CN117820447A - 一种可提高植物耐盐性的蛋白AtSRRM1L及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种可提高植物耐盐性的蛋白AtSRRM1L及其应用，属于生物技术领域。为了提高植物抗盐性，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的AtSRRM1L蛋白，通过实验证明，AtSRRM1L基因能应答盐胁迫反应，并且AtSRRM1L和AtSnRK1存在物理关联，AtSnRK1可以磷酸化AtSRRM1L，AtSRRM1L在很大程度上依赖于AtSnRK1激酶活性来发挥其在植物耐盐性中的作用。这为AtSRRM1L的新功能及其对植物耐盐胁迫的调控机制提供了新的线索。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可提高植物耐盐性的蛋白AtSRRM1L及其应用。
背景技术
盐胁迫等非生物因素严重影响植物生长和发育，对农业生产和生态环境产生极其不利的影响。因此，培育耐盐碱、耐干旱、耐高温和低温的优良作物新品种，开展植物耐逆机制的研究，充分发掘和提高作物在不良条件下的生产潜力和提高作物的耐逆性是发展我国农业生产的重大战略性课题之一。
为了适应非生物胁迫条件下的环境变化，植物进化出了广泛的分子机制以抵御环境变化造成的不利影响。植物中富含丝氨酸/精氨酸的蛋白在复杂的调控网络下通过与其他剪接因子和其他蛋白或RNA-蛋白质等相互作用参与非生物胁迫反应。植物发育过程中具有选择性剪接现象的许多相关基因的功能已被阐明，选择性剪接在植物发育和环境应答中的作用已受到研究者越来越多的重视。因此，研究植物中不同发育阶段、环境条件下选择性剪接的作用模式，明确其调控位点，将有助于理解选择性剪接作用的分子机制，同时有利于更加全面地了解选择性剪接对非生物胁迫的响应以及增强植物胁迫耐受性的机理。
发明内容
本发明为解决如何提高植物耐盐性的问题，本发明提供了一种可提高植物耐盐性的蛋白AtSRRM1L，所述蛋白AtSRRM1L为下述a)和b)中的任意一种蛋白：
a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
b)在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。
为了使a)中的蛋白便于纯化，可在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的氨基末端连接上HA标签。
本发明还提供了上述蛋白AtSRRM1L在提高植物耐盐性中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是在植物中过表达蛋白AtSRRM1L或共表达蛋白AtSRRM1L和AtSnRK1。
本发明还提供了上述蛋白AtSRRM1L的编码序列，所述编码序列SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述编码序列在提高植物耐盐性中的应用。
本发明还提供了一种含有上述编码序列的重组载体。
本发明还提供了一种含有上述编码序列或上述重组载体的重组菌。
本发明还提供了上述重组载体或上述重组菌在提高植物耐盐性中的应用。
本发明还提供了一种培育具有耐盐性的转基因大豆的方法，将权利要求1所述蛋白AtSRRM1L的编码基因导入大豆中，所述蛋白AtSRRM1L的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述转基因大豆为通过根癌农杆菌EHA105诱导获得的转基因大豆。
本发明有益效果：
本发明发现了一种与植物盐胁迫相关的富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子AtSRRM1L，其对NaCl敏感，并且通过qRT-PCR和GUS染色分析表明AtSRRM1L基因在拟南芥根中显性表达，且AtSRRM1L受NaCl胁迫诱导后表达量显著增加，能应答盐胁迫反应。AtSRRM1L蛋白定位于一个亚核结构，即核散斑区域，经NaCl处理后，AtSRRM1L的核散斑定位数量显著增加。通过酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补实验(BiFC)、荧光素酶互补实验(SLCA)以及免疫共沉淀(co-IP)实验证实了AtSRRM1L和AtSnRK1的物理关联。此外，体外以及体内磷酸化实验确定了AtSnRK1可以磷酸化AtSRRM1L。盐诱导下AtSnRK1的依赖性磷酸化不仅促进AtSRRM1L在核散斑中的定位，而且还促进了与剪接体成分AtU1-70K的互作。盐胁迫可以激活AtSnRK1，随后AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化是发挥剪接活性所必需的。在2kinm/srrm1l突变体中共表达不同类型的AtSnRK1和AtSRRM1L，表型分析表明，与表达AtSnRK1(K48M)/AtSRRM1L(wt)相比，AtSnRK1(wt)/AtSRRM1L(wt)使转基因植物表现出更高的耐盐性，这表明AtSRRM1L在很大程度上依赖于AtSnRK1激酶活性来发挥其功能。另一方面，无论AtSnRK1激酶活性如何，AtSRRM1L(9A)和AtSRRM1L(9D)都具有组成型盐敏感性和耐盐性，这表明AtSRRM1L在AtSnRK1的下游具有遗传功能。另外，通过对过表达AtSRRM1L或者AtSRRM1L(9A)大豆植株在盐胁迫下的表型及生理指标进行分析，结果显示在盐胁迫作用下，过表达AtSRRM1L的转基因大豆植株长势更优于AtSRRM1L(9A)转基因大豆。这为AtSRRM1L的新功能及其对植物耐盐胁迫的调控机制提供了新的线索。
附图说明
图1为qRT-PCR和GUS染色分析AtSRRM1L基因的时空表达模式及其对盐胁迫的响应结果图；其中，图1中的A为AtSRRM1基因在拟南芥植株各部位中的表达量检测结果图，图1中的B为200mM NaCl处理拟南芥幼苗不同时间段的AtSRRM1L基因的表达量检测结果图，图1中的C为通过GUS染色测定AtSRRM1L在经水或者200mM NaCl处理6h的转基因拟南芥(ProSRRM1L::GUS)幼苗中的表达量检测结果图，图1中的D为GUS活性测定的定量分析结果图；
图2为AtSRRM1L蛋白的结构示意图；
图3为AtSnRK1与AtSRRM1L的相互作用结果图；图3中的A为通过酵母双杂交证实AtSRRM1L和AtSnRK1的互作关系的结果图，图3中的B为BiFC证实AtSRRM1L和AtSnRK1的互作关系的结果图，图3中的C为SLCA证实AtSRRM1L和AtSnRK1的互作关系的结果图，图3中的D为co-IP证实AtSRRM1L和AtSnRK1在植物体内的相互作用的结果图；
图4为AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化分析结果图；图4中的A为利用Zn2+Phos-tagbiotin BTL-104抗体检测AtSnRK1对AtSRRM1L的体外磷酸化分析结果图，图4中的B为检测经200mM NaCl处理6h后的AtSRRM1L/Col-0以及AtSRRM1L/2kinm转基因株系中的AtSRRM1L的磷酸化结果图；
图5为AtSRRM1L蛋白在核散斑中的定位分析结果图；
图6为通过RNA-seq分析获得的AtSRRM1L与前体mRNA的结合结果图；其中，图6中的A为srrm1l突变体和野生型植株之间AS转录物的venn图，图6中的B为AtSRRM1L结合mRNA的GO富集分析结果图，图6中的C为体外RNA-EMSA实验对AtSRRM1L结合RNA的验证结果图；
图7为AtSnRK1的磷酸化对AtSRRM1L核散斑定位的影响结果图；图7中的A为AtSRRM1L-GFP和AtSRRM1L(3A)/(6A)/(9A)-GFP在烟草中的亚细胞定位结果图，图7中的B为盐胁迫下AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化对亚细胞定位的影响结果图；
图8为AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化影响AtSRRM1L对靶基因NFYA10前体mRNA的选择性剪接结果图；图8中的A为AtSRRM1L结合NFYA10前体mRNA的体外RNA-EMSA分析结果图，图8中的B为Col-0和2kinm背景下过表达GFP和SRRM1L-GFP基因的植物细胞中SRRM1L对NFYA10前体mRNA的结合能力分析结果图；
图9为盐胁迫下AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化对拟南芥耐盐性的影响结果图；图9中的A为野生型植株(Col-0)背景下过表达GFP、SRRM1L-GFP和SRRM1L(9A)-GFP以及srrm1l背景下回补GFP、SRRM1L-GFP和SRRM1L(9A)-GFP幼苗在含有或不含有200mM NaCl的1/2MS培养基上的表型图、根长和鲜重分析结果图，图9中的B为用水或250mM NaCl溶液灌溉土壤生长的植物的表型、存活率、相对叶绿素含量(RCC)结果图，图9中的C为AtSnRK1、AtSRRM1L及其突变基因在2kinm/srrm1l背景下共表达后的转基因植株在盐胁迫处理后的表型、存活率、相对叶绿素含量(RCC)结果图；
图10为异源表达AtSRRM1L以及AtSRRM1L(9A)基因的大豆的分析结果图；图10中的A为过表达及RNAi转基因大豆的Westernblot鉴定结果图，图10中的B为4周龄的野生型以及GFP、RNAi-GmSRRM1L.1/2、SRRM1L(9A)-GFP、SRRM1L-GFP转基因大豆植株用水或200mM NaCl溶液处理后的表型比较结果图，图10中的C为不同转基因大豆品系经盐处理后丙二醛和叶绿素含量的比较分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的拟南芥品种(Col-0型)以及东农50(DN50)大豆种子，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的拟南芥突变体种子srrm1l-t(SALK_135314C)和nfya10(SALK_127699C)属于Col-0背景下的T-DNA插入突变体，均购买于拟南芥生物资源中心(ABRC)(https://abrc.osu.edu/)，srrm1l-c是在拟南芥品种(Col-0型)背景下，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将AtSRRM1L基因进行敲除获得的，公众可以从东北农业大学获得。
