KR101372114B1 - 벼 징크 핑거 단백질 전사 인자 ｄｓｔ 및 가뭄 및 염 내성을 조절하기 위한 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

서열번호 2에 보여준 아미노산 서열을 갖는 징크 핑거 단백질 전사 인자 DST, 이의 보존적 변이체 및 상동성 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 전사 인자 DST를 코딩하는 DNA 서열, 상기 DNA 서열을 포함하는 벡터 또는 숙주 세포, 상기 DST에 결합하는 cis-액팅 인자, 상기 전사 인자 DST 또는 이의 코딩 서열의 억제제 또는 비보존 변이체, 및 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하기 위한 억제제 또는 비보존 변이체의 용도를 제공한다.

Description

벼 징크 핑거 단백질 전사 인자 ＤＳＴ 및 가뭄 및 염 내성을 조절하기 위한 이의 용도 {Rice zinc finger protein transcription factor DST and use thereof for regulating drought and salt tolerance}
본 발명은 식물 개량을 위한 식물 생물공학 및 유전공학 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 식물에서 가뭄 및 염 내성을 증가시키는 새로운 벼 징크 핑거 단백질 전사 인자 유전자 및 상기 유전자로 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 용도, 식물에서 상기 기재된 유전자 또는 상기 유전자로 발현된 단백질의 저해에 의한 염 저항성 및/또는 가뭄 저항성을 개선시키는 방법, 및 형질전환 식물체에 관한 것이다.
식량에 대해 증가된 세계적 수요 및 계속되는 경작지의 축소는 국가적인 식량 안전에 지속적인 압력을 야기했다. 식량 생산에 있어서, 가뭄 및 염은 매년 작물의 양 및 질의 현저한 감소를 초래하는 주요한 비생물적 (abiotic) 스트레스이다. 게다가, 가뭄은 대개 염을 동반한다. 예를 들면, 토양의 염화 (salinization)는 가뭄 지역에서 흔한 토양 악화 현상이다.
유효한 데이터는 중국에서 가뭄에 따른 연간 벼 손실 비용이 적어도 20억 $ 정도이고, 경작지의 염화는 또한 감소된 생산량 및 낮은 수확량의 주요한 이유라는 것을 보여준다. 가뭄 및 염은 중국의 농업이 직면한 두 가지의 심각한 문제를 나타내 왔다.
따라서, 중국 및 세계의 식량 문제를 해결하는, 수확량 증가를 위한 작물의 가뭄 및/또는 염 내성을 개선시키는 방법은 매우 중요하다. 비생물적 스트레스 연구는 식물 연구에서 가장 긴급하고 도전적인 분야 중 하나이다.
현재까지, 유전공학 기술을 사용하여 몇몇의 전사 인자를 포함하는, 몇 가지 가뭄 및 염 저항성 관련 유전자가 클로닝되었고, 식물 또는 작물의 몇 가지 스트레스 저항성 품종 (strain)이 얻어졌다. 스트레스 저항성 유전공학의 목적은 전사 인자가 중요한 역할을 수행하는 유전자 전사 및 발현 조절에 의한 식물 스트레스 저항성을 향상시키는 것이다.
현재, 스트레스 저항성 유전자 발현에 참여하는 몇 가지 전사 인자가 클로닝되었다. 그러나, 식물에서 이들 스트레스 반응의 복잡한 과정에 관여하는 많은 전사 인자 때문에, 상기 전사 인자는 단지 빙산의 일각에 불과하다. 훨씬 더 많은 전사 인자가 발견되고 조사되어야 하며, 스트레스 저항성과 함께 작물 육종에 사용되어야 한다.
따라서, 스트레스 저항성 작물의 새로운 육종 방법 및 상기 새로운 작물을 개발하여, 작물의 수량 및 품질을 개선하기 위해, 스트레스 반응 유전자 발현에 관여하는 전사인자를 조사하는 것이 이 분야에서 긴급히 요구된다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 목적은 식물에서 (특히 작물) 염 및 가뭄 내성과 밀접하게 관련된 신규 유전자인 벼 징크 핑거 단백질 전사 인자 DST를 제공하고, 상기 전사 인자가 식물에서 염 및 가뭄 내성의 음성조절자라는 것을 확인하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 식물에서 염 및/또는 가뭄 스트레스 저항성을 향상시키기 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 가뭄 및 염 내성이 향상된 형질전환 식물체를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 향상된 가뭄 및 염 저항성을 갖는 식물을 선발하는 방법 및 상기 선발 방법에 의해 얻어진 식물체를 제공하는 것이다.
제 1 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드에서 보존된 돌연변이를 갖는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 상동체를 포함하는 분리된 징크 핑거 단백질 전사 인자를 제공한다.
바람직한 일구현예에서, 상기 폴리펩티드는 Cys-2/His-2 유형 징크 핑거 구조 도메인을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 과산화수소 축적의 조절 및/또는 기공 개도 (stomatal aperture)를 조절하여, 벼에서 가뭄 및 염 내성에 영향을 미치는 퍼옥시드에 작용하는 효소에 관련된 유전자의 조절에 관여한다.
본 발명의 일구현예에서, 상기 폴리펩티드는 하기의 그룹에서 선택된다:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 아미노산 잔기 치환, 결실, 또는 삽입을 가지며, 식물에서 가뭄 및 염 감수성을 증가시킬 수 있는 (a)로부터 유래된 폴리펩티드; 또는
(c) Cys-2/His-2 유형 징크 핑거 구조 도메인을 가지며, 식물에서 가뭄 및 염 감수성을 증가시킬 수 있는 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 폴리펩티드 상동체.
바람직한 구현예에서, 상기 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물, 바람직하게는 작물이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물은 벼과 (Gramineae), 아욱과 목화속 (Malvaceae gossypium), 십자화과 유채속 (Cruciferae brassica), 국화과 (Compositae), 가지과 (Solanaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 또는 산형과 (Umbelliferae), 바람직하게는 벼과 (Gramineae)로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물은 벼, 옥수수, 밀, 보리, 사탕수수, 수수, 애기장대, 목화 또는 캐놀라, 더 바람직하게는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 사탕수수 또는 수수로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 염은 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 카보네이트 또는 소듐 바이카보네이트를 말한다.
제 2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
바람직한 일구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그것의 폴리펩티드 상동체를 코딩한다.
본 발명의 일구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 하기로부터 선택된 것이다:
(a) 서열번호 1의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
(b) 서열번호 1에서 뉴클레오티드 1-435를 포함하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열의 하나에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열.
제 3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 박테리아 플라스미드, 파지 (phage), 효모 플라스미드, 식물 바이러스, 또는 포유류 바이러스 (mammalian virus); 바람직하게는, pCAMBIA1301, pEGFP-1, pBI121, pCAMBIA1300, pCAMBIA2301 또는 pHB, 및 더욱 바람직하게는, pCAMBIA1301로부터 선택된다.
제 4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하거나, 또는 게놈에 삽입된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 갖는 유전적으로 조작된 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 하등 진핵 세포 또는 고등 진핵 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포, 더욱 바람직하게는 대장균, 스트렙토미세스, 아그로박테리움, 효모, 가장 바람직하게는 아그로박테리움으로부터 선택되며, 상기 아그로박테리움은 EHA105, SOUP1301 또는 C58, 바람직하게는, EHA105을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
제 5 양태에서, 본 발명은 본 발명의 전사 인자와 결합 가능한 서열번호 3의 서열을 포함하는 cis-액팅 인자(cis-acting element)를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 cis-액팅 인자는 TGCTANN(A/T)TTG의 서열을 가지며, 상기 N은 A, C, G 또는 T로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 cis-액팅 인자는 본 발명의 전사 인자의 징크 핑거 구조 도메인에 결합한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 전사 인자에 상기 cis-액팅 인자의 결합은 식물에서 가뭄 및 염에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다.
제 6 양태에서, 본 발명은 징크 핑거 전사 인자 단백질 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 길항제(antagonist)를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 길항제는 작은 간섭 RNA (small interference RNA), 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
제 7 양태에서, 본 발명은 식물에서 가뭄 및 염 내성을 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 징크 핑거 전사 인자 억제, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 발현 억제, 또는 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사 인자에 대한 cis-액팅 인자의 결합 억제를 포함한다.
바람직한 일구현예에서, 상기 억제는 결실, 돌연변이, RNAi, 안티센스 또는 우성 음성(dominant negative) 조절 방법에 의해 수행된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 억제는 본 발명의 전사 인자 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입을 도입하여, 개선된 가뭄 및 염 내성을 갖는 식물을 생성하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 상기 억제는 69번 아미노산에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 돌연변이, 162번 아미노산에서 알라닌의 트레오닌으로의 돌연변이를 시켜, 개선된 가뭄 및 염 내성을 얻기 위해 이들 돌연변이 서열을 갖는 식물을 생성하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 식물체에 본 발명의 길항제 적용을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 억제는 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사 인자를 표적화하는 작은 간섭 RNA를 포함하는 벡터로 식물을 형질전환시키거나 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 식물을 형질전환시키는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 비형질전환 식물 또는 다른 형질전환 식물과 상기 기재된 방법으로 얻어진 향상된 가뭄 및 염 내성을 갖는 식물을 교잡육종하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 염은 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 카보네이트 또는 소듐 바이카보네이트를 말한다.
