CN108060175B - 诱导型酵母转化重组系统的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导型酵母转化重组系统的构建及其在大片段DNA捕捉中的应用。所述的iTAR载体含有PGal1‑V10、I‑SceI、BleR、CEN6、ARSH4、URA3、同源臂1、同源臂2及同源臂间的I‑SceI酶切位点。iTAR载体可以通过半乳糖诱导Gal1‑V10启动子，产生I‑SceI酶，作用于I‑SceI酶切位点，使iTAR载体自身线性化，将大片段DNA转化到含iTAR载体的酿酒酵母中，实现空载体的降解和酵母体内的同源重组，达到克隆大片段DNA的目的。本发明的iTAR克隆方法简单、高效，能够快速、准确地从基因组中获得所需要的大片段DNA而无酶切位点的限制，转化效率可达73％左右。

Description

诱导型酵母转化重组系统的构建及其应用
技术领域
本发明涉及诱导型酵母转化重组系统的构建方法及其在捕捉线性大片段DNA中的应用，即利用iTAR克隆技术捕捉线性大片段DNA，具体涉及一种将具有同源序列的线性大片段DNA转入含有iTAR载体的酿酒酵母中，完成DNA的组装，属于生物技术领域。
背景技术
微生物能够产生许多具有生物活性的次级代谢产物，其中包括抗生素(Polymyxin)、抗癌药物(埃博霉素)、杀虫剂(阿维菌素)和免疫抑制剂(雷帕霉素)。合成这些次级代谢产物的基因簇一般都大于10kb，有的甚至超过100kb。然而传统的PCR克隆方法已不再能满足人们的需求，因此，迫切需要开发一种能高效捕捉大基因簇片段的方法。
目前，捕捉大基因簇的方法主要有基因组文库和同源重组策略，基因组文库主要包括Cosmid文库(Eiglmeier K,et al.Use of an ordered cosmid library to deducethe genomic organization of Mycobacterium leprae[J].Molecular microbiology,1993,7(2):197-206)，BAC文库(Choi S,et al.Construction and characterization ofa bacterial artificial chromosome library ofArabidopsis thaliana[J].PlantMolecular Biology Reporter,1995,13(2):124-128.)和YAC文库(Anand R,etal.A3.5genome equivalent multi access YAC library:construction,characterisation,screening and storage[J].Nucleic acids research,1990,18(8):1951-1956).，同源重组主要有RecE重组克隆(Gillen J R,et al.Genetic analysis ofthe RecE pathway of genetic recombination in Escherichia coli K-12[J].Journalof bacteriology,1981,145(1):521-532.)和TAR(Transformation-AssociatedRecombination)克隆(Li Y,et al.Directed natural product biosynthesis genecluster capture and expression in the model bacterium Bacillus subtilis[J].Scientific reports,2015,5.)。基因组文库因其具备容量大和易操作等优点，大片段基因组文库被广泛应用于动物、植物和微生物的基因组研究中，然而基因文库的随机性和筛选困难等缺陷限制了其应用范围。RecE重组克隆是利用噬菌体RecE将两条含有同源末端的线性DNA重组成环状质粒，由于该系统需要目的基因簇两端含有特异的酶切位点，因而限制了其使用。TAR克隆是基于转化介导的同源重组，没有酶切位点的限制，可以方便有效地对复杂、较大的DNA片段进行克隆。但传统的TAR克隆方法是将线性化的载体和线性化的大片段DNA同时转入酿酒酵母，然后利用酿酒酵母自身的同源重组机制，将大片段DNA克隆下来。由于两个DNA片段的共转化和酿酒酵母自身的修复机制，导致TAR克隆的效率仅为2％，因此，TAR克隆的应用也受到了一定的限制。
发明内容
针对现有的TAR克隆效率低的问题，本发明提供一种诱导型酵母转化重组系统，即iTAR克隆系统，利用半乳糖诱导Gal1-V10启动子控制基因I-SceI表达I-SceI酶，作用于I-SceI酶切位点，在酿酒酵母体内实现iTAR载体的线性化，进而实现大片段DNA简单、高效的克隆。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种重组载体pSHTB10，为将质粒pSH-SceI中的colE1、AmpR和PGal1基因元件替换成pSWB中的oriV、trfA和BleR DNA片段和Gal1-V10DNA合成片段，形成全长序列为SEQ ID NO.32的质粒pSHTB10；所述的质粒pSH-SceI是将质粒pSH47中的Cre元件替换成I-SceI基因片段；所述的质粒pSWB是将质粒pDGICZ中的Phbs-BleR基因元件插入到质粒pSW-2中。
本发明还提供基于上述重组载体pSHTB10的iTAR载体，为将质粒pSHTB10用不破坏其功能元件的限制性内切酶酶切，通过在酶切位点处插入与目标线性大片段DNA两端具有同源性的两个同源臂并在同源臂间插入I-SceI酶切位点构建而成。
进一步地，本发明提供一种基于上述质粒pSHTB10的iTAR载体pSHTB10-HR12，为将pSHTB10用限制性内切酶FspI酶切，在该酶切位点处插入同源臂HR1、同源臂HR2和同源臂间的I-SceI酶切位点，形成全长序列为SEQ ID NO.33的iTAR载体pSHTB10-HR12。
同样地，本发明还提供一种基于上述质粒pSHTB10的iTAR载体pSHTB10-HR34，为将pSHTB10用限制性内切酶FspI酶切，在该酶切位点处插入同源臂HR3、同源臂HR4和同源臂间的I-SceI酶切位点，形成全长序列为SEQ ID NO.34的iTAR载体pSHTB10-HR34。
