CN102533742B - 一种双链核苷酸序列、含其的重组质粒及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含多克隆位点的互补双链核苷酸序列，包含该双链核苷酸序列的重组质粒，所述重组质粒的构建方法。所述双链核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如式1和式2所示：5’-(X)n1GAGACC(X)n2TTTAAA(X)n3GGTCTC(X)n4-3’(式1)，5’-(Y)n5GAGACC(Y)n6TTTAAA(Y)n7GGTCTC(Y)n8-3’(式2)。包含该双链核苷酸序列的重组质粒为多用途表达载体，可以用于表达miRNA和蛋白质。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体而言，本发明涉及一种含多克隆位点的双链核苷酸序列，包含该双链核苷酸序列的重组质粒，所述重组质粒的构建方法。
背景技术
miRNA是真核生物中一类长度约为22个碱基的核苷酸，是参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。成熟的miRNA是由较长的可折叠形成发卡结构的前体转录物经过Dicer酶或类似于Dicer酶的内切核酸酶加工形成的。miRNA基因存在于基因组的间隔区域或者内含子当中，这些小分子的RNA通过碱基配对与靶mRNA序列的3’MTR区结合来调控基因的表达。
目前人们对miRNA的生物合成过程已经了解比较清楚。简单而言，所述合成过程包括：细胞内编码的miRNA的基因首先在RNA聚合酶II的作用下发生转录，从而形成长度约为几百个核苷酸的初级转录产物pri-miRNA；初级转录产物在RNaseIII家族酶——Drosha的参与下被加工成只含60-70nt具有茎环结构的单个miRNA前体pre-miRNA，然后在另一个RNaseIII家族酶——Dicer的参与下，miRNA前体被加工为双链的miRNA，随后接连形成单链成熟的miRNA。miRNA的转录所需的转录酶与蛋白表达所需的转录酶都属于RNA聚合酶II，因此可以使用同一个II型转录启动子。
目前较为常用的miRNA表达载体一般是利用某一特定的miRNA基因的5’-flanking region和3’-flanking region作为克隆位点来连接体外合成发卡形状的miRNA的前体。由于miRNA在基因组中的位置的特殊性，决定了在体外情况下，普通的miRNA表达载体中无法插入外源蛋白进行表达。这就限制了载体的用途。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种用于构建既能够表达miRNA又能够表达蛋白的重组质粒的双链核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供包含所述双链核苷酸序列的重组质粒，该重组质粒既能够表达miRNA又能够表达蛋白。
本发明的又一个目的是提供该重组质粒的构建方法。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种双链核苷酸序列，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如式1和式2所示：
5’-(X)n1GAGACC(X)n2TTTAAA(X)n3GGTCTC(X)n4-3’(式1)
5’-(Y)n5GAGACC(Y)n6TTTAAA(Y)n7GGTCTC(Y)n8-3’(式2)
其中，所述式1中的X为A、T、C或G，n1为1至20的整数，n2为1至20的整数，n3为1至20的整数，n4为1至20的整数，条件是(X)n1、(X)n2、(X)n3或(X)n4均不包含GAGACC、TTTAAA或GGTCTC；
所述式2中的Y为A、T、C或G，n5为1至20的整数，n6为1至20的整数，n7为1至20的整数，n8为1至20的整数，条件是(Y)n5、(Y)n6、(Y)n7或(Y)n8均不包含GAGACC、TTTAAA或GGTCTC；并且
n2＝n7，(X)n2与(Y)n7互补；n3＝n6，(X)n3与(Y)n6互补。
优选地，n2和n7为6至20的整数；n3和n6为6至20的整数。
优选地，所述(X)n1为TGCTG，所述(X)n4为A；
优选地，所述(Y)n5为CCTGT，所述(Y)n8为C。
根据本发明的具体实施方式，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
(SEQ ID NO.1)：
5’-TGCTGGAGACCGAATTCTTTAAACTGCAGAAGCTTGGTCTCA-3’
(SEQ ID NO.2)：
5’-CCTGTGAGACCAAGCTTCTGCAGTTTAAAGAATTCGGTCTCC-3’
根据本发明的具体实施方式，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别还可以如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：
(SEQ ID NO.3)：
5’-TGCTGGAGACCCTACTTCTTTAAAGTGTAAGAAGCTTGGTCTCA-3’
(SEQ ID NO.4)：
5’-CCTGTGAGACCAAGCTTCTTACACTTTAAAGAAGTAGGGTCTCC-3’
