CN101597622A - 肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体 - Google Patents
肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，该载体以pMD19－T为框架载体，包括5个串联的低氧反应元件HRE5，survivin promoter及miRNA表达框架反应元件。在miRNA表达框架中包含有EmGFP元件，及MCS多克隆位点。MCS位点可以插入多个不同的miRNA或shRNA序列，实现多靶点或多位点干预。载体大小为4592bp，载体命名为pMD－HRE5－SURV/EmGFP－miR。本发明通过HRE5及survivin promoter实现肿瘤靶向治疗，避免对正常组织的损伤。同时结合多串联miRNA或shRNA，达到多靶点治疗，提高肿瘤治疗的特异性和靶向性。
Description
技术领域
本发明属生物医学领域，特别涉及肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR。
现有技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是指外源或内源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)进入生物体细胞后在Dicer作用下，被裂解成由正义链和反义链组成的21～23nt的小分子干扰性RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，siRNA作为向导序列，与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)结合，引起与其同源的mRNA特异性降解，抑制相应基因的表达。其是涉及基因功能、基因治疗等领域的重要研究手段。近年来RNAi技术被广泛地应用到肿瘤的基因治疗研究中。实施RNAi技术的小分子有siRNA，shRNA及miRNA。miRNA是生物体内一类重要的调控分子，多具有数十个乃至上百个靶基因。其中一些miRNA具有肿瘤抑制作用。因此，利用miRNA表达载体抑制肿瘤增殖作用的miRNA，将成为肿瘤基因治疗的新方法，具有重要的理论及实际意义。目前，商品化的miRNA表达载体多为通用性表达载体，其所选用的启动子以在大多数哺乳动物细胞中均活性很高，且能被RNA Pol II识别的启动子为准，如Invitrogen公司产品BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi Expression Vector Kits，Ambion公司的pSilencerTM 4.1-CMV Expression Vectors，武汉晶赛公司基于microRNA mir-30双臂结构的shRNAmir质粒载体pGenesil-Mir30sh，所用启动子均为pol IIhuman CMV promoter。因miRNA与shRNA结构相似，故可以用miRNA的表达框架来表达shRNA。这类载体的缺陷在于其虽能保证miRNA或shRNA的正常表达，但如果将其应用于肿瘤基因治疗中时，此类载体除了在肿瘤中表达以外，还可以在正常细胞中表达，这样就可能出现在抑制了肿瘤细胞增殖的同时，还会抑制正常细胞的生长。如果能应用肿瘤特异性启动子，使得miRNA或shRNA只在肿瘤细胞中表达，就可提高肿瘤基因治疗的特异性和靶向性。
发明内容
本发明的目的是构建一种肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，通过肿瘤特异性启动子survivin promoter和厌氧反应元件(HRE)的双调控，使得该载体在肿瘤组织特异性表达，避免其对正常组织的损伤。同时实现肿瘤的多靶点或多位点治疗，提高肿瘤治疗疗效。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明以pMD19-T载体为框架载体，分别连接上五个串联的低氧反应元件HRE5，survivin promoter，及包含GFP的miRNA表达框架，载体大小为4592bp，载体序列为：
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat 420
cttccagaga ttactagtcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttggtcgac 480
cccacagtgc atacgtgggc tccaacaggt cctcttgcgg ccgcccacag tgcatacgtg 540
ggctccaaca ggtcctcttc catggccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt 600
cggatccgcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttccggaat tgcatgcgcg 660
ttctttgaaa gcagtcgagg gggcgctagg tgtgggcagg gacgagctgg cgcggcgtcg 720
ctgggtgcac cgcgaccacg ggcagagcca cgcggcggga ggactacaac tcccggcaca 780
ccccgcgccg ccccgcctct actcccagaa ggccgcgggg ggtggaccgc ctaagagggc 840
gtgcgctccc gacatgcccc gcggcgcgcc attaaccgcc agatttgaat cgcgggaccc 900
gttggcagag gtggcggcgg cggctgatca tctggctaac tagagaaccc actgcttact 960
ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagtccca agctggctag ttaagctatc 1020
aacaagtttg tacaaaaaag caggctttaa aaccatggtg agcaagggcg aggagctgtt 1080
caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag 1140
cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 1200
caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccttca cctacggcgt 1260
gcagtgcttc gcccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat 1320
gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac 1380
ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat 1440
cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca 1500
caaggtctat atcaccgccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagacccg 1560
ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat 1620
cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag 1680
caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg 1740
gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagctaag cacttcgtgg ccgtcgatcg 1800
tttaaaggga ggtagtgagt cgaccagtgg atcctggagg cttgctgaag gctgtatgct 1860
ggaattctgc agctagcggt accaagcttc aggacacaag gcctgttact agcactcaca 1920
tggaacaaat ggcccagatc tggccgcact cgagatatct agacccagct ttcttgtaca 1980
aagtggttga tctagagggc ccgcggttcg ctgatggggg aggctaactg aaacacggaa 2040
