CN101368188A - 一种快速高效的植物人工微rna表达载体构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种快速高效的植物人工微RNA(amiRNAs)表达载体构建方法，它是通过以下两大步骤完成的。一)含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建：1)选择并改造供体骨架载体，2)引物设计，3)PCR扩增，4)同源重组转化筛选；二)将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上：1)选择并改造受体载体，2)采用接合辅助的遗传整合克隆方法将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，验证重组子，选出植物amiRNAs表达载体。在改造供体骨架载体和受体载体时，分别克隆了筛选标记基因或报告基因表达单元和大肠杆菌条件致死基因表达单元。本发明不需要酶切连接反应，也不需要对载体或目的片段进行特殊处理，整个过程操作简单方便，实验周期短，重组效率高，能够快速、高效、零背景、高通量地构建植物amiRNAs表达载体。

Description

一种快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法

技术领域

本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种快速高效构建植物人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)表达载体的方法。特别适合用于大规模的构建针对植物的不同基因的植物人工微RNA表达单元，以研究植物基因的功能。

背景技术

随着越来越多的物种全基因组序列测定工作的完成，当前的基因组学研究热点已经由结构基因组学转向了功能基因组学，从而发展能够快速、高效、高通量的基因功能研究方法和策略也自然成为了研究热点。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术由于特异性高，操作简便，重复性好，已成为当今动植物基因功能研究中重要的手段之一，然而由于动植物细胞本身内在的特点，RNAi技术在动物基因功能研究中的应用已经相当广泛和普遍，而在植物中，由于脱靶效应的存在导致其应用相对受阻。近一年多来，陆续有文献报导植物人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)能够高效、高特异性地沉默植物的内源和外源基因，而且应用范围比传统的RNAi技术更加广泛。在美国的拟南芥2010计划中，就运用了植物amiRNAs表达技术研究拟南芥中以多基因家族形式存在的基因的功能。

目前，已知的构建植物amiRNAs表达载体的方法主要有三种：第一种是采用重叠延伸PCR的方法，先按照需要设计三对引物，进行三轮独立的PCR，获得的三种PCR产物分别含有：待干扰的目的基因的靶序列、amiRNAs的环序列以及待干扰的目的基因靶序列的互补序列；然后采用重叠延伸PCR的方法将获得的三种PCR产物拼接成完整的amiRNAs茎环结构序列(见图1)，再将其克隆到植物双元表达载体上。第二种是设计一对引物，该引物分别含有针对目的基因设计的靶序列以及与靶序列互补的序列，且两端分别带有特定的酶切位点，以从植物中获得的microRNA(miRNA)的cDNA序列作为模板进行PCR，获得的产物经酶切酶连处理后克隆到入口载体上，然后采用Gateway重组的方法将amiRNAs的茎环结构序列克隆到植物双元表达载体上(见图2)。第三种是直接合成法。通过以上方法虽然能够成功构建植物amiRNAs表达载体，但是明显存在不足，主要表现在以下几个方面：

一、步骤繁琐，克隆效率低。以上三种方法都需要对克隆的目的片段和载体进行特殊处理，需要目的片段与载体的连接反应。三种方法中，载体都需要经过合适的酶切、纯化处理。第一种方法需要用三对不同的引物经第一轮PCR获得三段200bp左右大小的DNA片段，对其分别进行纯化处理后，再以该纯化产物为模板进行第二轮重叠延伸PCR，得到完整的amiRNAs结构。由于第一轮PCR产物通常在200bp以下，因此纯化效率较低，成本较高。而且植物双元载体一般较大(10kb以上)，amiRNAs茎环结构克隆上去之前的酶切、纯化、酶连操作相对困难。第二种方法需要在引物中额外添加针对干扰目的基因设计的靶序列以及amiRNAs的侧翼序列，通常需要长引物(大于60nt)或者多轮的PCR扩增才能获得完整的amiRNAs茎环结构序列，获得的PCR产物也需要酶切，然后与同样酶切处理过的入口载体进行连接反应。这个过程不仅花费时间，而且增加了载体的自连背景，使后续的筛选过程复杂化。第三种方法需要化学合成的两条寡核苷酸单链体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体连接反应；由于待克隆的片段小于100bp，因此难以回收纯化，而且要鉴定正确的重组质粒较难，假阳性率高。