本发明提供上述重组载体pSHTB10的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，具体为通过合成Gal1-V10基因片段，设计引物从质粒pSWB上PCR扩增oriV、trfA和BleR目标片段，限制性内切酶PmlI和SacI酶切质粒pSH-SceI，将Gal1-V10、oriV、trfA、BleR和pSH-SceI目的片段连接，得到质粒pSHTB10；所述的质粒pSH-SceI的构建方法是通过PCR扩增I-SceI DNA序列，将其与限制性内切酶ClaI酶切的pSH47目的片段连接，得到质粒pSH-SceI；所述的质粒pSWB的构建方法是通过限制性内切酶BamHI酶切质粒pDGICZ和pSW-2，将其目的片段连接，得到质粒pSWB。
本发明还提供了上述iTAR载体的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，具体为通过合成引物PCR扩增相应的两个同源臂片段及I-SceI酶切位点，与经不破坏pSHTB10功能元件的限制性内切酶酶切回收的目的DNA片段连接，得到相应的iTAR载体。
进一步地，本发明提供上述iTAR载体pSHTB10-HR12的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，通过合成引物PCR扩增HR1和HR2DNA片段，与经限制性内切酶FspI酶切的pSHTB10片段连接，得到iTAR载体pSHTB10-HR12。
同样地，本发明提供上述iTAR载体pSHTB10-HR34的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，通过合成引物PCR扩增HR3和HR4DNA片段，与经限制性内切酶FspI酶切的pSHTB10片段连接，得到iTAR载体pSHTB10-HR34。
本发明进一步提供上述iTAR载体在捕捉大片段DNA中的应用，具体应用方法如下：
步骤1：针对目标线性大片段DNA的两端设计合成相应DNA片段，用体外转录的方式获得gRNA；
步骤2：利用Cas9核酸酶和gRNA可以特异性切割DNA的特性得到目标线性DNA；
步骤3：将iTAR载体转化到酿酒酵母中，通过将目标线性DNA片段转化至经半乳糖诱导的且含iTAR载体的酿酒酵母中，筛选阳性克隆，得到相应的捕捉载体；
步骤4：将捕捉载体转移至相应的模式菌株中使其表达，实现外源大片段DNA的克隆和表达。
本发明构建一种能高效捕捉DNA大片段的克隆载体，不需要化学合成DNA片段，只需利用半乳糖诱导iTAR载体就能在酿酒酵母体内实现自然界中任何生物体DNA的克隆。本发明在TAR克隆的基础上，利用半乳糖诱导Gal1-V10启动子产生I-SceI酶作用于I-SceI酶切位点，实现在酵母体内iTAR载体自身线性化，降低了空载体的污染，使转化效率提高到了73％左右。
附图说明
图1是pSH-SceI载体的酶切验证图，M表示marker，a表示BamHI酶切，b表示PstI酶切。
图2是pSH-SceI的质粒图谱。
图3是pSWB载体的酶切验证图，M表示marker，a表示XbaI酶切，b表示HindIII酶切。
图4是pSWB的质粒图谱。
图5是pSHTB10质粒的酶切验证图，M表示marker，a表示FspI酶切，b表示PstI酶切。
图6是pSHTB10的质粒图谱。
图7是pSHTB10-HR12质粒的酶切验证图，M表示marker，a表示SpeI酶切，b表示NcoI酶切。
图8是pSHTB10-HR12的质粒图谱。
图9是pSHTB10-HR34质粒的酶切验证图，M表示marker，a表示KpnI酶切，b表示ScaI酶切。
图10是pSHTB10-HR34的质粒图谱。
图11是重组菌株E.coli BL21-hygR的PCR验证图。
图12是BY4742/pSHTB10-HR12捕捉含hygR元件的大片段DNA后平板上转化子的生长情况，a表示涂布在SG-URA平板上的转化子生长情况，b表示涂布在含200μg/mL潮霉素的SG-URA平板上的转化子生长情况。
图13是iTAR载体pSHTB10-HR12捕捉含hygR元件的DNA大片段后的酶切验证图，M表示marker，a表示PciI酶切。
图14是iTAR载体pSHTB10-HR34捕捉polymyxin基因簇片段后的酶切验证图，M表示marker，a表示NcoI酶切。
图15是Bacillus subtilis 168::pSHTB10和Bacillus subtilis 168::pmx的抑菌活性测试，a表示Bacillus subtilis 168::pSHTB10的发酵液的抑菌测试，b表示Bacillus subtilis 168::pmx的发酵液的抑菌测试。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面结合实施例和附图加以说明。
实施例一：iTAR载体的构建
1.重组载体pSH-SceI的构建，包括以下步骤：
(1)引物设计：人工设计合成特异性引物序列。
SceIFor:5'-cgatatcaagcttatggaattgtgagcggataacaattcatgcatatgaaaaacatcaa-3'；
SceIRev:5'-catccttagcgccgtaaatcaatttatttcaggaaagtttcgg-3'；
(2)PCR扩增：PCR反应体系配置如表一所示。
试剂名称 储备液浓度 加入PCR反应体系的体积
5×Q5Reaction Buffer 5× 10μL
5×Q5High GC Enhancer 5× 10μL
dNTPs 10mmol/L 1μL
Forward Primer 10μmol/L 2.5μL
Reverse Primer 10μmol/L 2.5μL
Q5High-Fidelity DNA Polymerase 5U/μL 0.5μL
DNA模板 50ng/μL 2μL
ddH<sub>2</sub>O 加ddH<sub>2</sub>O至终体积50μL
PCR程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸，30个循环；最后72℃延伸10min。所述DNA模板是pSW-2，引物是SceIFor/SceIRev，延伸时间是30s。将PCR产物I-SceI通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收的I-SceI DNA片段是长度为776bp的核酸片段。
