CN112553098B

CN112553098B - 一种咖啡酸的生物制备方法

Info

Publication number: CN112553098B
Application number: CN202011446180.8A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 王希晖; 陆信曜; 宗红; 赵翠
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112553098A

Abstract

本发明公开了一种咖啡酸的生物制备方法，属于微生物技术领域。本发明选取高渗透压的产甘油假丝酵母CCTCC M93018构建工程菌，敲除了L‑色氨酸合成基因trp1和L‑苯丙氨酸合成基因pheA，并过表达3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7，并对酪氨酸解氨酶，和4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶进行了突变，在该酵母中实现以葡萄糖为碳源从头合成咖啡酸，咖啡酸的产量达到87.6mg/L。本发明的制备方法具有操作方便、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广等特点。

Description

一种咖啡酸的生物制备方法

技术领域

本发明涉及一种咖啡酸的生物制备方法，属于微生物技术领域。

背景技术

咖啡酸(caffeic acid)，别名3,4-二羟基肉桂酸，是一种广泛存在于植物中的天然酚类化合物。由于其已证明的抗癌，抗菌，抗病毒，和抗氧化活性而备受关注。此外，在其衍生物中，绿原酸(CGA)和咖啡酸苯乙酯(CAPE)被广泛应用于医药、食品及其它生命科学领域。

到目前为止，市售的咖啡酸通常是从植物中提取的，但是，复杂的分离过程以及植物中低含量的咖啡酸和相关植物的生长速度严重阻碍了从植物中高效提取咖啡酸。咖啡酸也可以化学方法生产，但这是能源密集型的，对环境不利且昂贵的。为了满足不断增长的市场需求，利用合成生物学和代谢工程技术对工程微生物进行异源生物合成提供了另一种生产方法。即可利用大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)等遗传背景清晰、基因操作体系成熟的模式微生物实现目标产品的高效合成。但大肠杆菌存在内毒素等影响食品安全的缺陷，影响了上述方法在工业化生产咖啡酸中的应用前景。且咖啡酸具有抗菌作用，提高发酵菌株对咖啡酸的耐受性对于提高咖啡酸产量具有重要的作用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产咖啡酸的基因工程菌，以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018为出发菌株，敲除了L-色氨酸合成基因trp1和L-苯丙氨酸合成基因pheA，并过表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7。

在一种实施方式中，所述L-色氨酸合成基因trp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述L-苯丙氨酸合成基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，所述工程菌还融合表达了约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)来源的酪氨酸解氨酶，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶和鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica)来源的NADPH黄素氧化还原酶。

在一种实施方式中，所述酪氨酸解氨酶、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶和NADPH黄素氧化还原酶之间均通过GSG串联。

在一种实施方式中，所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述NADPH黄素氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018的L-色氨酸合成基因trp1和L-苯丙氨酸合成基因pheA敲除，并过表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7，获得产甘油假丝酵母Cg-1。

在一种实施方式中，所述方法还将酪氨酸解氨酶基因、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因和NADPH黄素氧化还原酶基因依次连接至质粒pURGAPU的BamHI和NotI酶切位点之间；所述酪氨酸解氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述NADPH黄素氧化还原酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)将核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示的基因FjTAL、HpaB和HpaC利用连接肽GSG串联得到融合基因FjTAL-HpaB-HpaC，采用BamHI和NotI对融合基因进行双酶切，将融合基因连接到pURGAPU质粒上构建重组表达载体，采用SacI线性化重组表达载体；

(2)采用醋酸锂转化法将步骤(1)的线性化重组表达载体转化到产甘油假丝酵母Cg-1的基因组中。

本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌在生产咖啡酸或含咖啡酸的产品中的应用。

在一种实施方式中，所述产品包括但不限于药物。

在一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖为碳源，利用所述基因工程菌发酵生产咖啡酸。

在一种实施方式中，所述发酵在YPD培养基中进行。

在一种实施方式中，所述发酵是在28～30℃有氧发酵至少48h。

本发明的有益效果：

本发明敲除了L-色氨酸合成基因trp1和L-苯丙氨酸合成基因pheA，并过表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7，并将酪氨酸解氨酶FjTAL 151位的亮氨酸Leu突变成甘氨酸Gly，将4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶HpaB 195位的丙氨酸Ala突变成丝氨酸Ser，使构建的产甘油假丝酵母菌株具有咖啡酸产量高，转化率高的特点，该菌株可利用20g/L的葡萄糖生成87.6mg/L的咖啡酸，且发酵过程不需要添加对食品有害的诱导物，具有绿色、安全的特点，适于大规模的工业化应用。