下述实例中的2kinm突变体在文献“Li Q,Sun Q,Wang D,Liu YM,Zhang PM,LuHR,Zhang Y,Zhang S,Wang AX,Ding XD,et al.(2022)Quantitative phosphoproteomicsreveals the role of wild soybean GsSnRK1 as a metabolic regulator underdrought and alkali stresses.J Proteomics 258:104528”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实例中的拟南芥双突变体nfya10/srrm1l以及2kinm/srrm1l(srrm1l突变体指的是srrm1l-t突变体)是通过遗传杂交所制备的，并通过基因分型验证了其身份，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的pGADT7及pGBKT7载体在文献“YuY,Duan XB,Ding XD,Chen C,ZhuD,Yin KD,et al.(2017).Anovel AP2/ERF family transcription factor from Glycinesoja,GsERF71,is a DNA binding protein that positively regulates alkalinestress tolerance inArabidopsis.PLANT MOLBIOL 94:509-530”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的体外磷酸化反应步骤参见文献“Feng X,Feng P,Yu H,Yu X,SunQ,Liu S,Minh TN,Chen J,Wang D,Zhang Q,et al.(2020)GsSnRK1 interplays withtranscription factor GsERF7 from wild soybean to regulate soybean stressresistance.Plant Cell Environ 43:1192-1211”。
下述实施例中的大肠杆菌感受态DH5αChemically Competent Cell、大肠杆菌原核表达感受态BL21(DE3)Chemically Competent Cell、根癌农杆菌感受态GV3101Chemically Competent Cell、EHA105 Chemically Competent Cell和酿酒酵母感受态Y2HGold Chemically Competent Cell购自上海唯地生物技术有限公司。
本发明所述AtSnRK1基因的登录号为AT2G29210。
实施例1：富含丝氨酸/精氨酸的拟南芥剪接因子AtSRRM1L基因的克隆及其表达模式分析
一、植物材料的处理
1、拟南芥种子的处理
拟南芥种子表面经1％NaClO消毒后播种在1/2MS培养基上(1/2Murashige-Skoog盐，2％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7)，种子在4℃黑暗中春化3d后，置于光周期为16h的光照培养箱中竖直生长。盆栽幼苗是将拟南芥种子在含有蛭石和营养土比值为3∶1的盆钵中培养。为了进行发芽试验，将春化后的种子播种在含0mM或200mM NaCl的1/2MS培养基上，统计5d的种子萌发率，每种基因型进行三次生物学重复。对于盐胁迫处理，将盆钵中正常培养25d大的幼苗用含250mM NaCl的Hoagland′s营养液灌溉10d，期间定期更换培养液。2kinm突变体以及双突变体2kinm/srrm1l进行胁迫处理前，对生长20d大的突变体植株用10μMβ-雌二醇喷洒以降低植物体内SnRK1.2基因的表达。
2、大豆种子的处理
挑选健壮、成熟的成熟大豆种子(DN50)，使用氯气消毒法[100mL次氯酸钠(8％有效浓度)加入5mL浓盐酸]，持续灭菌16-20h，该实验流程在通风橱中进行。灭菌完成后在超净工作台内将种子吹24h散去残留氯气，将装有灭菌大豆的培养皿封口，4℃储存备用。
二、RNA提取
将土壤中生长25d大的拟南芥幼苗转移到的Hoagland′s营养液中培养1d后，再转移到含200mM NaCl的Hoagland′s培养液中，分别处理0h，3h，6h，12h，24h后进行取样。另对生长40d的拟南芥植株根、茎、叶和花分别进行取样。总RNA的提取按照PlantRNAKit(OMEGA)试剂盒说明书进行。
三、cDNA的获得
以上述步骤二获得的总RNA为模板，根据反转录试剂盒(TOYOBO)进行cDNA的合成。
四、PCR扩增
以步骤三获得的cDNA为模板，采用AtSRRM1L-Clone-F/R(SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR产物。经1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳结果显示，条带大小为2.6kb左右，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)对PCR产物进行回收，将纯化后的回收产物进行测序。测序结果表明：PCR扩增得到大小为2637bp的扩增产物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将其命名为AtSRRM1L基因，AtSRRM1L基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
五、实时荧光定量PCR分析AtSRRM1L的表达模式
利用引物AtSRRM1L-qPCR-F/R(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)对生长40d的拟南芥植株不同组织的cDNA和经200mM NaCl处理0h，3h，6h，12h，24h的25d大的拟南芥幼苗的cDNA进行qRT-PCR扩增。根据qRT-PCR结果可知AtSRRM1L基因在拟南芥植株的各个器官中均有表达，其中根中表达量相对较高(见图1中的A)。用200mM NaCl处理野生型拟南芥幼苗，经过一定时间后收集材料提取总RNA，结果表明，AtSRRM1L的转录水平经盐诱导上调(见图1中的B)。
六、GUS活性染色及GUS含量测定分析AtSRRM1L在NaCl胁迫下的表达模式
取1/2MS培养基上生长5d大的ProSRRM1L::GUS转基因幼苗用200NaCl处理6h后进行GUS染色。将对照和NaCl处理后的拟南芥幼苗分别置于GUS染色液(100mM Na3PO4，pH 7.0，10mM EDTA，2mM K3Fe(CN)6，2mM K4Fe(CN)6，0.1％Triton X-100和1mM X-Gluc)中，37℃孵育过夜，然后用70％乙醇对幼苗进行脱色。待去除多余染液后，将幼苗转移至ddH2O中，观察并拍照。植株的GUS活性的定量检测所需试剂：(1)0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0)；(2)10％SDS溶液；(3)0.5M EDTA(pH 8.0)；(4)GUS酶提取液；(5)MUG底物；(6)Stop Buffer(0.2M Na2CO3)；(7)考马斯亮蓝G250溶液；(8)1mg/mL BSA。使用GUS提取液进行总蛋白提取，总蛋白浓度的测定使用Bradford法。取总蛋白提取液100μL，加入到37℃的400μL GUS提取缓冲液，再加MUG底物500μL，放入37℃温箱中。每隔15min取200μL混合反应物加入到800μL反应终止液，共取样5次，室温避光保存。利用荧光分光光度计测定以365nm激发波长、455nm发射波长时各时间点的荧光强度数值。以荧光强度值对反应时间做曲线，求出单位时间的荧光强度变化值，并计算出GUS活性(nmol 4-MU/min mg protein)。结果表明，ProSRRM1L::GUS转基因拟南芥幼苗经盐胁迫处理后，植物的GUS活性显著上调。这些结果表明AtSRRM1L基因响应盐胁迫。(见图1中的C和图1中的D)。
利用SMART在线软件对AtSRRM1L蛋白的氨基酸序列进行分析，结果显示，AtSRRM1L蛋白含有一个保守的PWI结构域，属于PWI超家族，以及一个丝氨酸/精氨酸富集区域(RS区)(见图2)。
实施例2：AtSnRK1与AtSRRM1L的互作
一、酵母双杂交验证AtSnRK1与AtSRRM1L的互作
(一)pGBKT7-AtSnRK1和pGADT7-AtSRRM1L表达载体的构建
1、AtSnRK1基因的获得
以拟南芥总cDNA为模板，采用pGBKT7-AtSnRK1-SmaI SalIF/R(SEQ ID NO.7和SEQID NO.8)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI和SalI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSnRK1基因。
2、重组载体pGBKT7-AtSnRK1的构建
用限制性内切酶SmaI和SalI对pGBKT7载体进行双酶切，将步骤1所获得的AtSnRK1基因和双酶切后的pGBKT7载体进行连接，得到pGBKT7-AtSnRK1重组载体，对pGBKT7-AtSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGBKT7-AtSnRK1重组载体为将pGBKT7载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为AtSnRK1基因，且保持pGBKT7载体的其他序列不变得到的载体。pGBKT7-AtSnRK1重组载体表达AtSnRK1蛋白。
3、重组载体pGADT7-AtSRRM1L的构建
以拟南芥总cDNA为模板，采用pGADT7-AtSRRM1L-SmaIF/R(SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L基因。用限制性内切酶SmaI对pGADT7载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，与上述PCR产物进行连接，得到pGADT7-AtSRRM1L重组载体，对pGADT7-AtSRRM1L重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGADT7-AtSRRM1L重组载体为将pGADT7载体的SmaI酶切位点通过同源重组插入AtSRRM1L基因，且保持pGADT7载体的其他序列不变得到的载体。pGADT7-AtSRRM1L重组载体表达AtSRRM1L蛋白。