二、不适合高通量的操作。以上三种方法中的待克隆目的片段都需要预先处理纯化，都依赖于载体与片段的连接反应。这些操作对于构建单个或少数植物amiRNAs表达载体可能有效，但如果大规模构建植物amiRNAs表达载体却非常困难，效率低下。第一种方法中，得到一个完整的amiRNA茎环结构序列需要两对特定的引物，四次独立的PCR和回收步骤，这不仅步骤烦琐，费时费力，而且成本高。第二种方法中使用的引物通常大于60nt，第三种方法需要使用的寡核苷酸单链通常为80～100nt，合成这些长的引物或寡核苷酸单链不仅大大增加了实验成本，而且碱基合成正确率大大下降，从而使得后续的筛选工作成本增加。

三、不适合用于所有植物miRNA的种类。植物体内不同的miRNA的侧翼序列和环序列的长度差异很大。前两种方法都不适合用于以环序列长度过短的miRNA为基础的amiRNAs的构建。第一种方法中，如果amiRNAs的环长度过短，将使得第一轮PCR产物的长度过短，最终导致纯化困难，回收效率低下。第二种方法只适合侧翼序列碱基数目少而且环长度较长的植物miRNA。

(参见刊物“Plant Cell.2006 May；18(5)：1134-51”；“Plant Cell.2006 May；18(5)：1121-33.”“Nat Biotechnol.2006 Nov；24(11)：1420-8.”参见网页http://2010.cshl.edu/)

发明内容

本发明的目的是提供一种新的植物人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)表达载体构建技术。该技术主要包括植物amiRNAs表达单元的构建和amiRNAs表达单元克隆到植物双元表达载体两大步骤。该技术不需订购长度大于60nt的引物，不需要对PCR产物及载体进行酶切、连接步骤就能迅速地构建植物amiRNAs表达载体，真正做到快速、高效、低成本的构建植物amiRNAs表达载体。

本发明中构建植物amiRNAs表达载体的具体方法为(见图5)：

一)含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建

1)选择并改造供体骨架载体。在miRNA5’与3’侧翼序列之间克隆一筛选标记基因或报告基因的表达单元(如：gfp、ccdB等)，通过该表达单元的缺失，可以直接鉴定出含有植物amiRNAs表达单元的重组子；在5’侧翼序列(5’flank)的前面添加一个控制植物amiRNAs表达的启动子(promoter)，在3’侧翼序列(3’flank)的后面添加一终止子序列(terminator)，得到植物amiRNAs的供体骨架载体(见图3)。

2)引物设计。根据在线软件或相关运算规则，设计针对目的基因进行RNA干扰的靶序列。首先以miRNA的环序列为基础，设计一条长度与其相同的引物①；然后根据前面所述的amiRNAs的供体骨架载体上miRNA的5’侧翼序列和3’侧翼序列，设计一对PCR引物(引物②和引物③)，该对引物应该在与amiRNAs供体骨架载体特异性退火的序列5’末端加上已设计的靶序列(TS1、TS2)，除此之外，引物②还应在5’末端加上与引物①特异性退火的序列LSP1，引物③的5’末端还应加上引物①5’末端的10-15nt序列HR，使两者末端产生10-15bp的同源序列。(具体参见图5B)

3)PCR扩增。利用2)中设计的引物①②③，以前面所述的amiRNAs供体骨架载体为模板，经套式PCR扩增，获得的PCR产物含有amiRNAs供体骨架载体上的miRNA的侧翼序列和干扰目的基因的靶序列，而且PCR产物5’和3’末端分别带有部分miRNA的环序列，同时PCR产物缺失了amiRNAs骨架载体中的筛选标记基因或报告基因的表达单元(如：gfp、ccdB等)。(具体参见图5C)

4)同源重组转化筛选。获得的PCR产物直接转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，在大肠杆菌体内经同源重组自环化，得到含有干扰目的基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒。

以上叙述过程参见图5中路线A→B→C→F。

除了以上叙述的方法外，构建含amiRNAs表达单元的供体质粒还可以通过下列方法实现：

1)选择并改造供体骨架载体。首先在miRNA 5’与3’侧翼序列之间克隆一筛选标记基因或报告基因的表达单元(如：gfp、ccdB等)，通过该表达单元的缺失，可以直接鉴定出含有植物amiRNAs表达单元的重组子；在5’侧翼序列(5’flank)的前面添加一个控制植物amiRNAs表达的启动子(promoter)，在3’侧翼序列(3’flank)的后面添加一终止子序列(terminator)，得到植物amiRNAs的供体骨架载体(见图3)。