제 8 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 가뭄 및 염 내성을 갖는 식물체를 선발하는 방법을 제공한다:
(i) 후보 식물에서 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사 인자의 수준, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현 수준, 및/또는 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사 인자에 대한 본 발명의 cis-액팅 인자의 결합 수준을 검출하는 단계; 및
(ii) 대조구 식물의 수준과 단계 (i)의 후보 식물에서 검출된 수준을 비교하는 단계로서, 후보 식물의 수준이 대조구 식물의 수준보다 낮으면, 상기 후보 식물은 가뭄 및 염 내성 식물이다.
바람직한 구현예에서, 상기 염은 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 카보네이트 또는 소듐 바이카보네이트를 말한다.
제 9 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 단백질 전사 인자를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 발현에 적절한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양 배지로부터 징크 핑거 단백질 전사 인자를 분리하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 식물에서 가뭄 및 염 내성을 증가시키기 위한 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사 인자 또는 뉴클레오티드 서열의 억제제 또는 비보존 돌연변이 서열의 용도를 제공한다.
바람직한 일구현예에서, 상기 억제제는 상기 전사 인자 또는 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는, 작은 간섭 RNA, 항체, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 비보존 돌연변이 서열은 상기 비보존 돌연변이 서열을 포함하는 식물에서 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사 인자 또는 뉴클레오티드 서열의 번역 및 발현을 억제하여, 비보존 돌연변이 서열을 포함하지 않는 야생형 식물보다 나은 가뭄 및 염 내성을 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 비보존 돌연변이 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 205번 위치에서 A가 G로 돌연변이되고, 484번 위치에서 G가 A로 돌연변이된 2개의 돌연변이를 갖거나, 서열번호 2의 아미노산 서열의 69번 위치에서 아스파라긴이 아스파르트산으로 돌연변이되고, 162번 위치에서 알라닌이 트레오닌으로 돌연변이된 2개의 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 일구현예에서, 식물에서 상기 가뭄 및 염 내성 개선은 하기를 포함한다:
(i) 식물에 상기 기재된 억제제 (길항제)를 직접적으로 적용하는 단계;
(ii) 식물로 상기 기재된 비보존 돌연변이 서열을 도입하는 단계; 또는
(iii) 비보존 돌연변이 서열에 대한 특이적 분자 마커를 디자인하고, 상기 분자 마커를 사용하여 비보존 돌연변이 서열을 갖는 돌연변이 식물체와 또 다른 벼 종의 교잡육종으로부터 유래된 자손을 스크리닝하여 비보존 돌연변이 서열을 포함하는 개별 자손을 선발하는 단계.
본 발명의 바람직한 일구현예에서, 상기 분자 마커는 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 서열을 갖는 프라이머 쌍, 및/또는 서열번호 12 및 서열번호 13에 제시된 서열을 갖는 프라이머 쌍을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선시키는 방법을 제공한다: (A) 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사 인자 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 억제제 또는 비보존 돌연변이 서열을 제공하는 단계; (B) 하기로부터 선택된 하나 이상의 처리를 식물에 적용하는 단계: (i) 식물에 직접적으로 상기 억제제를 적용하는 단계; (ii) 식물로 비보존 돌연변이 서열을 도입하는 단계; 또는 (iii) 비보존 돌연변이 서열에 대해 특이적인 분자 마커를 디자인하고, 상기 분자 마커를 사용하여 비보존 돌연변이 서열을 갖는 돌연변이 식물체와 또 다른 벼 종의 교잡육종으로부터 유래된 자손을 스크리닝하여 비보존 돌연변이 서열을 포함하는 개별 자손을 선발하는 단계.
본 발명의 바람직한 일구현예에서, 상기 분자 마커는 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 서열을 갖는 프라이머 쌍, 및/또는 서열번호 12 및 서열번호 13에 제시된 서열을 갖는 프라이머 쌍이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다:
(1) 본 발명의 징크 핑거 단백질 전사인자의 비보존 돌연변이 서열을 포함하는 구축물 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비보존 돌연변이 서열을 포함하는 구축물로 식물 세포 또는 식물 기관을 트랜스펙션시키는 (transfecting) 단계;
(2) 비보존 돌연변이 서열을 포함하는 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관을 선발하는 단계; 및
(3) 단계 (2)에서 얻어진 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관으로부터 식물을 재분화시키는 단계,
상기 획득된 형질전환 식물은 비형질전환 식물보다 높은 가뭄 및 염 내성을 갖는다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 또한 비형질전환 식물 또는 또 다른 형질전환 식물과 획득된 형질전환 식물을 교잡육종하여, 비보존 돌연변이 서열을 포함하는 잡종 자손의 획득을 포함하며, 상기 잡종 자손은 비형질전환 식물체보다 높은 가뭄 및 염 내성을 갖고, 바람직하게는, 상기 잡종 자손은 안정적인 유전 형질을 갖는다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 또한 향상된 가뭄 및 염 내성을 갖는 식물을 획득하기 위해 형질전환 식물의 교잡육종으로부터 획득된 자손을 선별하기 위한 비보존 돌연변이 서열에 대한 특이적 분자 마커의 디자인을 포함한다.
본원을 기초로 하여, 본 발명의 다른 양태는 당업자에게 명백할 것이다.
도 1: 벼 DST 유전자 서열 (도 1A) 및 그의 코딩되는 아미노산 서열 (도 1B).
도 2: 가뭄 및 염 조건 하에서의 벼 DST 유전자 돌연변이 dst의 표현형 및 야생형 벼의 표현형의 비교. 각 패널에서, 야생형 (Zhonghua 11, ZH11)은 좌측에, dst 돌연변이는 우측에 있다.
도 3: 가뭄 및 염 조건 하에서의, 야생형, DST 유전자 상보성(complementation)으로 수득한 dst 돌연변이, 및 RNAi에 의해 감소된 DST 기능을 갖는 식물의 표현형 비교.
도 4: MatchmakerTM GAL4 yeast two-hybrid system 3 (Clontech)를 이용한 DST 전사 활성화의 분석.
도 5: EMSA(electrophoresis mobility shift assay)의 결과. 도 5a 및 5c는 DST와 결합하는 cis-액팅 인자의 다양한 돌연변이체의 서열을 보여준다. 도 5b는 DST와 cis-액팅 인자 결합이 표지되지 않은 DNA 경쟁자(competitor)와 경쟁할 수 있다는 것을 보여준다. 도 5d 및 5e는 원래의 B3 서열 및 다양한 돌연변이체 서열에 대한 겔-이동 분석을 보여준다. DST 결합에 대한 뉴클레오티드들의 상대적인 중요성은 도 5a의 하단부에 예시되어 있으며, 여기에서 각 뉴클레오티드의 상대적 크기는 결합 상호작용에서 이의 상대적 중요성을 나타낸다.
도 6: 벼과(Gramineae) 작물들에서의 상동성 DST 징크 핑거 단백질 도메인의 서열 정렬 분석.
장기간의 집중적인 조사 후, 본 발명의 발명자들은 신규한 벼 징크 핑거 단백질 전사 인자 유전자 DST (Drought and Salt Tolerance gene ; 가뭄 및 염 내성 유전자)를 발견했으며, 상기 유전자가 식물에서 가뭄 및 염 내성을 제어할 수 있는 가뭄 및 염 내성에 대한 음성조절자이며, 상기 유전자의 발현 억제가 식물에서 염 또는 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다는 것을 확인했다. 따라서, 상기 유전자는 가뭄 및 염에 저항성인 식물 육종에서 중요한 역할을 한다. 이를 근거로, 본 발명자들은 본 발명을 실용화시켰다.
구체적으로, 벼 돌연변이 라이브러리 (EMS 돌연변이생성) 및 맵-기반 클로닝 기법을 이용하여, 본 발명자들은 염 스트레스 조건 하에 대규모 스크리닝을 수행하여 벼에서 가뭄 및 염 내성을 제어하는 신규한 유전자 DST를 수득했다. 게놈 DST 유전자의 길이는 906bp인데, 이는 임의의 인트론을 포함하지 않는다. 따라서, 전장 ORF (오픈 리딩-프레임)은 906bp이다. 상기 유전자는 301개 아미노산을 코딩하는데, 이는 보존 징크 핑거 도메인을 포함하는 약 29KDa의 단백질이다. 상기 단백질은 전사 인자이다.