(二)转化酵母菌Y2HGold
根据Y2HGold转化说明书，将pGBKT7-AtSnRK1和pGADT7-AtSRRM1L重组质粒共转到Y2HGold菌株中，涂布在SD/-Trp-Leu培养基上，在30℃培养箱中生长48-96h。将细胞分别接种在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His(含20mM 3-AT)固体培养基上，分析AtSnRK1与AtSRRM1L之间的相互作用，以pGBKT7-Empty/pGADT7-AtSRRM1L、pGBKT7-AtSnRK1/pGADT7-Empty组合为空白对照，以pGBKT7-Empty/pGADT7-Empty组合为负对照，以pGBKT7-GsSnRK1α/pGADT7-GsSnRK1β组合为正对照。
结果如图3中的A所示，包含每个组合的酵母菌株均能在SD/-Trp-Leu培养基上生长，表明质粒共转化成功。而在SD/-Trp-Leu-His(含20mM 3-AT)固体培养基上酵母生长的结果显示只有pGBKT7-AtSnRK1和pGADT7-AtSRRM1L质粒共转的酵母菌株能够生长，空白对照及负对照组均不能生长，这表明AtSnRK1与AtSRRM1L蛋白存在互作关系。
二、烟草瞬时转化验证AtSnRK1与AtSRRM1L的互作及定位
(一)pSPYNE-AtSnRK1和pSPYCE-AtSRRM1L表达载体的构建
1.重组载体pSPYNE-AtSnRK1的构建
以pGBKT7-AtSnRK1重组质粒为模板，采用pSPYNE-AtSnRK1-KpnIF/R(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有KpnI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSnRK1基因。用限制性内切酶KpnI对pSPYNE载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，与上述PCR产物进行连接，得到pSPYNE-AtSnRK1重组载体，对pSPYNE-AtSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pSPYNE-AtSnRK1重组载体为将pSPYNE载体的KpnI酶切位点通过同源重组插入AtSnRK1基因，且保持pSPYNE载体的其他序列不变得到的载体。pSPYNE-AtSnRK1重组载体表达AtSnRK1蛋白。
2.重组载体pSPYCE-AtSRRM1L的构建
以pGADT7-AtSRRM1L重组质粒为模板，采用pSPYCE-AtSRRM1L-KpnIF/R(SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有KpnI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L基因。用限制性内切酶KpnI对pSPYCE载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，与上述PCR产物进行连接，得到pSPYCE-AtSRRM1L重组载体，对pSPYCE-AtSRRM1L重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pSPYCE-AtSRRM1L重组载体为将pSPYCE载体的KpnI酶切位点通过同源重组插入AtSRRM1L基因，且保持pSPYCE载体的其他序列不变得到的载体。pSPYCE-AtSRRM1L重组载体表达AtSRRM1L蛋白。
(二)pCAMBIA1300-cLUC-AtSnRK1和pCAMBIA1300-nLUC-AtSRRM1L表达载体的构建
pCAMBIA1300-cLUC-AtSnRK1和pCAMBIA1300-nLUC-AtSRRM1L表达载体的构建依照上述(一)中方法进行。
(三)烟草瞬时转化
利用双分子荧光互补(BiFC)实验检测AtSnRK1和AtSRRM1L之间的相互作用。将重组质粒pSPYNE-AtSnRK1和pSPYCE-AtSRRM1L分别转化农杆菌GV3101后，在烟草叶片中瞬时共表达。烟草培养2d后，使用共聚焦激光显微镜检测相互作用蛋白的荧光信号。结果如图3中的B所示，当AtSnRK1-nYFP和AtSRRM1L-cYFP融合蛋白在烟草叶片细胞中瞬时共表达时，在细胞核中观察到强烈的YFP荧光信号，而与空载体共表达不显示任何可被识别的YFP荧光信号，这表明AtSnRK1与AtSRRM1L的相互作用主要发生在细胞核中。
对于荧光素酶互补实验(SLCA)，将重组质粒pCAMBIA1300-cLUC-AtSnRK1和pCAMBIA1300-nLUC-AtSRRM1L分别转化农杆菌GV3101后，在烟草叶片中瞬时共表达。以GsSnRK1α-cLUC/GsSnRK1β-nLUC组合作为阳性对照。培养3d后，用荧光素溶液(1mM荧光素，0.01％Triton X-100)喷洒烟草叶片，黑暗处理20min后用化学发光成像系统观察荧光素酶活性。结果如图3中的C所示，当AtSnRK1-cLUC与AtSRRM1L-nLUC共同渗透到烟草叶片中时，观察到强烈的荧光素酶活性，这表明AtSRRM1L蛋白与AtSnRK1蛋白互作。
(四)烟草蛋白的提取及Western blot检测
将相关质粒在烟草叶片中进行瞬时表达后提取总蛋白，采用co-IP技术分析二者的互作关系。利用anti-HA从所有裂解物中免疫沉淀(即IP)出HA-AtSRRM1L，并通过anti-Myc抗体进行Westernblot检测Myc-AtSnRK1蛋白；以及利用anti-Myc从所有裂解物中免疫沉淀出Myc-AtSnRK1，并通过anti-HA抗体进行Western blot检测HA-AtSRRM1L蛋白。结果如图3中的D所示，该结果表明AtSRRM1L蛋白与AtSnRK1蛋白之间都存在互作，并能形成蛋白复合物。
三、AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化分析
(一)蛋白表达载体的构建
1、重组载体pET28a-AtSnRK1(T175E)和pET28a-AtSnRK1(K48M)的构建
1)AtSnRK1(T175E)基因的获得
我们将AtSnRK1基因序列上编码第175位氨基酸的碱基ACA替换为GAA，使AtSnRK1蛋白的第175位氨基酸由苏氨酸(T)突变为谷氨酸(E)，我们重新人工合成了突变过的AtSnRK1基因并命名为AtSnRK1(T175E)，AtSnRK1(T175E)基因编码的AtSnRK1(T175E)蛋白具有磷酸化的功能。
以AtSnRK1(T175E)基因为模板，采用pET28a-Myc-AtSnRK1(T175E)-SalIF/R(SEQID NO.15和SEQ ID NO.16)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SalI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSnRK1(T175E)基因。
2)AtSnRK1(K48M)基因的获得
我们将AtSnRK1基因序列上编码第48位氨基酸的碱基AAG替换为ATG，使AtSnRK1蛋白的第48位氨基酸由赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M)，我们重新人工合成了突变过的AtSnRK1基因并命名为AtSnRK1(K48M)，AtSnRK1(K48M)基因编码的AtSnRK1(K48M)蛋白不具有磷酸化的功能。
以AtSnRK1(K48M)基因为模板，采用pET28a-Myc-AtSnRK1(K48M)-SalIF/R(SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SalI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSnRK1(K48M)基因。
3)重组载体pET28a-AtSnRK1(T175E)和pET28a-AtSnRK1(K48M)的构建
用限制性内切酶SalI对pET28a载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，分别与与上述PCR产物进行连接，得到pET28a-AtSnRK1(T175E)和pET28a-AtSnRK1(K48M)重组载体，分别对pET28a-AtSnRK1(T175E)和pET28a-AtSnRK1(K48M)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET28a-AtSnRK1(T175E)重组载体为将pET28a载体的SalI酶切位点间的DNA片段替换为AtSnRK1(T175E)基因，且保持pET28a载体的其他序列不变得到的载体。pET28a-AtSnRK1(T175E)重组载体表达AtSnRK1(T175E)蛋白。pET28a-AtSnRK1(K48M)重组载体为将pET28a载体的SalI酶切位点间的DNA片段替换为AtSnRK1(K48M)基因，且保持pET28a载体的其他序列不变得到的载体。pET28a-AtSnRK1(K48M)重组载体表达AtSnRK1(K48M)蛋白。
2、重组载体pET28a-AtSRRM1L的构建
1)AtSRRM1L基因的获得
以pGADT7-AtSRRM1L重组质粒为模板，采用pET28a-HA-AtSRRM1L-SalIF/R(SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SalI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L基因。
2)重组载体pET28a-AtSRRM1L的构建
用限制性内切酶SalI对pET28a载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，与上述PCR产物进行连接，得到pET28a-AtSRRM1L重组载体，对pET28a-AtSRRM1L重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET28a-AtSRRM1L重组载体为将pET28a载体的SalI酶切位点间的DNA片段替换为AtSRRM1L基因，且保持pET28a载体的其他序列不变得到的载体。pET28a-AtSRRM1L重组载体表达AtSRRM1L蛋白。
3、重组载体pET28a-AtSRRM1L(9A)的构建
1)AtSRRM1L(9A)基因的获得