根据本发明的具体实施方式，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别还可以如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示：
(SEQ ID NO.5)：
5’-TGCTGGAGACCGCACATGTCTTTAAACTGCTAGCTTGGTCTCA-3’
(SEQ ID NO.6)：
5’-CCTGTGAGACCAAGCTAGCAGTTTAAAGACATGTGCGGTCTCC-3’
另一方面，本发明提供一种重组质粒，所述重组质粒包含上述任一双链核苷酸序列。
优选地，所述重组质粒为包含上述任一双链核苷酸序列的序列如SEQID NO.10所示的质粒pcDNA6.2-EmGFP-mir(重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL)，其结构如图1所示。
根据本发明的具体实施方式，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO.7所示(重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL1)。
根据本发明的具体实施方式，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO.8所示(重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL2)。
根据本发明的具体实施方式，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO.9所示(重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL3)。
又一方面，本发明提供上述重组质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤：
1)分别合成上述双链核苷酸序列的两条单链核苷酸序列，然后将两条单链核苷酸序列退火形成所述双链核苷酸序列；以及
2)将经步骤1)得到的双链核苷酸序列插入到质粒中，以形成所述重组质粒。
优选地，所述步骤2)包括：
连接经步骤1)得到的双链核苷酸序列和经线性化的质粒，用获得的连接产物转化宿主细胞，然后从宿主细胞获得所述重组质粒。
根据本发明的具体实施方式，在步骤1)中，通过HPLC方法纯化双链核苷酸序列，退火条件包括95℃水浴后缓慢降温至室温。
可以采用T4DNA连接酶连接双链核苷酸序列与经线性化的载体质粒。所述宿主细胞可以为细菌细胞，例如TOP10。
普通的miRNA表达载体中无法插入外源蛋白基因进行表达，这限制了该类载体的用途。和现有技术相比，本发明通过在miRNA载体中引入含多克隆位点的核苷酸序列，从而提供了一种多用途表达质粒，实验证明该重组质粒即可以用于表达miRNA，也可以用于表达蛋白质。
具体而言，本发明在miRNA表达载体的5’-flanking region和3’-flankingregion克隆位点处连接了包含特定的多克隆位点的核苷酸序列。其中，核苷酸序列中的克隆位点之一BsaI可以用于利用BsaI DNA内切酶的特殊切法而轻松地切出原来的5’-flanking region和3’-flanking region连接pre-miRNA的克隆位点，且同时不破坏核苷酸序列，因此可以通过连接表达miRNA的基因而表达miRNA。同时利用该核苷酸序列中的另一克隆位点DraI，可以切除掉miRNA表达载体的5’-flanking region，进而可以通过连接所需要表达的蛋白序列而表达目的蛋白。本发明利用一个特定的多克隆位点序列与pcDNA6.2-EmGFP-mir载体的连接得到了一个可以用来表达miRNA和蛋白的多用途表达载体。
并且，本发明所提供的包含多克隆位点的核苷酸序列是经过设计优化的。pcDNA6.2-EmGFP-mir线性质粒本来用于表达miRNA，该线性质粒购买时即是线性的，两端有粘性末端(参见图2)，5’-flanking region和3’-flankingregion及两端的粘性末端对于miRNA的表达是必须的，序列不能改变，而此粘性末端不是DNA内切酶的识别位点，不能用一般的DNA酶切开，所以不能自行连接一般的polylinker进行扩增，因此该线性质粒使用一次就必须从公司购买一次，非常浪费成本。为了克服这个问题，本发明人通过试验大量DNA酶的酶切位点，最终确立了限制性DNA内切酶BsaI，该酶的酶切位点与酶识别位点不在一起：
5’.....GGTCTC(N)1.........3’
5......CCAGAG(N)5▲......3’
(上面序列中带下划线部分为识别位点，三角形代表酶切位点)。此酶切出的位点有四个碱基的粘性末端，这几个碱基是随机的碱基，没有序列特异性，因此可用BsaI切出pcDNA6.2-EmGFP-mir粘性末端的四个碱基，这样就不会破坏flanking region的碱基序列也就不会影响miRNA的表达，因此发明人设计了两端加BsaI酶切位点。
关于DraI的设计，在图1中可以看出在5’-flanking region的前端有EmGFP的序列，此序列前后都有DraI酶切位点，在此序列的后面有终止密码子(后一个DraI后，5’-flanking region前面，miRNA的表达不受影响)，因此，此线性的末端不能直接连接蛋白表达。在试验中，本发明人在插入的多克隆位点中间加入一个DraI酶。加上插入的DraI，该质粒中共有三个DraI位点，用DraI酶切正好切除EmGFP和5’-flanking region的区域，而不破坏EmGFP前面的启动子，因此蛋白可以正常表达。
