CN113025512A - 一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素d3的酿酒酵母菌的构建方法及应用 - Google Patents

一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素d3的酿酒酵母菌的构建方法及应用 Download PDF

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区文彩
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Abstract

本发明涉及一种可动态调控7‑脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用，所述构建方法包括以下步骤：S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；S3、人工合成融合基因片段gal80F‑loxT‑PTEF1‑DHCR24‑Tcyc1‑PGAP‑DIC‑TADH1‑gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；S4、将步骤S3中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中，经筛选后获得可动态调控生产7‑DHC的酿酒酵母菌。本发明所提供的构建方法构建的酿酒酵母菌，通过在不影响菌株生长状态的同时，利用酿酒酵母内源的甾醇调控系统，结合dCas9系统实现副产物的减少，7‑DHC的产量提升。

Description

一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构 建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种通过微生物动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用。
背景技术
维生素D是一种在人类生长发育维持生命过程中不可或缺的脂溶性维生素，不光在增殖和分化、钙稳态、骨骼新陈代谢中起重要作用，还可以改变神经传递和突触可塑性。胆钙化醇（Cholecalciferol, VD3）和麦角钙化醇（Ergocalciferol, VD2）是维生素D系列化合物的两个主要的存在形式。与VD2相比，VD3在提高和维持人体血清中25-羟基维生素D水平方面的效力高出87%。合成VD3的重要前提物质为7-脱氢胆固醇（7-DHC），它是一种高附加值的甾醇，7-DHC不光在医药和临床有重要应用，它也是制备胆甾相液晶材料的重要原料，在显示制造等方面也有广泛应用。工业中将获得的7-DHC，在波长230-300nm的紫外线照射下转化为VD3，因此，提高7-DHC的产量便相当于提高VD3的产量。
DHC和VD3的制造法目前主要集中在菌株的筛选和简单的分子改造方面，菌株筛选费时费力，需要花费大量金钱进行大规模的高通量筛选，才能获得7-DHC和VD3产量极低的菌株，获得菌株后往往还需要进行时间冗长的菌株鉴定过程，面临着基因改造方法的缺失等一系列问题。简单的分子改造主要集中于合成路径基因的强化，分支路径的基因敲除，但这样极易造成菌株代谢压力过高，有毒中间产物积累，不利于菌株的生长和生产。
如中国专利CN109154015A是通过敲除ERG5和ERG6基因，达到生产7-DHC的效果，但是敲除ERG5和ERG6会造成酿酒酵母合成麦角甾醇受阻。麦角甾醇是酿酒酵母细胞膜的重要组成成分，决定着膜的流动性和渗透性，阻断麦角甾醇的合成会导致细胞生长缓慢，胞内氧化还原失衡，代谢通量失衡等问题。
传统的7-DHC制备方法主要采用两种化学合成法，第一种是以胆固醇醋酸酯为原料，经过7-位的溴化，消除和水解反应合成7-DHC。第二种是以胆固醇醋酸酯为原料，经过氧化，腙化、消除和水解反应合成7-DHC。化学合成的方法虽然产量高，但是存在能耗高，反应条件苛刻且污染严重等问题，不利于可持续发展。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种动态调控酿酒酵母中7-DHC和VD3的生产产量的方法，在不影响菌株生长状态的同时，利用酿酒酵母内源的甾醇调控系统，结合dCas9系统实现副产物的减少，7-DHC的产量提升。
为了实现上述目的，设计一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，包括以下步骤：
S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；
S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；
S3、人工合成融合基因片段gal80F-loxT- PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1-gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；
S4、将步骤S2中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中，经筛选后获得可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌。
本发明还具有如下优选的技术方案：
在一些实施方案中，所述步骤S1中，具体包括以下步骤：
S11、以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，通过如SEQ ID 1和SEQ ID 2的引物获得基因片段Mot3，采用如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示的引物扩增得到基因片段GAL7，采用如SEQ ID 5和SEQ ID 6所示的引物扩增得到上游同源臂基因片段NAT，以质粒pMHyLp-TRP1为模板，采用如SEQ ID 7和SEQ ID 8所示的引物扩增得到基因片段Loxp-Trp；
S12、将步骤S11中获得的4个基因片段转化进入感受态的原始酿酒酵母菌中并通过如SEQ ID 9和SEQ ID 10的引物验证培养后获得第一酿酒酵母菌。
进一步的，在一些实施方案中，所述步骤S2中具体包括以下步骤：
S21、人工合成基因片段PERG3-dCas9- Tcyc1-PSNR52-sgRNA- TADH1，使用如SEQ ID 11和SEQ ID 12的引物扩增得到基因片段Dcas9-sgRNA，以质粒PY13-TEF1质粒为模板，使用如SEQ ID 13和SEQ ID 14的引物扩增得到部分质粒片段PY13-1；
S22、将步骤S21中获得的2个片段Dcas9-sgRNA和PY13-1使用无缝克隆酶进行无缝连接，并加入感受态的大肠杆菌中培养离心后，全部涂布在氨苄青霉素抗性的LB平板上，培养得到单菌落；
S23、将步骤S22中获得的单菌落，使用如SEQ ID 15和SEQ ID 16的引物进行菌落PCR验证并测序，将测序正确的单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养后进行质粒提取，得到质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA。
进一步的，在一些实施方案中，所述步骤S3中包括具体以下步骤：
S31、人工合成基因片段PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1，以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，使用如SEQ ID 17和SEQ ID 18的引物扩增得到上游同源臂基因片段gal80F，使用如SEQ ID 19和SEQ ID 20的引物扩增得到下游同源臂基因片段gal80R，以pMHyLp-leu质粒为模板，使用SEQ ID 21和SEQ ID 22的引物扩增得到基因片断loxp-Leu；