根据磷酸化质谱分析结果，我们得到AtSRRM1L蛋白上能够被AtSnRK1所识别的磷酸化位点有九个，位置分别为Ser27、Thr41、Thr168、Ser285、Ser287、Ser391、Ser393、Ser41和Ser558，因此我们将AtSRRM1L基因序列上编码这9个氨基酸的碱基全部替换为GCT，使AtSRRM1L蛋白的9个位置的氨基酸全部突变为丙氨酸(A)，我们重新人工合成了突变过的AtSRRM1L基因并命名为AtSRRM1L(9A)，AtSRRM1L(9A)基因编码的AtSRRM1L(9A)蛋白不具有被AtSnRK1蛋白磷酸化的能力。
以AtSRRM1L(9A)基因为模板，采用pET28a-HA-AtSRRM1L(9A)-SalIF/R(SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18)引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SalI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L(9A)基因。
2)重组载体pET28a-AtSRRM1L(9A)的构建
用限制性内切酶SalI对pET28a载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，与上述PCR产物进行连接，得到pET28a-AtSRRM1L(9A)重组载体，对pET28a-AtSRRM1L(9A)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET28a-AtSRRM1L(9A)重组载体为将pET28a载体的SalI酶切位点间的DNA片段替换为AtSRRM1L(9A)基因，且保持pET28a载体的其他序列不变得到的载体。pET28a-AtSRRM1L(9A)重组载体表达AtSRRM1L(9A)蛋白。
4、重组载体pET28a-AtSRRM1L(S27)、pET28a-AtSRRM1L(T41)、pET28a-AtSRRM1L(T168)、pET28a-AtSRRM1L(S285)、pET28a-AtSRRM1L(S287)、pET28a-AtSRRM1L(S391)、pET28a-AtSRRM1L(S393)、pET28a-AtSRRM1L(S411)和pET28a-AtSRRM1L(S558)的构建
AtSRRM1L(S27)、AtSRRM1L(T41)、AtSRRM1L(T168)、AtSRRM1L(S285)、AtSRRM1L(S287)、AtSRRM1L(S391)、AtSRRM1L(S393)、AtSRRM1L(S411)和AtSRRM1L(S558)基因的获得及重组载体pET28a-AtSRRM1L(S27)、pET28a-AtSRRM1L(T41)、pET28a-AtSRRM1L(T168)、pET28a-AtSRRM1L(S285)、pET28a-AtSRRM1L(S287)、pET28a-AtSRRM1L(S391)、pET28a-AtSRRM1L(S393)、pET28a-AtSRRM1L(S411)和pET28a-AtSRRM1L(S558)的构建参照步骤3的方法进行。
(二)蛋白的表达和纯化
将(一)中获得的蛋白表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，分别获得含有上述蛋白表达载体的BL21(DE3)大肠杆菌并诱导蛋白表达。分别对表达的蛋白进行纯化，AtSnRK1(T175E)和AtSnRK1(K48M)蛋白的纯化采用上海谷研实业有限公司提供的Myc融和蛋白纯化试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书；AtSRRM1L、AtSRRM1L(9A)、AtSRRM1L(S27)、AtSRRM1L(T41)、AtSRRM1L(T168)、AtSRRM1L(S285)、AtSRRM1L(S287)、AtSRRM1L(S391)、AtSRRM1L(S393)、AtSRRM1L(S411)和AtSRRM1L(S558)蛋白的纯化采用康为世纪His-Tagged Protein Purification Kit试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书。
(三)使用Zn2+Phos-tag Biotin BTL-104抗体试剂盒检测AtSnRK1对AtSRRM1L的体外磷酸化
采用Zn2+Phos-tag Biotin BTL-104抗体分别检测AtSnRK1(T175E)、AtSnRK1(K49M)对AtSRRM1L；AtSnRK1(T175E)对AtSRRM1L(9A)、AtSRRM1L(S27)、AtSRRM1L(T41)、AtSRRM1L(T168)、AtSRRM1L(S285)、AtSRRM1L(S287)、AtSRRM1L(S391)、AtSRRM1L(S393)、AtSRRM1L(S411)和AtSRRM1L(S558)的磷酸化水平，具体操作步骤详见Zn2+Phos-tag BiotinBTL-104抗体试剂盒说明书。结果如图4中的A所示：AtSnRK1(T175E)对AtSRRM1L有磷酸化的作用，AtSnRK1(K49M)对AtSRRM1L没有磷酸化作用，AtSnRK1(T175E)对AtSRRM1L(9A)、AtSRRM1L(S27)、AtSRRM1L(T41)、AtSRRM1L(T168)、AtSRRM1L(S285)、AtSRRM1L(S287)、AtSRRM1L(S391)、AtSRRM1L(S393)、AtSRRM1L(S411)以及AtSRRM1L(S558)没有磷酸化作用。证明了AtSnRK1蛋白对AtSRRM1L蛋白具有磷酸化作用，AtSRRM1L蛋白上的9个磷酸化位点是AtSnRK1所识别的磷酸化位点。
(四)Westernblot检测AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化
分别在野生型(Col-0)或者2kinm背景下过表达AtSRRM1基因，对过表达植株HA-AtSRRM1L/Col-0和HA-SRRM1L/2kinm进行NaCl处理后，检测体内AtSRRM1L的磷酸化水平。
结果如图4中的B所示，采用HA抗体从HA-AtSRRM1L/Col-0和HA-SRRM1L/2kinm植物中免疫沉淀出HA-SRRM1L蛋白，采用Phos-tag抗体检测到AtSRRM1L可在体内被AtSnRK1磷酸化，盐胁迫可增强AtSRRM1L的磷酸化水平。说明AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化响应于盐胁迫。
实施例3：AtSRRM1L蛋白的定位分析
1、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP表达载体的构建
1)AtSRRM1L基因的获取
以上述pGADT7-AtSRRM1L质粒为模板，采用引物对pBWA(V)BS-3HA-SRRM1L-GFP-SmaIF/R(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L基因。
2)重组载体pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP的构建
用限制性内切酶SmaI对pBWA(V)BS-3HA-GFP载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将AtSRRM1L与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的其他序列不变得到的载体，得到pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP重组载体，对pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP重组载体为将pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的SmaI单酶切后，插入AtSRRM1L基因，且保持pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的其他序列不变得到的载体。
2、pBWA(V)BS-3HA-RSSRRM1L-GFP表达载体的构建
1)RSSRRM1L基因的获取
以上述pGADT7-AtSRRM1L质粒为模板，采用引物对pBWA(V)BS-3HA-RSSRRM1L-GFP-SmaIF/R(SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI酶切位点以及与载体部分同源臂的RSSRRM1L基因。
2)重组载体pBWA(V)BS-3HA-RSSRRM1L-GFP的构建
用限制性内切酶SmaI对pBWA(V)BS-3HA-GFP载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将RSSRRM1L与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的其他序列不变得到的载体，得到pBWA(V)BS-3HA-RSSRRM1L-GFP重组载体，对pBWA(V)BS-3HA-RSSRRM1L-GFP重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBWA(V)BS-3HA-RSSRRM1L-GFP重组载体为将pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的SmaI单酶切后，插入RSSRRM1L基因，且保持pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的其他序列不变得到的载体。
3、pBWA(V)BS-3HA-PWISRRM1L-GFP表达载体的构建
1)PWISRRM1L基因的获取
以上述pGADT7-AtSRRM1L质粒为模板，采用引物对pBWA(V)BS-3HA-PWISRRM1L-GFP-SmaIF/R(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.23)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI酶切位点以及与载体部分同源臂的PWISRRM1L基因。
2)重组载体pBWA(V)BS-3HA-PWISRRM1L-GFP的构建