综上所述，本发明通过提供含优化设计的多克隆位点的核苷酸序列，进而提供了可以用于表达miRNA和蛋白质的多用途表达载体，拓宽了特定表达载体的用途。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明提供的多用途载体pcDNA6.2-EmGFP-PL质粒示意性图谱；
图2显示了载体cDNA6.2-EmGFP-mir线性质粒的粘性末端示意图。
图3为实施例1中电泳检测SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的退火结果，其中电泳图左侧为分子量Marker，右侧为退火形成的双链。
图4为实施例1中电泳检测pcDNA6.2-EmGFP-PL重组质粒的结果，其中右侧为分子量Marker，左侧为重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL。
图5为实施例1电泳检测pcDNA6.2-EmGFP-PL重组质粒经EcoRI酶切结果，其中左侧为分子量Marker，右侧为酶切结果。
图6为实施例2中的电泳检测检测pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒经BsaI酶切的结果，由于插入的双链核苷酸与载体相比太小，看不到该片段。
图7为实施例2中电泳检测pcDNA6.2-EmGFP-mir-155质粒的结果，其中右侧为分子量Marker，左侧为表达质粒pcDNA6.2-EmGFP-mir-155。
图8为实施例2中电泳检测pcDNA6.2-EmGFP-mir-155质粒经MscI酶切的结果，其中左侧为分子量Marker，右侧为酶切结果。
图9显示了实施例2中转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-155质粒、pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒后hsa-mir-155在Hela细胞内的表达差异，其中A为未转染质粒组，B为转染pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒组，C为转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-155质粒组。
图10为实施例3中dsRed扩增结果，其中右侧为分子量Marker，左侧为dsRed。
图11为实施例3中电泳检测pcDNA6.2-PL1-DsRed质粒的结果，其中左侧为分子量Marker，右侧为表达质粒pcDNA6.2-PL1-DsRed。
图12为实施例3中电泳检测pcDNA6.2-PL1-DsRed质粒经DraI酶切的结果，其中右侧为分子量Marker，左侧为酶切结果。
图13为实施例3中转染pcDNA6.2-PL1-DsRed质粒后在Hela细胞内的表达情况(红色荧光)。
图14显示了实施例5中转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-34a质粒、pcDNA6.2-EmGFP-PL2质粒后hsa-mir-34a在Hela细胞内的表达差异，其中A为未转染质粒组，B为转染pcDNA6.2-EmGFP-PL2质粒组，C为转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-34a质粒组。
图15为实施例6中转染pcDNA6.2-PL2-DsRed质粒后在Hela细胞内的表达情况(红色荧光)。
图16显示了实施例8中转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-34c质粒、pcDNA6.2-EmGFP-PL3质粒后hsa-mir-34c在Hela细胞内的表达差异，其中A为未转染质粒组，B为转染pcDNA6.2-EmGFP-PL3质粒组，C为转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-34c质粒组。
图17为实施例9中转染pcDNA6.2-PL3-DsRed质粒后在Hela细胞内的表达情况(红色荧光)。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。其中，发明中所用到的pcDNA6.2-EmGFP-mir载体(购自Invitrogen)和Hela细胞(ATCC-CCL2)，以及后续试验中所插入的外源蛋白序列为北京工业大学病毒药理室所有(可购自Clontech Laboratories，Inc)。质粒中量提取试剂盒为QIAGEN Plasmid Midi kit，购于德国QIAGEN公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京TIANGEN公司；所用的BsaI和DraI及其他常用的DNA内切酶和T4DNA Ligase均购于英国NEB公司；细胞培养试剂DMEM，无血清培养基Opti-MEM，胎牛血清，脂质体转染试剂Lipofectamine及miRNA反转录和miRNA定量检测试剂盒均购于美国Invitrogen公司；Realtime PCR反应仪为美国stratagene Mx3000P。
本发明所涉及的分子生物学相关技术如核酸操作技术、细胞转染技术等在科学文献中都已有充分描述(如参见J·萨姆布鲁克E·F·弗里奇T·曼尼要蒂斯，《分子克隆实验指南》(第三版))。涉及到各种试剂(或试剂盒)的具体操作，按照各试剂(或试剂盒)的使用说明书进行。
