CN114957448B - 一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株和α-乳白蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种优化了氨基酸序列的α‑乳白蛋白，所述α‑乳白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了编码该α‑乳白蛋白的基因、插入有该基因的表达载体、高表达该α‑乳白蛋白的酵母菌株、制备该乳白蛋白的方法以及一种人造乳。通过上述技术方案，本发明得到了致敏性几乎消失的α‑乳白蛋白，并且还能够使得α‑乳白蛋白在毕赤酵母中高表达，因此可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。

Description

一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株和α-乳白蛋白及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体地，涉及一种优化了氨基酸序列的α-乳白蛋白、编码该α-乳白蛋白的基因、插入有该基因的表达载体、高效表达该α-乳白蛋白的酵母菌株、制备该α-乳白蛋白的方法以及一种人造乳。

背景技术

近些年来，在食品、洗涤剂、造纸、化学、制药和药妆行业中，为了克服天然来源蛋白质提取的困难，并且降低成本，重组蛋白质被广泛使用。

毕赤酵母是目前应用广泛的重组蛋白高效表达平台，也是是合成生物学和现代发酵工业中常用的真核底盘细胞，在工农业及医药等行业均有广泛应用。可溶性表达量偏低已成为限制研究目标蛋白质结构与功能的重大阻碍。随着合成生物学和基因工程技术的发展，越来越多的科研工作者利用DNA重组方法生产有用的蛋白质，这需要高活性、高产量的蛋白质表达系统。

另外目前，野生型的α-乳白蛋白仍然具有较高的致过敏性。

发明内容

本发明的目的在于提高重组α-乳白蛋白的表达量并且降低α-乳白蛋白的致过敏性。

本发明的发明人基于骆驼α-乳白蛋白的氨基酸序列，对人α-乳白蛋白的氨基酸序列进行了优化，得到了具有较低致过敏性的α-乳白蛋白，并且还对表达质粒进行了优化，使得α-乳白蛋白能够在毕赤酵母中进行高表达。

本发明提供了一种优化了氨基酸序列的α-乳白蛋白，所述α-乳白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码如上所述的α-乳白蛋白的基因。

可选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的α-乳白蛋白的表达框。

可选地，该表达载体插入有人工多顺反子α-乳白蛋白表达模块；所述人工多顺反子α-乳白蛋白表达模块包括多个拷贝的如上所述的基因。

可选地，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株，所述酵母菌株为导入有如上所述的表达载体的毕赤酵母。

本发明还提供了一种制备α-乳白蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的酵母菌株进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述α-乳白蛋白。

可选地，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、10-30g/L的葡萄糖和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。

本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的α-乳白蛋白。

通过上述技术方案，本发明得到了致敏性几乎消失的α-乳白蛋白，并且还能够使得α-乳白蛋白在毕赤酵母中高表达，因此可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为α-乳白蛋白人工高效表达模块的构建的结构示意图。

图2为靶标α-乳白蛋白的酵母菌株高效表达和纯化结果。M，标准分子量；1-2，对照酵母菌株GS-LA的表达产物；3-4，表达模块菌株GS-MLA的表达产物。

图3为α-乳白蛋白的致敏性ELISA检测分析结果。

序列表说明

SEQ ID NO.1，人工优化的α-乳白蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2，人工优化的α-乳白蛋白的基因DNA序列；

SEQ ID NO.3，人工优化α-乳白蛋白的高效表达模块核酸序列；

SEQ ID NO.4，人工优化α-乳白蛋白的高效表达载体的核酸序列。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种优化了氨基酸序列的α-乳白蛋白，所述α-乳白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，SEQ ID NO.1的序列中，1-123位的氨基酸为α-乳白蛋白的主体，末尾的6个氨基酸为纯化标签。

本发明还提供了编码如上所述的乳白蛋白的基因。其中，编码基因的核苷酸序列可以按照密码子规则推导出来，根据密码子简并性的规则，可以有多个不同的核苷酸序列编码如上所述的α-乳白蛋白的氨基酸序列。

为了α-乳白蛋白的高效表达，考虑到毕赤酵母的密码子偏好，优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的α-乳白蛋白的表达框。

其中，可以根据宿主的适配性，选择合适的表达载体，例如淼灵生物公司的pPIC9K表达载体。

可选地，如图1所示，该表达载体插入有人工多顺反子α-乳白蛋白表达模块；所述人工多顺反子α-乳白蛋白表达模块包括多个拷贝的如上所述的基因。相邻的两个拷贝的基因之间可以插入有基因串联序列，例如IRES序列。