用限制性内切酶SmaI对pBWA(V)BS-3HA-GFP载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将PWISRRM1L与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的其他序列不变得到的载体，得到pBWA(V)BS-3HA-PWISRRM1L-GFP重组载体，对pBWA(V)BS-3HA-PWISRRM1L-GFP重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBWA(V)BS-3HA-PWISRRM1L-GFP重组载体为将pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的SmaI单酶切后，插入PWISRRM1L基因，且保持pBWA(V)BS-3HA-GFP载体的其他序列不变得到的载体。
4、烟草瞬时转化
亚细胞定位分析为将质粒pBWA(V)BS-3HA-GFP和重组质粒pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP、pBWA(V)BS-3HA-RSSRRM1L-GFP和pBWA(V)BS-3HA-PWISRRM1L-GFP分别转化农杆菌GV3101，在烟草叶片中瞬时表达，烟草培养2d后，使用共聚焦激光显微镜检测相互作用蛋白的荧光信号。结果如图5所示，全长的AtSRRM1-GFP以典型的斑点模式定位于细胞核中。PWI-GFP存在于细胞质和细胞核中，表明没有任何亚细胞靶向信号。RS-GFP定位信号仅存在于细胞核中，另外RS-GFP定位于核散斑中，说明散斑靶向和散斑保留信号均位于RS区域中。这些结果表明RS区域不仅包含独立功能的核定位信号，而且散斑定位信号位于RS区域中，这对于散斑定位是必要和充分的。
实施例4：AtSRRM1L调控与胁迫相关基因的选择性剪接
为了阐明AtSRRM1L在拟南芥盐胁迫响应中的作用，对生长25d的野生型拟南芥和srrm1l突变体幼苗进行了转录组测序，检测SRRM1L的突变是否会导致植物中与胁迫相关的基因发生选择性剪接。RNA-seq结果如图6中的A所示，srrm1l突变体中发生选择性剪接的转录本共有22,477个，而野生型中有21,915个选择性剪接体，srrm1l突变体和WT中共有23,342个经过AS产生的转录本。对依赖于SRRM1L的发生选择性剪接的基因进行GO富集分析，结果如图6中的B所示，这些发生选择性剪接的基因在响应各种胁迫中富集，这意味着发生选择性剪接事件的基因可能与SRRM1L调控的盐胁迫反应有关。
RNA-seq分析显示，在srrm1l突变体中共有156个基因的内含子发生了保留，SRRM1L对内含子保留(IR)的影响提出了SRRM1L是否是RNA结合蛋白的问题。为了确定一个假定的SRRM1L结合基序，使用内含子(整个内含子序列加上内含子序列5'和3'侧翼外显子序列的50个碱基)进行了MEME搜索。通过搜索发现最显著富集的motif是一个富含CU的21bp序列，该序列出现在内含子序列5'或3'端两侧的外显子序列中，很少出现在内含子内部，预测该基序为SRRM1L的潜在结合位点。之后使用生物素标记的RNA探针进行电泳迁移率转移试验(REMSA)，该探针基于一个AT5G06510内含子I的5′侧翼区域的21nt序列(5′-CUCACCUGGUAAACUCUCUCA-3′)合成，该探针的序列如SEQ ID NO.46所示。REMSA结果如图6中的C所示，SRRM1L阻碍了探针的迁移，并且随着蛋白浓度的增加，探针迁移受阻增加，另外随着未标记探针的添加，这种迁移被削弱甚至取消。这些观察结果强烈提示SRRM1L与靶mRNA的结合。
实施例5：AtSnRK1的磷酸化对AtSRRM1L核散斑定位的影响
1、重组载体pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP的构建
1)AtSRRM1L(9A)基因的获得
以重组质粒pET28a-AtSRRM1L(9A)为模板，采用引物对pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP-SmaIF/R(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L(9A)基因。
2)重组载体pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)的构建
用限制性内切酶SmaI对pBWA(V)BS-3HA-GFP载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit与上述PCR产物进行连接，得到pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP重组载体，对pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP重组载体进行测序验证。
2、重组载体pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(3A)-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(6A)-GFP的构建
1)AtSRRM1L(3A)和AtSRRM1L(6A)基因的获得
已知AtSRRM1L蛋白上能够被AtSnRK1所识别的磷酸化位点有九个，位置分别为Ser27、Thr41、Thr168、Ser285、Ser287、Ser391、Ser393、Ser41和Ser558，其中Ser27、Thr41以及Thr168氨基酸位于AtSRRM1L蛋白的PWI保守结构域中，Ser285、Ser287、Ser391、Ser393、Ser41和Ser558氨基酸位于AtSRRM1L蛋白的RS区域中。我们将AtSRRM1L蛋白的PWI保守结构域中的3个磷酸化位点的碱基全部替换为GCT，使这3个位置的氨基酸全部突变为丙氨酸(A)，我们重新人工合成了突变过的AtSRRM1L基因并命名为AtSRRM1L(3A)，模拟中断的磷酸化。另外我们将AtSRRM1L蛋白的RS区域中的6个磷酸化位点的碱基全部替换为GCT，使这6个位置的氨基酸全部突变为丙氨酸(A)，我们重新人工合成了突变过的AtSRRM1L基因并命名为AtSRRM1L(6A)，模拟中断的磷酸化。
以AtSRRM1L(3A)和AtSRRM1L(6A)基因为模板，采用引物对pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(3A)-GFP-SmaIF/R(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)、引物对pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(6A)-GFP-SmaIF/R(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)及PrimeSTAR MaxDNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L(3A)和AtSRRM1L(6A)基因。
2)重组载体pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(3A)-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(6A)-GFP的构建
用限制性内切酶SmaI对pBWA(V)BS-3HA-GFP载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit分别与上述PCR产物进行连接，得到pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(3A)-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(6A)-GFP重组载体，对上述重组载体进行测序验证。
3、烟草瞬时转化
亚细胞定位分析为将重组质粒pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(3A)-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(6A)-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP分别转化农杆菌GV3101，在烟草叶片中瞬时表达，烟草培养2d后，使用共聚焦激光显微镜检测相互作用蛋白的荧光信号。结果如图7中的A所示，全长的AtSRRM1L-GFP以典型的斑点模式定位于细胞核中。AtSRRM1L(6A)以及AtSRRM1L(9A)均丢失了核散斑特征，均匀的分布在细胞核中，而位于PWI结构域上的3个磷酸化位点的突变并不影响核散斑的定位，这些数据表明AtSnRK1介导的AtSRRM1L蛋白的RS区域的磷酸化对核散斑定位是十分重要的，而RS区域是赋予AtSRRM1L核散斑定位的区域。
4、拟南芥的遗传转化
1)转化根癌农杆菌GV3101
采用冻融法将表达载体pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP分别转化至根癌农杆菌GV3101中，具体操作步骤详见唯地根癌农杆菌GV3101感受态说明书。
2)拟南芥的遗传转化
利用农杆菌介导的花浸法对拟南芥进行遗传转化。在Col-0背景下过表达GFP，SRRM1L-GFP和SRRM1L(9A)-GFP，经筛选获得纯合株系。取T3代种子经消毒后种于含25mg/LBasta抗性的1/2MS培养基上，对生长5日龄的幼苗根尖细胞进行亚细胞定位，结果如图7中的B所示，正常条件下，SRRM1L-GFP定位于拟南芥幼苗根尖细胞的核散斑中，与烟草叶片细胞中所观察到的定位一致。之后用盐处理SRRM1L-GFP转基因幼苗，结果显示，与对照相比，盐处理后，SRRM1L-GFP存在于更多的核散斑中。无论是否使用盐处理，SRRM1L(9A)-GFP转基因幼苗的细胞均显示GFP均匀的分布在细胞核中，并没有发现核散斑的存在。这些结果显示响应盐胁迫的SRRM1L的核散斑增多是通过SnRK1-SRRM1L途径促进的，这种促进部分依赖于SnRK1介导的磷酸化。
实施例6：AtSnRK1对AtSRRM1L的磷酸化影响AtSRRM1L对靶基因NFYA10前体mRNA的选择性剪接
1、重组载体pET28a-AtSRRM1L(9D)的构建
1)AtSRRM1L(9D)基因的获得