实施例1采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2构建重组质粒
pcDNA6.2-EmGFP-PL
1、采用本领域常规合成技术合成序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，然后使2条单链序列退火形成双链序列，即为本发明提供的含多克隆位点的核苷酸序列。
在退火使得两条单链形成双链的过程中，两条单链的浓度应该是相同的，退火反应体系中所用的单链的DNA的浓度为50μM。首先将合成的两条单链加入适量的TE缓冲液中配成浓度为200μM的溶液，各取5μl单链溶液加入到反应EP管里，加入2μl的10x退火反应液，加入8μl的无DNase/RNase的水，将反应体系加入到95℃的水浴锅中缓慢降温至室温，2.5％琼脂糖胶电泳检测，结果见图3。
将所得到的双链多克隆位点序列按梯度稀释法稀释到10nM的浓度。即，首先取1μl上一步得到的50μM的双链多克隆位点序列母液加入到99μl无DNase/RNase水中，混匀得到双链DNA的浓度为500nM，取500nM的双链DNA 1μl加入到49μl无DNase/RNase的水中混匀得到浓度为10nM的双链多克隆位点序列。所的双链片段-20℃保存。
2、连接得到的双链多克隆位点序列和线性的pcDNA6.2-EmGFP-MIR质粒载体。
所用到的线性的pcDNA6.2-EmGFP-MIR质粒载体(SEQ ID NO.10)的母液浓度为10ng/μl。在EP管中加入4μl 10nM双链多克隆位点序列反应液，2μl线性的pcDNA6.2-EmGFP-MIR质粒载体母液，2μl 10x Ligase bμffer，1μlDNA Ligase 11μl，无DNase/RNase的水，配成20μl的反应体系，16℃过夜连接。
3、制备TOP10感受态细菌
从37℃培养16-20hrs的新鲜平板上挑取TOP10单菌落，接种于3ml不含抗生素的LB培养基中，37℃中速摇床培养过夜(250r/mim，12-16h)。取1ml上述培养物按1∶100的接种比例加入到100ml的LB培养基中继续培养，待菌液的OD值达到0.3-0.6时，将菌液移植到两支预冷的无菌的50ml离心管中，冰浴30mins。4℃，3000g离心10mins，弃上清，加入10ml冰冷的CaCl2重悬，冰上放置30min，4℃，3000g离心5mins，再次加入含10％DMSO的2ml冰冷的CaCl2重悬细菌，按每管100μl的量分装到预冷无菌的EP管中。
4、连接产物的转化
取步骤2中的10μl连接产物加入到步骤3中的100μl的TOP10感受态细菌中，将反应体系冰上孵育30mins后，迅速放入42℃水浴中孵育90s热激活，热激活后再次冰浴3mins。冰浴结束后向反应体系加入500μl新鲜LB培养基，37℃，150r/min，复苏培养45mins。取200μl复苏好的菌液均匀涂到LB壮观霉素选择性固体培养基上，37℃过夜培养。
5、获得pcDNA6.2-EmGFP-PL重组质粒
分别挑取步骤4中的单个菌落接种到3ml LB培养基中，37℃，200r/min过夜摇菌(12-16hrs)，次日取2ml菌液碱裂解法提取质粒，1％琼脂糖电泳检测(图4)。EcoRI酶切鉴定，EcoRI是插在PL中的一个酶，pcDNA6.2-EmGFP-PL中只有一个EcoRI酶切切位点(图5)。鉴定正确，使用质粒中提试剂盒制备pcDNA6.2-EmGFP-PL质粒。
由于此pcDNA6.2-EmGFP-PL重组质粒所包含的多克隆位点序列来自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，将其命名为pcDNA6.2-EmGFP-PL1，线性序列为SEQ ID NO.7。
实施例2将实施例1构建的重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL1用于表
达miRNA
1、合成Hsa-miR-155的pre-miRNA的互补单链序列(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)：
正义链(SEQ ID NO.11)：
5-TGCTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCCCTATCGATTAGCATTAA-3
反义链(SEQ ID NO.12)：
5-CCTGTTAATGCTAATCGATAGGGGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACCCCTATCACGATTAGCATTAAC-3
序列最终含有MscI DNA内切酶以便于检测。2条单链退火合成双链的过程如实施例1的步骤1所述。
2、pcDNA6.2-EmGFP-PL1表达miRNA质粒的构建及中量制备
用BsaI酶切小量制备的pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒，1％琼脂糖凝胶回收试剂盒回收大片段(图6)，按照实施例1所述方法连接hsa-mir-155和线性的pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒，连接产物转化TOP10感受态细菌，分别挑取单个菌落接种到3ml LB培养基中，37℃摇菌活化细胞8hrs，将活化后的细菌按1∶1000的比例接种到100ml LB培养基中，37℃，250r/min过夜摇菌(12-16hrs)，次日使用质粒中提试剂盒提取质粒，将其命名为pcDNA6.2-EmGFP-mir-155。MscI DNA内切酶酶切质粒8hrs，1％琼脂糖电泳胶鉴定。质粒提取结果见图7，MscI酶切结果见图8。