可选地，所述表达载体为pPIC-MLA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株，所述酵母菌株为导入有如上所述的表达载体的毕赤酵母。

其中，毕赤酵母可以为各种商业使用的毕赤酵母表达菌株，例如淼灵生物公司的酵母表达菌株GS115。

本发明还提供了一种制备α-乳白蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的酵母菌株进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述α-乳白蛋白。

可选地，所述培养的条件可以包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、10-30g/L的葡萄糖和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。

本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的乳白蛋白。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。表达载体pPIC9K-His：为淼灵生物公司市售产品；酵母表达菌株GS115：为淼灵生物公司市售产品。

实施例1

如图1所示，本实施例举例说明人工多顺反子α-乳白蛋白表达模块的构建过程。

首先，利用化学合成法合成靶标优质α-乳白蛋白编码基因CAF-LA。

然后，构建多基因串联表达单元，组建靶标α-乳白蛋白表达功能模块。

接着，添加限制性内切酶BamH I与Not I序列连接酵母表达载体pPIC9K多克隆位点中构建载体pPIC-MLA。

再接着，利用限制性内切酶Sac I切割将验证正确的阳性重组表达载体pPIC-MLA，制备线性化质粒DNA，电击转化毕赤酵母GS115中。利用遗传霉素抗性平板筛选阳性重组酵母菌株，并利用PCR进行鉴定并测序。

鉴定结果和测序结果表明，成功构建了4拷贝的靶标优质α-乳白蛋白编码基因CAF-LA的串联表达单元，由此组建了优质α-乳白蛋白基因表达功能模块(图1)。将表达模块连接载体pPIC9K上，构建重组表达质粒pPIC-MLA，并转化至毕赤酵母中进行整合。研究结果显示，成果构建了优化α-乳白蛋白酵母表达酵母菌株GS-MLA。使用同样方法，获得单拷贝α-乳白蛋白基因的表达菌株GS-LA。

实施例2

本实施例用于举例说明α-乳白蛋白在毕赤酵母中的高效表达。

本实施例使用实施例1构建的α-乳白蛋白表达模块菌株GS-MLA和对照酵母表达菌株GS-LA。

首先，挑取乳蛋白表达菌株至种子液培养基(培养基成分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖)中，在30℃下培养20小时。

接着，以2％浓度转接与100mL发酵培养基(培养基成分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖)中，在30℃下转速220rpm下摇瓶发酵72小时，每隔24h补加一次甲醇(甲醇的补加量为5mL/L)。

然后，离心收集发酵上清液，利用人工乳蛋白的His-Tag，Ni-NTA-resin纯化柱纯化乳蛋白，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测靶标乳蛋白的表达情况(图2)。

实验结果显示，构建的带有α-乳白蛋白基因表达功能模块的酵母表达菌株GS-MLA能够通过摇瓶发酵诱导α-乳白蛋白高效异源表达。结果显示，通过组装功能模块表达，α-乳白蛋白在胞外表达量显著提高。表达单拷贝α-乳白蛋白菌株GS-LA的胞外浓度为4.32mg/L，而设计构建的携带功能模块的表达菌株GS-MLA的胞外α-乳白蛋白浓度为13.76mg/L，表达量提高了3.18倍。

实施例3

本实施例举例说明重组α-乳白蛋白的ELISA致敏性分析。

用CBS溶液将乳蛋白样品稀释至5μgmL-1，将每种样品100μL置于96孔板中，并在4℃下包被过夜。

用Tween 20/PBS(PBS-T)洗涤4次后，添加350μL 5％脱脂奶粉，并在37℃下孵育1小时。再次洗涤，然后添加BSA稀释的变应原血清(1：500)，并在室温下孵育3小时。洗涤后，将100μL过氧化物酶标记的山羊抗人/大鼠IgE抗体(1：5000)添加到孔中，然后在室温下孵育板1h。

用PBS-T洗涤5次并用PBS洗涤3次后，将200μL TMB溶液添加至孔中30分钟，然后使用50μL 2M H₂SO₄终止反应。

用分光光度计在450nm下测量值。对非过敏性血清进行相同的步骤，以确定非特异性结合的程度，将其从测试血清数据中减去。对每个样品进行三个平行实验，并将平均值作为最终数据。

