CN112011522A - MxRHEL蛋白及其编码基因的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MxRHEL蛋白及其编码基因的新用途。所述MxRHEL蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：本发明的MxRHEL蛋白可与MxMPK4蛋白互作，且具有E3泛素连接酶活性。

Description

MxRHEL蛋白及其编码基因的新用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及MxRHEL蛋白及其编码基因的新用途。

背景技术

铁(Fe)是植物生长所需重要微量元素，在包括光合作用、呼吸作用、固氮作用及核酸合成等在内的许多代谢过程中，铁都是参与其中的酶和蛋白的重要组成成分。植物在感知缺铁胁迫时，会通过各种信号转导途径将缺铁胁迫的信号传到植物体内，进而引起细胞内发生一系列蛋白质翻译后修饰过程，如泛素化、磷酸化及乙酰化等，这在植株生长发育各阶段及应答外界环境变化等多方面起着重要的调控作用。

蛋白质是植物体内一类非常重要的生命大分子化合物，它的翻译后修饰在生命体的各个生长发育阶段起着非常重要的调控作用，是一切生命活动正常运行的基础。泛素化也是蛋白质翻译后修饰的一种重要类型，能够广泛参与植物体内多种生理过程，如免疫防御、逆境应答、信号及激素传导等。参与泛素化过程主要有三种酶：E1泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme)、E2泛素结合酶(ubiquitin conjugating protein)和E3泛素连接酶(ubiquitin ligase)。E3泛素连接酶主要分为四种类型：HECT(Homologous toE6-associated protein C-Terminus)，RING/U-Box(Really Interesting New Gene/U-Box)，SCF复合体(a complex of Skp1，CDC53 and F-box protein)和APC复合体(anaphase-promoting complex)。

在泛素化过程中，E3泛素连接酶决定了底物的特异性，在植物响应逆境胁迫及生长发育过程中发挥重要的功能。例如，OsHRZ1和OsHRZ2作为水稻中的E3泛素连接酶，能够负调控水稻缺铁逆境应答；在拟南芥中，Fe²⁺转运体IRT1的亚细胞定位及降解受到E3泛素连接酶IDF1介导的泛素化调控，进而影响拟南芥对铁及其他金属元素的吸收；此外，E3泛素连接酶在信号通路的调控中也有所报道。在ABA存在的情况下，拟南芥的E3泛素连接酶KEG能够泛素化降解响应ABA信号的转录因子ABI5，而另一种E3泛素连接酶SDIR1也能通过调节脱落酸(ABA)的生物合成或信号通路来赋予应激耐受性。

发明内容

本发明的目的是提供MxRHEL蛋白质或与MxRHEL蛋白质相关生物材料的新用途。

本发明提供了MxRHEL蛋白质在与MxMPK4蛋白质互作中的应用。

本发明还提供了MxRHEL蛋白质在检测MxMPK4蛋白质中的应用。

本发明还提供了与MxRHEL蛋白质相关生物材料在制备E3泛素连接酶中的应用。

上述应用中，所述MxRHEL蛋白质来源于苹果属小金海棠(Malus xiaojinensisChenget Jiang)，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

所述MxMPK4蛋白质是如下e)或f)或g)或h)的蛋白质：

e)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

f)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

g)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

h)与序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

上述MxRHEL蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述MxRHEL蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述MxRHEL蛋白质中可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述MxRHEL蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述MxRHEL蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同源性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述MxRHEL蛋白质中，所述75％或75％以上的同一性可为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。

上述应用中，所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码MxRHEL蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码MxRHEL蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码MxRHEL蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码MxRHEL的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码MxRHEL的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码MxRHEL且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述生物材料中，所述同一性指与天然核酸序列的序列相似性，其包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高、85％或更高，90％或更高，95％或更高、96％或更高、97％或更高、或98％或更高、99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码MxRHEL的核酸分子的表达盒(MxRHEL基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达MxRHEL的DNA，该DNA不但可包括启动MxRHEL转录的启动子，还可包括终止MxRHEL转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述MxRHEL基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体，如pGEX-4T-1-GST载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明最后还提供了一种E3泛素连接酶的制备方法。

本发明提供的E3泛素连接酶的制备方法包括如下步骤：使MxRHEL蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到E3泛素连接酶；所述生物为微生物、植物或非人动物。

上述方法中，使MxRHEL蛋白质的编码基因在生物中进行表达的方法包括如下步骤：将MxRHEL蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述MxRHEL蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述MxRHEL蛋白质。

