CN111073905A

CN111073905A - 大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1编码基因的应用

Info

Publication number: CN111073905A
Application number: CN201911269369.1A
Authority: CN
Inventors: 阚贵珍; 廖锡良; 施美琪; 叶茜; 黄方; 喻德跃
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN111073905B

Abstract

本发明公开了大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1编码基因的应用。大豆丝裂原活化蛋白激酶基因GmMMK1在调节大豆耐盐性中的应用。总的说来，本发明所述的大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1可通过基因工程转化到大豆毛状根中，并最终负调控大豆的耐盐性。

Description

大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1编码基因的应用

技术领域

本发明涉及大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1编码基因的应用，属于基因工程领域。

背景技术

大豆富含丰富的蛋白和油分，其中蛋白质含量40％左右，油分含量21％左右，是世界上种植面积最广的油料作物，在2013年，大豆产量占世界植物油种子产量的56％。大豆在满足人类饮食、动物饲料和生物油的需求中起着重要的作用，同时它作为工业产品的原料也被广泛利用，因此全球对大豆的需求量与日俱增。但是，盐害会严重抑制大豆产量和降低品质。据统计，全球近1/3的土地受到盐渍化的影响，在中国，土地盐渍化问题也不容乐观，有7％左右耕地盐渍化严重。一般来说，盐害会抑制大豆种子的萌发和营养生长，阻碍大豆根瘤的形成，在盐度值超过5dS/m时，大豆的产量就会明显降低。培育大豆耐盐品种则成为应对盐害有效的策略之一。

GmMMK1是一种大豆丝裂原活化蛋白激酶，其所属MAPK基因家族。植物对盐胁迫的等逆境的应答受到复杂的MAPK级联的控制，但具体机制仍不很清楚，特别对于其他非模式植物，MAPK级联在植物应答盐胁迫中的作用仍不是很清楚。我们利用分子手段，构建了过表达载体，发现GmMMK1会负调控耐盐性，具体表现在过表达GmMMK1会导致过表达毛状根大豆植株的盐敏感性，在拟南芥中的异源表达会导致拟南芥在盐胁迫下的发芽率下降。这一基因功能的发现不仅揭示了大豆耐盐机制的新途径，同时可以加快大豆耐盐品种育种进程。

发明内容

本发明的目的在于公开大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1的抗逆性基因工程应用，该基因可作为目的基因导入大豆毛状根中，GmMMK1通过调节Na⁺稳态负调控大豆的耐盐性，与此同时GmMMK1会影响大豆ABA信号转导，进而影响盐胁迫下大豆植株的根系形态，导致大豆植株的耐盐性改变。除此之外，我们还发现异源表达GmMMK1会导致拟南芥在盐处理下的发芽率下降，表明该基因还有调控植物萌发期发芽率的潜力。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

大豆丝裂原活化蛋白激酶基因GmMMK1在调节大豆耐盐性中的应用。

过表达大豆丝裂原活化蛋白激酶基因GmMMK1的重组表达载体在调节大豆耐盐性中的应用。

过表达该基因，能够减弱大豆的耐盐性。

有益效果

GmMMK1是一种大豆丝裂原活化蛋白激酶，MAPK家族在拟南芥和水稻等模式作物中与耐盐性高度相关，且耐盐信号的转导和ABA通路密切相关。在大豆中，我们首次发现了一个MAPK家族基因，GmMMK1，与大豆耐盐性负相关。GmMMK1受盐胁迫诱导表达，且在盐敏感材料和耐盐材料中的表达量不尽相同。GmMMK1通过调节Na⁺稳态，调节根系形态负调控大豆的耐盐性，与此同时GmMMK1会影响盐胁迫下的ABA信号通路。可见，GmMMK1可以作为调节大豆耐盐性的靶点，用于大豆的耐盐性改造。

附图说明

图1.PCR克隆GmMMK1后琼脂糖凝胶电泳图。Marker：DL5000

图2. 150mM NaCl盐胁迫诱导后，GmMMK1的相对表达量。(A)幼苗期(B)萌发期在150mM盐胁迫下GmMMK1表达的模式。分别在150mM NaCl处理后的2、4、24和48小时取样。(C)盐敏感品种NJAU_002和耐盐品种NJAU_101进行48h盐处理后的发芽状况。

图3.正常生长和NaCl处理情况下，转GmMMK1的嵌合体和其空载对照的生长状况。

(A)75mM处理4天之后的转基因嵌合体和空载对照。其中MMK1-OE代表过表达GmMMK1的大豆毛状根，对照是带有空载体pMDC83的大豆毛状根。(B)在150mM NaCl处理下检测生存情况，从前视图和俯视图分别进行拍摄。

图4.转GmMMK1的嵌合体和其空载对照的形态学及生理指标变化

(A)用0mM或75mM NaCl处理7天的转基因植株和对照的叶片的SPAD值。(B)用0mM或75mM NaCl处理7天后，GmMMK1-OE和对照毛状根的鲜重，(C)GmMMK1-OE和对照根的鲜重和(D)Na⁺含量。(C)GmMMK1-OE毛状根和对照根的交叉数。(F)由根扫描仪拍摄的GmMMK1-OE毛状根及其对照根的根系形态。