(3)载体构建：将质粒pSH47用限制性内切酶ClaI酶切，回收线性DNA片段，并将其与I-SceI用Gibson Assembly的方式进行连接，并将连接产物转化至E.coli DH10B感受态细胞中，挑取阳性克隆验证，获得克隆载体pSH-SceI。pSH47质粒用限制性内切酶ClaI酶切后的片段大小分别为871bp和6108bp，回收的目的片段是长度为6108bp的DNA片段。pSH-SceI重组质粒用BamHI酶切后片段大小为6844bp，用PstI酶切后片段大小分别为3166bp和3678bp，验证图如图1所示：M表示marker，a表示BamHI酶切，b表示PstI酶切。构建完成的pSH-SceI质粒图谱如图2所示。
2.重组载体pSWB的构建，包括以下步骤：
(1)质粒酶切：将pDGICZ质粒DNA用限制性内切酶BamHI酶切，酶切后的片段大小分别为434bp、2033bp和8248bp，回收长度为434bp的Phbs-BleR DNA片段，再用限制性内切酶BamHI酶切pSW-2质粒DNA，回收线性化DNA片段pSW-2的长度为7457bp。
(2)载体构建：将经步骤2回收的Phbs-BleR和pSW-2线性DNA片段以摩尔比3:1的比例进行连接，在T4连接酶的作用下，于16℃连接2h，然后将连接产物转化至E.coli DH10B感受态细胞中，挑取阳性克隆验证，获得克隆载体pSWB。pSWB质粒用XbaI酶切后片段大小为7891bp，用HindIII酶切后片段大小分别为1438bp和6453bp，验证图如图3所示：M表示marker，a表示XbaI酶切，b表示HindIII酶切。构建完成的pSWB质粒图谱如图4所示。
3.质粒pSHTB10的构建，包括以下步骤：
(1)Minigene合成：
Gal1-V10:5'-gatccactagttctagaatccggggttttttctccttgacgtttaagtatagaggcatattgacaattttttgttgatacttttattacgtttgaataagaagtaatacaaaccgaaaacgttgaaagtattagttaaagtggttatgcagtttctgcatttatatatctgttaatagatcaaaaatcatcgcttcgctaattaattaccccagaaataaggctaaaaaactaatcgcattatcatcctatggttg-3'；
(2)引物设计：
vtbFor:5'-ggcttctaatccgtactagagctcactacagcagagccatgtag-3'；
vtbRev:5'-ttataattatttttatagcacgtgatgtacaaactgccgaac-3'；
pSHTB10For:5'-cgcattatcatcctatggttg-3'；
pSHTB10Rev:5'-ggattctagaactagtggatc-3'；
(3)PCR扩增：PCR反应体系是5×Q5PCR buffer 10μL，5×enhancer 10μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，引物(10μmol/L)各2.5μL，质粒DNA(约50ng/μL)2μL，Q5DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加ddH2O至50μL。PCR程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸，30个循环；最后72℃延伸10min。所述DNA模板分别是pSWB和pSHTB，引物分别是vtbFor/vtbRev和pSHTB10For/pSHTB10Rev，延伸时间分别是2min和4min。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收的目的DNA片段vtb的长度为3291bp的核酸片段，pSHTB10的长度为7712bp的核酸片段。
(4)载体构建：质粒pSH-SceI经限制性内切酶PmlI和SacI酶切，回收目标DNA片段，并将其与步骤(3)回收的vtb DNA片段以Gibson Assembly的方式连接，并将连接产物转化至E.coli DH10B感受态细胞中，挑取阳性克隆验证，获得克隆载体pSHTB。再将步骤(1)合成的Gal1-V10与步骤(3)回收的pSHTB10DNA片段以Gibson Assembly的方式连接，并将连接产物转化至E.coli DH10B感受态细胞中，挑取阳性克隆验证，获得克隆载体pSHTB10。pSH-SceI质粒用限制性内切酶pmlI和SacI酶切后的片段大小分别为2220bp和4624bp，回收的目的片段是长度为4624bp的DNA片段。pSHTB10质粒用FspI酶切后片段大小为7871bp，用PstI酶切后片段大小分别为3166bp和4705bp，验证图如图5所示：M表示marker，a表示FspI酶切，b表示PstI酶切。构建完成的pSHTB10质粒图谱如图6所示。
4.iTAR载体pSHTB10-HR12的构建，包括以下步骤：
(1)引物设计：
HR1For:5'-cattcgccattcaggctgcgtgcgctatgaccgggtattg-3'；
HR1Rev:5'-attaccctgttatccctagtaatgtgttcatccatcatcg-3'；
HR2For:5'-tagggataacagggtaatcggtaatggtgagtttgctg-3'；
HR2Rev:5'-gcccttcccaacagttgcgcatcactttccgtaccag-3'；
(2)PCR扩增：PCR反应体系是5×Q5PCR buffer 10μL，5×enhancer 10μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，引物(10μmol/L)各2.5μL，质粒DNA(约500ng/μL)2μL，Q5DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加ddH2O至50μL。PCR程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸，30个循环；最后72℃延伸10min。所述DNA模板均是E.coli BL21(DE3)基因组DNA，引物分别是HR1For/HR1Rev和HR2For/HR2Rev，延伸时间均是45s。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收的目的DNA片段HR1的长度为1013bp的核酸片段，HR2的长度为1008bp的核酸片段。