ggagacaata ccggaaggaa cccgcgctat gacggcaata aaaagacaga ataaaacgca 2100
cgggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg 2160
ataccccacc gtgaccccat tggggccaat acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc 2220
accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg 2280
ccatagcatc ccctatagtg agtcgtatta catggtcata gctgttgagc tcatcgtcga 2340
acggcaggcg tgcaaacttg gcgtaatcat ggtcatagcg tttcctgtgt gaaattgtta 2400
tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 2460
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 2520
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 2580
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 2640
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 2700
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 2760
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 2820
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 2880
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 2940
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 3000
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 3060
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 3120
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 3180
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct 3240
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 3300
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 3360
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 3420
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 3480
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 3540
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 3600
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 3660
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 3720
cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 3780
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 3840
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 3900
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 3960
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 4020
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 4080
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 4140
ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 4200
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 4260
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 4320
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 4380
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4440
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 4500
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 4560
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 4592
载体上各元件位置为：
HRE5：439-651 SpeI：433-438
Survivin promtor：658-924 SphI：652-657
GFP：1055-1774 FbaI：925-930
MCS：1862-1889 SacI：2327-2332
PolA：2016-2332 EcoRI：1862-1867
Ori：2774-3362 PstI：1867-1872
Amp：3533-4393 NheI：1872-1877
HindIII：1884-1889
本发明构建的肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在肿瘤细胞中可以正常表达，在原代培养的小鼠正常细胞不表达。而且在厌氧条件下该载体在肿瘤细胞中的表达明显高于在正常培养条件下的表达，说明该载体可以实现肿瘤特异性和厌氧双调控表达。
附图说明
图1pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体结构图。
图2ds oligo电泳鉴定图。
图3HRE5 PCR扩增结果。
图4Sp PCR扩增结果。
图5MCS位点ds oligo退火后电泳图。
图6miR侧翼片段PCR电泳图。
图7pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光显微镜图像。
图7(1)为HepG2细胞转染后荧光照片。
图7(2)为小鼠原代培养皮肤细胞转然后荧光照片。
其中A，B，C分别为正常培养条件下pEGFP-C1，pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。D，E，F分别为厌氧(1.1％02)培养条件下pEGFP-C1，pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。
下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。
具体实施方式
参照图1所示，肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR结构图。载体大小为4592bp。其主要元件为5个串联的低氧反应元件(HRE5)，survivin promoter及miRNA表达框架，在miRNA表达框架上有插入串联miRNA或shRNA的多克隆(MCS)位点，其酶切位点为：EcoRI，PstI，NheI，KpnI，HindIII.
参照图2所示，连接于pMD19-T载体上，且用于连接HRE5，survivinpromoter及miRNA表达框架的酶切位点寡核苷酸双链ds oligo电泳鉴定图。其大小为43bp。Marker大小依次为：25bp，50bp，75bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，350bp，500bp，766bp。从图中可见该寡核酸双链退火成功，大小正确。