附图说明

图1为产咖啡酸工程菌生产咖啡酸的液相色谱-质谱联用图谱；其中，(A)为标准样品质谱图；(B)为重组菌发酵液样品质谱图(对香豆酸出峰时间7.41，咖啡酸出峰时间9.44)。

图2为途径改造后的菌株Cg-1与出发菌株Cg中咖啡酸的产量对比。

图3为生产宿主Cg-1中突变基因与原始基因的咖啡酸产量对比。

图4为生产菌株Cg-2与出发菌株Cg发酵结果对比。

图5为不同菌株的咖啡酸产量。

具体实施方式

YPD液体培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，定容到1L。

MM固体培养基：YNB(无氨基酵母氮源)6.7g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，定容到1L。

咖啡酸的检测：采用液相色谱-质谱(LC-MS)仪(TSQ quantum Ultra EMR)进行检测。

色谱条件：色谱柱C18反相色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃，流动相水：乙腈：乙酸＝849:150:1，流速0.4mL/min；进样量5μL。

质谱条件：电喷雾负离子模式，干燥气温度(Gas temperature)350℃，干燥气流速(Drying gas)8L/min，雾化气压力255kPa，传输毛细管电压(DualESI VCap)3500V，碎裂器电压(Fragmentor)175V，锥孔电压(Skimmer)65V。

实施例1生产咖啡酸的重组产甘油假丝酵母Cg-1的构建

重组菌的构建：以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018为出发菌株，使用CRISPR-Cas9技术敲除和敲入基因，通过敲除SEQ ID NO.7所示的L-色氨酸合成基因trp1和SEQ ID NO.8所示的L-苯丙氨酸合成基因pheA，敲除出发菌株中L-酪氨酸合成的竞争途径L-色氨酸和L-苯丙氨酸；通过过表达SEQ ID NO.9所示的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4和SEQ ID NO.10所示的双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7解除L-酪氨酸的反馈抑制作用，改造得到生产宿主Cg-1。

实施例2

基因突变：根据软件分析酪氨酸解氨酶FjTAL、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶HpaB和NADPH黄素氧化还原酶HpaC三个基因的蛋白结构，发现FjTAL的Leu151和HpaB的Ala195与底物形成氢键作用，分析可能与底物的结合及糖苷键断裂其重要作用，所以对上述三个酶的编码基因进行饱和突变，以提高转化率。突变基因融合表达后发现只有将FjTAL 151位的亮氨酸Leu突变成甘氨酸Gly，HpaB 195位的丙氨酸Ala突变成丝氨酸Ser，咖啡酸的产量才得到较明显的提高，大多数突变使得基因丧失活性或产量降低，突变后的融合基因在生产宿主Cg-1中表达得到菌株Cg-2，与未经突变的工程菌相比，咖啡酸的产量提高了45.51％，达到87.6mg/L。

实施例3表达融合基因的线性化质粒的构建

线性化载体准备：将编码突变酶基因FjTAL、HpaB和HpaC利用连接肽GSG串联得到融合基因FjTAL-HpaB-HpaC，使用限制性内切酶BamHI和NotI酶切后，连接到同样经BamHI和NotI酶切的pURGAPU质粒(SEQ ID NO.11)上构建重组表达载体，采用SacI线性化重组表达载体。