(3)载体构建：质粒pSHTB10经限制性内切酶FspI酶切，回收线性DNA片段，并将其与步骤(2)回收的HR1和HR2DNA片段以Gibson Assembly的方式连接，并将连接产物转化至E.coli DH10B感受态细胞中，挑取阳性克隆验证，获得克隆载体pSHTB10-HR12。pSHTB10质粒用限制性内切酶FspI酶切后的片段大小为7871bp。pSHTB10-HR12质粒用SpeI酶切后片段大小为9910bp，用NcoI酶切后片段大小分别为1989bp和7921bp，验证图如图7所示：M表示marker，a表示SpeI酶切，b表示NcoI酶切。构建完成的pSHTB10-HR12质粒图谱如图8所示。
5.iTAR载体pSHTB10-HR34的构建，包括以下步骤：
(1)引物设计：
HR3For:5'-caaataaggagtgtcaagaatggcttttgaaaaagaaac-3'；
HR3Rev:5'-attaccctgttatccctactccagaatgtagcggatgc-3'；
HR4For:5'-tagggataacagggtaataagtgaaacgaagagcatcg-3'；
HR4Rev:5'-caatgcatgtttctgagatctacggcatacacccaagcc-3'；
EctBFor:5'-ggcttgggtgtatgccgtagatctcagaaacatgcattg-3'；
EctBRev:5'-gcccttcccaacagttgctacagcgtaaccaagttgc-3'；
HRamyEFor:5'-cattcgccattcaggctgcggttgaagcggttatgcttg-3'；
HRamyERev:5'-gtttctttttcaaaagccattcttgacactccttatttg-3'；
(2)PCR扩增：PCR反应体系是5×Q5PCR buffer 10μL，5×enhancer 10μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，引物(10μmol/L)各2.5μL，质粒DNA(约500ng/μL)2μL，Q5DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加ddH2O至50μL。PCR程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸，30个循环；最后72℃延伸10min。合成HR3、HR4和EctB DNA片段的模板均是Paenibacilluspolymyxa SQR-21基因组DNA，合成HRamyE DNA片段的模板是Bacillus subtilis 168基因组DNA。引物分别是HR3For/HR3Rev、HR4For/HR4Rev、EctBFor/EctBRev和HRamyEFor/HRamyERev，延伸时间分别是45s、45s、1min和45s。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收的目的DNA片段HR3的长度为1090bp的核酸片段，HR4的长度为1136bp的核酸片段，EctB的长度为1605bp的核酸片段，HRamyE的长度为1083bp的核酸片段。
(3)载体构建：质粒pSHTB10经限制性内切酶FspI酶切，回收线性DNA片段，并将其与步骤(2)回收的HR3、HR4、EctB和HRAmyE DNA片段以Gibson Assembly的方式连接，并将连接产物转化至E.coli DH10B感受态细胞中，挑取阳性克隆验证，获得克隆载体pSHTB10-HR34。pSHTB10-HR34质粒用KpnI酶切后片段大小为12653bp，用ScaI酶切后片段大小分别为3707bp和8946bp，验证图如图9所示：M表示marker，a表示KpnI酶切，b表示ScaI酶切。构建完成的pSHTB10-HR34质粒图谱如图10所示。
琼脂糖凝胶电泳参见《分子克隆实验指南》中琼脂糖凝胶电泳的方法，胶回收采用qiagen胶回收试剂盒，大肠杆菌化学转化法参见《分子克隆实验指南》中氯化钙制备和感受态转化大肠杆菌的方法。所述酶切方法参照限制性内切酶说明书，连接体系和方法参见Gibson Assembly和T4连接酶说明书。
实施例二：一种iTAR载体pSHTB10-HR12在捕捉含hygR元件的DNA大片段中的应用，包括以下步骤：
1.重组菌株E.coli BL21-hygR的构建
(1)引物设计：
TE7For:5'-cagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagtacgagcttgctcctgatc-3'；
TE7Rev:5'-gtatccagcagcctgattcggctgagtgaacatcagttattcctttgccctcggac-3'；
P1:5'-gagcgtcaacttaaagctg-3'；
P2:5'-gaagtggtacggcgatgcgc-3'；
P3:5'-gtcgatgcgacgcaatcgtc-3'；
P4:5'-gtccgactctaagatgtcac-3'；
(2)PCR扩增：PCR反应体系是5×Q5PCR buffer 10μL，5×enhancer 10μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，引物(10μmol/L)各2.5μL，质粒DNA(约50ng/μL)2μL，Q5DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加ddH2O至50μL。PCR程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸，30个循环；最后72℃延伸10min。所述DNA模板是pPICZαA-hygR，引物是TE7For/TE7Rev，延伸时间是1min。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收的TE7DNA片段是长度为1734bp的核酸片段。