参照图3所示，HRE5PCR产物长225bp。Marker大小分别为50bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，350bp，400bp，500bp。因HRE5为5个相同的串联结构，所以扩增出大小不等的5个片段，胶回收时只切取225bp产物片段，即最大片段。
参照图4所示，最亮条带为300bp。该产物片段长279bp。Marker大小分别为50bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，350bp，400bp，500bp。可见扩增产物大小正确。
参照图5所示，该序列长为33bp。Marker大小依次为：25bp，50bp，75bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，350bp，500bp，766bp。从图中可见该寡核酸双链退火成功，大小正确。
参照图6所示，该产物大小为1408bp。Marker由下往上两条带大小分别为1kb，2kb。Marker由下往上两条带大小分别为1kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，7kb，8kb，10kb。从图中可见miRNA表达框架扩增大小正确。
参照图7(1)、(2)所示，其中A，B，C分别为正常培养条件下pEGFP-C1，pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。D，E，F分别为厌氧(1.1％O2)培养条件下pEGFP-C1，pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。从图中可见，pEGFP-C1，pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在HepG2细胞中无论在正常培养还是厌氧培养都有表达，但是pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在厌氧条件下的表达高于正常培养条件下。pEGFP-C1，pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR三个载体在小鼠正常培养皮肤细胞中，无论在正常培养还是厌氧培养，只有pEGFP-C1表达，而pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR 两个载体均无表达。说明pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR的表达具有肿瘤特异性及低氧调控性。
本发明解决了有关肿瘤基因治疗存在的两个问题：
(1)肿瘤特异性表达问题。首先选用在肿瘤中高表达的肿瘤特异性启动子survivin promoter。近年研究发现Survivin在正常分化成熟的组织中几无表达，仅见于胚胎细胞、胸腺、睾丸和分泌期子宫内膜，而在几乎所有人类肿瘤中高表达，且表达具有肿瘤细胞依赖性。由于survivin启动子调控的基因能在部分正常细胞中表达，因此以其为调控序列的基因治疗将会影响胸腺、睾丸和分泌期子宫内膜。为了降低其在正常组织中表达治疗性基因，可以在survivin启动子上游增加低氧调控的增强子即低氧反应元件(hypoxia responseelement，HRE)，对其进行进一步的肿瘤特异性改造。大多数恶性肿瘤都存在组织缺氧现象，血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是血管内皮细胞特异性有丝分裂原，不但能够促进血管内皮细胞增生和血管再建，而且可以使肿瘤血管通透性增加，在肿瘤生长和转移过程中具有重要的作用。其在几乎所有的实体瘤细胞中都有过量的表达，而在正常组织中不表达或极少表达。VEGF表达水平的高低与VEGF启动子(VEGFP)的HRE有关。该元件在低氧的诱导下可以增强VEGF表达，并作为肿瘤靶向基因治疗的重要增强子。因此，应用HRE与survivin启动子联合构建HRE-survivin启动子调节的miRNA或shRNA表达载体，具有成功的可能性。该载体将有助于提高肿瘤基因治疗的特异性，同时避免对正常组织杀伤作用，增加肿瘤基因治疗的安全性。
(2)多靶点基因治疗问题。肿瘤的发生是多基因共同作用的结果。单纯针对某一靶基因的治疗效果往往不是十分理想，如果能同时作用与肿瘤相关的多个靶基因，实现多途径，多靶点的治疗，就可明显提高疗效。本发明在载体的多克隆位点设计了5个不同的酶切位点，这样就可实现随意插入不同miRNA或shRNA，使得串联的miRNA或shRNA同时表达，达到多靶点治疗的目的。
本发明的肿瘤特异性表达载体是以pMD19-T载体为框架载体，分别连接上5个串联的HRE(5HRE)，survivin promoter，及miRNA表达框架三个主体元件，构建成为新的肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR，其中在miRNA表达框架中有EmGFP作为报告基因，EmGFP下游为插入miRNA或shRNA的多克隆位点，及PolA尾。
pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体结构图及MCS内切酶位点详细序列如图1所示。
1.pMD19-T载体的改造：
1)化学合成包含SpeI，SphI，FbaI，SacI四个酶切位点的寡核苷酸链。其序列为：
sense oligo：5’-actagtatcagcgcatgccaagattgatcagaatcggagctca-3’
anti-sense oligo：5’-gagctccgattctgatcaatcttggcatgcgctgatactagta-3’
2)双链寡核苷酸的合成：将合成好的sence oligo和antisence oligo在95℃4min，常温5～10min下退火形成双链。
3)鉴定退火双链：取1ul退火液，加99ulH2O，稀释为500nM。用4％的琼脂糖凝胶电泳鉴定退火双链。退火后双链长43bp.如图2。电泳证实ds oligo退火成功。
4)用500nM ds双链与PMD19-T载体相连，转化PMD19-T与ds Oligo的连接产物pMD-ds。
5)挑单菌落，过夜摇菌。
6)提取质粒酶切鉴定后，送测序。测序正确，将此载体作为框架载体，将HRE5，Survivin promoter及miRNA表达框架依次连接到pMD-ds载体上。
2.低氧反应元件HRE5的获得：包含5个HRE串联片段的载体pEGFP-5HR(石秦东，张蓬勃，康前雁等，以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体的构建及鉴定。南方医科大学学报，2007，27(12))的获得是由西安交大医学院神经生物研究所石秦东惠赠。设计HRE5引物，以pEGFP-5HR载体为模板扩增HRE5，产物长225bp。引物5’端加SpeI酶切位点，3’端加SphI酶切位点。引物序列如下：
HRE5 forward primer：5′-ACTAGTCCACAGTGCATACGTGG-3′
HRE5 reverse primer：5′-GCATGCAATTCCGGAAGAGGACCTGTT-3′
1)PCR扩增获得HRE5片段，经电泳证实扩增片段大小正确，如图3。因有相同的串联片段，故扩出了大小不等的5条片段，胶回收时只切割200bp以上条带即可。
2)胶回收HRE5片段，与pMD19-T载体连接，转化后，挑菌，提取质粒酶切鉴定，送测序。该载体记为T-HRE5。
3.survivin promoter的获得：
1)提取培养的肝癌HepG2细胞基因组DNA。
2)以上述DNA为模板扩增survivin promoter，引物序列如下：
Sp forward primer：5’-GCATGCGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3’
Sp reverse primer：5′-TGATCAGCCGCCGCCGCCACCTCTGCCAACGGG-3’
引物5’端加SphI酶切位点，3’端加FbaI酶切位点。扩增片段长279bp。PCR产物电泳鉴定图4：
3)胶回收Survivin promoter片段，与pMD19-T载体连接，转化后，挑菌，提取质粒酶切鉴定，送测序。该载体记为T-SP。
4.miRNA表达框架的获得：
1)改造商品化miR载体pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR。
a.在插入pre-miRNA ds oligo的位置插入包含有EcoR I，Pst I，Nhe I，Kpn I，Hind III五个酶切位点的MCS ds oligo。化学合成oligo DNA序列；