通过ELISA体外免疫实验对构建表达的人工重组乳蛋白进行致敏性表征。利用乳蛋白抗体血清对牛乳蛋白与人工重组乳蛋白进行致敏性分析。研究结果显示，牛α-乳白蛋白(Bta-LA)具有强的IgE结合能力(OD值为0.933)，而经过结构序列人工重组乳蛋白(GAF-LA)的结合能力(OD值为0.016)显著降低(图3)。其中，人工重组α-乳白蛋白GAF-LA的IgE结合能力降低了98％以上，应变反应与阴性空白对照相似，蛋白致敏性几近消失。研究结果显示，人工重组α-乳白蛋白成功地降低了免疫反应原性。

本发明利用合成生物学方法人工设计构建了低致敏性的优化的乳白蛋白，提高乳蛋白的应用性能，实现靶标乳蛋白全局优化与生物合成，能够用于食品、保健品、医疗、饲料及蛋白产品等领域。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株和α-乳白蛋白及其应用

<130> 26132CAAS-B-ZW-R

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Gln Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Ile Asp

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Gly Ile Thr Leu Ala Glu Trp Ile Cys Ile Ile Phe His

20 25 30

Met Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Glu Asn Asn Glu Asn Arg

35 40 45

Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys Lys Ser Ser

50 55 60

Gln Val Pro Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys Asp Lys Phe

65 70 75 80

Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Lys Met Cys Ala Lys Lys Ile Leu

85 90 95

Asp Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Trp Leu Ala His Lys Pro Leu Cys Ser

100 105 110

Glu Lys Leu Glu Gln Trp Gln Cys Glu Lys Trp His His His His His

115 120 125

His

<210> 2

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagcaattta caaaatgtga gttgtcccag ctgttgaagg acatcgatgg atatggcggc 60

attacccttg ccgagtggat ttgtattatc ttccacatgt ctggttatga tacccaagcc 120

attgttgaaa acaatgaaaa ccgtgagtat ggccttttcc agattaacaa caagatttgg 180

tgcaaatcat cacaggttcc tcagagtagg aacatttgcg atatttcatg tgacaagttt 240

ttggacgatg acttgactga cgacaagatg tgcgcaaaga agattttgga tattaaagga 300

attgattact ggcttgctca taagccatta tgttctgaaa agttggaaca atggcaatgt 360

gagaagtggc atcatcacca tcaccattaa 390

<210> 3

<211> 2876

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctattc caagattccc atctatcttc actgctgttt tgttcgctgc ttcctccgct 60