上述方法中，所述MxRHEL蛋白质的编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

进一步的，所述MxRHEL蛋白质的编码基因通过重组载体导入受体微生物。所述重组载体为将序列1所示的DNA分子插入表达载体的酶切位点之间后得到的载体。

更进一步的，所述重组载体为将序列1所示的DNA分子插入pGEX-4T-1-GST载体(pGEX-4T-1-GST载体的核苷酸序列如序列表中的序列5所示)的BamHI和SalI酶切位点之间后得到的载体。所述重组载体表达带GST标签的MxRHEL蛋白(MxRHEL-GST蛋白)。

上述方法中，所述微生物或所述受体微生物为B1)-B4)中的任一种：

B1)原核微生物；

B2)肠杆菌科细菌；

B3)埃希氏菌属细菌；

B4)大肠杆菌。

在本发明的一个具体实施例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明从苹果属小金海棠中克隆得到MxRHEL基因，进一步研究发现MxRHEL基因编码的MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白在活体和离体条件下都存在相互作用，同时证明了MxRHEL具有E3泛素连接酶的活性，并且MxRHEL能够受到缺铁胁迫诱导。相关研究结果为深入揭示果实缺铁响应的分子基础提供了重要线索。

附图说明

图1为MxRHEL在不同组织中的表达水平。M.xiaojinensis代表小金海棠；M.baccata代表山定子。

图2为MxRHEL在缺铁处理下的基因表达变化。

图3为MxRHEL与MxMPK4的酵母双杂交试验。

图4为MxRHEL蛋白原核诱导体外表达。0h代表诱导前；4h代表诱导4h时的蛋白溶液；上清为诱导后菌液破碎离心后收集的上清液；沉淀为诱导后菌液破碎离心后收集的菌体沉淀；复性后为下述实施例中的复性后样品。

图5为MxMPK4蛋白原核诱导体外表达。4h代表诱导4h时的蛋白溶液；复性后为下述实施例中的复性后样品。

图6为MxRHEL与MxMPK4的Pull-Down试验。

图7为MxRHEL与MxMPK4的BiFC试验。

图8为MxRHEL蛋白分段与MxMPK4蛋白的酵母双杂交试验。

图9为MxRHEL蛋白的自泛素化试验。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

下述实施例中完全营养液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：33.00g/L NH₄NO₃，38.00g/L KNO₃，3.40g/L KH₂PO₄，7.40g/L MgSO₄·7H₂O，8.80g/L CaCl₂·2H₂O，2.23g/L MnSO₄·4H₂O，0.625g/L H₃BO₅，0.083g/L KI，0.0025g/L CuSO₄·5H₂O，0.865g/L ZnSO₄·7H₂O，0.0025g/L CoCl₂·6H₂O，0.025g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.05g/L烟酸，0.05g/L盐酸吡哆素，0.4g/L盐酸硫胺素，0.2g/L甘氨酸，10g/L肌醇，4.211g/L EDTA-NaFe。

下述实施例中的泛素分子Ubi(Flag-Ubi)、E1泛素激活酶、E2泛素结合酶均是Boston Biochem的产品，ATP是北京欣汇天东方科技有限公司的产品。

下述实施例中的MxRHEL蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示，其编码基因序列如序列表中的序列1所示。

下述实施例中的MxMPK4蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列4所示，其编码基因序列如序列表中的序列3所示。

下述实施例中的YFP^N载体和YFP^C载体均记载于文献“An ethylene responsefactor(MxERF4)functions as a repressor of Fe acquisition in Malusxiaojinensis”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、MxRHEL蛋白及其编码基因的获得与MxRHEL在不同组织及缺铁胁迫下的表达情况

一、MxRHEL蛋白及其编码基因的获得

对小金海棠的根部进行RNA提取，反转录成cDNA后用actin基因进行检验，确认cDNA质量合格后采用MxRHEL-F和MxRHEL-R引物进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：

MxRHEL-F：5'-ATGCTAAAGAGCAAAGAAAG-3'；

MxRHEL-R：5'-ATATATATTTGTTATATTGCC-3'。

对PCR产物进行测序，测序结果表明：PCR得到大小为690bp的片段，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为MxRHEL基因，MxRHEL基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列2所示，将序列2所示的氨基酸序列命名为MxRHEL蛋白。