(3)E.coli BL21/pKD46感受态细胞制备：于新鲜平板上接种E.coli BL21/pKD46单克隆，30℃培养过夜，然后1％转接到20mL含100μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养至OD600到0.2，添加20％的阿拉伯糖200μL，再培养到OD600至0.5；冰浴10min后，在4000rpm，4℃下离心5min收集细胞。然后用冰浴的0.1mol/L的氯化钙处理20min；在4000rpm，4℃下离心5min收集细胞。最后，悬浮在1mL含15％甘油的0.1mol/L氯化钙中。
(4)菌株构建：将步骤(2)回收的TE7DNA片段转化至步骤(3)的E.coli BL21/pKD46感受态细胞中，涂布在含100μg/mL潮霉素的LB平板上，在37℃培养箱中培养16h，挑取单克隆验证，获得重组菌株E.coli BL21-hygR。重组菌株E.coli BL21-hygR通过PCR的方式验证，验证引物P1/P2和P3/P4。重组菌株E.coli BL21-hygR PCR扩增片段大小分别为489bp和800bp，验证图如图11所示：M表示marker，a表示由引物P1/P2扩增，b表示由引物P3/P4扩增。
2.含hygR元件的DNA大片段的酶切与克隆
(1)Minigene合成：
S1:5'-gactgacactgataatacgactcactataggcgtgcgatagcccatagaagttttagagctagaaatagcaagtt-3'；
S2:5'-gactgacactgataatacgactcactatagggtggcccccaccatcggcagttttagagctagaaatagcaagtt-3'；
(2)E.coli BL21-hygR基因组酶切：体外转录DNA片段S1和S2，回收得到gRNA-1和gRNA-2。将BL21-hygR基因组DNA与Cas9酶，gRNA-1和gRNA-2混合，酶切体系是BL21-hygR基因组DNA(约25μg/μL)20μL，Cas9酶(70pmol)1μL，gRNA-1(5μg)1μL，gRNA-2(5μg)1μL，Cas9缓冲液4μL，加ddH2O至40μL，37℃过夜酶切，回收酶切产物。
(3)BY4742/pSHTB10-HR12感受态细胞制备：将iTAR载体pSHTB10-HR12转化到酿酒酵母BY4742中，涂布于SD-URA平板，挑取阳性克隆于28℃培养过夜，然后1％转接到50mLYPD培养基中，在28℃，200rpm的条件下培养至OD600到0.4，将菌体用无菌水洗涤两次，重新悬浮在含2％半乳糖的50mL YEP-lactate培养基中，在28℃，200rpm的条件下培养2h。3000g离心5min，收集细胞。然后用25mL无菌水悬浮细胞，3000g离心5min。再用25mL无菌水悬浮细胞，3000g离心5min。最后，悬浮细胞在500μL无菌水中，以每管100μL分装感受态细胞。
(4)捕捉大片段：将纯化后的酶切产物(1μg)转化至经半乳糖诱导的BY4742/pSHTB10-HR12感受态细胞中，分别取100μL转化液涂布在SG-URA平板上和含200μg/mL潮霉素SG-URA平板，在28℃培养箱中培养4～5天，挑取阳性克隆验证，获得捕捉质粒pSHTB10-HygR，如图12所示，a表示涂布在在SG-URA平板上的转化子生长情况，b表示涂布在含200μg/mL潮霉素的SG-URA平板上的转化子生长情况。从图12中可以看出，在SG-URA平板上的转化子的数目为33个，在含200μg/mL潮霉素的SG-URA平板上的转化子的数目为24个。经过三次重复试验，得出iTAR载体捕捉含hygR的大片段DNA的阳性克隆率为73.2％。pSHTB10-HygR用PciI酶切后的片段大小分别是2082bp、3027bp、4622bp、5827bp、6928bp、16660bp和19759bp，验证图如图13所示：M表示marker，a表示PciI酶切。
细菌DNA提取方法参见《精编分子生物学实验指南》中从细菌中制备基因组DNA的方法，酵母菌转化方法参见《精编分子生物学实验指南》中乙酸锂转化方法，所述DNA转录采用NEB体外转录试剂盒，酶切方法参照限制性内切酶说明书，酶切产物用QIAamp试剂盒纯化。
实施例三：一种iTAR载体pSHTB10-HR34在捕捉polymyxin基因簇中的应用，包括以下步骤：
(1)Minigene合成：
S3:5'-gactgacactgataatacgactcactataggatatctaaaacgtgcgccggttttagagctagaaatagcaagtt-3'；
S4:5'-gactgacactgataatacgactcactataggcttttaccgatgaagagaggttttagagctagaaatagcaagtt-3'；
(2)Paenibacillus polymyxa SQR-21基因组酶切：体外转录DNA片段S3和S4，回收得到gRNA-3和gRNA-4。将SQR-21基因组DNA与Cas9酶，gRNA-3和gRNA-4混合，酶切体系是SQR-21基因组DNA(约25μg/μL)20μL，Cas9酶(70pmol)1μL，gRNA-1(5μg)1μL，gRNA-2(5μg)1μL，Cas9缓冲液4μL，加ddH2O至40μL，37℃过夜酶切，回收酶切产物。
(3)polymyxin基因簇捕捉：将纯化后的酶切产物(1μg)转化至经半乳糖诱导的BY4742/pSHTB10-HR34感受态细胞中，涂布SG-URA平板，在28℃培养箱中培养4～5天，挑取阳性克隆验证，获得捕捉质粒pSHTB10-pmx。pSHTB10-pmx用NcoI酶切后的片段大小分别是116bp、1767bp、2953bp、3245bp、4995bp、17228bp和19829bp，验证图如图14所示：M表示marker，a表示NcoI酶切。
(4)polymyxin表达：将质粒pSHTB10和pSHTB10-pmx分别电转化到Bacillussubtilis 168感受态中，涂布在含25μg/ml博来霉素的LB平板上，挑取阳性克隆，得到重组菌株Bacillus subtilis168::pSHTB10和Bacillus subtilis 168::pmx。挑取Bacillussubtilis 168::pSHTB10和Bacillus subtilis168::pmx单菌落分别接种于10mL GSC培养基中，于37℃培养24h，然后1％分别转接到50mL GSC培养基中，于30℃培养24h。