ttggctgctc cagtcaacac tactaccgag gacgaaactg ctcaaattcc agctgaggct 120

gtcatcggtt actctgacct ggagggtgac ttcgacgttg ctgtcttgcc attctccaac 180

tccaccaaca acggtttgtt ggaggaggct gaagctgaag ctgaacctaa attcatcaac 240

actactatcg cttctatcgc tgctaaggag gagggtgttt ccctcgagaa aagagaggct 300

gaagcttacg tagaattcaa gcaatttaca aaatgtgagt tgtcccagct gttgaaggac 360

atcgatggat atggcggcat tacccttgcc gagtggattt gtattatctt ccacatgtct 420

ggttatgata cccaagccat tgttgaaaac aatgaaaacc gtgagtatgg ccttttccag 480

attaacaaca agatttggtg caaatcatca caggttcctc agagtaggaa catttgcgat 540

atttcatgtg acaagttttt ggacgatgac ttgactgacg acaagatgtg cgcaaagaag 600

attttggata ttaaaggaat tgattactgg cttgctcata agccattatg ttctgaaaag 660

ttggaacaat ggcaatgtga gaagtggcat catcaccatc accattaatg ttgagtcaat 720

caaacactca acagatggct attccaagat tcccatctat cttcactgct gttttgttcg 780

ctgcttcctc cgctttggct gctccagtca acactactac cgaggacgaa actgctcaaa 840

ttccagctga ggctgtcatc ggttactctg acctggaggg tgacttcgac gttgctgtct 900

tgccattctc caactccacc aacaacggtt tgttggagga ggctgaagct gaagctgaac 960

ctaaattcat caacactact atcgcttcta tcgctgctaa ggaggagggt gtttccctcg 1020

agaaaagaga ggctgaagct tacgtagaat tcaagcaatt tacaaaatgt gagttgtccc 1080

agctgttgaa ggacatcgat ggatatggcg gcattaccct tgccgagtgg atttgtatta 1140

tcttccacat gtctggttat gatacccaag ccattgttga aaacaatgaa aaccgtgagt 1200

atggcctttt ccagattaac aacaagattt ggtgcaaatc atcacaggtt cctcagagta 1260

ggaacatttg cgatatttca tgtgacaagt ttttggacga tgacttgact gacgacaaga 1320

tgtgcgcaaa gaagattttg gatattaaag gaattgatta ctggcttgct cataagccat 1380

tatgttctga aaagttggaa caatggcaat gtgagaagtg gcatcatcac catcaccatt 1440

aacaatcaaa catggctatt ccaagattcc catctatctt cactgctgtt ttgttcgctg 1500

cttcctccgc tttggctgct ccagtcaaca ctactaccga ggacgaaact gctcaaattc 1560

cagctgaggc tgtcatcggt tactctgacc tggagggtga cttcgacgtt gctgtcttgc 1620

cattctccaa ctccaccaac aacggtttgt tggaggaggc tgaagctgaa gctgaaccta 1680

aattcatcaa cactactatc gcttctatcg ctgctaagga ggagggtgtt tccctcgaga 1740

aaagagaggc tgaagcttac gtagaattca agcaatttac aaaatgtgag ttgtcccagc 1800

tgttgaagga catcgatgga tatggcggca ttacccttgc cgagtggatt tgtattatct 1860

tccacatgtc tggttatgat acccaagcca ttgttgaaaa caatgaaaac cgtgagtatg 1920

gccttttcca gattaacaac aagatttggt gcaaatcatc acaggttcct cagagtagga 1980

acatttgcga tatttcatgt gacaagtttt tggacgatga cttgactgac gacaagatgt 2040

gcgcaaagaa gattttggat attaaaggaa ttgattactg gcttgctcat aagccattat 2100

gttctgaaaa gttggaacaa tggcaatgtg agaagtggca tcatcaccat caccattaac 2160

aatcaaacat ggctattcca agattcccat ctatcttcac tgctgttttg ttcgctgctt 2220

cctccgcttt ggctgctcca gtcaacacta ctaccgagga cgaaactgct caaattccag 2280

ctgaggctgt catcggttac tctgacctgg agggtgactt cgacgttgct gtcttgccat 2340

tctccaactc caccaacaac ggtttgttgg aggaggctga agctgaagct gaacctaaat 2400

tcatcaacac tactatcgct tctatcgctg ctaaggagga gggtgtttcc ctcgagaaaa 2460

gagaggctga agcttacgta gaattcaagc aatttacaaa atgtgagttg tcccagctgt 2520

tgaaggacat cgatggatat ggcggcatta cccttgccga gtggatttgt attatcttcc 2580

acatgtctgg ttatgatacc caagccattg ttgaaaacaa tgaaaaccgt gagtatggcc 2640

ttttccagat taacaacaag atttggtgca aatcatcaca ggttcctcag agtaggaaca 2700

tttgcgatat ttcatgtgac aagtttttgg acgatgactt gactgacgac aagatgtgcg 2760

caaagaagat tttggatatt aaaggaattg attactggct tgctcataag ccattatgtt 2820

ctgaaaagtt ggaacaatgg caatgtgaga agtggcatca tcaccatcac cattaa 2876

<210> 4

<211> 11862

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccatggcta ttccaagatt 960

cccatctatc ttcactgctg ttttgttcgc tgcttcctcc gctttggctg ctccagtcaa 1020

cactactacc gaggacgaaa ctgctcaaat tccagctgag gctgtcatcg gttactctga 1080

cctggagggt gacttcgacg ttgctgtctt gccattctcc aactccacca acaacggttt 1140

gttggaggag gctgaagctg aagctgaacc taaattcatc aacactacta tcgcttctat 1200

cgctgctaag gaggagggtg tttccctcga gaaaagagag gctgaagctt acgtagaatt 1260

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tgagaagtgg catcatcacc atcaccatta atgttgagtc aatcaaacac tcaacagatg 1680