S32、将步骤S31中获得的四个基因片段PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1、gal80F、gal80R和loxp-Leu进行重叠延伸PCR，验证正确后，切胶回收片段，得到融合基因片段gal80F-loxT- PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1- gal80R；
S33、将步骤S32得到的融合基因片段，转化进入步骤S1获得的第一酿酒酵母菌株的感受态中，涂布在SD Leu平板上培养，使用SEQ ID 23和SEQ ID 24的引物进行菌落PCR验证得到第二酿酒酵母菌株；
S34、将步骤S33得到的第二酿酒酵母菌株制成感受态，并将质粒PY26-Cre转化进入，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后，接入YPD培养基中培养12h，再于含有5-FOA的YPD固体平板上培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，为第二酿酒酵母菌。
进一步的，在一些实施方案中，在所述步骤S4中，具体包括以下步骤：
S41、将步骤S2验证成功的PY13-erg3-dCas9-sgRNA质粒，使用如序列SEQ ID 25和SEQ ID 26的引物扩增得到替换了sgRNA中20bp序列的如SEQ ID 27所示的质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA-mls。
S42、将步骤S41中获得质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA-ml转化进入步骤S3获得的第二酿酒酵母菌株的感受态中，并涂布在SD Leu平板上，培养后使用如SEQ ID 27和SEQ ID28的引物进行菌落PCR验证得到可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌菌株；
S43、将步骤S42中得到的可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌菌株制成感受态，并将质粒PY26-Cre转化进入酿酒酵母菌菌株中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后，接入YPD培养基中培养12h，于含有5-FOA的YPD固体平板上，30 ℃培养3 d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SDUra筛选平板无法生长的单菌落即为正确的可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母基因工程菌。
本发明还包括一种生产7-脱氢胆固醇的方法，将上述获得的可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌进行发酵培养，发酵结束后离心取沉淀。
进一步的，在一些实施方案中，生产7-脱氢胆固醇的方法包括以下步骤：
在2 ml YPD培养基中接种固体YPD平板上的可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌单菌落，在30℃，220rpm培养16-20 h 后，按接种量1%接入含有25 mL YPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，再经过30℃，220rpm培养96 h，发酵至16h时，加入乙醇进行碳源的补充，发酵结束后，离心取沉淀。
发明的有益效果
本发明以原始的酿酒酵母为出发菌株，使用启动子GAL1和GAL10分别控制甾醇△24-还原酶和△-胆甾烯醇酶的表达，并将表达框整合到GAL80位点，这样既能使酿酒酵母的GAL启动子只受葡萄糖抑制的同时，还能在酿酒酵母中合成7-DHC。接下来使用GAL7启动子控制mot3基因的表达，并使用ERG启动子控制dCas9系统。菌株生长前期，因为葡萄糖存在的情况下，mot3基因不发挥作用，麦角甾醇合成正常，当葡萄糖含量消耗结束时，GAL7启动子启动，mot3基因表达，发挥作用，抑制麦角甾醇的合成，麦角甾醇合成受到抑制后，产量降低，便会解除mot3对Ecm22转录因子的抑制作用，从而激活ERG基因，使dCas9系统发挥作用，达到抑制分支路径的作用，原理如图1所示，实现代谢通量更大限度的流向目标产物，同时也不会影响菌体的生长繁殖，最终使7-DHC的产量达到156mg/L。
附图说明
图1示例性示出了本发明的调控原理示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是提供一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及其相关的应用。
为了进一步的说明本发明，下面结合实施例对本发明的具体技术效果作进一步说明。
实施例1构建第一酿酒酵母菌DC-1
（1a）以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，采用引物扩增得到基因片段Mot3、基因片段GAL7、上游同源臂基因片段NAT，以质粒pMHyLp-TRP1为模板，采用引物扩增得到基因片段Loxp-Trp。
其中增扩得到基因片段Mot3的引物如SEQ ID 1和SEQ ID 2所示，增扩得到基因片段GAL7的引物如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示，增扩得到上游同源臂基因片段NAT的引物如SEQID 5和SEQ ID 6所示，增扩得到基因片段Loxp-Trp的引物如SEQ ID 7和SEQ ID 8所示。
（1b）将原始酵母菌制成感受态，把步骤（1a）中得到的4个基因片段转化进入酿酒酵母菌中，使用如SEQ ID 9和SEQ ID 10所示引物进行菌落PCR验证。
（1c）将步骤（1b）中菌落PCR验证正确的单菌落接入SD trp液体培养基内培养2-3天，之后涂布于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD trp筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD trp筛选平板无法生长的单菌落即为正确的第一酿酒酵母菌，并命名为DC-1。
实施例2 构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统
（2a）人工合成基因片段PERG3-dCas9- Tcyc1-PSNR52-sgRNA- TADH1，使用如SEQID 11和SEQ ID 12所示的引物扩增得到基因片段Dcas9-sgRNA，以质粒PY13-TEF1质粒为模板，使用如SEQ ID 13和SEQ ID 14所示的引物扩增得到部分质粒片段PY13-1。
（2b）将步骤（2a）中获得的基因片段Dcas9-sgRNA和基因片段PY13-1使用无缝克隆酶进行无缝连接。在50℃的水浴中反应30分钟后，取10μl反应样品加入50-100μl JM109大肠杆菌感受态中，轻轻混匀，置于冰上孵育30min。42℃水浴中热激90秒，迅速放入冰浴中，静置2-3分钟，加入500μl LB培养基，37℃培养1小时，5000rpm离心1分钟，去除500μl培养基后，重悬菌体，全部涂布在氨苄青霉素抗性的LB平板上，过夜培养得到单菌落。