표현형 동정으로부터의 결과는 상기 유전자의 돌연변이 (예를 들어, 2개의 뉴클레오티드 돌연변이가 있는 DST 유전자로, 결과적으로 2개의 아미노산 치환이 있는 것)가 가뭄 및 염 내성 양자를 나타낸다는 것을 보여준다. 상기 유전자의 발현을 하향조절하는 RNAi의 이용은 또한 증진된 가뭄 및 염 내성을 제공했다.
생화학적 연구 결과들은 DST가 전사 활성화 도메인 뿐만 아니라 DNA 결합 도메인을 포함하는 전사 인자임을 보여준다. 유전자 칩 분석은 DST가 일련의 다운스트림 유전자를 조절하는 전사 인자로서 기능한다는 것을 보여준다.
기능 연구는, 야생형과 비교시, 돌연변이체가 기공 주변에 더 많은 과산화수소 (H2O2)를 축적하고, 더 작은 기공개도를 갖고 있으며, 잎으로 하여금 가뭄 스트레스 하에 상대적으로 더 많은 수분 함량을 유지하도록 한다는 것을 보여준다. 따라서, 돌연변이체는 더 높은 가뭄 내성을 갖고 있다. 추가로, 돌연변이체에서의 더 작은 기공개도로 인해, 기공 유통성(conductance)이 더 낮고, 수분 증발 속도가 더 느리다. 그 결과, 뿌리로부터 지상부 (잎 등)으로의 Na+ 이온의 수송은 줄어들고, 따라서 Na+ 독성이 더 낮고, 이로써 염 내성이 증진된다. 본 연구는, DST가 퍼옥시다아제-관련 유전자의 조절에 관여하며, 과산화수소 (H2O2)의 축적을 제어하고, 기공개도를 조절함으로써, 벼에서의 가뭄 및 염 내성에 영향을 준다는 것을 보여준다.
상기 연구는 DST 유전자가 가뭄 저항성 및 염 저항성에 대한 음성 조절 인자이고, 그의 발현 억제가 식물에서의 염 또는 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다는 점을 보여준다. 이러한 특성은 염 스트레스 및 가뭄에 대한 현저히 더 높은 저항성이 있는 트랜스제닉 (transgenic) 식물 생산에 이용될 수 있다. 따라서, DST 유전자는 염 스트레스 및 가뭄과 같은 불리한 스트레스를 작물이 견뎌내는 능력 개선에 있어서 큰 잠재성을 갖는다 .
더욱이, 데이터베이스 검색은 다음과 같은 점을 밝혀낸다: 수수 (Sorghum bicolor) 게놈에 1 개의 DST 상동성 유전자가 있고, 그의 단백질 유사도가 54.3%이고; 옥수수 (Zea mays) 게놈에 3 개의 DST 상동성 유전자가 있고, 그의 단백질 유사도가 51.7%, 36.1% 및 33.5%이고; 보리 (Hordeum vulgare) 게놈에 1 개의 DST 상동성 유전자가 있고, 그의 단백질 유사도가 38.4%이고; 사탕수수 (Saccharum officinarum) 게놈에 3 개의 DST 상동성 유전자가 있고, 그의 단백질 유사도가 38.2%, 38.2% 및 34.5%임. 상기 상동성 유전자는 전부 보존된 C2H2-타입 징크 핑거 구조 도메인을 갖고 있는데, 이는 N 말단에서 높은 유사성을 갖고 있어, 기타 식물 (바람직하게는 벼과식물(Gramineae))에서의 DST 상동성 유전자가 벼 DST 유전자의 것과 유사한 기능을 갖는다는 점을 시사한다.
DST 단백질 또는 폴리펩티드 및 그의 코딩 서열
본 발명에서, 용어 "DST 단백질 또는 폴리펩티드", "DST 유전자가 코딩하는 단백질 또는 폴리펩티드" 또는 "징크 핑거 단백질 전사 인자"는 본 발명의 DST 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 정의는 보존 돌연변이가 있는 상기 기재된 단백질 또는 폴리펩티드의 돌연변이 또는 그의 상동성 폴리펩티드를 포함한다. 이들은 전부 Cys-2/His-2 타입 징크 핑거 구조 도메인을 갖고 있으며, 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 발현이 억제되면, 가뭄 또는 염 스트레스에 대한 저항성이 식물에서 증가될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 전사 인자들은 퍼옥시다아제-관련 유전자의 조절에 관여하며, 과산화수소 축적을 제어하고/하거나 기공개도를 조절함으로써, 벼에서의 가뭄 및 염 내성에 영향을 준다.
상기 DST 단백질 또는 폴리펩티드 서열은 하기의 것으로부터 선택된다: (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 삽입을 갖고, 식물에서 가뭄 및 염 감수성을 증가시킬 수 있는, (a)로부터 유도된 폴리펩티드; 또는 (c) Cys-2/His-2 타입 징크 핑거 구조 도메인을 갖고, 식물에서 가뭄 및 염 감수성을 증가시킬 수 있는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 폴리펩티드 상동체. 바람직하게는, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 TGCTANN(A/T)TTG에 결합할 수 있고, 여기서 N은 A, C, G 또는 T를 나타낸다.
본 발명의 단백질 및 폴리펩티드는 정제된 천연 생성물 또는 화학적으로 합성된 생성물일 수 있거나, 또는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포)로부터 재조합 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 DST 단백질 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 벼과식물 (바람직하게는, 벼) DST 유전자 또는 그의 상동성 유전자 또는 패밀리 유전자에 의해 코딩된다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드에서의 돌연변이의 유형에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: 하나 이상 (일반적으로 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 가장 바람직하게는 1 내지 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 하나 또는 여러개 (일반적으로 20개 이하, 바람직하게는 10개 미만, 가장 바람직하게는 5개 미만)의 아미노산의 C 말단 및/또는 N 말단에서의 부가. 예를 들어, 당업계에는, 관련 또는 유사 특성을 가진 아미노산을 치환하는 경우, 단백질 또는 폴리펩티드의 기능이 일반적으로 변화하지 않는다는 것이 공지되어 있다. 또다른 예시로서, C 말단 및/또는 N 말단에서의 1개 또는 여러개의 아미노산 부가는 일반적으로 단백질 또는 폴리펩티드의 기능을 변화시키지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 DST 단백질 또는 폴리펩티드는 출발 메티오닌 잔기를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있으며, 식물에서 중금속 또는 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 활성을 여전히 갖는다. 당업자라면, 당업계 및/또는 통상적인 실험에서의 일반적인 지식을 근거로, 단백질 및 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치지 않는 상기 다양한 유형의 돌연변이를 쉽게 식별할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "보존 돌연변이 폴리펩티드"는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교해 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3개 이하의 아미노산이 관련 또는 유사 특성을 가진 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 지칭한다. 이들 보존 돌연변이 폴리펩티드는 아미노산 치환에 대해 하기 표 1에 따라 최선으로 생성될 수 있다:
Figure 112011086373227-pct00001
(b) 로부터의 상기 단백질 및 폴리펩티드는 무작위 돌연변이생성을 제공하기 위한 방사선조사 또는 돌연변이유발물질에 대한 노출에 의해, 또는 자리지정 돌연변이유발을 통해 또는 기타 공지된 분자생물학적 기법을 통해 수득될 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 형질전환 식물 구축에 이용되어, 형질전환 식물이 변경된 특징을 갖는지 여부를 근거로 단백질 또는 폴리펩티드를 스크리닝하거나 동정할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 돌연변이 형태는 하기의 것을 포함한다: 상동성 서열, 보존 돌연변이, 대립형질 돌연변이, 자연 돌연변이, 유도된 돌연변이, 높은 또는 낮은 스트린전트(stringent) 조건 하에 DST 단백질에 대한 코딩 서열과 혼성화할 수 있는 서열에 의해 코딩되는 단백질, 및 항-DST 단백질 항혈청을 이용해 수득된 폴리펩티드 또는 단백질. DST 단백질 또는 그의 절편을 포함하는 융합 단백질과 같은 기타 폴리펩티드도 또한 본 발명에 이용될 수 있다. 거의 전장의 폴리펩티드에 추가하여, 본 발명은 또한 DST 단백질의 가용성 절편도 포함한다. 일반적으로, 상기 가용성 절편은 DST 단백질 서열 중 약 10개 이상의 연속하는 아미노산, 일반적으로 약 30개 이상의 연속하는 아미노산, 바람직하게는 약 50개 이상의 연속하는 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 80개 이상의 연속하는 아미노산, 가장 바람직하게는 약 100개 이상의 연속하는 아미노산을 포함한다.