3、pcDNA6.2-EmGFP-mir-155质粒在Hela细胞表达miRNA
将pcDNA6.2-EmGFP-mir-155质粒和pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒分别转染Hela细胞。Hela细胞按3x105/孔的量铺六孔板，用无抗生素的培养基过夜培养，待细胞达到90-95％融合的时候进行脂质体转染。转染前1hrs去掉6孔板中细胞培养基，加入1ml无血清无抗生素的Opti-MEM培养基。4μg质粒溶解在250μl无血清无抗生素Opti-MEM培养基中，10μl lipofectamine溶解在250μl无血清无抗生素OPti-MEM培养基中，室温孵育5mins后，将含质粒的Opti-MEM培养基分别加入到含lipofectamine的Opti-MEM培养基中，混匀，室温孵育30mins，将脂质体和质粒的混合物均匀地滴加到6孔板中的Hela细胞中，37℃，5％CO2培养箱中过夜孵育后去掉旧培养基换上带血清的DMEM培养基。18-36小时以后提取RNA，DNaseI消化以后做反转录，用Realtime PCR仪检测Hsa-mir-155的表达情况。反应的条件是：共40个循环的“50℃2mins，95℃，2mins；95℃，15s；60℃，1min”；95℃，1min；55℃，30s，95℃，30s。
实验结果表明在hsa-mir-155表达量方面，转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-155质粒组比转染pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒组和未转染组增高7倍，证实pcDNA6.2-EmGFP-PL1载体可以用于表达miRNA。实验结果见图9。
实施例3将实施例1构建的重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL1用于表
达dsRed蛋白
1、dsRed蛋白DNA序列的克隆
蛋白表达所插入的外源蛋白核酸是红色荧光蛋白dsRed蛋白核酸序列(SEQ ID NO 13)，此蛋白在波长为557nm的激发光照射下可以显示红色荧光。通过PCR的方式从质粒pDsRed-Monomer-Hyg-N1载体中克隆得到。克隆DeRed的上游和下游引物分别插入DraI酶切位点(上游引物AGCTTTGTTTAAAATGGACAAGACCGAGGACGTC ，下游引物AGCTTTGTTTAAACTACTGGGAGCCGGAGTGGCG)。在200μl的反应管中加入50μl的反应体系：1μl(2.5M)Taq DNA聚合酶、5μl的10x反应缓冲液、1μl dNTP(10mM each)、2μl每条引物溶液(5μM)，1μl模板质粒(0.1μg/μl)，ddH2O 38μl。PCR反应的设置条件：95℃，5mins；95℃，30s，58℃，30s，72℃，1min(共30个循环)；72℃，5mins。将PCR反应的产物用1％琼脂糖电泳胶电泳并用琼脂糖电泳回收试剂盒回收，目的产物大小为700bp左右(图10)。
2、pcDNA6.2-EmGFP-PL1表达蛋白质粒构建及中量制备
用DraI内切酶酶切pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒，1％电泳胶电泳回收大片段，按照实施例1所述方法连接DsRed片段与回收到的线性pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒，连接产物转化TOP10感受态细菌，分别挑取单个转化的菌落接种到3ml LB培养基中，37℃摇菌活化细胞8hrs，将活化后的细菌按1∶1000的比例接种到100ml LB培养基中，37℃，250r/min过夜摇菌(12-16hrs)，次日使用质粒中提试剂盒提取质粒，将其命名为pcDNA6.2-PL1-DsRed，DraI DNA内切酶酶切质粒8hrs，1％琼脂糖电泳胶鉴定。质粒提取结果见图11，DraI酶切结果见图12。
3、pcDNA6.2-PL1-DsRed质粒在Hela细胞中表达与鉴定
将pcDNA6.2-PL1-DsRed质粒和pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒分别转染Hela细胞。Hela细胞按3x105/孔的量铺6孔板，用无抗生素的培养基过夜培养，待细胞达到90-95％融合的时候进行脂质体转染。转染前1hrs去掉6孔板中细胞培养基加入1ml无血清无抗生素的Opti-MEM培养基，4μg质粒溶解在250μl无血清无抗生素Opti-MEM培养基中，10μl lipofectamine溶解在250μl无血清无抗生素OPti-MEM培养基中，室温孵育5mins后，将含质粒的Opti-MEM培养基分别加入到含lipofectamine的Opti-MEM培养基中，混匀，室温孵育30mins，将脂质体和质粒的混合物均匀地滴加到6孔板中的Hela细胞中，37℃，5％CO2培养箱中过夜孵育后去掉旧培养基换上带血清的DMEM培养基。18-36小时以后荧光显微镜在557nm波长激发光条件下观察转染组Hela细胞红色荧光的表达情况。