2)引物设计。根据在线软件或相关运算规则，设计干扰目的基因的靶序列。根据前面所述的amiRNAs的供体骨架载体上miRNA5’侧翼序列和3’侧翼序列，设计一对引物④和⑤；同时根据该miRNA的环序列，再设计一对引物⑥和⑦，该引物应该在与所选用的植物miRNA的环序列特异性退火的序列5’末端依次加上已设计的靶序列(TS1、TS2)以及引物④和引物⑤的5’末端的10-15nt序列(HR1、HR2)，使两PCR产物末端分别产生10-15bp的同源序列。(具体参见图5D/G)

3)PCR扩增。利用2)中设计的引物④和⑤，以前面所述的ami RNAs供体骨架载体为模板，进行PCR扩增；利用引物⑥和⑦，以含有所选用的植物miRNA的环序列的载体为模板，进行PCR扩增。

4)同源重组转化筛选。获得的两种PCR产物经乙醇沉淀后按1：5～10比例混合转化至大肠杆菌DH10β感受态细胞，在大肠杆菌体内经同源重组后，得到含有干扰目的基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒。

以上叙述过程参见图5中路线A→D/G→E→F。

由于在以amiRNAs供体骨架载体为模板的PCR过程中，miRNA 5’与3’侧翼序列之间的筛选标记基因或报告基因的表达单元(如：gfp、ccdB等)缺失，重组质粒和原始模板可以通过琼脂糖凝胶电泳有效区分；还可以通过筛选标记基因或报告基因自身的特点，如：gfp报告基因表达能自发荧光，在大肠杆菌中，原始模板表达gfp自发荧光，排除因模板污染而产生的背景。

二)人工微RNAs(amiRNAs)表达单元克隆到植物双元载体上

1)选择并改造受体载体。首先在植物双元载体上克隆一大肠杆菌的条件致死基因表达单元，如：phes基因(在培养基中加入氯化苯丙氨酸，表达的PHES对大肠杆菌有致死效应)，而且该表达单元两端分别带有一个I-SceI酶切位点以及一段与含有amiRNAs表达单元的供体质粒同源的50bp序列，获得植物双元受体载体(见图4)，将其转入大肠杆菌BUN21(pML300)中。

2)采用接合辅助的遗传整合克隆方法(mating-assisted genetically integrated cloning，MAGIC)将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，具体操作步骤如下：

a)将携带有包含amiRNAs表达单元的供体质粒(构建过程前面已叙述)的大肠杆菌DH10β接种于含有氨苄青霉素(Amp)100μg/ml、葡萄糖0.2％的LB平板，将含有植物双元受体载体的大肠杆菌BUN21(pML300)接种于含有卡那霉素(Kan)50μg/ml、壮观霉素(Spec)50μg/ml和葡萄糖0.2％的LB平板，于30℃过夜培养。

b)挑取已长出的单菌落接种于5ml相应的液体培养基过夜培养。

c)第二天，分别于4000rpm室温离心5min，收集菌体，将收集的两种菌体分别重悬于1ml LB液体，重复上述离心重悬操作1-3次。将两种菌体各取40μl分别加入到两支不同的试管中，试管内含有2ml添加了0.2％鼠李糖的LB培养基，于30℃摇2小时左右，使两试管中菌体的OD₂₆₀值达到0.15～0.25。

d)1：1混合上述两种菌体，加阿拉伯糖使其终浓度为0.2％，混匀后，37℃静置2小时，然后37℃摇床培养2小时。

e)将上述菌体涂布于含有氨苄青霉素100μg/ml、卡那霉素50μg/ml的LB固体平板，42℃过夜培养。

f)挑取单菌落，验证重组子，选出植物人工微RNA(amiRNAs)表达载体。

上述步骤中，通过在培养基中添加阿拉伯糖，从大肠杆菌BUN21(pML300)中诱导表达出的内切酶I-SceI，可将供体质粒上amiRNAs表达单元和植物双元受体载体上的大肠杆菌条件致死基因表达单元(如：pheS)分别从其两侧I-SceI酶切位点处切下，因含有amiRNAs表达单元的供体质粒和植物双元受体载体经内切酶I-SceI酶切后，切下的amiRNAs表达单元和植物双元受体载体的线性化酶切产物末端带有50bp的彼此同源序列，所以在大肠杆菌BUN21(pML300)中，由鼠李糖诱导表达出的重组酶可以使带有50bp同源序列的两片段在大肠杆菌体内发生同源重组，从而获得含有amiRNAs表达单元的植物双元载体，即植物amiRNAs表达载体。