(5)抑菌活性测试：将质粒pCMrfp转化到E.coli DH10B感受态细胞中，挑取阳性克隆于10mL LB培养基中，过夜培养。取300μL培养液均匀涂布在含0.2％阿拉伯糖的LB平板上，待平板晾干，分别取经步骤(4)培养的Bacillus subtilis 168::pSHTB10和Bacillussubtilis 168::pmx发酵液各5μL滴在平板上，过夜培养，测试其抑菌活性。活性测试如图15所示，a表示Bacillus subtilis 168::pSHTB10的发酵液的抑菌测试，b表示Bacillussubtilis 168::pmx的发酵液的抑菌测试。从图15可以看出，Bacillus subtilis168::pSHTB10作为对照，没有产生抑菌圈，而Bacillus subtilis 168::pmx产生了抑菌圈，由此说明，利用iTAR克隆技术成功捕获了polymyxin基因簇，通过将polymyxin基因簇转移至Bacillus subtilis 168基因组上的方式，使该基因簇成功表达，产生了抑菌物质，抑制了E.coli DH10B/pCMrfp，故此产生了抑菌圈的效果。
细菌DNA提取方法参见《精编分子生物学实验指南》中从细菌中制备基因组DNA的方法，酵母菌转化方法参见《精编分子生物学实验指南》中乙酸锂转化方法，枯草芽孢杆菌转化方法参见《分子克隆实验指南》中的电击转化方法，所述DNA转录采用NEB体外转录试剂盒，酶切方法参照限制性内切酶说明书，酶切产物用QIAamp试剂盒纯化。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 诱导型酵母转化重组系统的构建及其应用
<141> 2017-12-12
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(59)
<223> primer
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cgatatcaag cttatggaat tgtgagcgga taacaattca tgcatatgaa aaacatcaa 59
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<223> primer
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catccttagc gccgtaaatc aatttatttc aggaaagttt cgg 43
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<223> Synthetic DNA
<400> 26
gatccactag ttctagaatc cggggttttt tctccttgac gtttaagtat agaggcatat 60
tgacaatttt ttgttgatac ttttattacg tttgaataag aagtaataca aaccgaaaac 120
gttgaaagta ttagttaaag tggttatgca gtttctgcat ttatatatct gttaatagat 180
caaaaatcat cgcttcgcta attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat 240
tatcatccta tggttg 256
<210> 4
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<212> DNA
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<220>
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ggcttctaat ccgtactaga gctcactaca gcagagccat gtag 44
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ttataattat ttttatagca cgtgatgtac aaactgccga ac 42
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<222> (1)..(21)
<223> primer
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cgcattatca tcctatggtt g 21
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attaccctgt tatccctagt aatgtgttca tccatcatcg 40
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<221> misc_feature
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gcccttccca acagttgcgc atcactttcc gtaccag 37
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caaataagga gtgtcaagaa tggcttttga aaaagaaac 39
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attaccctgt tatccctact ccagaatgta gcggatgc 38
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<223> primer
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gtttcttttt caaaagccat tcttgacact ccttatttg 39