实施例4产咖啡酸的工程菌的构建

将突变融合基因FjTAL-HpaB-HpaC分别在出发菌株Cg和实施例2构建的生产菌株Cg-1中表达，

醋酸锂法转化酵母细胞：接种活化的产甘油假丝酵母细胞于10mL YPD培养基中30℃过夜培养。按1％接种量接种50mL YPD培养基，培养至OD₆₀₀为1.0左右。6000r/min离心3min收集菌体，加入1mL无菌水轻柔悬浮洗涤，离心弃去上清液，重复两次。加入44μL无菌水轻柔悬浮菌体，再分别加入240μl 50％聚乙二醇溶液(PEG)，36μl 1M醋酸锂(LiAc)，20μlssDNA(鲑鱼精DNA，预先沸水浴10min，然后冰上冷却1min)，500ng线性化DNA片段。充分轻柔地吹吸混匀，置于42℃水浴锅中热激1h。10000r/min离心收集菌体，弃去上清液，加入1mLYPD培养基，30℃培养2h。培养后的菌体6000r/min离心收集，用无菌水洗涤两次。涂布于MM固体培养基上，30℃培养3d，获得产咖啡酸工程菌。

挑取1环产咖啡酸工程菌接入YPD培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养12h，得到菌体浓度OD₆₀₀为10.3的液态种子，将液态种子按5％(v/v)的接种量接入50mL YPD发酵培养基中，控制发酵温度为30℃，转速为200r/min，发酵时间为72h，每隔12h取样测定OD₆₀₀和样品中咖啡酸浓度。发酵12后，两株工程菌Cg和Cg-2的咖啡酸产量分别是34.7mg/L和87.6mg/L，相对于出发菌株Cg，菌株Cg-2的咖啡酸产量提高了152.4％。

对比例1：

具体实施方式同实施例2，区别在于，分别将FjTAL 151位的亮氨酸Leu突变成酪氨酸Tyr，将HpaB 195位的丙氨酸Ala突变成精氨酸Arg，按照实施例3～4的方法将突变后的融合基因在生产宿主Cg-1中表达得到菌株Cg-3，结果显示咖啡酸的产量为27.4mg/L，下降了54.5％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种咖啡酸的生物制备方法

<130> BAA201473A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 506

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Leu Lys Pro Ile Gln Val Glu Ile Arg Glu Gly Leu Ala Leu Ile Asn

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Gly Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Gly Val Val Asn Val Tyr His Ala

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<210> 6

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcaagttg atgaacaaag attgagattt agagatgcta tggcttcttt ggctgctgct 60

gttaatattg ttaccaccgc tggtcatgct ggtagatgtg gtattaccgc taccgctgtt 120

tgttctgtta ccgatacccc accatctgtt atggtttgta ttaatgctaa ttctgctatg 180

aatccagttt ttcaaggaaa tggtagacta tgtataaacg tcctcaatca cgaacaaggt 240

ttgatggcta gacattttgc tggtatgacc ggtatggcta tggaagaaag atttcatcaa 300

ccatgttggc aaaatggtcc attgggtcaa ccagttttga atggtgcttt ggctggtttg 360

gaaggtgaaa tttctgaagt tcaaaccatc ggtacccatt tggtttacct tgttgctatt 420

aaaaacatta ttctttctca agacggtcat ggattgattt atttcaagag aagatttcat 480

ccagttagat tggaaatgga agctccagtt taa 513

<210> 7

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcaaaga ttatcaaagt ctgtggccta aaaacagctg atgctgcata tactgctatt 60

gaaaacggtg caaacctgct aggtgtcatt ttggttccaa accgtgctag aacggttgat 120

cctcaacaag ccatcgaaat atccaagcta tgtcgagcaa agaggatctc aaacgggtcc 180

agatttgtgg attcaagaga tttactaaat tatatgagga atattgatga ggtagggcca 240

gagtggttcg aaatatcagt aaatcaagtc actgaaaatg ggcctttcct tgttggtgtt 300

ttccgtaatc aacctttaga agacgttatc aaagctagca aagagcttaa tttggatttt 360

gtacagttac atggttctga aaacgtggat gattattcta gccaacttga tatccccgtt 420

atttcaaggt tcgttcttaa taaacctgga atagagaatg cactaatgac ccataagttc 480

atcattccat tattagattc cgaagtgggc ggagagggga aattgattga ctgggatgat 540

gcaagttcgt ttggggacaa gatgaaaggg agatacattt tagcaggtgg gttaacaccg 600

gaaaacgtgg accaagcgtt gaatgtcagt gggtgttgtg gcgttgatgt cagtggcgga 660

gtagagactg agggcgtgaa agatttgggt aaagtgaaag catttgtggt taatgccaaa 720

aacacatgta agtaa 735

<210> 8

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgagagtcg ggtatttagg accggcaggt acgtactcgt accaggctgc agtgcagcat 60