（2c）将步骤（2b）中得到的单菌落，使用如SEQ ID 15和SEQ ID 16所示的引物进行菌落PCR验证，并进行测序，将测序正确的单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，过夜培养后，进行质粒提取，得到质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA。
实施例3 构建第二酿酒酵母菌DC-2
（3a）人工合成基因片段PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1，以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，使用如SEQ ID 17和SEQ ID 18所示的引物扩增得到上游同源臂基因片段gal80F，使用如SEQ ID 19和SEQ ID 20所示的引物扩增得到下游同源臂基因片段gal80R，以pMHyLp-leu质粒为模板，使用如SEQ ID 21和SEQ ID 22所示的引物扩增得到基因片断loxp-Leu片段。
（3b）将步骤（3a）中获得的四个片段PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1、gal80F、gal80R和loxp-Leu基因片段进行重叠延伸PCR，1%的琼脂糖凝胶电泳验证正确后，切胶回收片段，得到融合基因片段gal80F-loxT- PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1- gal80R。
（3c）将步骤（3b）中得到的融合基因片段，转化进入实施例1中获得的酿酒酵母DC-1菌株的感受态中，并涂布在SD Leu平板上，30℃培养3天，使用如SEQ ID 23和SEQ ID 24的引物进行菌落PCR验证得到第二酿酒酵母菌菌株。
（3d）将步骤（3c）得到的第二酿酒酵母菌菌株制成感受态，并将PY26-Cre这个质粒转化进入第二酿酒酵母菌菌株中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后，接入YPD培养基中培养12h，于含有5-FOA的YPD固体平板上，30 ℃培养3天，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的第二酿酒酵母菌，并命名为DC-2。
实施例4 构建产动态调控生产7-DHC酿酒酵母菌DC-3
（4a）将实施例2中验证成功的质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA，通过如SEQ ID 25和SEQ ID 6s所示的引物扩增得到得到替换了sgRNA中20bp序列的如SEQ ID 27所示的质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA-mls。
（4b）将步骤（4a）中获得质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA-ml转化进入实施例2获得的酿酒酵母DC-2菌株的感受态中，涂布在SD Leu平板上，30℃培养3天，使用引物YZ-dCas9-F、YZ-dCas9-R进行菌落PCR验证得到菌株DC-3。
（d）将步骤（c）得到的菌株DC-2制成感受态，并将PY26-Cre这个质粒转化进入酿酒酵母中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后，接入YPD培养基中培养12h，于含有5-FOA的YPD固体平板上，30 ℃培养3 d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的即为正确的可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母基因工程菌，
实施例5 将构建成功的酿酒酵母菌进行发酵培养，制备7-脱氧胆固醇。
在2 ml YPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌DC-3单菌落，30℃，220rpm培养16-20 h 后，按接种量1%接入含有25 mL YPD液体培养基的250 mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96 h。发酵至16h时，加入乙醇进行碳源的补充。发酵结束后，离心取沉淀。
对于实施例5，通过高效液相色谱对酿酒酵母中的7-DHC进行检测，将发酵96h的酿酒酵母菌液离心，使用10ml无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5gHBT，混匀，依次加入20ml的无水乙醇，10ml的1.5mol/L的氢氧化钾甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2小时，皂化结束后使用萃取液（异丙醇：正己烷=1:3）进行超声震荡30分钟，使用分液漏斗出去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。本发明保证酿酒酵母菌正常的生长发育的同时，可以使7-脱氧胆固醇产量可以达到156mg/L，同时通过紫外光照射以控制生产维生素D3。
以上所述，仅为此发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案和新型的构思加于等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西宝生物科技（上海）股份有限公司
<120> 一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
aacagttgaa tattccctca aaaatgaatg cggaccatca cct 43
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
tttaacgtcg tccttattca gtacacca 28
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
cttggcactg gccgtcgttt tatttgccag cttactatcc ttctt 45
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
tggtccgcat tcatttttga gggaatattc aactgttttt tttt 44
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
tgtatacgaa catcgaagga gcac 24
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
atggtcatag ctgtttcctg tcacggcatg tgaaggcaat atacg 45
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
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<211> 35
<212> DNA
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<400> 8
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<212> DNA
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<400> 9
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
tattgttgat cctgttgcgg tattg 25