图5.过表达GmMMK1的转基因拟南芥萌发期的耐盐性。(A)不同浓度NaCl处理下野生型和转基因拟南芥种子之间的发芽率差异。OE-11、OE-22、OE-51分别是三个独立的株系。(B)在3种不同浓度的NaCl中，一周内每天的发芽率。

图6.GmMMK1与ABA受体蛋白PYL4互作。GmMMK1在酵母中与含有GAL4结合域的BD载体融合，而GmPYL4在酵母中与GAL4激活域AD载体融合。将等量的酵母克隆接种在SD-Leu-Trp和SD-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal选择性平板上检测互作。

图7.过表达毛状根(GmMMK1-OE)PCR检测。M：Marker DL2000，P：阳性质粒，ck：阴性毛状根。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

1)大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1的克隆

以大豆参考基因组W82为取材对象，取其根，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(Total RNA Kit(天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照日本TaKaRa公司提供的反转录试剂盒(TaKaRa Primer Script^TMRT reagent kit，日本)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，获得W82的cDNA。

从NCBI数据库和Phytozome v12大豆数据库，找到GmMMK1所对应的基因(Glyma.18g236800，GeneID:100815697)，根据数据库提供的核苷酸序列设计特异引物引物，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，从W82的cDNA的基因编码区(CDS)序列扩增基因，PCR克隆后随后进行PCR产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序，测序后获得具有完整编码区的长度为2454bp的大豆GmMMK1基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQID NO.1，大小为2454bp(图1)，核苷酸序列和氨基酸序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。

2)GmMMK1在持续盐胁迫诱导下的表达分析

我们使用不同耐盐性的两种极端材料，调查GmMMK1的诱导表达。150mM NaCl胁迫分别处理盐敏感材料NJAU_002以及耐盐材料NJAU_101。在芽期和苗期的2h，4h，24h，和48h后，取下胚轴或者叶片液氮速冻后于-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以上述2个材料2个时期所取样获得的总RNA为模板，反转为cDNA。GmMMK1荧光定量引物序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，检测GmMMK1基因受盐胁迫的表达量变化以大豆组成内参基因Tubulin作为内部参照，引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.7。进行实时荧光定量PCR反应(Real-timeRT-PCR)。我们发现，敏感种质NJAU_002在发芽阶段和苗期对盐敏感，对盐胁迫具有更高和更快的响应。但是，盐处理后的性能NJAU_101正好相反。更有趣的是，在每个时间点，敏感和耐性材料的表达方式都相反。表明GmMMK1受盐胁迫诱导表达，且在盐敏感材料和耐盐材料中的表达量不尽相同。

3)筛选GmMMK1互作蛋白

使用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12利用重组法构建酵母双杂用pGBKT7载体。所构建载体利用根文库进行酵母双杂交实验，筛选得到互作蛋白GmPYL4。然后进行酵母互转验证，验证证实GmMMK1与GmPYL4存在互作关系。

实施例2基因GmMMK1的基因工程应用

1)植物表达载体的构建

构建过表达载体时，将GmMMK1基因序列与Invitrogen公司的

Technology with Clonase^TMII试剂盒中的pDONR221载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，引物序列见SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，具体的PCR过程与步骤1)相同，获得入门克隆。接着将得到的入门克隆与Invitrogen公司开发的目的表达载体pMDC83进行重组交换，得到pMDC83-GmMMK1植物过量表达表达载体，植物转化载体pMDC83含有2x 35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmMMK1在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株K599中。同时将空载pMDC83也转化到K599中，作为空载对照。

2)转基因植株的获得

利用Kereszt等人(2007)提出的大豆毛状根转化方法，将步骤2)获得的分别含pMDC83-GmMMK1以及空载对照的根癌农杆菌菌株K599菌液注射到7天大大豆幼苗的子叶节下方，至于恒温光照培养箱中，12h光照，12h黑暗培养，并保持高湿度，2-3周后毛状根会从注射部位长出，当有5-10cm时，减掉幼苗主根，并置于1/2Hoagland营养液中培养5天，获得的大豆幼苗嵌合体，包括非转基因部分的地上部和转基因的毛状根。将具有过表达毛状根的嵌合体称之为GmMMK1-OE，其空载对照为Control。为检测是否为阳性毛状根，利用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR检测。过表达毛状根检测引物序列见SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14，PCR阳性毛状根检测胶图见图7。利用沾花法(floral dipping)将pMDC83-GmMMK1的农杆菌侵染转化拟南芥，获得转化后的阳性T2代过表达拟南芥。