二、MxRHEL在不同组织及缺铁胁迫下的表达情况

为了研究MxRHEL在不同组织及缺铁胁迫下的表达情况，利用Primer 5软件设计定量引物，使用qRT-PCR技术对其进行分析。具体步骤如下：

1、MxRHEL在不同组织中的表达情况

分别提取小金海棠和山定子的根、茎、叶的总RNA，反转录成cDNA。然后用MxRHEL基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析MxRHEL基因在小金海棠和山定子的根、茎、叶中的表达情况。以actin为内参基因。引物序列如下：

MxRHEL-F：5'-ATGCTAAAGAGCAAAGAAAG-3'；

MxRHEL-R：5'-ATATATATTTGTTATATTGCC-3'。

actin-F：5'-TGGTGAGGCTCTATTCCAAC-3'；

actin-R：5'-TGGCATATACTCTGGAGGCT 3'。

结果表明，MxRHEL在小金海棠和山定子的根、茎、叶中均有表达，在叶片中表达量最高(图1)。

2、MxRHEL在缺铁胁迫下的表达情况

1)将小金海棠(M.xiaojinensis)组培苗在继代培养基中培养一个月左右后(此时幼苗生长健壮且木质化程度较弱)移栽至生根培养基培养，培养10天左右长出根原基，约一个半月根系生长较为旺盛时将幼苗移栽到完全营养液中进行水培，期间每周及时更换新的营养液。进行缺铁处理时，将小金海棠分成两组，一组用完全营养液作为对照，另一组用不含铁素(不含EDTA-NaFe)的营养液进行处理，于培养0d、2d、4d、6d、9d时分别取样，每次每组各取三颗植株作为生物学重复，用吸水纸吸干水分后利用液氮冻存于锡箔纸中，于-80℃冰箱保存。

2)分别检测步骤1)中获得的两组实验材料中的MxRHEL基因在缺铁处理不同时间后的表达情况。

结果表明：在缺铁处理前期，MxRHEL的表达量逐渐升高，在缺铁6d时达到最高，随后明显下降，缺铁9d时MxRHEL的表达量则低于对照(+Fe)水平(图2)。

实施例2、MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白互作

一、酵母双杂交试验验证MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白的互作

为了确认MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白的互作关系，分别构建pGADT7-MxRHEL与pGBKT7-MxMPK4双杂载体，进行MxRHEL与MxMPK4的酵母双杂交试验。具体步骤如下：将MxRHEL蛋白的编码基因序列构建到AD(pGADT7)载体上，得到pGADT7-MxRHEL；将MxMPK4蛋白的编码基因序列构建到BD(pGBKT7)载体上，得到pGBKT7-MxMPK4。将阴性对照与pGADT7-MxRHEL、pGBKT7-MxMPK4组合分别转入酵母感受态Y2H Gold，涂布于酵母二缺板，置于30℃培养箱内生长2-3天，待二缺板上长出菌斑后，将酵母菌斑在四缺板上进行四个浓度梯度的稀释，置于30℃培养箱内生长3-5天。

结果表明：pGADT7-MxRHEL与pGBKT7-MxMPK4的组合在四缺板中的四个浓度梯度菌液均能够生长，但是空载pGADT7与BD-MxMPK4的组合在四缺的酵母板上不生长(图3)。因此说明pGBKT7-MxMPK4无酵母自主激活活性，且AD-MxRHEL与BD-MxMPK4在体外互作。

二、Pull-Down试验验证MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白的互作

1、体外原核表达诱导MxRHEL蛋白

1)重组载体的获得

将序列1所示的DNA分子(MxRHEL基因全长)插入pGEX-4T-1-GST载体(pGEX-4T-1-GST载体的核苷酸序列如序列表中的序列5所示)的BamHI和SalI酶切位点之间，得到重组载体。重组载体表达带GST标签的MxRHEL蛋白(MxRHEL-GST蛋白)。

2)重组菌的获得

用氯化钙化学转化法将步骤1)中得到的重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，用含有氨苄霉素(100μg/ml)的LB培养基对重组菌进行筛选培养，挑取单菌落，提取质粒并进行菌落PCR验证。

3)MxRHEL蛋白的获得

挑取单菌落接入含有氨苄霉素(100μg/ml)的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物接种于50ml含有氨苄霉素(100μg/ml)的LB培养基，37℃、220rpm摇床振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8左右，再向培养体系中加入IPTG(终浓度3mM)，37℃、220rpm条件下再培养4小时，得到诱导后菌液。取诱导后菌液1mL留存，将剩余菌液4℃、7000rpm离心4min，弃上清；加适量Buffer重悬菌体沉淀，然后加10μL/mL的PMSF，涡旋震荡混匀，再超声波破碎(超声6s，间歇9s，60-90个循环)，破碎完成后4℃、7000rpm离心25min，分别收集上清和沉淀；将沉淀用梯度尿素(8M-6M-4M-2M-0M，PBS)复性后得到的蛋白溶液即为复性后样品，-80℃保存。