재조합체 제조에 사용되는 숙주에 따라서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않을 수 있다. 상기 용어는 또한 DST 단백질의 활성 절편 및 활성 유도체를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "DST 유전자", "식물 DST 유전자" 또는 "본 발명의 전사 인자의 코딩 서열"은 호환가능하다. 이들은 전부 본 발명의 DST 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 지칭한다. 이들은 벼 DST 유전자 서열 (서열번호 1 참조)에 대해 고도로 상동성이며; 이들은 스트린전트 조건 하에 상기 유전자 서열에 혼성화할 수 있는 분자들이거나; 또는 이들은 상기 분자들에 고도로 상동성인 패밀리 유전자 분자들이다. 상기 유전자 발현 억제는 식물에서 가뭄 또는 염 스트레스에 대한 저항성에 있어서 명백한 개선을 초래한다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함한다: (a) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 435를 가진 뉴클레오티드 서열; 또는 (c) (a) 내지 (b)에서의 뉴클레오티드 서열 중 하나에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
본 명세서에서, 용어 "스트린전트 조건"은 하기를 지칭한다: (1) 0.2 ×SSC, 0.1% SDS, 60℃과 같은 낮은 이온 강도 및 고온 하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 변성제, 예컨대 50% (v/v) 포름아미드, 0.1% 소 혈청/0.1% Ficoll, 42℃ 등의 존재 하의 혼성화; 또는 (3) 두 서열간 상동성이 50% 이상, 바람직하게는 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상에 도달하는 경우에만 일어나는 혼성화. 예를 들어, 상기 서열은 (a)에서 정의된 서열에 상보적 서열일 수 있다.
본 발명의 DST 유전자 뉴클레오티드 서열의 전장 또는 절편은 일반적으로 PCR 증폭, 재조합 또는 합성 방법으로 수득될 수 있다. PCR 증폭을 위해서는, 관련된 서열들은 본 발명에서 개시된 관련 뉴클레오티드 서열, 구체적으로는 오픈 리딩 프레임을 근거로 하여 프라이머를 디자인하고, 상업적으로 유용한 cDNA 라이브러리 또는 당업자에게 공지된 방법으로 생성된 cDNA 라이브러리를 주형으로 이용하여 수득될 수 있다. 긴 서열을 다룰 때는, 2회 이상의 PCR 증폭이 일반적으로 필요하며, 이어서 증폭으로 수득된 절편을 올바른 순서에 따라 어셈블해야 한다.
본 발명의 DST 유전자는 바람직하게는 벼 유래라는 것을 이해해야 한다. 벼 DST 유전자와 높은 상동성 (예컨대 50% 이상, 바람직하게는 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 예컨대 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98%의 서열 동일성)을 공유하는 기타 식물로부터 수득되는 기타 유전자들도 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 서열 동일성을 비교하기 위한 방법 및 수단, 예컨대 BLAST는 당업계에 널리 공지되어 있다.
식물 및 염 및/또는 가뭄 스트레스에 대한 그의 저항성
본 명세서에서 사용된, 상기 "식물"은 하기를 포함한다 (그러나, 이에 제한되지는 않음): 벼과 (Gramineae), 아욱과 목화속 (Malvaceae Gossypium) 식물, 십자화과 유채속 (cruciferous Brassica), 국화과 (Compositae), 가지과 (Solanaceae), 꿀풀과 (Labiatae) 식물 또는 산형과 (Umbelliferae) 등. 바람직하게는, 상기 식물은 벼과 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼과 작물이다. 예를 들어, 상기 식물은 하기로부터 선택될 수 있다: 벼, 옥수수, 밀, 보리, 사탕수수, 수수, 애기장대, 목화 또는 캐놀라, 더욱 바람직하게는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 사탕수수 또는 수수.
본 명세서에서 사용된, 용어 "작물"은 곡물, 목화, 오일 등 농업 및 공업에서 경제적 가치가 있는 식물을 지칭한다. 경제적 가치는 식물의 종자, 과실, 뿌리, 줄기, 잎 및 기타 유용한 부분에 의해 반영될 수 있다. 작물에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: 쌍자엽식물 또는 단자엽식물. 바람직한 단자엽식물은 벼과 식물, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 수수 등이다. 바람직한 쌍자엽식물에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: 아욱과 목화 식물, 십자화과 식물, 예컨대 유채속 식물, 더욱 바람직하게는 목화 및 캐놀라.
본 명세서에서 사용된, 용어 "염 스트레스"는 하기를 지칭한다: 식물이 고농도의 염을 포함하는 토양 또는 물에서 생장할 때, 그의 생장이 억제되거나 또는 심지어 죽게 되는 현상. 염 스트레스를 유발하는 염에는 하기의 것이 포함된다 (이에 제한되지는 않음): 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 카보네이트 또는 소듐 바이카보네이트. 본 발명의 DST 유전자 또는 그의 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드는 식물에서 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다. 증가된 저항성은 상기 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드로 처리되지 않은 대조군 식물과의 비교에 의해 관찰될 수 있다. 상기 식물의 생장 및 발달은 높은 염 농도에 의해 영향받지 않거나 또는 적게 영향받거나, 또는 상기 식물이 더 높은 염 농도에서도 생존할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "가뭄 스트레스"는 하기를 지칭한다: 건조한 토양 또는 기타 가뭄 환경에서 생장시, 그의 생장이 억제되거나 또는 심지어 죽게 되는 현상. 본 발명의 DST 유전자 또는 그의 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드는 가뭄 스트레스에 대한 식물의 저항성을 증가시킬 수 있고, 증가된 저항성은 상기 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드로 처리되지 않은 대조군 식물과의 비교에 의해 관찰될 수 있다. 상기 식물의 생장 및 발달은 물 부족에 의해 영향받지 않거나 또는 적게 영향받거나, 또는 상기 식물이 더 심한 가뭄 조건에서도 생존할 수 있다.
벡터, 숙주 및 형질전환 식물
본 발명은 또한 DST 유전자를 포함하는 벡터, 및 유전공학으로 생성되는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 유전자 형질전환에 의해 생성되고 높은 수준의 DST를 발현하는 형질전환 식물에 관한 것이다.
통상적인 재조합 DNA 기술 (Science, 1984; 224:1431)을 이용하여, 본 발명의 코딩 서열은 재조합 DST 단백질의 발현 또는 생산에 이용될 수 있다. 일반적으로, 이들은 하기의 단계를 수반한다:
(1) 본 발명의 DST 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 돌연변이체) 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 이용한 적합한 숙주 세포의 형질감염(transfecting) 또는 형질전환;
(2) 적합한 배양 배지에서의 상기 숙주 세포 배양; 및
(3) 상기 배양 배지 또는 세포로부터의 단백질 또는 폴리펩티드의 분리 및 정제.
본 발명에서, 용어 "벡터" 및 "재조합 발현 벡터"는 호환하여 사용가능하며, 당업계에 널리 공지된 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유류 세포 바이러스 또는 기타 벡터를 지칭한다. 간략하게, 임의의 플라스미드 및 벡터가 숙주 세포 내에서 복제가능하고 안정하다면 사용될 수 있다. 발현 벡터의 한가지 중요한 특징은 이들이 일반적으로 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 인자를 포함한다는 점이다.
당업자에게 널리 공지된 방법은 DST 코딩 서열 및 적합한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터 구축에 이용될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 (in vitro) 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 및 생체내 (in vivo) 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 발현 벡터 내의 적합한 프로모터에 유효하게 연결되어 mRNA 합성을 이끌 수 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 전사 종결 부위를 포함한다. 본 발명에서, pEGFP-1, pBI121, pCAMBIA1300, pCAMBIA1301, pCAMBIA2301 또는 pHB가 바람직하게 사용된다.
추가로, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선별 마커 유전자를 포함하여, 형질감염된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형, 예컨대 진핵 세포 배양에서 사용하기 위한 디히드로폴레이트 리덕타아제, 네오마이신 저항성 및 녹색 형광 단백질 (GFP), 또는 대장균 (E. coli) 에 사용하기 위한 테트라사이클린 또는 앰피실린 저항성을 제공한다.
상기 기재된 DNA 서열 및 적합한 프로모터 또는 조절 인자를 포함하는 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있으며, 이들로 하여금 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있게 한다. 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포; 또는 하등 진핵 세포, 예컨대 효모 세포; 또는 고등 진핵 세포, 예컨대 식물 세포일 수 있다. 대표적인 예시는 하기를 포함한다: 대장균 (E. coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 아그로박테리움 (Agrobacterium); 진균 세포, 예컨대 효모; 식물 세포 등. 본 발명에서, 숙주 세포는 바람직하게는 아그로박테리움이다.
고등 진핵 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해, 인핸서 서열이 벡터에 삽입되어 있는 경우, 전사가 증진될 수 있다. 인핸서는 DNA cis-액팅 인자로, 일반적으로 약 10 내지 300 bp이며, 프로모터에 작용하여 유전자 전사를 증진시킨다. 당업자는 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 숙주 세포를 선별하는 방법을 알고 있다.