gctattccaa gattcccatc tatcttcact gctgttttgt tcgctgcttc ctccgctttg 1740

gctgctccag tcaacactac taccgaggac gaaactgctc aaattccagc tgaggctgtc 1800

atcggttact ctgacctgga gggtgacttc gacgttgctg tcttgccatt ctccaactcc 1860

accaacaacg gtttgttgga ggaggctgaa gctgaagctg aacctaaatt catcaacact 1920

actatcgctt ctatcgctgc taaggaggag ggtgtttccc tcgagaaaag agaggctgaa 1980

gcttacgtag aattcaagca atttacaaaa tgtgagttgt cccagctgtt gaaggacatc 2040

gatggatatg gcggcattac ccttgccgag tggatttgta ttatcttcca catgtctggt 2100

tatgataccc aagccattgt tgaaaacaat gaaaaccgtg agtatggcct tttccagatt 2160

aacaacaaga tttggtgcaa atcatcacag gttcctcaga gtaggaacat ttgcgatatt 2220

tcatgtgaca agtttttgga cgatgacttg actgacgaca agatgtgcgc aaagaagatt 2280

ttggatatta aaggaattga ttactggctt gctcataagc cattatgttc tgaaaagttg 2340

gaacaatggc aatgtgagaa gtggcatcat caccatcacc attaacaatc aaacatggct 2400

attccaagat tcccatctat cttcactgct gttttgttcg ctgcttcctc cgctttggct 2460

gctccagtca acactactac cgaggacgaa actgctcaaa ttccagctga ggctgtcatc 2520

ggttactctg acctggaggg tgacttcgac gttgctgtct tgccattctc caactccacc 2580

aacaacggtt tgttggagga ggctgaagct gaagctgaac ctaaattcat caacactact 2640

atcgcttcta tcgctgctaa ggaggagggt gtttccctcg agaaaagaga ggctgaagct 2700

tacgtagaat tcaagcaatt tacaaaatgt gagttgtccc agctgttgaa ggacatcgat 2760

ggatatggcg gcattaccct tgccgagtgg atttgtatta tcttccacat gtctggttat 2820

gatacccaag ccattgttga aaacaatgaa aaccgtgagt atggcctttt ccagattaac 2880

aacaagattt ggtgcaaatc atcacaggtt cctcagagta ggaacatttg cgatatttca 2940

tgtgacaagt ttttggacga tgacttgact gacgacaaga tgtgcgcaaa gaagattttg 3000

gatattaaag gaattgatta ctggcttgct cataagccat tatgttctga aaagttggaa 3060

caatggcaat gtgagaagtg gcatcatcac catcaccatt aacaatcaaa catggctatt 3120

ccaagattcc catctatctt cactgctgtt ttgttcgctg cttcctccgc tttggctgct 3180

ccagtcaaca ctactaccga ggacgaaact gctcaaattc cagctgaggc tgtcatcggt 3240

tactctgacc tggagggtga cttcgacgtt gctgtcttgc cattctccaa ctccaccaac 3300

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gtagaattca agcaatttac aaaatgtgag ttgtcccagc tgttgaagga catcgatgga 3480

tatggcggca ttacccttgc cgagtggatt tgtattatct tccacatgtc tggttatgat 3540

acccaagcca ttgttgaaaa caatgaaaac cgtgagtatg gccttttcca gattaacaac 3600

aagatttggt gcaaatcatc acaggttcct cagagtagga acatttgcga tatttcatgt 3660

gacaagtttt tggacgatga cttgactgac gacaagatgt gcgcaaagaa gattttggat 3720

attaaaggaa ttgattactg gcttgctcat aagccattat gttctgaaaa gttggaacaa 3780

tggcaatgtg agaagtggca tcatcaccat caccattaag cggccgcgaa ttaattcgcc 3840

ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttacg agaagaccgg tcttgctaga 3900

ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgcctgagag atgcaggctt catttttgat 3960

acttttttat ttgtaaccta tatagtatag gatttttttt gtcattttgt ttcttctcgt 4020

acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc agctgatgaa tatcttgtgg taggggtttg 4080

ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt ggtatttccc actcctcttc agagtacaga 4140

agattaagtg agaagttcgt ttgtgcaagc ttatcgataa gctttaatgc ggtagtttat 4200

cacagttaaa ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg 4260

tcatcctcgg caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc 4320

cgggcctctt gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc 4380

tagcgctata tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc 4440

gctttggccg ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga 4500

tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatct atcgaatcta aatgtaagtt aaaatctcta 4560

aataattaaa taagtcccag tttctccata cgaaccttaa cagcattgcg gtgagcatct 4620

agaccttcaa cagcagccag atccatcact gcttggccaa tatgtttcag tccctcagga 4680

gttacgtctt gtgaagtgat gaacttctgg aaggttgcag tgttaactcc gctgtattga 4740

cgggcatatc cgtacgttgg caaagtgtgg ttggtaccgg aggagtaatc tccacaactc 4800

tctggagagt aggcaccaac aaacacagat ccagcgtgtt gtacttgatc aacataagaa 4860

gaagcattct cgatttgcag gatcaagtgt tcaggagcgt actgattgga catttccaaa 4920

gcctgctcgt aggttgcaac cgatagggtt gtagagtgtg caatacactt gcgtacaatt 4980

tcaacccttg gcaactgcac agcttggttg tgaacagcat cttcaattct ggcaagctcc 5040

ttgtctgtca tatcgacagc caacagaatc acctgggaat caataccatg ttcagcttga 5100

gacagaaggt ctgaggcaac gaaatctgga tcagcgtatt tatcagcaat aactagaact 5160

tcagaaggcc cagcaggcat gtcaatacta cacagggctg atgtgtcatt ttgaaccatc 5220

atcttggcag cagtaacgaa ctggtttcct ggaccaaata ttttgtcaca cttaggaaca 5280

gtttctgttc cgtaagccat agcagctact gcctgggcgc ctcctgctag cacgatacac 5340

ttagcaccaa ccttgtgggc aacgtagatg acttctgggg taagggtacc atccttctta 5400

ggtggagatg caaaaacaat ttctttgcaa ccagcaactt tggcaggaac acccagcatc 5460

agggaagtgg aaggcagaat tgcggttcca ccaggaatat agaggccaac tttctcaata 5520

ggtcttgcaa aacgagagca gactacacca gggcaagtct caacttgcaa cgtctccgtt 5580

agttgagctt catggaattt cctgacgtta tctatagaga gatcaatggc tctcttaacg 5640

ttatctggca attgcataag ttcctctggg aaaggagctt ctaacacagg tgtcttcaaa 5700

gcgactccat caaacttggc agttagttct aaaagggctt tgtcaccatt ttgacgaaca 5760

ttgtcgacaa ttggtttgac taattccata atctgttccg ttttctggat aggacgacga 5820

agggcatctt caatttcttg tgaggaggcc ttagaaacgt caattttgca caattcaata 5880

cgaccttcag aagggacttc tttaggtttg gattcttctt taggttgttc cttggtgtat 5940

cctggcttgg catctccttt ccttctagtg acctttaggg acttcatatc caggtttctc 6000

tccacctcgt ccaacgtcac accgtacttg gcacatctaa ctaatgcaaa ataaaataag 6060

tcagcacatt cccaggctat atcttccttg gatttagctt ctgcaagttc atcagcttcc 6120

tccctaattt tagcgttcaa caaaacttcg tcgtcaaata accgtttggt ataagaacct 6180

tctggagcat tgctcttacg atcccacaag gtggcttcca tggctctaag accctttgat 6240

tggccaaaac aggaagtgcg ttccaagtga cagaaaccaa cacctgtttg ttcaaccaca 6300

aatttcaagc agtctccatc acaatccaat tcgataccca gcaacttttg agttgctcca 6360

gatgtagcac ctttatacca caaaccgtga cgacgagatt ggtagactcc agtttgtgtc 6420

cttatagcct ccggaataga ctttttggac gagtacacca ggcccaacga gtaattagaa 6480

gagtcagcca ccaaagtagt gaatagacca tcggggcggt cagtagtcaa agacgccaac 6540

aaaatttcac tgacagggaa ctttttgaca tcttcagaaa gttcgtattc agtagtcaat 6600

tgccgagcat caataatggg gattatacca gaagcaacag tggaagtcac atctaccaac 6660

tttgcggtct cagaaaaagc ataaacagtt ctactaccgc cattagtgaa acttttcaaa 6720

tcgcccagtg gagaagaaaa aggcacagcg atactagcat tagcgggcaa ggatgcaact 6780

ttatcaacca gggtcctata gataacccta gcgcctggga tcatcctttg gacaactctt 6840

tctgccaaat ctaggtccaa aatcacttca ttgataccat tattgtacaa cttgagcaag 6900

ttgtcgatca gctcctcaaa ttggtcctct gtaacggatg actcaacttg cacattaact 6960

tgaagctcag tcgattgagt gaacttgatc aggttgtgca gctggtcagc agcataggga 7020

aacacggctt ttcctaccaa actcaaggaa ttatcaaact ctgcaacact tgcgtatgca 7080

ggtagcaagg gaaatgtcat acttgaagtc ggacagtgag tgtagtcttg agaaattctg 7140

aagccgtatt tttattatca gtgagtcagt catcaggaga tcctctacgc cggacgcatc 7200

gtggccgacc tgcagggggg gggggggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga aggtgttgct 7260