上清、沉淀和复性后样品的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图4所示。从图中可以看到：沉淀和复性后样品中均含有大小为50kDa的MxRHEL-GST蛋白。

2、体外原核表达诱导MxMPK4蛋白

1)重组载体的获得

将序列3所示的DNA分子(MxMPK4基因全长)插入pET32a-His载体(pET32a-His载体的核苷酸序列如序列表中的序列6所示)的BamHI和SalI酶切位点之间，得到重组载体。重组载体表达带His标签的MxMPK4蛋白(MxMPK4-His蛋白)。

2)重组菌的获得

用氯化钙化学转化法将步骤1)中得到的重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，用含有氨苄霉素(100μg/ml)的LB培养基对重组菌进行筛选培养，挑取单菌落，提取质粒并进行菌落PCR验证。

3)MxMPK4蛋白的获得

挑取单菌落接入含有氨苄霉素(100μg/ml)的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物接种于50ml含有氨苄霉素(100μg/ml)的LB培养基，37℃、220rpm摇床振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8左右，再向培养体系中加入IPTG(终浓度3mM)，37℃、220rpm条件下再培养4小时，得到诱导后菌液。取诱导后菌液1mL留存，将剩余菌液4℃、7000rpm离心4min，弃上清；加适量Buffer重悬菌体沉淀，然后加10μL/mL的PMSF，涡旋震荡混匀，再超声波破碎(超声6s，间歇9s，60-90个循环)，破碎完成后4℃、7000rpm离心25min，分别收集上清和沉淀；将沉淀用梯度尿素(8M-6M-4M-2M-0M，PBS)复性后得到的蛋白溶液即为复性后样品，-80℃保存。

复性后样品的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图5所示。从图中可以看到：复性后样品中含有大小为60kDa的MxMPK4-His蛋白。

3、利用体外诱导的蛋白进行Pull-Down试验

利用Pull-Down试验验证上述原核表达诱导得到的MxMPK4蛋白和MxRHEL蛋白的相互作用。具体步骤如下：

(1)将原核诱导的两种蛋白溶液(MxRHEL-GST蛋白和MxMPK4-His蛋白)混匀，4℃摇床中赋予5小时；

(2)将蛋白混养转入His纯化柱内，4℃孵育5小时；

(3)样品上柱，用吊瓶针头控制流速，10倍柱体积/小时；

(4)使用15倍柱体积的binding buffer冲洗柱子，去除杂蛋白；

(5)使用Elution buffer洗脱，收集洗脱液；

(6)加上样缓冲液，Western Blot检测。

结果证明：MxRHEL蛋白确实能与MxMPK4蛋白在体外互作(图6)。

三、BiFC试验验证MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白的互作

利用Pull-Down试验验证MxMPK4蛋白和MxRHEL蛋白的相互作用。具体步骤如下：

1、配置MMA缓冲液：溶剂为水，溶质及浓度如下：MgCl₂ 10mM、MES 10mM、乙酰丁香酮100mM。

2、将RHEL-YFP^N(将序列1所示的MxRHEL插入YFP^N载体中，得到重组载体RHEL-YFP^N)和MxMPK4-YFP^C(将序列3所示的MxMPK4插入YFP^C载体中，得到重组载体MxMPK4-YFP^C)分别转入农杆菌GV3101，菌液PCR鉴定无误后，摇菌至OD₆₀₀为1.0左右。

3、用MMA缓冲液重悬至OD₆₀₀为0.8。

4、重悬后的两份菌液各10mL混合，于黑暗处静置2-3h。

5、将混合后的菌液注射烟草叶片叶片背面，一手托住叶片，为针注射提供一个着力点，另只手轻推注射器，用力不能过猛，不要把叶片打穿，最好一针就能浸润完整片叶，最多两针要打完整片叶，且浸润后留下痕迹越浅越好。选择的注射点在叶片的两个主叶脉之间，注射烟草后避光一晚。