ttcccgaatg ccaacgggga agttgaatat ttaccacaaa aatctattgg agcatgtttc 120

caatcaatgt atgacggcag tgtcgactat gcaattgtcc cctttgaaaa ttccaccaat 180

ggacaagtga ttttcacctt tgatttgatt gtcgactggt ttgtaggggg gaaggcaaac 240

ttccaagtgg ttggcgaaga atatgtagca atccaccatg ccttggttgg atatgcggca 300

tcgataaatg gtattaaaga agtgcattca catccacagg tgtggggaca gtgtcgaaat 360

attttggcca aatttgagag tccaatacag gtagacgagt catctactgc tgcggcagtt 420

ttggcagtga gtaaactgag aagtttatca gtggcagctt tagcacctct atcggcagca 480

cacgttcata atgtaccaat tattcagtcc cccgttgaag atgatccttc taatactacc 540

cgctttttag tgcttggccg tcagcactat tccgccgaca ggaaaatcgc cgacaggaaa 600

atcgccgaca aaggtatgct ccttcttgct ccgcacgggg acccctttgc tcctgcaggg 660

gtagcacgcg ccatggcgga gcttgccgcc cgcggcgtgg gcgtcgccgg cgttaccagt 720

cggccgctgg gcaacggcgt gggcaacggc gtgggtaaag tttttgtggt ggactgtttt 780

gacgaggaag cgagggggga ggaatttgct gggagaatag cagaggcggc tcaacaaatt 840

ggaattgcta tagttgcggg agtttactaa 870

<210> 9

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgagtgaat ctccaatgtt cgctgccaac ggcatgccaa aggtaaatca aggtgctgaa 60

gaagatgtca gaattttagg ttacgaccca ttagcttctc cagctctcct tcaagtgcaa 120

atcccagcca caccaacttc tttggaaact gccaagagag gtagaagaga agctatagat 180

attattaccg gtaaagacga cagagttctt gtcattgtcg gtccttgttc catccatgat 240

ctagaagccg ctcaagaata cgctttgaga ttaaagaaat tgtcagatga attaaaaggt 300

gatttatcca tcattatgag agcatacttg gagaagccaa gaacaaccgt cggctggaaa 360

ggtctaatta atgaccctga tgttaacaac actttcaaca tcaacaaggg tttgcaatcc 420

gctagacaat tgtttgtcaa cttgacaaat atcggtttgc caattggttc tgaaatgctt 480

gataccattt ctcctcaata cttggctgat ttggtctcct tcggtgccat tggtgccaga 540

accaccgaat ctcaactgca cagagaattg gcctccggtt tgtctttccc agttggtttc 600

aagaacggta ccgatggtac cttaaatgtt gctgtggatg cttgtcaagc cgctgctcat 660

tctcaccatt tcatgggtgt tactcttcat ggtgttgctg ctatcaccac tactaagggt 720

aacgaacact gcttcgttat tctaagaggt ggtaaaaagg gtaccaacta cgacgctaag 780

tccgttgcag aagctaaggc tcaattgcct gccggttcca acggtctaat gattgactac 840

tctcacggta actccaataa ggatttcaga aaccaaccaa aggtcaatga cgttgtttgt 900

gagcaaatcg ctaacggtga aaacgccatt accggtgtca tgattgaatc aaacatcaac 960

gaaggtaacc aaggcatccc agccgaaggt aaagccggct tgaaatatgg tgtttccatc 1020

actgatgctt gtataggttg ggaaactact gaagacgtct tgaggaaatt ggctgctgct 1080

gtcagacaaa gaagagaagt taacaagaaa taa 1113

<210> 10

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggatttca caaaaccaga aactgtttta aatctacaaa atattagaga tgaattagtt 60