实验结果证实转染pcDNA6.2-PL1-DsRed质粒组细胞出现红色荧光的表达(图13)，转染pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒组和未转染组无红色荧光的表达，证明pcDNA6.2-EmGFP-PL1质粒可以作为一种表达蛋白的载体使用。
实施例4采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4构建重组质粒
pcDNA6.2-EmGFP-PL
基本上按照实施例1中所述操作构建重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL，区别在于采用序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4形成含多克隆位点的核苷酸序列。
由于此pcDNA6.2-EmGFP-PL重组质粒所包含的多克隆位点序列来自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，将其命名为pcDNA6.2-EmGFP-PL2。
实施例5将实施例4构建的重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL2用于表
达miRNA
基本上按照实施例2所述操作进行此实施例。
将重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL2用于表达miRNA，区别在于采用Hsa-miR-34a代替Hsa-miR-155和pcDNA6.2-EmGFP-PL2一起构建miRNA表达质粒pcDNA6.2-EmGFP-mir-34a。其中Hsa-miR-34a(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)为：
正义链(SEQ ID NO.14)：
5-TGCTGTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTGTTTTGGCCACTGACTGACACAACCAGAAGACACTGCCA-3
反义链(SEQ ID NO.15)：
5-CCTG-TGGCAGTGTCTTCTGGTTGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACAACCAGCTAAGACACTGCCAC-3
将pcDNA6.2-EmGFP-mir-34a质粒和pcDNA6.2-EmGFP-PL2质粒分别转染Hela细胞。
实验结果表明在hsa-mir-34a表达量方面，转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-34a质粒组比转染pcDNA6.2-EmGFP-PL2质粒组和未转染组高5.84倍，证实pcDNA6.2-EmGFP-PL2载体可以用于表达miRNA。实验结果见图14。
实施例6将实施例4构建的重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL2用于表
达dsRed蛋白
基本上按照实施例3所述操作进行此实施例，区别在于将重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL2和dsRed蛋白序列用于构建表达dsRed蛋白的重组质粒pcDNA6.2-PL2-DsRed。
将pcDNA6.2-PL2-DsRed质粒和pcDNA6.2-EmGFP-PL2质粒分别转染Hela细胞。
实验结果证实转染pcDNA6.2-PL2-DsRed质粒组细胞出现红色荧光的表达(图15)，转染pcDNA6.2-EmGFP-PL2质粒组和未转染组无红色荧光的表达，证明pcDNA6.2-EmGFP-PL2质粒可以作为一种表达蛋白的载体使用。
实施例7采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6构建重组质粒
pcDNA6.2-EmGFP-PL
基本上按照实施例1中所述操作构建重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL，区别在于采用序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6形成含多克隆位点的核苷酸序列。
由于此pcDNA6.2-EmGFP-PL重组质粒所包含的多克隆位点序列来自SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，将其命名为pcDNA6.2-EmGFP-PL3。
实施例8将实施例7构建的重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL3用于表
达miRNA
基本上按照实施例2所述操作进行此实施例。
将重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL3用于表达miRNA，区别在于采用Hsa-miR-34c代替Hsa-miR-155和pcDNA6.2-EmGFP-PL3一起构建miRNA表达质粒pcDNA6.2-EmGFP-mir-34c。其中Hsa-miR-34c(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17)为：
正义链(SEQ ID NO.16)：