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cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagtacg agcttgctcc tgatc 55
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gtatccagca gcctgattcg gctgagtgaa catcagttat tcctttgccc tcggac 56
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gagcgtcaac ttaaagctg 19
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gtcgatgcga cgcaatcgtc 20
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<223> primer
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gtccgactct aagatgtcac 20
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gactgacact gataatacga ctcactatag gcgtgcgata gcccatagaa gttttagagc 60
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gactgacact gataatacga ctcactatag ggtggccccc accatcggca gttttagagc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
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<223> Synthetic DNA
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gactgacact gataatacga ctcactatag gatatctaaa acgtgcgccg gttttagagc 60
tagaaatagc aagtt 75
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(75)
<223> Synthetic DNA
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gactgacact gataatacga ctcactatag gcttttaccg atgaagagag gttttagagc 60
tagaaatagc aagtt 75
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<223> plasmid
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cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 180
tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 240
gcaccatacc acagcttttc aattcaattc atcatttttt ttttattctt ttttttgatt 300
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<220>
<221> misc_feature
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<223> plasmid
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cgaggcgctg caaaacaagg tcattttcca cgtcaacaag gacgtgaaga tcacctacac 10920
cggcgtcgag ctgcgggccg acgatgacga actggtgtgg cagcaggtgt tggagtacgc 10980
gaagcgcacc cctatcggcg agccgatcac cttcacgttc tacgagcttt gccaggacct 11040
gggctggtcg atcaatggcc ggtattacac gaaggccgag gaatgcctgt cgcgcctaca 11100
ggcgacggcg atgggcttca cgtccgaccg cgttgggcac ctggaatcgg tgtcgctgct 11160
gcaccgcttc cgcgtcctgg accgtggcaa gaaaacgtcc cgttgccagg tcctgatcga 11220
cgaggaaatc gtcgtgctgt ttgctggcga ccactacacg aaattcacat gggagaagta 11280
ccgcaagctg tcgccgacgg cccgacggat gttcgactat ttcagctcgc accgggagcc 11340
gtacccgctc aagctggaaa ccttccgcct catgtgcgga tcggattcca cccgcgtgaa 11400
gaagtggcgc gagcaggtcg gcgaagcctg cgaagagttg cgaggcagcg gcctggtgga 11460
acacgcctgg gtcaatgatg acctggtgca ttgcaaacgc tagggccttg tggggtcagt 11520
tccggctggg ggttcagcag ccaccggcat gcaagcttgc tagagggtca gctttatgct 11580
tgtaaaccgt tttgtgaaaa aatttttaaa ataaaaaagg ggacctctag ggtccccaat 11640
taattagtaa tataatctat taaaggtcat tcaaaaggtc atccaccgga tcaattcccc 11700