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
cgactcacta tagggcgaat tgggtaccta cgtaaaagaa gaaaa 45
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
aaaagctgga gctcgtcgct cttattgacc acacctctac cgg 43
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
tgtggtcaat aagagcgacg agctccagct tttgttccct ttagt 45
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
ttttttcttc ttttacgtag gtacccaatt cgccctatag tgagt 45
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
aaaatctgat cggagctctc ctcttt 26
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
gctgataccg ctcgccgcag ccg 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
atggactaca acaagagatc ttcg 24
<210> 18
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 18
cgaccttggc actggccgtc gttttaaaat gttgtggtta ccagatctac a 51
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 19
tccagctttt gttcccttta gtgaagttcg tacttttcca ggata 45
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 20
tataaactat aatgcgagat attgcta 27
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 21
tggtaaccac aacattttaa aacgacggcc agtgccaagg tcg 43
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 22
tttagtacgg gtaattaacg acaggaaaca gctatgacca tgatt 45
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 23
gctgctgctg aacgtggggt tcaa 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 24
atgtcccaga attcctctct agtc 24
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 25
ataaattaca aagacgaaga attaatcaaa ttgggcaaaa gttaaaataa ggctagtc 58
<210> 26
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 26
ttgcccaatt tgattaattc ttcgtctttg taatttataa gatcatttat ctttcactgc 60
ggagaag 67
<210> 27
<211> 10616
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 27
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgcgtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaatt cccgttttaa gagcttggtg agcgctagga gtcactgcca ggtatcgttt 240
gaacacggca ttagtcaggg aagtcataac acagtccttt cccgcaattt tctttttcta 300
ttactcttgg cctcctctag tacactctat atttttttat gcctcggtaa tgattttcat 360
tttttttttt cccctagcgg atgactcttt ttttttctta gcgattggca ttatcacata 420
atgaattata cattatataa agtaatgtga tttcttcgaa gaatatacta aaaaatgagc 480
aggcaagata aacgaaggca aagatgacag agcagaaagc cctagtaaag cgtattacaa 540
atgaaaccaa gattcagatt gcgatctctt taaagggtgg tcccctagcg atagagcact 600
cgatcttccc agaaaaagag gcagaagcag tagcagaaca ggccacacaa tcgcaagtga 660
ttaacgtcca cacaggtata gggtttctgg accatatgat acatgctctg gccaagcatt 720
ccggctggtc gctaatcgtt gagtgcattg gtgacttaca catagacgac catcacacca 780
ctgaagactg cgggattgct ctcggtcaag cttttaaaga ggccctactg gcgcgtggag 840
taaaaaggtt tggatcagga tttgcgcctt tggatgaggc actttccaga gcggtggtag 900
atctttcgaa caggccgtac gcagttgtcg aacttggttt gcaaagggag aaagtaggag 960
atctctcttg cgagatgatc ccgcattttc ttgaaagctt tgcagaggct agcagaatta 1020
ccctccacgt tgattgtctg cgaggcaaga atgatcatca ccgtagtgag agtgcgttca 1080
aggctcttgc ggttgccata agagaagcca cctcgcccaa tggtaccaac gatgttccct 1140
ccaccaaagg tgttcttatg tagtgacacc gattatttaa agctgcagca tacgatatat 1200
atacatgtgt atatatgtat acctatgaat gtcagtaagt atgtatacga acagtatgat 1260
actgaagatg acaaggtaat gcatcattct atacgtgtca ttctgaacga ggcgcgcttt 1320
ccttttttct ttttgctttt tctttttttt tctcttgaac tcgacggatc tatgcggtgt 1380
gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata 1440
ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 1500
aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 1560
cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 1620
ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 1680
cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 1740
ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 1800
gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 1860
cgccgctaca gggcgcgtcg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 1920
gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 1980
gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 2040
agcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac ctacgtaaaa gaagaaaaaa 2100
aaaaaaactg agcctttagt acactacagt tactgctaca gccttttaca gcccagcatc 2160
tggcaccact acgctataat atatgatgcg tctattatgc tagaatcctt cctgaaaggg 2220
cattctggaa gccctacgta cagagtgaca atatattagg gcatccataa aaatagatta 2280
gggcagctct gccatttttt tcatagccga aagaagaaaa actgaaaaaa aaaatgatac 2340
gaaaaaaccg cgaaacgacg ccttttgttg cgattgtcgg gcatcgcaag ttacgacgcg 2400
ttgtcccttg catcgctgcc gtgtggcacg acccactgcg gcctaaacga ccgagatcgg 2460
tgcccggggc agaccacccg aaaactcccg ggcattattt cggtcgttta gttgcgcccc 2520
agggcaaccg gggtgtatac gaggccgatg gctgcgataa acgaaaaatt caggctcgta 2580
taagtggcac aatagaaggt gaagaagaac agcaggtgca ttgaaacaag aggttcagca 2640
gcgatcgggt attgttgttg ctgctattat gtaacggtcg aaagaaacat cgcggtatat 2700
attagaggcg gatttctatc tttcttatca attcgttttt tcattcactt gttcattcat 2760
tctttacatt tgtcttgttc tttgaagtgg ttgcagagga ggtcagtttg ttgcatttgt 2820
aaaaaaagat aataagaaaa atattcgtct agatttgaga tatggacaag aagtattcta 2880
tcggactggc tatcgggact aatagcgtcg ggtgggccgt catcactgac gagtacaagg 2940
tgccctctaa gaagttcaag gtgctcggga acaccgaccg gcattccatc aagaaaaatc 3000
tgatcggagc tctcctcttt gattcagggg agaccgctga agcaacccgc ctcaagcgga 3060
ctgctagacg gcggtacacc aggaggaaga accggatttg ttaccttcaa gagatattct 3120
ccaacgaaat ggcaaaggtc gacgacagct tcttccatag gctggaagaa tcattcctcg 3180
tggaagagga taagaagcat gaacggcatc ccatcttcgg taatatcgtc gacgaggtgg 3240
cctatcacga gaaataccca accatctacc atcttcgcaa aaagctggtg gactcaaccg 3300
acaaggcaga cctccggctt atctacctgg ccctggccca catgattaag ttcagaggcc 3360
acttcctgat cgagggcgac ctcaatcctg acaatagcga tgtggataaa ctgttcatcc 3420
agctggtgca gacttacaac cagctctttg aagagaaccc catcaatgca agcggagtcg 3480
atgccaaggc cattctgtca gcccggctgt caaagagccg cagacttgag aatcttatcg 3540
ctcagctgcc gggtgaaaag aaaaatggac tgttcgggaa cctgattgct ctttcacttg 3600
ggctgactcc caatttcaag tctaatttcg acctggcaga ggatgccaag ctgcaactgt 3660
ccaaggacac ctatgatgac gatctcgaca acctcctggc ccagatcggt gaccaatacg 3720
ccgacctttt ccttgctgct aagaatcttt ctgacgccat cctgctgtct gacattctcc 3780
gcgtgaacac tgaaatcacc aaggcccctc tttcagcttc aatgattaag cggtatgatg 3840
agcaccacca ggacctgacc ctgcttaagg cactcgtccg gcagcagctt ccggagaagt 3900
acaaggaaat cttctttgac cagtcaaaga atggatacgc cggctacatc gacggaggtg 3960
cctcccaaga ggaattttat aagtttatca aacctatcct tgagaagatg gacggcaccg 4020
aagagctcct cgtgaaactg aatcgggagg atctgctgcg gaagcagcgc actttcgaca 4080
atgggagcat tccccaccag atccatcttg gggagcttca cgccatcctt cggcgccaag 4140
aggacttcta cccctttctt aaggacaaca gggagaagat tgagaaaatt ctcactttcc 4200
gcatccccta ctacgtggga cccctcgcca gaggaaatag ccggtttgct tggatgacca 4260
gaaagtcaga agaaactatc actccctgga acttcgaaga ggtggtggac aagggagcca 4320
gcgctcagtc attcatcgaa cggatgacta acttcgataa gaacctcccc aatgagaagg 4380
tcctgccgaa acattccctg ctctacgagt actttaccgt gtacaacgag ctgaccaagg 4440
tgaaatatgt caccgaaggg atgaggaagc ccgcattcct gtcaggcgaa caaaagaagg 4500