6、移至光下培养3d，观察荧光。

结果表明：MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白在植物体内互作(图7)。

四、分段的MxRHEL蛋白与MxMPK4蛋白酵母双杂交试验

为了进一步探究MxRHEL蛋白的互作功能域。具体步骤如下：将序列1第1-320位所示的MxRHEL基因信号结合区与序列1第327-657位所示的MxRHEL基因RING型结构域分别构建在pGADT7载体上，与pGBKT7-MxMPK4进行酵母双杂交试验。

结果表明，分段后的MxRHEL均不能与MxMPK4互作，只有完整的MxRHEL才能与MxMPK4互作。因此，完整的MxRHEL是其与MxMPK4互作所必须的(图8)。

实施例3、MxRHEL蛋白在作为E3泛素连接酶中的应用

自泛素化试验验证MxRHEL蛋白的E3泛素连接酶活性。

利用实施例2中成功诱导的MxRHEL-GST蛋白，配制体外泛素化试验所需的缓冲液，根据缓冲液中的组分不同分成如下各组：

试验组1(30μL)：5-8μL MxRHEL-GST蛋白溶液、2μL E2泛素结合酶(0.1-1mM)、1μLFlag-Ubi(10mg/ml)、1.5μL Tris-HCl(50mM，pH＝7.5)、1.5μL MgCl₂(5mM)、0.12μL ATP(2mM)、0.06μL DTT(2mM)，H₂O补足至30μL。

试验组2：5-8μL MxRHEL-GST蛋白溶液、4μL E1泛素激活酶(50mM)、1μL Flag-Ubi(10mg/ml)、1.5μL Tris-HCl(50mM，pH＝7.5)、1.5μL MgCl₂(5mM)、0.12μL ATP(2mM)、0.06μL DTT(2mM)，H₂O补足至30μL。

试验组3：5-8μL MxRHEL-GST蛋白溶液、4μL E1泛素激活酶(50mM)、2μL E2泛素结合酶(0.1-1mM)、1μL Flag-Ubi(10mg/ml)、1.5μL Tris-HCl(50mM，pH＝7.5)、1.5μL MgCl₂(5mM)、0.12μL ATP(2mM)、0.06μL DTT(2mM)，H₂O补足至30μL。

MxRHEL-GST蛋白溶液的具体制备方法如下：将实施例2二1的步骤2)中的重组菌接种于含有氨苄霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃、220rpm摇床振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8，得到OD₆₀₀值为0.6-0.8的菌液；向50ml OD₆₀₀值为0.6-0.8的菌液中加入IPTG(终浓度3mM)进行诱导培养，37℃、220rpm条件下诱导培养4小时，得到诱导后菌液；将诱导后菌液超声破碎(超声6s，间歇9s，60-90个循环)后离心(4℃、7000rpm离心25min)，收集沉淀(含有MxRHEL-GST蛋白的包涵体)；将沉淀用梯度尿素(8M-6M-4M-2M-0M，PBS)复性后得到的蛋白溶液即为上述试验组1、2、3中加入的MxRHEL-GST蛋白溶液。

将各试验组在30℃条件下反应过夜后用Anti-GST标签抗体(康为世纪有限公司)进行Western检测。

结果显示：在E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、MxRHEL-GST蛋白同时存在的情况下，MxRHEL-GST蛋白会进行自身泛素化出现一条弥散的条带，而缺少任何一种成分则不能用Anti-GST标签抗体检测到泛素化条带(图9)，因此证明MxRHEL蛋白具有E3泛素连接酶活性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的试验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>中国农业大学

<120>MxRHEL蛋白及其编码基因的新用途

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>690

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgggtgctc tttgctgctg tccttgcggc gaggaattcg aagagtatgc gctgccgagc 60

aattcaattt ataggcattg ctcatgcctg agatacttct tccaccagct attcactggg 120

tataatgcgc catttcaaag gcttgatgga cgagcacctt cattacctat tcaaggggct 180

actttggcat catccggagt aggcacaaca ctacagaata atcccttgaa tgatactcag 240

ctctcagttt ccaggccaac ccccttcgat gctgatcaga gatactcgcg tttgcagcgt 300

gatggcttgg tctcaaggcg cgagaagtca atgactcatt tgcaagaaga tgcacaacaa 360

ctgagaaggg gcagttctgg caccgaatcc ctgggctttg ggaagaaatg gaatggagat 420

gatacagaag aagattgtac gtttggccaa tctgagacct tggaaaaggc ttcggcaaca 480

aaactcgcat atggactaac ttatgtgcaa ccatcttctg aagatgaaga tgtctgccct 540

acatgtctgg atgaatacac ttcagaaaat ccaaaaatca taacgagatg ttcccatcat 600

tttcaccttg gctgtattta tgaatggttg gaaagaagcg aaagctgtcc aatttgtggc 660

aaggagatgg agttctgtga aagcccttaa 690

<210>2

<211>229

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Gly Ala Leu Cys Cys Cys Pro Cys Gly Glu Glu Phe Glu Glu Tyr