已知AtSRRM1L蛋白上能够被AtSnRK1所识别的磷酸化位点有九个，位置分别为Ser27、Thr41、Thr168、Ser285、Ser287、Ser391、Ser393、Ser41和Ser558，因此我们将AtSRRM1L蛋白的这9个位置的丝氨酸(S)突变为天冬氨酸(D)，苏氨酸(T)突变为谷氨酸(E)，我们重新人工合成了突变过的AtSRRM1L基因并命名为AtSRRM1L(9D)，AtSRRM1L(9D)基因编码的AtSRRM1L(9D)蛋白具有已经被AtSnRK1蛋白磷酸化的能力。
以AtSRRM1L(9D)基因为模板，采用引物对pET28a-HA-AtSRRM1L(9D)-SalIF/R(SEQID NO.17和SEQ ID NO.18)及PrimeSTARMax DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SalI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L(9D)基因。
2)重组载体pET28a-AtSRRM1L(9D)的构建
用限制性内切酶SalI对pET28a载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit与上述PCR产物进行连接，得到pET28a-AtSRRM1L(9D)重组载体，对重组载体进行测序验证。
2、蛋白的表达和纯化
将蛋白表达载体pET28a-AtSRRM1L(9D)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，具体操作步骤详见BL21(DE3)Chemically Competent Cell说明书。获得含有pET28a-AtSRRM1L(9D)蛋白表达载体的BL21(DE3)大肠杆菌并诱导蛋白表达。对表达的AtSRRM1L(9D)蛋白进行纯化，采用康为世纪His-TaggedProtein Purification Kit试剂盒进行纯化。
3、体外REMSA分析
为了检测AtSnRK1介导的磷酸化是否影响AtSRRM1L的RNA结合活性，进行了体外REMSA分析。REMSA分析结果如图8中的A所示，磷酸化状态的SRRM1L(9D)的mRNA结合能力高于SRRM1L(wt)，表明AtSnRK1介导的AtSRRM1L磷酸化促进了AtSRRM1L结合靶mRNA的能力。
4、植物体内RIP-PCR分析
分别在野生型(Col-0)或者2kinm背景下过表达GFP或者AtSRRM1-GFP基因，通过RIP-PCR测定过表达植株GFP/Col-0、AtSRRM1-GFP/Col-0、GFP/2kinm和AtSRRM1-GFP/2kinm中GFP或者AtSRRM1L结合RNA的能力。结果如图8中的B所示，采用GFP抗体分别从GFP/Col-0、AtSRRM1-GFP/Col-0、GFP/2kinm和AtSRRM1-GFP/2kinm植物中免疫沉淀出GFP和AtSRRM1L-GFP蛋白，在AtSRRM1-GFP/Col-0过表达植株中，AtSRRM1L在NFYA10 pre-mRNA的第一外显子上的结合比在AtSRRM1-GFP/2kinm过表达植株中更富集，表明AtSnRK1磷酸化可以增强AtSRRM1L与靶RNA的结合。
实施例7：AtSRRM1L的遗传转化及在转基因拟南芥中的表达分析
1、重组载体pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)-GFP和pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)-GFP的构建
1)AtSRRM1l基因的启动子序列的获得
以野生型拟南芥基因组DNA为模板，采用引物对pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GUS-EcoRINcoIF/R(SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有EcoRINcoI酶切位点以及与载体部分同源臂的ProSRRM1L启动子。
用限制性内切酶EcoRI和NcoI对pCAMBIA3301载体进行双酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit与上述PCR产物进行连接，得到pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GUS重组载体，对pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GUS重组载体进行测序验证。
2)重组载体pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9D)-GFP的构建
以重组质粒PET28a-AtSRRM1L(9D)为模板，采用引物对pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9D)-GFP-SmaIF/R(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有SmaI酶切位点以及与载体部分同源臂的AtSRRM1L(9D)基因。
用限制性内切酶SmaI对pBWA(V)BS-3HA-GFP载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit与上述PCR产物进行连接，得到pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9D)-GFP重组载体，对pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9D)-GFP重组载体进行测序验证。
3)重组载体pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)-GFP和pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)-GFP的构建
分别以重组质粒pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9D)-GFP为模板，采用引物对pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GFP-NcoIPmlIF/R(SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27)、引物对pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L-GFP-NcoIPmlIF/R(SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29、引物对pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)-GFP-NcoIPmlIF/R(SEQ ID NO.28和SEQ IDNO.29)、引物对pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)-GFP-NcoIPmlIF/R(SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29)及PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有NcoIPmlI酶切位点以及与载体部分同源臂的GFP基因、AtSRRM1L-GFP基因、AtSRRM1L(9A)-GFP和AtSRRM1L(9D)-GFP基因。
用限制性内切酶NcoI和PmlI对pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GUS载体进行双酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit分别与上述PCR产物进行连接，得到pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)-GFP和pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)-GFP重组载体，对上述重组载体进行测序验证。
2、重组载体pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L、pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)和pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)的构建
分别以重组质粒pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)-GFP和pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)-GFP为模板，采用引物对pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L-KpnI NcoIF/R(SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31)、引物对pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)-KpnI NcoIF/R(SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31)、引物对pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)-KpnI NcoIF/R(SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有KpnINcoI酶切位点以及与载体部分同源臂的ProSRRM1L-AtSRRM1L基因、ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)基因和ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)基因。
用限制性内切酶KpnI和NcoI对pCAMBIA1302载体进行双酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit分别与上述PCR产物进行连接，得到pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L、pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)和pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)重组载体，对上述重组载体进行测序验证。