수득한 형질전환체는 통상적인 방법을 이용해 배양될 수 있고, 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 숙주 세포에 따라서, 배양에 사용되는 배양 배지는 임의의 통상적인 배지로부터 선택될 수 있다. 배양은 숙주 세포 생장에 적합한 조건 하에 수행될 수 있다. 숙주 세포가 적합한 세포 밀도로 생장하는 경우, 적합한 방법 (예컨대, 온도 변화 또는 화학물질 유도)이 사용되어 선택된 프로모터를 유도하며, 이어서 또다른 기간 동안 배양이 계속된다.
상기 방법으로 수득된 재조합 폴리펩티드는 세포에서 세포막 상에서 발현될 수 있거나, 또는 세포 밖으로 분비될 수 있다. 필요한 경우, 재조합 단백질은 그의 물리적, 화학적 및 기타 특성을 근거로 다양한 분리 방법을 이용해 분리 및 정제될 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 방법의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: 통상적인 재생(renaturation) 처리, 단백질 침전제를 이용한 처리 (염석 (salting out) 방법), 원심분리, 박테리아의 삼투압 세포용해, 초음파 처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 다양한 기타 액체 크로마토그래피 기술 및 이들의 조합.
식물의 형질전환은 아그로박테리움 형질전환 또는 유전자 건 (gene gun) 형질전환 등, 예컨대 잎 디스크 (leaf disk)의 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 달성될 수 있다. 형질전환된 식물 세포, 조직 또는 기관은 통상적인 방법을 이용해 식물로 재분화되어, 질병에 대한 개선된 저항성을 가진 식물을 제공할 수 있다다.
cis -액팅 인자
본 명세서에 사용된, 용어 "cis-액팅 인자"는 유전자의 플랭킹 영역에 위치하고, 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 서열을 지칭한다. 그의 기능은 유전자 발현의 조절에 참여하는 것이다. cis-액팅 인자 자체로는 임의의 단백질은 코딩하지 않으며; 이는 오직 작용 부위를 제공하기만 한다. 이는 trans -액팅 인자와 상호작용하여 그의 기능을 결과로서 제공한다.
연구를 통해, 본 발명의 발명자들은 하기의 사실을 발견했다: 본 발명의 DST 단백질이 DNA 결합 능력을 가짐. 그의 코어 결합 인자는 cis-액팅 인자, TGCTANN(A/T)TTG인데, 여기서 N은 A, C, G 또는 T를 나타낸다. 본 발명의 cis-액팅 인자는 DST 전사 인자에 결합하여, 식물에서 가뭄 및 염에 대한 감수성을 증대시킴으로써, 식물에서 가뭄 및 염 저항력을 저감시킨다. 상기 cis-액팅 인자는 바람직하게는 DST 의 징크 핑거 도메인과 상호작용한다.
역으로, cis-액팅 인자 및 본 발명의 DST 전사 인자 사이의 상호작용이 억제되면, 식물에서 증진된 가뭄 및 염 내성이 초래된다.
식물에서의 가뭄 및 염 내성 증진 방법
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 본 발명의 DST 단백질, 그의 코딩 서열 또는 cis-액팅 인자에 대한 DST 단백질의 결합은 식물에서의 가뭄 및 염 내성과 밀접한 관련이 있다. DST 단백질, 그의 코딩 서열 또는 DST 단백질의 cis-액팅 인자에 대한 결합의 억제는 식물에서 증진된 가뭄 및 염 내성을 유도할 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 DST 단백질, 그의 코딩 서열, 또는 DST 단백질의 cis-액팅 인자에 대한 결합의 억제에 의해 식물에서 가뭄 및 염 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에서, DST 단백질 또는 그의 코딩 서열의 길항제는 그의 발현 억제에 이용될 수 있다. 상기 길항제에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: 소형 분자 간섭 RNA, 항체, 우성 음성 조절자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드. DST 단백질 또는 그의 코딩 서열을 알고 있는 당업자는 상기 길항제를 스크리닝하고 수득하기 위한 통상적인 방법 및 시험을 이용하는 방법을 알 것이다.
본 발명에 사용된, 용어 "비보존 돌연변이" 또는 "비보존적 돌연변이" 는 식물에서 증진된 가뭄 및 염 내성을 얻기 위해, DST 단백질 또는 그의 코딩 서열에서의 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입 (바람직하게는, 비보존)을 지칭한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 당업자에게 공지된 방법이 본 발명의 DST 단백질 또는 그의 코딩 서열에 비보존 돌연변이를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, DST 단백질 코딩 서열에서의 뉴클레오티드 돌연변이는 비보존 돌연변이를 서열번호 2를 포함하는 DST 단백질의 아미노산 서열에 도입하여, 돌연변이 서열을 포함하는 식물에 증진된 가뭄 및 염 내성을 부여하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 69에서의 아스파라긴의 아스파르트산으로의 돌연변이, 또는 아미노산 162에서의 알라닌의 트레오닌으로의 돌연변이가 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, DST 유전자 또는 단백질의 발현을 억제시킨 형질전환 식물이 제조될 수 있으며, 이들 형질전환 식물들은 선택적으로는 형질전환되지 않은 식물 또는 기타 형질전환 식물과 함께 교잡육종할 수 있다. 예를 들어, 식물은 소형 분자 간섭 RNA를 포함하는 벡터, 안티센스 벡터, DST 단백질을 특이적으로 표적화하는 우성 음성 조절 벡터 또는 그의 코딩되는 단백질 또는 상기 벡터를 보유하는 숙주 세포를 이용해 형질전환될 수 있다.
가뭄 및 염 내성 식물의 스크리닝 방법
본 발명의 DST 유전자 및 그의 코딩되는 단백질의 고유의 특성에 따라, 본 발명은 추가로 가뭄 및 염 내성 식물의 스크리닝 방법을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 후보 식물에서의, 본 발명의 DST 징크 핑거 단백질 전사 인자의 수준, 그의 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현 수준, 및/또는 본 발명의 cis-액팅 인자의 DST 징크 핑거 단백질 전사 인자에 대한 결합 수준을 평가하는 단계; (ii) 단계 (i)에서의 후보 식물에서 검출된 수준을 대조군 식물에서의 해당 수준과 비교하여, 후보 식물에서의 수준이 대조군 식물에서의 것보다 더 낮은 경우, 후보 식물이 가뭄 및 염 내성 식물인 것으로 판단하는 단계.
또다른 구현예에서, 당업계에 공지된 분자 마커 선별 기술은 가뭄 및 염 내성 DST 유전자를 기타 변이체에 도입하여, 가뭄 및 염 내성인 신규한 변이체를 스크리닝 및 배양하기 위해 이용될 수 있다. 상기 방법은 통상적인 교잡육종 방법을 이용할 수 있다. 그의 장점은, 유전자 전달이 필요하지 않아, 유전자 전달의 안전성 문제를 피할 수 있다는 점이다. 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 비보존 돌연변이 서열에 특이적인 분자 마커를 디자인하는 단계, 상기 분자 마커를 이용해 비보존 돌연변이 서열을 가진 돌연변이 및 기타 벼 변이체의 교잡육종으로부터의 후손을 스크리닝함으로써, 상기 비보존 돌연변이 서열을 보유하는 개체 식물을 선별하는 단계.
본 발명의 주된 장점
본 발명의 주된 장점은 하기 내용을 포함한다:
(1) DST 유전자 및 그의 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드를 동정하여, 그의 식물에서의 가뭄 및 염 내성과의 관련성을 확인하여, 식물에서의 가뭄 및 염 내성 연구를 위한 신규한 방법을 제공함;
(2) 증진된 염 또는 가뭄 스트레스 저항성을 가진 형질전환 식물을 제공하여, 곡물, 목화 및 오일의 제조 및 가공을 위한 탁월한 원료 및 생산품을 제공함; 및
(3) 유전자 전달의 필요없이 통상적인 교잡육종 방법을 이용해 실현될 수 있는, 분자 마커를 이용하여 가뭄 및 염 내성 후손에 대한 스크리닝 방법을 제공하여, 유전자 전달의 안전성 문제를 피함.
본 발명은 적용에 있어 큰 잠재성을 가진, 식물에서의 염 또는 가뭄 스트레스에 대한 저항성 개선을 위한 신규한 접근법을 제공한다.
실시예
구체적인 실시예와 조합된 하기의 설명은 본 발명을 추가로 더 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 이용되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위해 이용되어선 안된다는 점을 이해해야 한다.
하기 실시예에서, 조건이 실험 방법에서 지정되지 않은 경우, 이들은 일반적으로 통상적인 조건 (예를 들어, Sambrook 등의 문헌, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 3 판, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press" 를 참고), 또는 제조사의 제안에 따른 조건을 기반으로 했다. 달리 표시되지 않는 한, 백분율 및 비율은 중량을 기준으로 계산되었다.