agaatggagg attcgatcat cttcaaattt attgagaggt cgcatttcgc cacatgtcct 120

tcagtttatg aggcaaacca tccaggttta gaaattccga attttaaagg atctttcttg 180

gattgggctc tttcaaatct tgaaattgcg cattctcgca tcagaagatt cgaatcacct 240

gatgaaactc ccttctttcc tgacaagatt cagaaatcat tcttaccgag cattaactac 300

ccacaaattt tggcgcctta tgccccagaa gttaattaca atgataaaat aaaaaaagtt 360

tatattgaaa agattatacc attaatttcg aaaagagatg gtgatgataa gaataacttc 420

tcttctgttg ccactagaga tatagaatgt ttgcaaagct tgagtaggag aatccacttt 480

ggcaagtttg ttgctgaagc caagttccaa tcggatatcc cgctatacac aaagctgatc 540

aaaagtaaag atgtcgaggg gataatgaag aatatcacca attctgccgt tgaagaaaag 600

attctagaaa gattaactaa gaaggctgaa gtctatggtg tggaccctac caacgagtca 660

ggtgaaagaa ggattactcc agaatatttg gtaaaaattt ataaggaaat tgttatacct 720

atcactaagg aagttgaggt ggaatacttg ctaagaaggt tggaagagta a 771

<210> 11

<211> 5572

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagct cgaaactccg tcgtgctggg 420

gatagagcat tgtaattttt gctcttcaac gaggaattcc tagtaagcgc aagtcatcag 480

cttgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc gtcgctacta ccgattgaat 540