caattgtgga ccttctgttc aagaccaata gaaaggtgac cgtgaagcag ctgaaggagg 4560
actatttcaa gaaaattgaa tgcttcgact ctgtggagat tagcggggtc gaagatcggt 4620
tcaacgcaag cctgggtacc taccatgatc tgcttaagat catcaaggac aaggattttc 4680
tggacaatga ggagaaagag gacatccttg aggacattgt cctgactctc actctgttcg 4740
aggaccggga aatgatcgag gagaggctta agacctacgc ccatctgttc gacgataaag 4800
tgatgaagca acttaaacgg agaagatata ccggatgggg acgccttagc cgcaaactca 4860
tcaacggaat ccgggacaaa cagagcggaa agaccattct tgatttcctt aagagcgacg 4920
gattcgctaa tcgcaacttc atgcaactta tccatgatga ttccctgacc tttaaggagg 4980
acatccagaa ggcccaagtg tctggacaag gtgactcact gcacgagcat atcgcaaatc 5040
tggctggttc acccgctatt aagaagggta ttctccagac cgtgaaagtc gtggacgagc 5100
tggtcaaggt gatgggtcgc cataaaccag agaacattgt catcgagatg gccagggaaa 5160
accagactac ccagaaggga cagaagaaca gcagggagcg gatgaaaaga attgaggaag 5220
ggattaagga gctcgggtca cagatcctta aagagcaccc ggtggaaaac acccagcttc 5280
agaatgagaa gctctatctg tactaccttc aaaatggacg cgatatgtat gtggaccaag 5340
agcttgatat caacaggctc tcagactacg acgtggacgc tatcgtccct cagagcttcc 5400
tcaaagacga ctcaattgac aataaggtgc tgactcgctc agacaagaac cggggaaagt 5460
cagataacgt gccctcagag gaagtcgtga aaaagatgaa gaactattgg cgccagcttc 5520
tgaacgcaaa gctaatcact cagcggaagt tcgacaatct cactaaggct gagaggggcg 5580
gactgagcga actggacaaa gcaggattca ttaaacggca acttgtggag actcggcaga 5640
ttactaaaca tgtagcccaa atccttgact cacgcatgaa taccaagtac gacgaaaacg 5700
acaaacttat ccgcgaggtg aaggtgatta ccctgaagtc caagctggtc agcgatttca 5760
gaaaggactt tcaattctac aaagtgcggg agatcaataa ctatcatcat gctcatgacg 5820
catatctgaa tgccgtggtg ggaaccgccc taatcaagaa gtacccaaag ctggaaagcg 5880
agttcgtgta cggagactac aaggtctacg acgtgcgcaa gatgattgcc aaatctgagc 5940
aggagatcgg aaaggccacc gcaaagtact tcttctacag caacatcatg aatttcttca 6000
agaccgaaat cacccttgca aacggtgaga tccggaagag gccgctcatc gagactaatg 6060
gggagactgg cgaaatcgtg tgggacaagg gcagagattt cgctaccgtg cgcaaagtgc 6120
tttctatgcc tcaagtgaac atcgtgaaga aaaccgaggt gcaaaccgga ggcttttcta 6180
aggaatcaat cctccccaag cgcaactccg acaagctcat tgcaaggaag aaggattggg 6240
accctaagaa gtacggcgga ttcgattcac caactgtggc ttattctgtc ctggtcgtgg 6300
ctaaggtgga aaaaggaaag tctaagaagc tcaagagcgt gaaggaactg ctgggtatca 6360
ccattatgga gcgcagctcc ttcgagaaga acccaattga ctttctcgaa gccaaaggtt 6420
acaaggaagt caagaaggac cttatcatca agctcccaaa gtatagcctg ttcgaactgg 6480
agaatgggcg gaagcggatg ctcgcctccg ctggcgaact tcagaagggt aatgagctgg 6540
ctctcccctc caagtacgtg aatttcctct accttgcaag ccattacgag aagctgaagg 6600
ggagccccga ggacaacgag caaaagcaac tgtttgtgga gcagcataag cattatctgg 6660
acgagatcat tgagcagatt tccgagtttt ctaaacgcgt cattctcgct gatgccaacc 6720
tcgataaagt ccttagcgca tacaataagc acagagacaa accaattcgg gagcaggctg 6780
agaatatcat ccacctgttc accctcacca atcttggtgc ccctgccgca ttcaagtact 6840
tcgacaccac catcgaccgg aaacgctata cctccaccaa agaagtgctg gacgccaccc 6900
tcatccacca gagcatcacc ggactttacg aaactcggat tgacctctca cagctcggag 6960
gggatgaggg agctcccaag aaaaagcgca aggtaggtag ttccggatcc tagactctcg 7020
agggccgcaa attaaagcct tcgagcgtcc caaaaccttc tcaagcaagg ttttcagtat 7080
aatgttacat gcgtacacgc gtctgtacag aaaaaaaaga aaaatttgaa atataaataa 7140
cgttcttaat actaacataa ctataaaaaa ataaataggg acctagactt caggttgtct 7200
aactccttcc ttttcggtta gagcggatgt ggggggaggg cgtgaatgta agcgtgacat 7260
aactaattac atgactccac cgcggacaat ctttgaaaag ataatgtatg attatgcttt 7320
cactcatatt tatacagaaa cttgatgttt tctttcgagt atatacaagg tgattacatg 7380