달리 정해지지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 전문용어 및 과학용어는 당업자에게 널리 공지된 것과 동일한 의미를 갖는다. 추가로, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바람직한 방법 및 재료는 오직 예시를 위해 사용된다.
실시예에서 사용한 다양한 배지 (YEB 액체 배양 배지, AB 액체 배양 배지, AAM 액체 배양 배지, N6D2 배양 배지, N6D2C 배양 배지, 공동 배양 배지, 선별 배양 배지 N6D2S1, N6D2S2, 예비분화 배양 배지, 분화 배양 배지, 1/2 MS0H 배양 배지, 벼 배양 배지, SD 배양 배지 등)는 관련 문헌의 설명에 따라 제조된다 (Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Hiei, Y., etc., Plant J., 1994, 6, 271-282).
실시예 1: 벼 DST 유전자 전달 실험
1. 높은 가뭄 및 염 내성을 가진 DST 돌연변이체의 생성, 그의 특징 및 세포이하의 국재성(localization)
벼 종자에 0.6% 의 EMS (에틸 메탄술포네이트)를 처리하여, 약 9,000 개의 벼 돌연변이 라인을 포함하는 벼 돌연변이체 라이브러리를 구축했다. 벼 돌연변이체 라이브러리의 대규모 스크리닝은 140 mM 소듐 클로라이드의 염 스트레스 하에 수행했다. 염- 및 가뭄-내성 표현형은, 후보 돌연변이체를 반복적인 140 mM 소듐 클로라이드의 염 스트레스 및 20% PEG4000 자극 가뭄 스트레스에 적용시켜 밝혀냈다. 고도의 가뭄- 및 염-내성 돌연변이체 (dst)가 수득되었다.
분자 마커를 이용해, DST 유전자는 벼의 3번 염색체에 위치한다는 것을 먼저 확인했다. dst 돌연변이체와 염-감수성 계통의 교잡육종에 의해, 대규모 F2 후손을 구축했다. 교잡육종된 후손에 대한 유전자형 및 표현형이 조합된 상기 군으로부터 교잡육종된 후손을 스크리닝 하기 위한 분자 마커를 이용해, 맵-기반 (map-based)의 클로닝을 수행했다. 이는 DST 유전자의 성공적 클로닝을 유도했다. 상기 DST 유전자는 보존된 C2H2 타입 징크 핑거 도메인을 가진 미지 기능의 징크 핑거 단백질 (전사 인자)을 코딩한다. 벼 게놈에서는 기타 DST 상동성 카피가 발견되지 않았고, 애기장대 게놈에서 상동성 유전자가 발견되지 않았다. 상기 게놈 유전자의 길이는, 인트론없이 906 bp이다. 전장 ORF (오픈 리딩-프레임)은 906 bp 길이의 것이며, 301개 아미노산을 코딩한다. 단백질 생성물의 분자량은 29KDa인 것으로 예측된다 (도 1). 서열 비교 분석은 상기 돌연변이 내의 DST 유전자가 2개의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하며, 이는 2개의 아미노산 치환 (아미노산 69가 아스파라긴으로부터 아스파르트산으로 돌연변이화되고, 아미노산 162가 알라닌으로부터 트레오닌으로 돌연변이화됨)을 유도하여, 가뭄 및 염 내성 표현형을 생성한다는 것을 보여준다. 상기 관찰은 DST가 가뭄 및 염 내성에 대한 음성 조절자임을 나타낸다.
DST의 세포이하 국재성(subcellular localization)을 결정하기 위해, DST 및 GFP (녹색 형광 단백질) 융합 구축물을 제조하여, 일시적 발현을 위한 유전자 건 방법 (gene gun method)을 이용해 양파 상피 세포에 전달하였다. 세포 내부 형광의 위치는 형광 공초점 현미경을 이용해 조사했다. 상기 세포이하 국재성 연구를 통해, DST가 핵에 특이적으로 위치한다는 것을 발견했다.
2. DST 게놈 절편을 포함하는 트랜스진(transgene) 플라스미드의 구축:
야생형 벼 BAC 클론을 ApaLI 제한효소로 절단한 후, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 블런트 (blunt) 말단을 만들어, SalI 제한 효소로 절단하였다. 4.6-kb 야생형 게놈 절편 (DST 의 전장 ORF, 프로모터 영역 및 다운스트림 영역에 있는 정지 코돈을 포함함)이 회수되었다. 식물 발현 바이너리 벡터 pCAMBIA1301 (CAMBIA로부터 구입)을 EcoRI로 절단한 후, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 블런트 말단을 만들고, 이를 SalI로 절단한 후 상기 언급한 회수된 절편과 라이게이션시켜 p-DST 플라스미드를 성공적으로 구축해, 이를 돌연변이체 형질전환 및 상보성(complementation) 실험 수행에 이용했다. 모든 효소들은 New England Biolabs로부터 구입했다.
3. DST-RNAi 발현 플라스미드의 구축:
프라이머로 5' 및 3' 말단의 올리고뉴클레오티드 (서열번호 4 및 5)를 이용해, PCR 에 의해 고유의 코딩 영역을 가진 DST 절편을 증폭했다 (535-bp). 상기 절편을 p1300RNAi 벡터 (양 말단에서 폴리-A 및 폴리-T 에 의해 플랭킹된, 링커로서의 카탈라아제 인트론 삽입을 통해 pCAMBIA1300 를 변형하여 수득함)와 라이게이션하여 DST-RNAi 플라스미드를 구축했다.
5' 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 다음과 같다:
5'-AAGCTTTCCTTGCGAAGCCAAATAGC-3' (서열번호 4)
3' 프라이머 서열은 다음과 같다:
5'-GGATCCCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGA-3' (서열번호 5)
4. DST 형질전환 벼:
상기 설명한 2 개의 재조합 플라스미드를 냉동-해동 방법을 이용하여 아그로박테리움 (Agrobacterium) 균주 EHA105에 전달하였다. 0.5 내지 1 ㎍ (약 10 ㎕)의 플라스미드 DNA를 각각 200 ㎕ EHA105 컴피턴트 세포에 첨가하고, 혼합한 후, 얼음, 액체 질소 및 37℃ 수조에 각각 5 분씩 차례로 위치시켰다. 반응 혼합물을 신선한 YEB 액체 배양 배지를 이용해 1 ml로 희석하고, 이어서 진탕하면서 28℃에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션했다. 200 ㎕의 분취물을 취해, 그것을 카나마이신 (Kan) 항생제 (50 ㎍/ml)를 포함하는 YEB 플레이트 상에 도말했다. 상기 플레이트를 28℃ 에서 2 내지 3일간 인큐베이션했다. 수득한 콜로니를 Kan (50 ㎍/ml)를 포함하는 YEB 플레이트 상에 3회에 걸쳐 스트리킹하여 단일 콜로니를 선별했다.
YEB 플레이트로부터 단일 아그로박테리움 콜로니를 찍어 내어, 그것을 50 ㎍/ml Kan 항생제를 포함하는 YEB 액체 배양 배지 3 ml에 접종하고, 28℃에서 밤새 진탕하며 인큐베이션했다. 2일째에, 1% 접종액을 50 ㎍/ml Kan 항생제를 포함하는 AB 액체 배지 50 ml로 이동시키고, OD600 가 약 0.6 내지 0.8 에 도달할 때까지 200 rpm에서 진탕하면서 인큐베이션을 계속했다. 5000 rpm 및 4℃에서 5 분 동안 신선한 아그로박테리움 배양액을 원심분리하고, 펠렛을 1/3 부피의 AAM 액체 배양 배지에 재현탁시켰다. 상기 현탁액을 다양한 벼 수용자(recipient) 물질을 형질전환하는데 이용할 수 있다.
상기 실험은 벼 Zhonghua 11 (또는 그의 돌연변이체)의 배아 캘러스를 형질전환하기 위해 통상적인 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용한다. Zhonghua 11 의 미성숙 종자 (수분 12 내지 15일 후)를 70% 에탄올에 1 분간 침지시키고, 이들을 NaClO 용액 (물과 1:3로 혼합하고, 2 내지 3 방울의 Tween 20를 첨가함)에서 90분 이상 멸균시키고, 종자를 멸균수로 4 내지 5 회 헹구어냈다. 이어서, 종자 유래의 배아를 수술용 메스 및 핀셋을 이용해 집어내고, N6D2 배양 배지 상에 플레이팅하여, 암실에서 26±1℃에서 배양하여 캘러스 조직 형성을 유도했다. 4일 후, 이들을 형질전환에 이용할 수 있게 되었다.