3、重组载体pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1和pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1(K48M)的构建
1)重组载体pCAMBIA1302-ProSnRK1的构建
以野生型拟南芥基因组DNA为模板，采用引物对pCAMBIA1302-ProSnRK1-KpnINcoIF/R(SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33)及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有EcoRINcoI酶切位点以及与载体部分同源臂的ProSnRK1启动子。
用限制性内切酶KpnI和NcoI对pCAMBIA1302载体进行双酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit与上述PCR产物进行连接，得到pCAMBIA1302-ProSnRK1重组载体，对pCAMBIA1302-ProSnRK1重组载体进行测序验证。
2)重组载体pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1和pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1(K48M)的构建
以重组质粒pGBKT7-AtSnRK1和PET28a-AtSnRK1(K48M)为模板，采用引物对pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1-NcoIF/R(SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35)、引物对pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1(K48M)-NcoIF/R(SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35)及PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有NcoI酶切位点以及与载体部分同源臂的ProSnRK1-AtSnRK1基因和ProSnRK1-AtSnRK1(K48M)基因。
用限制性内切酶NcoI对pCAMBIA1302-ProSnRK1载体进行酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶ClonExpress IIOne Step Cloning Kit分别与上述PCR产物进行连接，得到pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1和pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1(K48M)重组载体，对上述重组载体进行测序验证。
4、转化根癌农杆菌GV3101
采用冻融法将表达载体pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L-GFP、pCAMBIA3301-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)-GFP、pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L、pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9A)、pCAMBIA1302-ProSRRM1L-AtSRRM1L(9D)、pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1和pCAMBIA1302-ProSnRK1-AtSnRK1(K48M)分别转化至根癌农杆菌GV3101中，具体操作步骤详见唯地根癌农杆菌GV3101感受态说明书。
5、根癌农杆菌GV3101介导转基因拟南芥的遗传转化及植株在盐胁迫下的表型分析
利用农杆菌介导的花浸法对拟南芥进行遗传转化。在Col-0背景下过表达或者在srrm1l突变体背景下回补GFP，SRRM1L-GFP和SRRM1L(9A)-GFP，经筛选获得纯合株系。结果如图9中的A所示，在1/2MS培养基上，与正常回补的SRRM1-GFP株系相比，磷酸化位点突变的SRRM1L(9A)基因的表达无法挽救srrm1l突变体的盐敏感表型。在盐胁迫处理后，SRRM1L(9A)-GFP回补系相对于SRRM1L-GFP回补系表现为根长较短，存活率较低。另外，在正常条件下，SRRM1L(9A)-GFP过表达系和SRRM1L-GFP过表达系的根长无显著差异，但在盐胁迫处理下，SRRM1L(9A)-GFP过表达系幼苗的根长显著低于SRRM1L-GFP过表达系，幼苗存活率也相对较低。同样测定了土壤中不同基因型植株的耐盐性，结果如图9中的B所示，与幼苗时期的结果一致，在正常生长条件下，不同基因型的存活率与相对叶绿素含量无显著差异。虽然盐胁迫降低了不同基因型植株的存活率，但SRRM1L-GFP过表达植株的存活率要高于其他基因型，而SRRM1L(9A)-GFP过表达植株对盐较为敏感。
为了进一步探讨SnRK1与SRRM1L之间的关系，将功能缺失突变体2kinm与srrm1l突变体进行杂交，生成2kinm/srrm1l双突变体。在双突变体的背景下进行了一系列的回补，首先将SRRM1L和SnRK1基因同时引入到2kinm/srrm1l双突变体中，生成了独立的回补系，结果如图9中的C所示，SRRM1L和SnRK1基因的回补完全挽救了2kinm/srrml1突变体的盐敏感反应，而当SRRM1L(9A)和SnRK1(K48M)基因同时回补到2kinm/srrm1l双突变体后，发现SnRK1(K48M)/SRRM1L(9A)回补系与2kinm/srrm1l双突变体表型一致，对盐高度敏感。当比较SRRM1L磷酸化位点突变时，发现SnRK1/SRRM1L(9A)回补系对盐高度敏感，而SnRK1/SRRM1L(9D)回补系对盐的耐受性要高于SnRK1/SRRM1L回补系。另外其他一些回补系SnRK1(K48M)/SRRM1L以及SnRK1(K48M)/SRRM1L(9D)对盐的耐受性均要低于SnRK1/SRRM1L回补系。接下来评估了不同基因型植株在对照或盐处理下的存活率和叶绿素含量，得出了与盐处理后植株生长受到抑制相似的结论。以上结果表明，SnRK1对SRRM1L的磷酸化对SRRM1L在耐盐性中的作用至关重要。
实施例8：AtSRRM1L的遗传转化及在转基因大豆中的表达分析
一、pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2表达载体的构建
选取GmSRRM1L.1(2343-2573bp)和GmSRRM1L.2(2274-2504bp)基因的非保守区域，因为GmSRRM1L.1和GmSRRM1L.2基因均为AtSRRM1L的同源基因，且两者相似性较高，因此需要选择一段相同且非保守序列作为RNAi技术的靶标序列，即通过RNAi技术将两个大豆内源基因进行敲除。
1、pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2正向重组载体的构建
选取的靶标序列进行人工合成后，采用引物对pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2-XhoIF/R(SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37)PrimeSTARMax DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有XhoI酶切位点以及与载体部分同源臂的GmSRRM1L.1/.2基因片段。
用限制性内切酶XhoI对pHANNIBAL载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将部分GmSRRM1L.1/.2与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pHANNIBAL载体的其他序列不变得到的载体，得到pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2正向重组载体，对pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2正向重组载体进行测序验证。
2、pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2载体的构建
选取的靶标序列的反义片段进行人工合成后，采用引物对pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2-XbaIF/R(SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39)及PrimeSTAR MaxDNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有XbaI酶切位点以及与载体部分同源臂的GmSRRM1L.1/.2反义片段。
用限制性内切酶XbaI对上述pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2正向载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将部分GmSRRM1L.1/.2反义片段与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2正向载体的其他序列不变得到的载体，得到pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2重组载体，对pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2重组载体为将pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2正向载体的XbaI单酶切后，插入部分GmSRRM1L.1/.2反义片段，且保持pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2正向载体的其他序列不变得到的载体。