tgctcgcgca ggctgggtgc caagctctcg ggtaacatca aggcccgatc cttggtagtc 11760
ggcaaataat gtctaacaat tcgttcaagc cgacgccgct tcgcggcgcg gcttaactca 11820
agcgttagat gcactaagca cataattgct cacagccaaa ctatcaggtc aagtctgctt 11880
ttattatttt taagcgtgca taataagccc tacacaaatt gggagatata tcatgaaagg 11940
ctggcttttt cttgttatcg caatagttgg cgaagtaatc gcaacatccg cattaaaatc 12000
tagcgagggc tttactaagc tgatccggtg gatgaccttt tgaatgacct ttaatagatt 12060
atattactaa ttaattgggg accctagagg tccccttttt tattttaaaa attttttcac 12120
aaaacggttt acaagcataa agctgactct agctagagga tccttgatat ggctttttat 12180
atgtgttact ctacatacag aaaggaggaa ctaaatatgg ccaagttgac cagtgccgtt 12240
ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg 12300
ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg 12360
ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg 12420
cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac 12480
gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg 12540
cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg aggatcccct 12600
cgacttatta tttcaggaaa gtttcggagg agatagtgtt cggcagtttg tac 12653

Claims (9)

1.重组载体pSHTB10，其特征在于，为将质粒pSH-SceI中的colE1、AmpR和PGal1基因元件替换成pSWB中的oriV、trfA和BleRDNA片段和Gal1-V10 DNA合成片段，形成全长序列为SEQID NO.32的质粒pSHTB10；所述的质粒pSH-SceI是将质粒pSH47中的Cre元件替换成I-SceI基因片段；所述的质粒pSWB是将质粒pDGICZ中的Phbs-BleR基因元件插入到质粒pSW-2中。
2.基于如权利要求1所述的重组载体pSHTB10的iTAR载体，其特征在于，为将质粒pSHTB10用限制性内切酶FspI酶切，通过在酶切位点处插入与目标线性大片段DNA两端具有同源性的两个同源臂并在同源臂间插入I-SceI酶切位点构建而成。
3.如权利要求2所述的iTAR载体，其特征在于，所述的iTAR载体为pSHTB10-HR12，为将pSHTB10用限制性内切酶FspI酶切，在该酶切位点处插入同源臂HR1、同源臂HR2和同源臂间的I-SceI酶切位点，形成全长序列为SEQ ID NO.33的iTAR载体pSHTB10-HR12。
4.如权利要求2所述的iTAR载体，其特征在于，所述的iTAR载体为pSHTB10-HR34，为将pSHTB10用限制性内切酶FspI酶切，在该酶切位点处插入同源臂HR3、同源臂HR4和同源臂间的I-SceI酶切位点，形成全长序列为SEQ ID NO.34的iTAR载体pSHTB10-HR34。
5.如权利要求1所述的重组载体pSHTB10的构建方法，其特征在于，包括引物设计、基因克隆和载体构建，具体为通过合成Gal1-V10基因片段，设计引物从质粒pSWB上PCR扩增oriV、trfA和BleR目标片段，限制性内切酶PmlI和SacI酶切质粒pSH-SceI，将Gal1-V10、oriV、trfA、BleR和pSH-SceI目的片段连接，得到质粒pSHTB10；所述的质粒pSH-SceI的构建方法是通过PCR扩增I-SceIDNA序列，将其与限制性内切酶ClaI酶切的pSH47目的片段连接，得到质粒pSH-SceI；所述的质粒pSWB的构建方法是通过限制性内切酶BamHI酶切质粒pDGICZ和pSW-2，将其目的片段连接，得到质粒pSWB。
6.如权利要求2所述的iTAR载体的构建方法，其特征在于，包括引物设计、基因克隆和载体构建，具体为通过合成引物PCR扩增相应的两个同源臂片段及I-SceI酶切位点，与经不破坏pSHTB10功能元件的限制性内切酶酶切回收的目的DNA片段连接，得到相应的iTAR载体。
7.如权利要求3所述的iTAR载体的构建方法，其特征在于，包括引物设计、基因克隆和载体构建，具体为通过合成引物PCR扩增HR1和HR2 DNA片段，与经限制性内切酶FspI酶切的pSHTB10片段连接，得到iTAR载体pSHTB10-HR12。
8.如权利要求4所述的iTAR载体的构建方法，其特征在于，包括引物设计、基因克隆和载体构建，具体为通过合成引物PCR扩增HR3和HR4 DNA片段，与经限制性内切酶FspI酶切的pSHTB10片段连接，得到iTAR载体pSHTB10-HR34。
9.如权利要求2～4所述的iTAR载体在捕捉大片段DNA中的应用，其特征在于，具体应用方法如下：
步骤1：针对目标线性大片段DNA的两端设计合成相应DNA片段，用体外转录的方式获得gRNA；
步骤2：利用Cas9核酸酶和gRNA可以特异性切割DNA的特性得到目标线性DNA；
步骤3：将iTAR载体转化到酿酒酵母中，通过将目标线性DNA片段转化至经半乳糖诱导的且含iTAR载体的酿酒酵母中，筛选阳性克隆，得到相应的捕捉载体；
步骤4：将捕捉载体转移至相应的模式菌株中使其表达，实现外源大片段DNA的克隆和表达。
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