所述的植物amiRNAs表达载体包括以所有植物miRNA结构为骨架构建的含有植物amiRNAs表达单元的载体；控制植物amiRNAs表达的启动子可以是组成型、诱导型、细胞或组织特异性启动子。

当步骤一)中构建的含有植物amiRNAs表达单元的载体用于植物原生质体的瞬间表达检测、或者通过除步骤二)所述的接合辅助的遗传整合克隆方式以外的方法将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上、或者不依赖于农杆菌介导的植株转化时，用到的载体可以是能在大肠杆菌体内复制的所有载体。

步骤二)所述的将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，还可以通过传统的酶切连接的方法或者Gateway重组的方式来实现。

本发明与现有技术相比具有明显的优势：

一、本发明中，获得的PCR产物转化大肠杆菌DH10β菌株的感受态细胞，产物通过在大肠杆菌体内同源重组，得到含有干扰目的基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体载体。然后通过接合辅助的遗传整合克隆的方式，快速高效地将含有干扰目的基因的靶序列的amiRNAs表达单元转移到植物双元表达载体上。整个过程不需要酶切连接反应，也不需要对载体或目的片段进行特殊处理，PCR产物就可直接转化大肠杆菌感受态细胞。整个过程操作简单方便，实验周期短，重组效率高，能够快速高效地构建植物amiRNAs表达载体。

二、本发明在amiRNAs供体骨架载体上引入筛选标记基因或报告基因的表达单元(如：gfp、ccdB等)，通过该表达单元的缺失，根据筛选标记基因或报告基因自身的特点，可以直接鉴定出含有植物amiRNAs表达单元的重组子，如：gfp报告基因表达能自发荧光，经PCR后gfp表达单元缺失，可根据转化后的大肠杆菌菌落发光与否将模板淘汰；且最终的amiRNAs供体质粒与模板大小有一定差异，也能通过简单的琼脂糖凝胶电泳区分开来；在amiRNAs受体骨架载体上引入一个大肠杆菌的条件致死基因(如：phes)表达单元，amiRNAs表达单元转移上去之后该单元缺失，因此可通过在培养基中添加特殊化学物质(如：氯化苯丙氨酸)将含有模板质粒的大肠杆菌淘汰。利用引入的筛选标记基因或报告基因(如：gfp、ccdB等)以及大肠杆菌的条件致死基因(如：phes)的方法能有效去除模板污染，真正做到零背景的构建植物amiRNAs表达载体。

三、本发明中构建amiRNAs表达单元所用到的每条引物长度都可控制在60nt以内，不仅节省了实验成本，而且大大降低了引物合成中的碱基错误率。

四、本发明采用接合辅助的遗传整合克隆(MAGIC)的方式将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，整个过程操作简单方便，实验周期短，重组效率高。

五、本发明的整个过程操作简单、成本低、效率高，很容易实现自动化和高通量操作。

该方法不仅适用于实验室小规模的单个基因功能研究，也适用于大规模的功能基因组学研究。

附图说明

图1：重叠延伸PCR构建amiRNAs结构过程。

其中A和B为基于模板载体设计的一对引物，I—IV为带有针对目的基因设计的靶序列的引物。重叠延伸PCR为将引物A-IV、II-III、I-B分别扩增得到的PCR产物混于一个反应体系，利用引物A-B进行PCR得到的PCR产物为完整的amiRNA茎环结构。

图2：Gateway重组的方式构建amiRNAs表达载体过程。

其中FW primer和RV primer为带有干扰目的基因的靶序列引物，同时引物5’带有miR159a的侧翼序列以及额外引入的酶切位点。

图3：本发明中构建的amiRNAs供体骨架载体。Promoter为控制amiRNA表达的启动子，5’flank和3’flank为miRNA两端侧翼序列，gfp表示包括gfp在内的所有筛选标记基因或报告基因表达单元，terminator表示终止信号，Amp^R表示氨苄青霉素抗性基因，H3和H4表示与50bp受体载体同源的序列，I-SceI表示酶切位点。

图4：本发明中构建的amiRNAs受体骨架载体。LB和RB分别表示植物双元表达载体的左边界和右边界，bar^R表示除草剂抗性基因，hygr^R表示潮霉素抗性基因，H3和H4表示50bp与amiRNAs供体载体同源的序列，pheS表示包括phes在内的所有大肠杆菌条件致死基因表达单元，I-SceI表示酶切位点。