5-TGCTGAGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCAATCAGAACTACACTGCCT-3
反义链(SEQ ID NO.17)：
5-CCTGAGGCAGTGTAGTTCTGATTGCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGCAATCAGCTAACTACACTGCCTC-3
将pcDNA6.2-EmGFP-mir-34c质粒和pcDNA6.2-EmGFP-PL3质粒分别转染Hela细胞。
实验结果表明在hsa-mir-34c表达量方面，转染pcDNA6.2-EmGFP-mir-34c质粒组比转染pcDNA6.2-EmGFP-PL3质粒组和未转染组高6.8倍，证实pcDNA6.2-EmGFP-PL3载体可以用于表达miRNA。实验结果见图16。
实施例9将实施例7构建的重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL3用于表
达dsRed蛋白
基本上按照实施例3所述操作进行此实施例，区别在于将重组质粒pcDNA6.2-EmGFP-PL3和dsRed蛋白序列用于构建表达dsRed蛋白的重组质粒pcDNA6.2-PL3-DsRed。
将pcDNA6.2-PL3-DsRed质粒和pcDNA6.2-EmGFP-PL3质粒分别转染Hela细胞。
实验结果证实转染pcDNA6.2-PL3-DsRed质粒组细胞出现红色荧光的表达(图17)，转染pcDNA6.2-EmGFP-PL3质粒组和未转染组无红色荧光的表达，证明pcDNA6.2-EmGFP-PL3质粒可以作为一种表达蛋白的载体使用。
Claims (12)
1.一种双链核苷酸序列，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如式1和式2所示：
5’-(X)n1GAGACC(X)n2TTTAAA(X)n3GGTCTC(X)n4-3’
式1
5’-(Y)n5GAGACC(Y)n6TTTAAA(Y)n7GGTCTC(Y)n8-3’
式2
其中，所述式1中的X为选自A、T、C或G，(X)n1为TGCTG，(X)n4为A，n2为1至20的整数，n3为1至20的整数，条件是(X)n2或(X)n3均不包含GAGACC、TTTAAA和GGTCTC；
所述式2中的Y为选自A、T、C或G，(Y)n5为CCTGT，(Y)n8为C，n6为1至20的整数，n7为1至20的整数，条件是(Y)n6或(Y)n7均不包含GAGACC、TTTAAA和GGTCTC；并且
n2=n7，(X)n2与(Y)n7互补；n3=n6，(X)n3与(Y)n6互补。
2.根据权利要求1所述的双链核苷酸序列，其特征在于，n2和n7为6至20的整数；n3和n6为6至20的整数。
3.根据权利要求1或2所述的双链核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1或2所述的双链核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1或2所述的双链核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
6.一种重组质粒，所述重组质粒包含根据权利要求1至5中任一项所述的双链核苷酸序列，并且所述重组质粒通过将根据权利要求1至5中任一项所述的双链核苷酸序列插入到质粒pcDNA6.2-EmGFP-mir中进行构建。
7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pcDNA6.2-EmGFP-PL。
8.根据权利要求6或7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pcDNA6.2-EmGFP-PL1，序列如SEQ ID NO.7所示。
9.根据权利要求6或7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pcDNA6.2-EmGFP-PL2，序列如SEQ ID NO.8所示。
10.根据权利要求6或7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pcDNA6.2-EmGFP-PL3，序列如SEQ ID NO.9所示。
11.一种构建根据权利要求6至10中任一项所述的重组质粒的方法，所述方法包括：
1）分别合成如权利要求1至5中任一项所述的双链核苷酸序列的两条单链核苷酸序列，然后使两条单链核苷酸序列退火形成所述双链核苷酸序列；以及
2）将经步骤1）得到的双链核苷酸序列插入到质粒pcDNA6.2-EmGFP-mir中，以形成所述重组质粒。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤2）包括：
连接经步骤1）得到的双链核苷酸序列与经线性化的质粒pcDNA6.2-EmGFP-mir，将获得的连接产物转化宿主细胞，然后从宿主细胞获得所述重组质粒。
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| 小RNA分子研究进展;沙龙泽等;《生物学通报》;20091231;第44卷(第1期);第1-5页 * |
| 沙龙泽等.小RNA分子研究进展.《生物学通报》.2009,第44卷(第1期),第1-5页. |
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