在大豆毛状根长到合适大小时，分别用H₂O和75mM NaCl分别处理。在0mM NaCl存在下，转基因发根与其对照之间没有发现明显差异。在暴露于NaCl后，与对照植物相比，GmMMK1-OE植物呈现出不健康的叶子，平均叶绿素含量较低，平均根鲜重降低，根系的根长、侧根数、交叉数也明显下降。同时，GmMMK1-OE毛状根中的平均Na+含量明显高于对照。这些结果表明，GmMMK1-OE植物比对照植物对盐胁迫表现出更高的敏感性。除此之外，在150mMNaCl中暴露2天后，GmMMK1-OE植物表现出明显的盐害症状，例如严重萎阉，叶片变白然后开始死亡。与转基因植物相比，对照大豆表现出更强的生命力。相同的载体35S::GmMMK1转化了拟南芥观察异源表达后的表型变化。在没有盐胁迫的时候，携带GmMMK1的拟南芥株系显示出与WT相同的发芽率。当被不同浓度盐处理之后，携带GmMMK1的拟南芥发芽率显着下降更加明显(图3、图4)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1编码基因的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1122

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atggctcttg agtctgctcc tgcttcagct gacatcagag gagttcacac tcatggtgga 60

cgctatgttc agtacaatat ctatggaaac ctctttgagg tctctaggaa gtatgttcct 120

cctattcgcc ctgtgggaag aggagcatat ggtattgttt gtgctgctgt aaatgcagag 180

acacgtgaag aagttgccat taagaaggtt ggcaatgcat ttgacaacag aatagatgcc 240

aaaaggactc tacgagaaat taaacttctt cggcacatgg atcatgaaaa tgtgatagcc 300

cttaaagaca ttatacgacc accacagagg gataacttca atgatgtgta cattgtttat 360

gagttaatgg atactgatct gcatcaaata attcgatcca atcaacaatt gactgatgat 420

cattgtcggt attttcttta tcagttgcta cgaggactca aatatgtaca ctcagcaaat 480

gttctgcacc gtgatctaaa gcctagcaac ttgctactga atgccaactg tgatcttaag 540

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gttactcggt ggtaccgagc tccagagtta cttcttaatt gctcagaata tactgctgcc 660

atcgatatat ggtctgtggg ttgcatcctt ggtgaaatca taacaagaca acccctattt 720

ccggggaaag attatgttca tcagctcagg ctgattacag agctcatagg ctcacctgat 780

gaccatagcc ttggatttct acgaagtgat aatgctcgta gatatgtgag acagcttcca 840

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<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

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1 5 10 15

Thr His Gly Gly Arg Tyr Val Gln Tyr Asn Ile Tyr Gly Asn Leu Phe

20 25 30

Glu Val Ser Arg Lys Tyr Val Pro Pro Ile Arg Pro Val Gly Arg Gly

35 40 45

Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ala Ala Val Asn Ala Glu Thr Arg Glu Glu

50 55 60

Val Ala Ile Lys Lys Val Gly Asn Ala Phe Asp Asn Arg Ile Asp Ala

65 70 75 80

Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Met Asp His Glu

85 90 95

Asn Val Ile Ala Leu Lys Asp Ile Ile Arg Pro Pro Gln Arg Asp Asn

100 105 110

Phe Asn Asp Val Tyr Ile Val Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His

115 120 125

Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gln Leu Thr Asp Asp His Cys Arg Tyr

130 135 140

Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Val His Ser Ala Asn

145 150 155 160

Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn

165 170 175

Cys Asp Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Thr Ser Glu

180 185 190

Thr Asp Phe Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro

195 200 205

Glu Leu Leu Leu Asn Cys Ser Glu Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Ile Trp

210 215 220

Ser Val Gly Cys Ile Leu Gly Glu Ile Ile Thr Arg Gln Pro Leu Phe

225 230 235 240

Pro Gly Lys Asp Tyr Val His Gln Leu Arg Leu Ile Thr Glu Leu Ile

245 250 255

Gly Ser Pro Asp Asp His Ser Leu Gly Phe Leu Arg Ser Asp Asn Ala

260 265 270

Arg Arg Tyr Val Arg Gln Leu Pro Gln Tyr Pro Arg Gln Gln Phe Ala

275 280 285

Thr Arg Phe Pro Ser Met Ser Pro Gly Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys

290 295 300

Met Leu Val Phe Asp Pro Asn Arg Arg Ile Thr Val Lys Glu Ala Leu

305 310 315 320

Cys His Pro Tyr Leu Ala Pro Leu His Asp Ile Asn Glu Glu Pro Val

325 330 335

Cys Val Arg Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln Pro Ser Phe Thr Glu

340 345 350

Glu Asp Ile Lys Glu Leu Ile Trp Arg Glu Ser Val Leu Phe Asn Pro

355 360 365

Asp Pro Pro Ile Tyr

370

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggctcttg agtctgctcc 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaataaata ggtggatcag g 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 6

gaccatatat cgatggcagc a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctcgttcga attcgctttt tg 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caactgtctt gtcacttggc at 22

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtcgact ctagaggatc cgccaccatg gctcttgagt ctgctcctgc tt 52

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tctcagagga ggacctgcat atgtctgctg ctgtgtctgc aacca 45

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<400> 12

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tcagtaacat agatgacacc gc 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcaataaata ggtggatcag g 21

Claims

1.大豆丝裂原活化蛋白激酶基因GmMMK1在调节大豆耐盐性中的应用。

2.过表达大豆丝裂原活化蛋白激酶基因GmMMK1的重组表达载体在调节大豆耐盐性中的应用。