
（A4）在（A3）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
所述病为烟草野火病；
所述病原菌为丁香假单胞烟草致病变种；
所述植物为烟草。
5.一种培育抗病性提高和/或对病原菌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达SIPKG蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性提高和/或对病原菌抗性提高；
所述SIPKG蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
所述病为番茄斑点病；
所述病原菌为丁香假单胞番茄致病变种；
所述植物为番茄。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：能够表达所述SIPKG蛋白的核酸分子是通过重组载体的形式导入所述受体植物中的。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：能够表达所述SIPKG蛋白的核酸分子为SEQ ID No.1所示DNA分子。
8.一种培育抗病性降低和/或对病原菌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达NbPKG蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比株抗病性降低和/或对病原菌抗性降低；
对所述受体植物中能够表达所述NbPKG蛋白的核酸分子进行抑制表达是通过向所述受体植物中导入携带有SEQ ID No.3的第2395-2691位所示DNA片段的VIGS载体实现的；
所述NbPKG蛋白为如下任一：
（A3）氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的蛋白质；
（A4）在（A3）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
所述病为烟草野火病；
所述病原菌为丁香假单胞烟草致病变种；
所述植物为烟草。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：能够表达所述NbPKG蛋白的核酸分子为SEQ ID No.3所示的DNA分子。
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