수득한 배아 캘러스 조직을 신선한 AAM 아그로박테리움 액체 배지에서 종종 진탕시키면서 침지시켰다. 20분 후 벼 재료를 제거하고, 멸균 여과지를 이용해 과량의 박테리아 용액을 제거한 후, 이들을 멸균 여과지를 덮은 N6D2C 배양 배지에 옮기고, 26℃에서 3일간 공동배양했다. 아그로박테리움 Vir 유전자 활성화제로서 아세토시린곤 (Acetosyringone)을 공동 배양 배지에 100 μmol/L의 농도로 첨가했다.
3일 후, 공동 배양 배지로부터 캘러스 조직을 제거하고, 싹을 잘라내고, 이들을 선별을 위해 N6D2S1 선별 배지 (25 mg/l Hyg 를 포함하는 N6D2 배지)에 이동시켰다. 7 내지 12일 후, 저항성 캘러스 조직을 N6D2S2 (50 mg/l Hyg을 포함하는 N6D2 배지) 선별 배지로 옮기고, 선별을 계속했다.
10 내지 12일 후, 맹렬히 성장한 저항성 캘러스 조직을 예비분화 배양 배지로 옮기고, 약 1 주간 배양했다. 이어서, 이들을 분화 배양 배지에 옮겨, 이들이 분화하도록 했다 (12 h 명/일). 일단 재분화된 유묘가 뿌리를 1/2 MS0H 배양 배지에서 생장시키면, 이들을 화분 토양에 옮기고, 기후 제어 챔버에서 생장시켰다.
재분화된 식물이 이식을 견뎌낸 후, β-글루코시다아제 검출 (베타-글루쿠로니다아제, GUS, Jefferson 등의 EMBO J. 6, 3901-3907, 1987 참고)에 의해, 또는 잎 위에 0.1% 제초제를 칠해서 당업계에 공지된 방법을 이용해 양성 형질전환 식물을 식별해냈다. 양성 형질전환 식물의 잎에서 전체 DNA를 추출하고, PCR을 이용해 상기 형질전환 식물을 추가로 확인했다.
후속 실험에서, 상기 방법으로 수득한 T2 세대 형질전환 식물들은 가뭄 및 염 스트레스 (140 mM NaCl) 처리 하에서의 가뭄 및 염 내성 표현형 조사에 이용해, DST 유전자의 기능을 확인했다.
실시예 2: 형질전환 식물 배양 및 가뭄 및 염 스트레스 시험
실시예 1에서 수득한 형질전환 벼의 종자를 취해, 이들을 오븐에서 45℃에서 1주간 인큐베이션하여 휴면을 깨웠다. 이어서, 이들을 실온의 수돗물에 3일간 담궈두고, 37℃에서 2일간 발아하도록 두었다. 발아 후, 이들을 96-웰 플레이트에 점뿌리기했다. 이어서, 이들을 광 인큐베이터로 옮겨, 30℃에서 인큐베이션하고, 이들을 광에 1일 당 13시간 동안 노출시켰다. 1일 후, 온도를 28℃ 및 26℃로 점차 강하시키고, 이들을 각 1일 동안 인큐베이션하고, 이들을 밤에는 20℃에서 배양했다. 유묘가 전부 생장한 후, 수돗물을 벼 배양 배지로 교체하고, 배양을 계속했다.
배양 약 14일 후, 유묘들은 2 개의 잎 및 1개의 속잎의 상태까지 생장했다. 이들을 140 mM NaCl를 포함하는 벼 배양 배지에서 12 일간 염 처리하거나, 또는 20% (m/v) PEG-4000를 포함하는 벼 배양 배지에서 PEG 처리하여 가뭄 스트레스를 연출했다.
PVP 파이프 (폴리비닐피롤리돈 파이프, 1.2 m 높이, 20 cm 직경, 2 개의 배수구가 파이프의 바닥에 있음)에서의 가뭄 처리에 있어서, 25일간 물 인큐베이터에서 생장시킨 유묘들을 토양을 포함하는 PVP 파이프로 이식하고, 상기 유묘들을 기후 제어 챔버에서 배양했다. 온도는 24℃ 내지 30℃였고, 습도는 50% 내지 60%였다. 이식 30일 후 물을 배출시키고, 바닥 배수구를 열어 물을 배수시켜, 가뭄 처리를 12일간 수행했다.
도 2 및 도 3은 실험 결과를 보여준다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 벼 돌연변이체 dst는 야생형 (Zhonghua 11, ZH11)보다 훨씬 더 높은 가뭄 및 염 내성을 갖는다. 관찰 및 비교를 통해, 다음과 같은 사실을 발견했다: 야생형과 비교하여, 돌연변이체는 더 많은 과산화수소 (H2O2)가 기공 주변에 축적되어 있으며, 기공개도가 더 작고, 가뭄 스트레스 하에 잎에서 수분 함량이 상대적으로 더 높다. 따라서, 돌연변이체는 더 높은 가뭄 저항성을 갖고 있다. 추가로, 돌연변이체는 더 낮은 기공개도를 갖고 있기 때문에, 기공 유통성이 더 낮고 물 증발 속도가 더 느려서, Na+ 이온의 뿌리로부터 지상 부분 (잎 등)으로의 수송을 감소시키고 Na+ 독성을 낮춰, 이에 따라 염 내성이 증가된다.
도 3 에 나타난 바와 같이: 야생형 벼 (Zhonghua 11, ZH11)로부터의 DST 게놈 절편의 dst 돌연변이체로의 형질감염은 형질전환 상보성 식물에서 야생형의 가뭄 및 염 감수성 표현형을 회복하고; DST의 발현 수준이 RNAi (Zhonghua 11을 형질전환)에 의해 감소된 반면, Zhonghua 11에서의 가뭄 및 염 내성은 현저히 증진된다.
상기 결과들은 하기의 것을 보여준다: DST 유전자는 성공적으로 클로닝되고, DST를 수반하여 유전자적으로 조작되면, 벼에서의 스트레스 저항성은 현저히 증가될 수 있다.
실시예 3: DST 전사 활성화 활성의 분석
Matchmaker GAL4 효모 two-hybrid system 3 (Clontech)을 DST의 전사 활성화 분석에 이용했다. 양성 대조군 벡터 pAD의 구축을 위해, NLS 및 GAL4 활성화 도메인 (AD) 서열을 PCR로 증폭시키고, pGBKT7 (Clontech 에서 구입) BamHI/SalI 절단 부위에 삽입하여 (프라이머는 서열번호 6 및 7), pGBKT7 의 GAL4 DNA 결합 도메인 (BD)과 융합했다.
이어서, PCR을 이용해 DST 전장 ORF를 증폭했다 (프라이머는 서열번호 8 및 9). 서열분석으로 확인 후, PCR 생성물을 pGBKT7 벡터에 BamHI 및 SalI 부위에서 구축해 GAL4 DNA 결합 도메인과 융합하여 pGBKT7-DST 벡터를 수득했다. 이어서, 다양한 벡터를 효모 AH109에 형질전환했다. 밤새 생장시킨 후, 배양물을 희석시키고, Trp가 없거나 또는 3 가지 아미노산 (-Trp/-His/-Ade)이 없는 SD 배양 배지 상에 플레이팅했다. 이어서, 효모의 생장을 관찰하고, DST의 전사 활성화 활성을 측정했다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 다음과 같다:
5'-AAAGGATCCAAGCGGAATTAATTCCCGAG-3' (서열번호 6);
5'-AAAGTCGACCCTCTTTTTTTGGGTTTGGTGG-3' (서열번호 7);
5'-AAAGGATCCTGATGGACTCCCCGTCGCCT-3' (서열번호 8);
5'-AAAGTCGACCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGAG-3' (서열번호 9).
결과를 도 4에 나타냈다. 도면에 나타난 바와 같이: 벼 DST 단백질은 전사 활성화 활성을 갖고 있는 반면, 돌연변이 DST 단백질 및 N-말단 결실이 있는 단백질은 전사 활성화 활성을 잃었다.
결과는, pGBKT7-DST가 더욱 강력한 전사 활성화 활성을 갖고 있고, 전사 활성화 도메인은 N 말단에 위치한다는 것을 나타내며, 이는 DST가 전사 활성화 활성을 가진 전사 인자임을 나타낸다.
실시예 4: DST 단백질의 분석 및 EMSA (전기영동 이동도 변동 분석)
1. 원핵세포 단백질 발현:
pGBKT7-DST 벡터를 EcoRI 및 SalI로 절단하여 DST 전장 cDNA를 수득해, 이를 이어서 pET32a(+)로 재구축했다. 재조합 DST를 포함하는 원핵세포 발현 벡터 pET32a(+)를 BL21로 형질감염시키고, IPTG를 이용해 원핵세포 발현을 유도한 후, His-tag 컬럼 (비드)을 이용해 단백질을 정제했다.
2. 항체 생성:
통상적인 방법을 이용해 토끼를 상기 기재된 정제된 단백질로 면역화시켜 항-DST 항체를 생성시켰다.