tacgtttgaa gtacaactct agattttgta gtgccctctt gggctagcgg taaaggtgcg 7440
cattttttca caccctacaa tgttctgttc aaaagatttt ggtcaaacgc tgtagaagtg 7500
aaagttggtg cgcatgtttc ggcgttcgaa acttctccgc agtgaaagat aaatgatctt 7560
ataaattaca aagacgaaga attaatcaaa ttgggcaaaa gttaaaataa ggctagtccg 7620
ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtggtgcttt ttttgttttt tatgtcttcg 7680
agtcatgtaa ttagttataa gcatgtgagc taagacactg taattgccaa tctaaacgat 7740
accacggccg ctctagagaa atggggagcg atttgcaggc atttgctcgg catgccggta 7800
gaggtgtggt caataagagc gacgagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt 7860
gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 7920
attccacaca acataggagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 7980
aggtaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 8040
tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 8100
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 8160
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 8220
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 8280
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 8340
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 8400
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 8460
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 8520
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 8580
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 8640
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 8700
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 8760
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 8820
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 8880
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 8940
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 9000
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 9060
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 9120
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 9180
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 9240
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 9300
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 9360
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 9420
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 9480
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 9540
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 9600
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 9660
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 9720
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 9780
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 9840
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 9900
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 9960
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 10020
aaagtgccac ctgggtcctt ttcatcacgt gctataaaaa taattataat ttaaattttt 10080
taatataaat atataaatta aaaatagaaa gtaaaaaaag aaattaaaga aaaaatagtt 10140
tttgttttcc gaagatgtaa aagactctag ggggatcgcc aacaaatact accttttatc 10200
ttgctcttcc tgctctcagg tattaatgcc gaattgtttc atcttgtctg tgtagaagac 10260
cacacacgaa aatcctgtga ttttacattt tacttatcgt taatcgaatg tatatctatt 10320
taatctgctt ttcttgtcta ataaatatat atgtaaagta cgctttttgt tgaaattttt 10380
taaacctttg tttatttttt tttcttcatt ccgtaactct tctaccttct ttatttactt 10440
tctaaaatcc aaatacaaaa cataaaaata aataaacaca gagtaaattc ccaaattatt 10500
ccatcattaa aagatacgag gcgcgtgtaa gttacaggca agcgatccgt cctaagaaac 10560