3、pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2表达载体的构建
以上述pHANNIBAL-RNAi-GmSRRM1L.1/.2质粒为模板，采用引物对3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2-EcoRI NcoIF/R(SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41)及PrimeSTAR MaxDNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到CaMV 35S启动子、部分正义片段、内含子以及部分反义片段PCR扩增产物。
用限制性内切酶EcoRI和NcoI对pCAMBIA3301载体进行双酶切，然后利用同源重组酶将CaMV 35S启动子、部分正义片段、内含子以及部分反义片段与酶切纯化后的载体进行连接，得到pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2重组载体，对pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2重组载体为将pCAMBIA3301载体的EcoRI和NcoI酶切位点间的DNA片段替换为CaMV 35S启动子、部分正义片段、内含子以及部分反义片段基因，且保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变得到的载体。
二、转化根癌农杆菌EHA105
采用冻融法将表达载体pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP和pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2分别转化至根癌农杆菌EHA105中，具体操作步骤详见唯地发根农杆菌K599感受态说明书。
三、根癌农杆菌EHA105介导转基因大豆的遗传转化及植株在盐胁迫下的表型分析
1、转基因大豆的获得
1)诱导：挑选健壮、成熟的成熟大豆种子，使用氯气消毒法[100mL次氯酸钠(8％有效浓度)加入5mL浓盐酸]，持续灭菌16-20h，该实验流程在通风橱中进行。灭菌完成后在超净工作台内将种子吹24h散去残留氯气，将装有灭菌大豆的培养皿封口，4℃储存备用。
2)预培养：将灭过菌的种子种脐朝下接种在萌发培养基上，置于25℃培养箱，暗培养1d。
3)农杆菌菌液的制备：将携带有目的基因质粒的农杆菌涂布于相应培养基上进行初次活化，培养48h后收集菌体再次于新的培养基上活化。培养24h后收集菌体于侵染液中，涡旋混匀，分光光度计调整菌液OD＝0.5待用。
4)侵染：将萌发好的大豆，进行划伤处理后，倒入制备好的菌液完成侵染。弃侵染液，再将外植体铺放到垫有滤纸的共培养培养基上，25℃避光共培养3-5d。
5)恢复培养：选取共培养后长势良好无污染的外植体，切去胚轴末端，插入恢复固体培养基上，恢复培养7-10d。
6)筛选培养：将恢复培养后长有丛生芽的外植体接种至筛选培养基上，16h/8h光照/黑暗培养，筛选培养21d。
7)伸长培养：将经过筛选后长势良好的丛生芽，转移至新的伸长培养基上，16h/8h光照/黑暗培养，筛选培养21d。
8)生根培养：待幼芽生长至约5cm时，转移至生根培养基中继续筛选，16h/8h光照/黑暗培养，筛选培养21d。
9)阳性苗检测：采用Bar试纸法直接对转基因植物内有无bar蛋白进行鉴定。
10)炼苗：将经过Bar试纸检测的阳性幼苗移出培养基，洗干净幼苗根上附着的培养基，移载至装盛有营养土的育苗盘中。27℃16h/8h光照/黑暗培养，炼苗3-4周。
2、转基因大豆的鉴定
1)pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP转基因大豆的鉴定
利用PCR的方法对转基因大豆中的Bar抗性基因进行检测，随机选取2-3片转基因大豆叶片，放入离心管内并加入35μLLysis BufferA，95℃加热10min，静置后取上清液1μL作为PCR反应体系的模板。采用引物对Bar-F/R(SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43)及PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，通过PCR对pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP载体携带的抗性基因片段进行检测，得到PCR扩增产物。克隆出Bar基因，表明相关目的基因已经在转基因大豆中表达。
2)pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2转基因大豆的鉴定
利用PCR的方法对转基因大豆进行鉴定，随机选取2-3片转基因大豆叶片，放入离心管内并加入35μLLysis Buffer A，95℃加热10min，静置后取上清液1μL作为PCR反应体系的模板。采用引物对PDK-F/R(SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45)及PrimeSTAR MaxDNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，通过PCR对pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2载体携带的特异性基因片段进行检测，得到PCR扩增产物。克隆出PDK基因，表明相关目的基因已经在转基因大豆中表达。
3)Westernblot检测转基因大豆中SRRM1L蛋白的表达。
提取pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP和pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2转基因大豆的总蛋白，采用SRRM1L定制抗体检测SRRM1L蛋白在转基因大豆中的表达情况。
结果如图10中的A所示，Western blot结果表明AtSRRM1L以及AtSRRM1L(9A)蛋白已经在pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP和pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP转基因大豆成功表达，pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2转基因大豆中的GmSRRM1L.1和GmSRRM1L.2基因已成功敲除，未检测到GmSRRM1L.1和GmSRRM1L.2蛋白。
3、转基因大豆植株在盐胁迫下的表型及生理指标分析
按泥炭土：蛭石：珍珠岩比例为3：1：1的比例把土拌好并浸泡透，然后放入种植盆，留2-3cm高的空隙；挑选健壮、成熟的成熟转基因大豆种子，均匀放入种植盆中，再覆盖1cm左右的营养土后放置16h的光照下进行培养。当幼苗生长至4周大时，对其进行胁迫处理。对于盐胁迫处理，将盆钵中正常培养4周大的幼苗用含200mM NaCl的Hoagland′s营养液灌溉10d，期间定期更换培养液。对转基因大豆植株的表型及相关生理数据进行分析。通过对丙二醛和叶绿素含量等生理指标进行统计，所有实验技术重复和生物学重复各3次。
结果如图10中的B所示，正常情况下，各组植株的生长状态相似，而在盐处理后，野生型植株以及过表达空载植株生长受到抑制，表现出叶片发黄，RNAi-GmSRRM1L.1/.2转基因大豆植株生长受到严重影响，表现出严重的叶片变白甚至枯萎。生长状态最好的为pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP转基因大豆植株，其次为pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP转基因大豆植株，这说明SnRK1对SRRM1L的磷酸化对于植物耐盐性是至关重要的。
如图10中的C所示，正常情况下，各组植株的丙二醛和叶绿素含量等生理指标无明显差异，而在盐处理后，野生型植株、pBWA(V)BS-3HA-GFP、pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L(9A)-GFP和pCAMBIA3301-RNAi-GmSRRM1L.1/.2转基因大豆的丙二醛含量均较正常条件下显著升高，叶绿素含量均较正常条件下降低，生长最好的为pBWA(V)BS-3HA-AtSRRM1L-GFP转基因大豆植株。这说明AtSRRM1L对于提高植物耐盐性是至关重要的。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种可提高植物耐盐性的蛋白AtSRRM1L，其特征在于，所述蛋白AtSRRM1L为下述a)和b)中的任意一种蛋白：
a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
b)在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。
2.权利要求1所述蛋白AtSRRM1L在提高植物耐盐性中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是在植物中过表达蛋白AtSRRM1L或共表达蛋白AtSRRM1L和AtSnRK1。
4.权利要求1所述蛋白AtSRRM1L的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ IDNO.2所示。
5.权利要求4所述编码序列在提高植物耐盐性中的应用。
6.一种含有权利要求4所述编码序列的重组载体。
7.一种含有权利要求4所述编码序列或权利要求6所述重组载体的重组菌。
8.权利要求6所述的重组载体或权利要求7所述的重组菌在提高植物耐盐性中的应用。
9.一种培育具有耐盐性的转基因大豆的方法，其特征在于，将权利要求1所述蛋白AtSRRM1L的编码基因导入大豆中，所述蛋白AtSRRM1L的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转基因大豆为通过根癌农杆菌EHA105诱导获得的转基因大豆。
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| CN202311748905.2A CN117820447A (zh) | 2023-12-19 | 2023-12-19 | 一种可提高植物耐盐性的蛋白AtSRRM1L及其应用 |
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