3. 프로브를 합성하고, 이들을 바이오틴으로 표지하고, 이들을 PAGE 겔 상에서 정제하고, 전기용출에 의해 표지된 프로브를 회수했다.
4. 표지된 프로브를 정제된 원핵세포 발현 DST 단백질과 반응시켰다. 이어서, 복합체들을 네이티브-PAGE 전기영동하고, 반건조 막 이동 방법을 이용해 나일론 막 상에 이동시켰다. 이어서, 나일론 막을 자가방사법용 X-선 필름에 노출시켜 변동 밴드를 관찰했다.
도 5는 실험 결과를 보여준다. 도 5에 나타낸 바와 같이, DST는 DNA-결합 능력을 갖고 있다. DST 결합을 위한 코어 인자는 다음과 같다: cis-액팅 인자 TGCTANN(A/T)TTG (서열번호 3).
본 연구는 상기 cis-액팅 인자에 대한 DST 결합이 다운스트림 유전자 발현을 조절하여, 식물에서의 가뭄 및 염 내성에 영향을 준다는 것을 보여준다. 따라서, cis-액팅 인자에 대한 DST 결합은 가뭄 및 염 내성의 음성 조절에 있어서 중요한 역할을 한다.
실시예 5: 상이한 식물에서의 DST 유전자 상동체의 존재
데이터베이스 검색(http://plantta.jcvi.org/index.shtml)은, 수수 (Sorghum bicolor) 게놈 중 1개의 DST 유전자 상동체가 54.3% 단백질 유사성을 갖고 있고; 옥수수 (Zea mays) 게놈 중 3개의 유전자 상동체가 51.7%, 36.1% 및 33.5% 단백질 유사성을 갖고 있고; 보리 (Hordeum vulgare) 게놈 중 1개의 DST 유전자 상동체가 38.4% 단백질 유사성을 갖고 있고; 사탕수수 (Saccharum officinarum) 게놈 중 3개의 유전자 상동체가 38.2%, 38.2% 및 34.5% 단백질 유사성을 갖고 있다는 점을 밝혀냈다.
모든 상기 유전자 상동체들은 보존된 C2H2-타입 징크 핑거 도메인을 갖는다. 이들은 동일한 징크 핑거 도메인을 공유한다. 동시에, N-말단 도메인에서는 유사성이 높다 (도 6은 상기 유전자 상동체의 공유되는 서열을 보여준다. 공유되는 서열은 DGKDVRLFPCLFCNKKFLKSQALGGHQNAHKKERSIGWNPYFYM로, 서열번호 2의 위치 42 내지 85에 해당함). C2H2 타입 징크 핑거 단백질은 징크 핑거 도메인을 통해 cis-액팅 인자에 결합한다. 따라서, 상기 유전자 상동체 및 cis-액팅 인자 사이에는 대응하는 관계가 있어, 기타 벼과 작물의 DST 유전자 상동체가 벼 DST 유전자의 것과 유사한 기능을 공유할 수 있다는 점을 시사한다.
실시예 6: 작물에서의 저항성 개선을 위해 작물 육종에서의 벼 및 기타 작물 DST 유전자 분자 마커 -보조 선별 기법의 적용
화학물 돌연변이유발 (EMS)을 통해, DST 유전자 내에 2개의 뉴클레오티드 돌연변이를 생성하여 (뉴클레오티드 205에서 A를 G로 돌연변이화시키고, 뉴클레오티드 484에서 G를 A로 돌연변이화시킴), 2개의 아미노산 치환을 유발해 (위치 69에서의 아스파라긴을 아스파르트산으로 돌연변이화시키고, 위치 162에서의 알라닌을 트레오닌으로 돌연변이화시킴), 가뭄-저항성 및 염-저항성 표현형을 생성했다. 상기 유전자 내에서 하기의 두 프라이머쌍, SNP5 및 SNP3을 디자인해, 증폭된 생성물이 각각 첫번째 점 돌연변이 및 두번째 점 돌연변이를 포함하도록 했다.
SNP-5S: ATGGACTCCCCGTCGCCT (서열번호 10)
SNP-5A: GTGCGCCGGGAGAAGCCC (서열번호 11)
SNP-3S: GCGGTGCCGACGTCGTTCCC (서열번호 12)
SNP-3A: GCCGCCGTCGTCGTCGTCTTC (서열번호 13)
첫번째 점 돌연변이는 ScrFI 제한 효소 절단 부위를 생성한 반면, 두번째 점 돌연변이는 BstUI 제한 효소 절단 부위를 파괴한다. 프라이머 SNP5를 이용해 수득된 증폭된 생성물을 ScrFI로 절단하여 야생형에서 311 bp, 85 bp 및 31 bp의 절편을 수득한 반면, 돌연변이 증폭 생성물은 202 bp, 109 bp, 85 bp 및 31 bp의 절편을 제공하여 다형성 (polymorphism)을 생성했다. SNP3 프라이머로 수득한 증폭 생성물을 BstUI로 절단하여 야생형에서는 66 bp, 40 bp 및 25 bp의 절편을 수득한 반면, 돌연변이 증폭 생성물은 91 bp 및 40 bp의 절편을 생성하여 역시 다형성을 생성했다. 따라서, 이들 두 프라이머쌍 SNP5 및 SNP3를 분자 마커-보조 선별 육종에 이용하기 위한 분자 마커로 이용할 수 있다.
벼 변이체와의 교배에 가뭄- 및 염-저항성 dst 돌연변이체를 이용하며, 1개의 분자 마커 또는 2개의 분자 마커에 대해 후손을 스크리닝하여, DST 돌연변이 유전자를 가진 개체들을 선별해낸다. 이어서, 증가된 가뭄- 및 염-저항성을 가진 신규한 변이체 (계통)를 배양한다.
상기 방법은 유전자 전달 없이 통상적인 교잡육종을 이용함으로써, 유전자 전달과 연관된 안전성 문제를 피할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 유리하다.
본 발명에 인용된 모든 문헌들은, 모든 문헌들이 개별적으로 언급된 것과 마찬가지로, 본 출원에서 참고문헌으로 이용된다. 추가로, 상기 기재된 본 발명의 설명을 읽은 당업자는 본 발명의 다양한 국면을 변화 또는 변형시킬 수 있다. 이러한 등가물은 본 출원에 첨부된 특허청구범위의 범주에 속한다.
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Claims (15)

  1. 전사 인자의 기능을 억제하는 단계를 포함하는, 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법으로서, 상기 전사 인자는 서열번호 2의 아미노산 42-85의 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 42-85의 서열의 보존 변이체(conservative variant)를 포함하는 C2H2 유형 징크 핑거(zinc finger) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전사 인자는 하기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (b) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 삽입되며, 식물에서 가뭄 및 염 감수성을 증가시킬 수 있는 (a)로부터 유래된 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전사 인자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 억제는 식물에서 가뭄 및 염 감수성을 증가시킬 수 없는 비보존(non-conserved) 돌연변이 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이며, 상기 비보존(non-conserved) 돌연변이 전사 인자는 서열번호 2의 서열에서 하나 이상의 비보존 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함하는 서열을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비보존(non-conserved) 돌연변이 전사 인자는 서열번호 2의 서열에서 Asn69Asp(N69D) 돌연변이 및 Ala162Thr(A162T) 돌연변이를 포함하는 서열을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 도입은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법:
    (1) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물(construct)로 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관을 형질전환하는 단계;
    (2) 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관을 선발하는 단계; 및
    (3) 단계 (2)에서 얻어진 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관으로부터 식물을 재분화시키는 단계.
  7. 제1항에 있어서, 상기 억제는 상기 전사 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 전사 인자의 발현 억제는 식물 내로 RNAi 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열을 표적으로 하는 것임을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 전사 인자의 발현 억제는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법:
    (1) 상기 RNAi 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구축물(construct)로 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관을 형질전환하는 단계;
    (2) 상기 올리고뉴클레오티드로 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관을 선발하는 단계; 및
    (3) 단계 (2)에서 얻어진 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 기관으로부터 식물을 재분화시키는 단계.
  11. 제1항에 있어서, 상기 억제는 cis-액팅 인자와 상기 전사 인자의 결합을 억제하는 것임을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 cis-액팅 인자는 서열번호 3의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 식물에서 가뭄 및 염 내성을 개선하는 방법에 의해 생산된 식물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 식물은 벼과 (Gramineae), 아욱과 목화속 (Malvaceae gossypium), 십자화과 유채속 (Cruciferae brassica), 국화과 (Compositae), 가지과 (Solanaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 또는 산형과 (Umbelliferae)로부터 선택되는 작물인 것을 특징으로 하는 식물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 식물은 벼, 옥수수, 밀, 보리, 사탕수수, 수수, 애기장대, 목화 또는 캐놀라로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물.
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