1 5 10 15

Ala Leu Pro Ser Asn Ser Ile Tyr Arg His Cys Ser Cys Leu Arg Tyr

20 25 30

Phe Phe His Gln Leu Phe Thr Gly Tyr Asn Ala Pro Phe Gln Arg Leu

35 40 45

Asp Gly Arg Ala Pro Ser Leu Pro Ile Gln Gly Ala Thr Leu Ala Ser

50 55 60

Ser Gly Val Gly Thr Thr Leu Gln Asn Asn Pro Leu Asn Asp Thr Gln

65 70 75 80

Leu Ser Val Ser Arg Pro Thr Pro Phe Asp Ala Asp Gln Arg Tyr Ser

85 90 95

Arg Leu Gln Arg Asp Gly Leu Val Ser Arg Arg Glu Lys Ser Met Thr

100 105 110

His Leu Gln Glu Asp Ala Gln Gln Leu Arg Arg Gly Ser Ser Gly Thr

115 120 125

Glu Ser Leu Gly Phe Gly Lys Lys Trp Asn Gly Asp Asp Thr Glu Glu

130 135 140

Asp Cys Thr Phe Gly Gln Ser Glu Thr Leu Glu Lys Ala Ser Ala Thr

145 150 155 160

Lys Leu Ala Tyr Gly Leu Thr Tyr Val Gln Pro Ser Ser Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Val Cys Pro Thr Cys Leu Asp Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Pro Lys

180 185 190

Ile Ile Thr Arg Cys Ser His His Phe His Leu Gly Cys Ile Tyr Glu

195 200 205

Trp Leu Glu Arg Ser Glu Ser Cys Pro Ile Cys Gly Lys Glu Met Glu

210 215 220

Phe Cys Glu Ser Pro

225

<210>3

<211>1122

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atggactcga gctctgcttc agcaggtgac cacaacatca gaggggtgct gacccacggc 60

ggacgctacg ttcagtacaa tgtctatggc aacatctttg aagtttccag gaagtacgtc 120

ccgccccttc ggcccgtcgg cagaggtgct tacggtatcg tctgtgctgc tgtcaacgct 180

gaggctcgtg aggaggttgc cattaagaag attggtaatg catttgacaa cagaatagat 240

gccaaaagga cyttacgaga aattaaactt cttcggcaca tggatcatga aaatgttatt 300

gccatcaaag ayatcatacg gcctccacag aaggagaact tcaatgatgt ctacattgtt 360

tatgaattaa tggacactga tcttcatcag attatacggt ccaaccaacc tttgaatgat 420

gatcattgtc ggtactttct ktatcagttg ttacgtgggc tcaaatatgt acattcagct 480

ggtgttttgc atcgtgattt aaagcccagc aatttgttca tgaatgcaaa ttgtgacctt 540

aagattggag attttggtct tgccaggaca acatctgaaa ctgatttcat gactgagtat 600

gttgttactc gttggtaccg tgcaccagaa ttgctgctta attgttcgga gtacactgca 660

gcaattgata tatggtctgt aggttgcatt ctaggtgaaa tcatgaccag aaaaccccta 720

ttccctggca aagattatgt acatcagctg agactcataa cagagctctt aggctcacct 780

gatgactcca gccttggatt tttacgaagt gataatgctc gaagatatgt tcgacaacta 840

cctcagtacc caaagcggag cttctcgctc gggtttccta atatgtctcc tagctctata 900

gatttgctgg agaagatgct tatctttgac ccaaacaggc gcattacagt tgatgaggct 960

ctttcccacc catacttggc gcctcttcat gatatcaacg aggagcctgt ctgcccaatg 1020

cctttcaatt ttgattttga gcaaccctcg tttactgaag agaacatcaa ggagctcatc 1080

tggagagagt ccgtaaggtt caatccagat ccatttcaat ga 1122

<210>4

<211>373

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

Met Asp Ser Ser Ser Ala Ser Ala Gly Asp His Asn Ile Arg Gly Val

1 5 10 15

Leu Thr His Gly Gly Arg Tyr Val Gln Tyr Asn Val Tyr Gly Asn Ile

20 25 30

Phe Glu Val Ser Arg Lys Tyr Val Pro Pro Leu Arg Pro Val Gly Arg

35 40 45

Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ala Ala Val Asn Ala Glu Ala Arg Glu