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 10616

Claims (7)

1.一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；
S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；
S3、人工合成融合基因片段gal80F-loxT- PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1-gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；
S4、将步骤S2中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中，经筛选后获得可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌。
2.如权利要求1所述的一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，在所述步骤S1中，具体包括以下步骤：
S11、以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，通过如SEQ ID 1和SEQ ID 2的引物获得基因片段Mot3，采用如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示的引物扩增得到基因片段GAL7，采用如SEQID 5和SEQ ID 6所示的引物扩增得到上游同源臂基因片段NAT，以质粒pMHyLp-TRP1为模板，采用如SEQ ID 7和SEQ ID 8所示的引物扩增得到基因片段Loxp-Trp；
S12、将步骤S11中获得的4个基因片段转化进入感受态的原始酿酒酵母菌中并通过如SEQ ID 9和SEQ ID 10的引物验证培养后获得第一酿酒酵母菌。
3.如权利要求2所述的一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中具体包括以下步骤：
S21、人工合成基因片段PERG3-dCas9- Tcyc1-PSNR52-sgRNA- TADH1，使用如SEQ ID 11和SEQID 12的引物扩增得到基因片段Dcas9-sgRNA，以质粒PY13-TEF1质粒为模板，使用如SEQ ID13和SEQ ID 14的引物扩增得到部分质粒片段PY13-1；
S22、将步骤S21中获得的2个片段Dcas9-sgRNA和PY13-1使用无缝克隆酶进行无缝连接，并加入感受态的大肠杆菌中培养离心后，全部涂布在氨苄青霉素抗性的LB平板上，培养得到单菌落；
S23、将步骤S22中获得的单菌落，使用如SEQ ID 15和SEQ ID 16的引物进行菌落PCR验证并测序，将测序正确的单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养后进行质粒提取，得到质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA。
4.如权利要求3所述的一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中包括具体以下步骤：
S31、人工合成基因片段PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1，以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，使用如SEQ ID 17和SEQ ID 18的引物扩增得到上游同源臂基因片段gal80F，使用如SEQ ID 19和SEQ ID 20的引物扩增得到下游同源臂基因片段gal80R，以pMHyLp-leu质粒为模板，使用SEQ ID 21和SEQ ID 22的引物扩增得到基因片断loxp-Leu；
S32、将步骤S31中获得的四个基因片段PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1、gal80F、gal80R和loxp-Leu进行重叠延伸PCR，验证正确后，切胶回收片段，得到融合基因片段gal80F-loxT- PTEF1-DHCR24- Tcyc1-PGAP-DIC- TADH1- gal80R；
S33、将步骤S32得到的融合基因片段，转化进入步骤S1获得的第一酿酒酵母菌株的感受态中，涂布在SD Leu平板上培养，使用SEQ ID 23和SEQ ID 24的引物进行菌落PCR验证得到第二酿酒酵母菌株；
S34、将步骤S33得到的第二酿酒酵母菌株制成感受态，并将质粒PY26-Cre转化进入，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后，接入YPD培养基中培养12h，再于含有5-FOA的YPD固体平板上培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，为第二酿酒酵母菌。
5.如权利要求4所述的一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，具体包括以下步骤：
S41、将步骤S2验证成功的PY13-erg3-dCas9-sgRNA质粒，使用如序列SEQ ID 25和SEQID 26的引物扩增得到替换了sgRNA中20bp序列的如SEQ ID 27所示的质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA-mls；
S42、将步骤S41中获得质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA-ml转化进入步骤S3获得的第二酿酒酵母菌株的感受态中，并涂布在SD Leu平板上，培养后使用如SEQ ID 27和SEQ ID 28的引物进行菌落PCR验证得到可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌菌株；
S43、将步骤S42中得到的可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌菌株制成感受态，并将质粒PY26-Cre转化进入酿酒酵母菌菌株中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后，接入YPD培养基中培养12h，于含有5-FOA的YPD固体平板上，30 ℃培养3 d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母基因工程菌。
6.一种生产7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，将权利要求1~5任一所述的可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌进行发酵培养，发酵结束后离心取沉淀。
7.如权利要求6所述的一种生产7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在2 ml YPD培养基中接种固体YPD平板上的可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌单菌落，在30℃，220rpm培养16-20 h 后，按接种量1%接入含有25 mL YPD液体培养基的250 mL圆底摇瓶内，再经过30℃，220rpm培养96 h，发酵至16h时，加入乙醇进行碳源的补充，发酵结束后，离心取沉淀。
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