Sense：5’-TGCTGGAATTCTGCAGCTAGCGGTACCAAGCTT-3’
Antisense：5’-CCTGA AGCTTGGTACCGCTAGCTGCAGAATTCC-3’
b.将以上oligo DNA退火形成双链，电泳鉴定如图5。
c.将ds oligo DNA与pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR连接，转化，挑菌，提取质粒酶切鉴定，送测序。该载体记为pcDNA 6.2-GW/EmGFP-ds。
2)以pcDNA 6.2-GW/EmGFP-ds为模板，扩增包含有EmGFP及polA的miRNA表达框架。引物序列如下：
miR forward primer：5′-TGATCATCTGGCTAACTAGAGAACCCAC-3′
miR reverse primer：5′-GAGCTCAACAGCTATGACCATGTAATAC-3′
扩出的片段长1408bp。引物5’端加入FbaI酶切位点，3’端加入SacI酶切位点。扩增产物电泳鉴定如图6：
3)胶回收miRNA表达框架，与pMD19-T载体连接，转化，挑菌，提取质粒酶切鉴定，送测序。该载体记为T-miR。
5.pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体的连接：
1)用SpeI和SacI双酶切PMD-ds，胶回收大片段。
2)用SpeI和SphI双酶切T-HRE5，用SphI和FbaI双酶切T-Sp，用FbaI和SacI双酶切T-miR，分别将每个酶切产物的小片段胶回收。
3)将pMD-ds胶回收的大片段与回收的HRE5，SP，miRNA表达框架一起连接，转化，挑菌，提质粒酶切鉴定，送测序。此次构建好本发明的肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR。
pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体表达功能的验证：
实验目的：验证pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在肿瘤细胞中的正常表达。
实验步骤：
1.将测序正确的pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR菌液扩增，提取质粒，同时亦将本发明过程中构建的测序正确且无HRE5的载体pMD-SURV/EmGFP-miR菌液扩增，提取质粒。同时提取pEGFP-C1质粒，作为阳性对照组。
2.培养不同的肿瘤细胞，包括肝癌细胞SSCM7721，HepG2，Hep3B，胃癌细胞7901，肺癌细胞A549，宫颈癌细胞HeLa，乳腺癌MCF-7，胰腺癌BXPC-3，黑色素瘤细胞EH。
3.原代培养小鼠脑细胞，胃细胞及皮肤细胞。
4.将培养细胞按5×104/孔接种于24孔板中，每种细胞接种3孔，分别用于转染pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR，pMD-SURV/EmGFP-miR及pEGFP-C1三个不同的质粒。重复种两块相同的24孔培养板，待转染质粒后一块置于正常氧浓度培养箱中培养，一块置于厌氧培养箱中培养(1.1％O2)。
5.用lipofectam 2000转染质粒，24h后在荧光显微镜下通过观察GFP的表达来判断pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR，pMD-SURV/EmGFP-miR载体在不同肿瘤细胞中的表达情况。
实验结果：pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在不同的肿瘤细胞中都有表达，且在低氧培养下pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR的表达高于正常培养组，亦高于低氧培养下转染的pMD-SURV/EmGFP-miR载体组。在上述肿瘤细胞中表达最高的为HepG2，表达较高的为Bxpc-3，MCF-7。在小鼠原代培养细胞中，pMD-SURV/EmGFP-miR和pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR无论在正常培养下，还是厌氧培养均无表达。以上结果证实pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR可以在肿瘤细胞中表现出很好的缺氧诱导作用和高水平的表达，且在正常细胞不表达。说明pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR可以在肿瘤细胞中能够有效地进行缺氧诱导和调控工作，为后期在该载体中插入miRNA或shRNA串联序列，进行miRNA或shRNA功能验证奠定了基础。荧光照片见图7。
Claims (2)
1、肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，其特征在于，以pMD19-T载体为框架载体，分别连接上五个串联的低氧反应元件HRE5，survivin promoter，及包含GFP的miRNA表达框架，载体大小为4592bp，载体序列为：
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat 420
cttccagaga ttactagtcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttggtcgac 480
cccacagtgc atacgtgggc tccaacaggt cctcttgcgg ccgcccacag tgcatacgtg 540
ggctccaaca ggtcctcttc catggccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt 600
cggatccgcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttccggaat tgcatgcgcg 660
ttctttgaaa gcagtcgagg gggcgctagg tgtgggcagg gacgagctgg cgcggcgtcg 720
ctgggtgcac cgcgaccacg ggcagagcca cgcggcggga ggactacaac tcccggcaca 780
ccccgcgccg ccccgcctct actcccagaa ggccgcgggg ggtggaccgc ctaagagggc 840
gtgcgctccc gacatgcccc gcggcgcgcc attaaccgcc agatttgaat cgcgggaccc 900
gttggcagag gtggcggcgg cggctgatca tctggctaac tagagaaccc actgcttact 960
ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagtccca agctggctag ttaagctatc 1020
aacaagtttg tacaaaaaag caggctttaa aaccatggtg agcaagggcg aggagctgtt 1080
caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag 1140
cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 1200
caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccttca cctacggcgt 1260
gcagtgcttc gcccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat 1320
gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac 1380
ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat 1440
cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca 1500
caaggtctat atcaccgccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagacccg 1560
ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat 1620
cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag 1680
caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg 1740
gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagctaag cacttcgtgg ccgtcgatcg 1800
tttaaaggga ggtagtgagt cgaccagtgg atcctggagg cttgctgaag gctgtatgct 1860
ggaattctgc agctagcggt accaagcttc aggacacaag gcctgttact agcactcaca 1920
tggaacaaat ggcccagatc tggccgcact cgagatatct agacccagct ttcttgtaca 1980
aagtggttga tctagagggc ccgcggttcg ctgatggggg aggctaactg aaacacggaa 2040
ggagacaata ccggaaggaa cccgcgctat gacggcaata aaaagacaga ataaaacgca 2100
cgggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg 2160
ataccccacc gtgaccccat tggggccaat acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc 2220
accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg 2280
ccatagcatc ccctatagtg agtcgtatta catggtcata gctgttgagc tcatcgtcga 2340
acggcaggcg tgcaaacttg gcgtaatcat ggtcatagcg tttcctgtgt gaaattgtta 2400
tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 2460
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 2520
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 2580
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 2640
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 2700
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 2760
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 2820
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 2880
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 2940
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 3000
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 3060
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 3120
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 3180
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct 3240
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 3300
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 3360
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 3420
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 3480
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 3540
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 3600
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 3660
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 3720
cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 3780
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 3840
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 3900
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 3960
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 4020
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 4080
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 4140
ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 4200
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 4260
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 4320
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 4380
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4440
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 4500
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 4560
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 4592
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，载体上各元件位置为：
HRE5：439-651 SpeI：433-438
Survivin promtor：658-924 SphI：652-657
GFP：1055-1774 FbaI：925-930
MCS：1862-1889 SacI：2327-2332
PolA；2016-2332 EcoRI：1862-1867
Ori：2774-3362 PstI：1867-1872
Amp：3533-4393 NheI：1872-1877
HindIII：1884-1889。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533742A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-07-04 | 北京工业大学 | 一种双链核苷酸序列、含其的重组质粒及其构建方法 |
| CN102618577A (zh) * | 2012-03-19 | 2012-08-01 | 西安交通大学 | 一种增强型肿瘤特异性治疗载体 |
| CN114681428A (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-01 | 南京大学人工智能生物医药技术研究院 | 一种靶向抑制egfr的递送系统及其应用 |
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2009
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