50 55 60

Glu Val Ala Ile Lys Lys Ile Gly Asn Ala Phe Asp Asn Arg Ile Asp

65 70 75 80

Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Met Asp His

85 90 95

Glu Asn Val Ile Ala Ile Lys Asp Ile Ile Arg Pro Pro Gln Lys Glu

100 105 110

Asn Phe Asn Asp Val Tyr Ile Val Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu

115 120 125

His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Pro Leu Asn Asp Asp His Cys Arg

130 135 140

Tyr Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Val His Ser Ala

145 150 155 160

Gly Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Phe Met Asn Ala

165 170 175

Asn Cys Asp Leu Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Thr Ser

180 185 190

Glu Thr Gly Phe Met Thr Ala Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala

195 200 205

Pro Glu Leu Leu Leu Asn Cys Ser Glu Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Ile

210 215 220

Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Gly Glu Ile Met Thr Arg Lys Pro Leu

225 230 235 240

Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Val His Gln Leu Arg Leu Ile Thr Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Ser Pro Asp Asp Ser Ser Leu Gly Phe Leu Arg Ser Asp Asn

260 265 270

Ala Arg Arg Tyr Val Arg Gln Leu Pro Gln Tyr Pro Lys Arg Ser Phe

275 280 285

Ser Leu Gly Phe Pro Asn Met Ser Pro Ser Ser Ile Asp Leu Leu Glu

290 295 300

Lys Met Leu Ile Phe Asp Pro Asn Arg Arg Ile Thr Val Asp Glu Ala

305 310 315 320

Leu Ser His Pro Tyr Leu Ala Pro Leu His Asp Ile Asn Glu Glu Pro

325 330 335

Val Cys Pro Met Pro Phe Asn Phe Asp Phe Glu Gln Pro Ser Phe Thr

340 345 350

Glu Glu Asn Ile Lys Glu Leu Ile Trp Arg Glu Ser Val Arg Phe Asn

355 360 365

Pro Asp Pro Phe Gln

370

<210>5

<211>4969

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

acgttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg 60

gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt 120

tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc 180

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 240

cacaggaaac agtattcatg tcccctatac taggttattg gaaaattaag ggccttgtgc 300

aacccactcg acttcttttg gaatatcttg aagaaaaata tgaagagcat ttgtatgagc 360

gcgatgaagg tgataaatgg cgaaacaaaa agtttgaatt gggtttggag tttcccaatc 420

ttccttatta tattgatggt gatgttaaat taacacagtc tatggccatc atacgttata 480

tagctgacaa gcacaacatg ttgggtggtt gtccaaaaga gcgtgcagag atttcaatgc 540

ttgaaggagc ggttttggat attagatacg gtgtttcgag aattgcatat agtaaagact 600

ttgaaactct caaagttgat tttcttagca agctacctga aatgctgaaa atgttcgaag 660

atcgtttatg tcataaaaca tatttaaatg gtgatcatgt aacccatcct gacttcatgt 720

tgtatgacgc tcttgatgtt gttttataca tggacccaat gtgcctggat gcgttcccaa 780

aattagtttg ttttaaaaaa cgtattgaag ctatcccaca aattgataag tacttgaaat 840

ccagcaagta tatagcatgg cctttgcagg gctggcaagc cacgtttggt ggtggcgacc 900

atcctccaaa atcggatctg gttccgcgtg gatccccgga attcccgggt cgactcgagc 960

ggccgcatcg tgactgactg acgatctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 1020

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 1080

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc 1140

agtcacgtag cgatagcgga gtgtataatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc 1200

tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 1260

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 1320

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 1380

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 1440

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 1500

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 1560

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg 1620

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 1680

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 1740

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 1800

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 1860

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 1920

cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 1980

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 2040

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 2100

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 2160

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 2220

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 2280

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 2340

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 2400

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 2460

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 2520

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 2580

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 2640

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 2700

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 2760

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 2820

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 2880

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 2940

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 3000

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 3060

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 3120

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 3180

gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc ataaattccg 3240

acaccatcga atggtgcaaa acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc 3300

aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg 3360

tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc 3420

gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac 3480

aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg 3540

cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg 3600

tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc 3660

tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg 3720

ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac 3780

ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg 3840

tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc 3900

gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg 3960

aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg 4020

agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc 4080

gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg 4140

ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc 4200

tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg 4260

gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc 4320

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 4380

gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 4440

ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 4500

caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat tcactggccg tcgttttaca 4560

acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 4620

tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 4680

cagcctgaat ggcgaatggc gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag 4740

ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat 4800

gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtaacctat cccattacgg tcaatccgcc 4860

gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag 4920

ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc gttggaatt 4969

<210>6

<211>5900

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgatatca gccatggcct tgtcgtcgtc gtcggtaccc 240

agatctgggc tgtccatgtg ctggcgttcg aatttagcag cagcggtttc tttcatacca 300

gaaccgcgtg gcaccagacc agaagaatga tgatgatgat ggtgcatatg gccagaacca 360

gaaccggcca ggttagcgtc gaggaactct ttcaactgac ctttagacag tgcacccact 420

ttggttgccg ccacttcacc gtttttgaac agcagcagag tcgggatacc acggatgcca 480

tatttcggcg cagtgccagg gttttgatcg atgttcagtt ttgcaacggt cagtttgccc 540

tgatattcgt cagcgatttc atccagaatc ggggcgatca ttttgcacgg accgcaccac 600

tctgcccaga aatcgacgag gatcgccccg tccgctttga gtacatccgt gtcaaaactg 660

tcgtcagtca ggtgaataat tttatcgctc atatgtatat ctccttctta aagttaaaca 720

aaattatttc tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc ccctatagtg agtcgtatta 780

atttcgcggg atcgagatcg atctcgatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca 840

ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc 900

gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg 960

tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc 1020

tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc 1080

gtcgagatcc cggacaccat cgaatggcgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc 1140

ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca 1200

gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt 1260

tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac 1320

cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt 1380

ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg 1440

ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg 1500

gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac 1560

caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc 1620

tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc 1680

gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt 1740

tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt 1800

cagccgatag cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg 1860

caaatgctga atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg 1920

ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga catctcggta 1980

gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa 2040

caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 2100

caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 2160

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 2220

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagct 2280

cactcattag gcaccgggat ctcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc 2340

cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct tctttatcat 2400

gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg 2460

ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc 2520

tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc 2580

cggcatggcg gccccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg 2640

ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag 2700

cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg 2760

tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc accattatgt tccggatctg 2820

catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg 2880

gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc 2940

ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct 3000

ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc 3060

agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa gccagacatt 3120

aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa caggcagaca tctgtgaatc 3180

gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 3240

tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 3300

cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 3360

catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 3420

cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 3480

gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3540

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3600

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3660

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3720

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3780

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3840

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3900

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3960

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 4020

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 4080

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 4140

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4200

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4260

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4320

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4380

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4440

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 4500

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 4560

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 4620

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 4680

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 4740

acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 4800

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 4860

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 4920

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 4980

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 5040

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 5100

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 5160

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 5220

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 5280

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 5340

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 5400

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat attttgttaa 5460

aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca 5520

aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 5580

acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 5640

agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc 5700

gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 5760

cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg 5820

caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 5880

agggcgcgtc ccattcgcca 5900

Claims (10)

1.MxRHEL蛋白质在与MxMPK4蛋白质互作中的应用。

2.MxRHEL蛋白质在检测MxMPK4蛋白质中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述MxRHEL蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

所述MxMPK4蛋白质是如下e)或f)或g)或h)的蛋白质：

e)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

f)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

g)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

h)与序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

4.与权利要求1-3中任一所述的MxRHEL蛋白质相关的生物材料在制备E3泛素连接酶中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述与MxRHEL蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码权利要求1-3中任一所述的MxRHEL蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1-3中任一所述的MxRHEL蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1-3中任一所述的MxRHEL蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

7.一种E3泛素连接酶的制备方法，包括如下步骤：使权利要求1-3中任一所述的MxRHEL蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到E3泛素连接酶；所述生物为微生物、植物或非人动物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述使权利要求1-3中任一所述的MxRHEL蛋白质的编码基因在生物中进行表达的方法包括如下步骤：将权利要求1-3中任一所述的MxRHEL蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述MxRHEL蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述MxRHEL蛋白质。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述MxRHEL蛋白质的编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述微生物或所述受体微生物为B1)-B4)中的任一种：

B1)原核微生物；

B2)肠杆菌科细菌；

B3)埃希氏菌属细菌；

B4)大肠杆菌。

Images