gactcatacc aggcctgaat cgccccatca tccagccaga aagtgaggga gccacggttg 7320

atgagagctt tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga acttttgctt tgccacggaa 7380

cggtctgcgt tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca actcagcaaa agttcgattt 7440

attcaacaaa gccgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt tacaaccaat 7500

taaccaattc tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat 7560

caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac 7620

cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa 7680

catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac 7740

catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct ttccagactt 7800

gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat 7860

tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac 7920

aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac 7980

ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccggggatc gcagtggtga 8040

gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt 8100

ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc 8160

catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac 8220

ctgattgccc gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg 8280

aatttaatcg cggcctcgag caagacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg 8340

tattactgtt tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg 8400

caatgtaaca tcagagattt tgagacacaa cgtggctttc cccccccccc ctgcaggtcg 8460

gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg 8520

aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag 8580

gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg 8640

cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg 8700

gagagcgtcg agtatctatg attggaagta tgggaatggt gatacccgca ttcttcagtg 8760

tcttgaggtc tcctatcaga ttatgcccaa ctaaagcaac cggaggagga gatttcatgg 8820

taaatttctc tgacttttgg tcatcagtag actcgaactg tgagactatc tcggttatga 8880

cagcagaaat gtccttcttg gagacagtaa atgaagtccc accaataaag aaatccttgt 8940

tatcaggaac aaacttcttg tttcgaactt tttcggtgcc ttgaactata aaatgtagag 9000

tggatatgtc gggtaggaat ggagcgggca aatgcttacc ttctggacct tcaagaggta 9060

tgtagggttt gtagatactg atgccaactt cagtgacaac gttgctattt cgttcaaacc 9120

attccgaatc cagagaaatc aaagttgttt gtctactatt gatccaagcc agtgcggtct 9180

tgaaactgac aatagtgtgc tcgtgttttg aggtcatctt tgtatgaata aatctagtct 9240

ttgatctaaa taatcttgac gagccaaggc gataaatacc caaatctaaa actcttttaa 9300

aacgttaaaa ggacaagtat gtctgcctgt attaaacccc aaatcagctc gtagtctgat 9360

cctcatcaac ttgaggggca ctatcttgtt ttagagaaat ttgcggagat gcgatatcga 9420

gaaaaaggta cgctgatttt aaacgtgaaa tttatctcaa gatctctgcc tcgcgcgttt 9480

cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct 9540

gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg 9600

tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat 9660

gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga 9720

tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 9780

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 9840

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 9900

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 9960

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 10020

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 10080

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 10140

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 10200

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 10260

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 10320

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 10380

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 10440

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 10500

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 10560

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 10620

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 10680

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 10740

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 10800

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 10860

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 10920

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 10980

agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 11040

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 11100

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 11160

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 11220

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 11280

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 11340

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 11400

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 11460

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 11520

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 11580

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 11640

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 11700

attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa 11760

ttaattctca tgtttgacag cttatcatcg ataagctgac tcatgttggt attgtgaaat 11820

agacgcagat cgggaacact gaaaaataac agttattatt cg 11862

Claims (9)

1.一种优化了氨基酸序列的α-乳白蛋白，其特征在于，所述α-乳白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.编码权利要求1所述的α-乳白蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有SEQ ID NO. 3所示的表达框。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

6.一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为导入有权利要求4或5所述的表达载体的毕赤酵母。

7.一种制备α-乳白蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6所述的酵母菌株进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述α-乳白蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20 g/L的酵母提取物、10-30g/L的葡萄糖和2-10 mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90 小时。

9.一种人造乳产品，其特征在于，所述人造乳产品含有蛋白质和水，所述蛋白质包括权利要求1所述的α-乳白蛋白。