ggcttagtga ggcttcaaga ttggcgccgc tctagagggc cccaccacag cagcaccaac 600

agttacaaca acagttacaa caacagttac agctacaaac gccttcacag acggcacgcc 660

cggatggcca aggacggcag ggggtcaaga gggacagaga tgaagtgggt gagatgagag 720

agcaatttga ggaaggaata ggagaaggag aagcaatttc taggaaagag caaggtgtgc 780

aacagcatgc tctgaatgat attttcagca atagttcagt tgaagaacct gttggcgtat 840

ctacatcact tcctacaaac aacaccacga attgcgtccg tggtgacgca actacgaatg 900

gcattgtcaa tgccaatgcc agtgcacata cacgtgcaag tcccaccggt tccctgcccg 960

gctatggtag agacaagaag gacgataccg gcatcgacat caacagtttc aacagcaatg 1020

cgtttggcgt cgacgcgtcg atggggctgc cgtatttgga tttggacggg ctagatttcg 1080

atatggatat ggatatggat atggagatga atttgaattt agatttgggt cttgatttgg 1140

ggttggaatt aaaaggggat aacaatgagg gttttcctgt tgatttaaac aatggacgtg 1200

ggaggtgatt gatttaacct gatccaaaag gggtatgtct attttttaga gagtgttttt 1260

gtgtcaaatt atggtagaat gtgtaaagta gtataaactt tcctctcaaa tgacgaggtt 1320

taaaacaccc cccgggtgag ccgagccgag aatggggcaa ttgttcaatg tgaaatagaa 1380

gtatcgagtg agaaacttgg gtgttggcca gccaaggggg ggggggggaa tgaaaatggc 1440

gcgaatgctc aggtgagatt gttttggaat tgggtgaagc gaggaaatga gcgacccgga 1500

ggttgtgact ttagtggcgg aggaggacgg aggaaaagcc aagagggaag tgtatataag 1560

gggagcaatt tgccaccagg atagaattgg atgagttata attctactgt atttattgta 1620

taatttattt ctccttttgt atcaaacaca ttacaaaaca cacaaaacac acaaacaaac 1680

acaattacaa aaaggatcca gatctgcggc cgcggtacca tagcctcatg aaatcagcca 1740

tttgcttttg ttcaacgatc ttttgaaatt gttgttgttc ttggtagtta agttgatcca 1800

tcttggctta tgttgtgtgt atgttgtagt tattcttagt atattcctgt cctgagttta 1860

gtgaaacata gtatcgcctt gaaatgaaaa tgctgaaatt cgtcgacata caatttttca 1920

aacttttttt ttttcttggt gcacggacat gtttttaaag gaagtactct ataccagtta 1980

ttcttcacaa atttaattgc tggagaatag atcttcaacg ctttaataaa gtagtttgtt 2040

tgtcaaggat ggcgtcatac aaagaaagat cagaatcaca cacttcccct gttgctagga 2100

gacttttctc catcatggag gaaaagaagt ctaacctttg tgcatcattg gatattactg 2160

aaactgaaaa gcttctctct attttggaca ctattggtcc ttacatctgt ctagttaaaa 2220

cacacatcga tattgtttct gattttacgt atgaaggaac tgtgttgcct ttgaaggagc 2280

ttgccaagaa acataatttt atgatttttg aagatagaaa atttgctgat attggtaaca 2340

ctgttaaaaa tcaatataaa tctggtgtct tccgtattgc cgaatgggct gacatcacta 2400

atgcacatgg tgtaacgggt gcaggtattg tttctggctt gaaggaggca gcccaagaaa 2460

caaccagtga acctagaggt ttgctaatgc ttgctgagtt atcatcaaag ggttctttag 2520

catatggtga atatacagaa aaaacagtag aaattgctaa atctgataaa gagtttgtca 2580

ttggttttat tgcgcaacac gatatgggcg gtagagaaga aggttttgac tggatcatta 2640

tgactccagg ggttggttta gatgacaaag gtgatgcact tggtcaacaa tatagaactg 2700

ttgatgaagt tgtaaagact ggaacggata tcataattgt tggtagaggt ttgtacggtc 2760

aaggaagaga tcctatagag caagctaaaa gataccaaca agctggttgg aatgcttatt 2820

taaacagatt taaatgattc ttacacaaag atttgataca tgtacactag tttaaataag 2880

catgaaaaga attacacaag caaaaaaaaa aataaatgag gtactttacg ttcacctaca 2940

accaaaaaaa ctagatagag taaaatctta agatttagaa aaagttgttt aacaaaggct 3000

ttagtatgtg aatttttaat gtagcaaagc gataactaat aaacataaac aaaagtatgg 3060

ttttctttat cagtcaaatc attatcgatt gattgttccg cgtatctcga gcctgtttga 3120

gcgtcgtttc catcttgcgc gtgcgcagag ttgggggagc ggagcggacg acgtgtaaag 3180

agcgtcggag ctgcgactcg cctgaaaggg agcgaagctg gccgagcgaa ctagactttt 3240

tttcagggac gcttggcggc cgagagcgag tgttgcgaga caacaaaaag ctcgacctca 3300

aatcaggtag gaatacccgc tgaacttaag caaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 3360

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 3420

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 3480

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 3540

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 3600

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 3660

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 3720

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 3780

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 3840

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 3900

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 3960

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 4020

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 4080

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 4140

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 4200

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 4260

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 4320

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 4380

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 4440

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 4500

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 4560

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 4620

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 4680

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 4740

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 4800

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 4860

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 4920

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 4980

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 5040

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 5100

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5160

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 5220

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 5280

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 5340

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 5400

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 5460

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 5520

attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 5572

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCCM 93018为出发菌株，敲除了L-色氨酸合成基因trp1和L-苯丙氨酸合成基因pheA，并过表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7，还融合表达了约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）来源的酪氨酸解氨酶，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）来源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶和鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica）来源的NADPH黄素氧化还原酶；

所述酪氨酸解氨酶、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶和NADPH黄素氧化还原酶之间均通过GSG串联；

所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述NADPH黄素氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述L-色氨酸合成基因trp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述L-苯丙氨酸合成基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.一种构建权利要求1~3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，将产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018的L-色氨酸合成基因trp1和L-苯丙氨酸合成基因pheA敲除，并过表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7，获得产甘油假丝酵母Cg-1；

还将酪氨酸解氨酶基因、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因和NADPH黄素氧化还原酶基因依次通过GSG串联连接至质粒pURGAPU的BamHI和NotI酶切位点之间，获得重组质粒，再将重组质粒线性化后转化至产甘油假丝酵母Cg-1中；

5.权利要求1~3任一所述的基因工程菌在生产咖啡酸或含咖啡酸的产品中的应用。

6.一种生产咖啡酸的方法，其特征在于，将权利要求1~3任一所述的基因工程菌在以葡萄糖为碳源的培养基中发酵，所述发酵是在28~30℃有氧发酵至少48 h。