图5：本发明中植物amiRNAs表达载体的构建过程。

其中A表示amiRNAs供体骨架载体，5’flank和3’flank分别表示miRNA的5’和3’侧翼序列。B和D表示根据miRNA的侧翼序列和环序列设计的引物，箭头所指方向为引物5’→3’方向，①表示根据环序列设计的一条引物；引物②和③中，SP1和SP2表示与侧翼序列退火区域，TS1和TS2表示针对目的基因设计的干扰靶序列及其互补序列，LSP1表示与引物①退火区域，HR表示与环序列末端的同源区域；引物④和⑤中，5’flank和3’flank分别表示miRNA的5’和3’侧翼序列，VP1和VP2表示与载体退火区域。C和E表示PCR扩增得到的线性产物。F表示经大肠杆菌体内同源重组后得到的含有amiRNAs表达单元的供体质粒。G表示根据miRNA的环序列设计的引物⑥和⑦，loop sequence表示miRNA的环序列，LP1和LP2表示与环序列的退火区域，TS1和TS2表示针对目的基因设计的干扰靶序列及其互补序列，HR1和HR2表示与载体两端同源的区域。H表示本发明中构建的amiRNAs受体骨架载体。I表示采用接合辅助的遗传整合克隆(MAGIC)的方式获得的植物amiRNAs表达载体。

具体实施方式

下面以实施例对本发明进一步说明：

实施例1：

利用本发明的方法构建以模式植物拟南芥的一种miRNA——miR156b为骨架，干扰目的基因——β-葡萄糖酸苷酶基因(GUS)的amiRNAs表达载体。

1)含干扰GUS基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒的构建

首先构建一个包含由RNA聚合酶II型启动子(CaMV35S)控制的miR156b表达单元(CaMV35S-miR156b-NOS)的供体质粒，在该供体质粒中包含的miR156b序列的5’侧翼序列和3’侧翼序列之间引入gfp基因表达单元，得到供体骨架载体pDonor156b-gfp。根据miR156b的环序列设计一条引物①——p156loop，根据在线软件设计干扰GUS基因的amiRNAs的靶序列，根据miR156b的5’侧翼序列和3’侧翼序列设计一对反向PCR扩增供体质粒pDonor156b-gfp的引物②——pGUS1和引物③——pGUS2，具体序列为：

p156loop：5’atgcaggcactgttatgtgtctataactttgcgtgtgc 3’；

pGUS1：5’tgtctataactttgcgtgtgctttaatcgcctgtaagtgcgGTTGCCTATCTCTGCCTG 3’；

pGUS2：5’ataacagtgcctgcattttaatcgcctgtaagtgcgGTTTTCTCTGTTGCATTCCT 3’；

其中，斜体为干扰GUS基因的靶序列，大写为与供体骨架载体特异性退火的序列，pGUS1中下划线部分为与引物p156loop退火的序列，pGUS2中下划线部分为15nt的同源序列。以构建好的供体骨架载体pDonor156b-gfp为模板，利用上述3条引物进行套式PCR扩增，得到的PCR产物直接转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，筛选得到重组质粒，即含有干扰GUS基因的靶序列的amiRNA表达单元的供体质粒。实验结果表明，阳性克隆率大于95％。

2)amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上

首先构建一个植物amiRNAs受体骨架载体：在植物双元载体pCAMBIA2300的多克隆位点处引入一phes基因表达单元，同时该表达单元两端携带I-SceI酶切位点及与供体骨架载体pDonor156b-gfp中amiRNAs表达单元两端同源的50bp序列，获得植物双元受体载体pR-2300，并将其转化至大肠杆菌BUN21(pML300)中。

采用接合辅助的遗传整合克隆(MAGIC)的方式，将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，具体操作步骤如下：

a)将携带有包含干扰GUS基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒的大肠杆菌DH10β接种于含有氨苄青霉素(Amp)100μg/ml、葡萄糖0.2％的LB平板，将含有植物双元受体载体pR-2300的大肠杆菌BUN21(pML300)接种于含有卡那霉素(Kan)50μg/ml、壮观霉素(Spec)50μg/ml和葡萄糖0.2％的LB平板，于30℃过夜培养。

b)挑取已长出的单菌落接种于5ml相应的液体培养基过夜培养。

c)第二天，分别于4000rpm室温离心5min，收集菌体，将收集的两种菌体分别重悬于1ml LB液体，重复上述重悬、离心操作1-3次。将两种菌体各取40μl分别加入到两支不同的试管中，试管内含有2ml添加了0.2％鼠李糖的LB培养基，于30℃摇2小时左右，使两试管中菌体的OD₂₆₀值达到0.15～0.25。

d)按1：1比例混合上述两种菌体，加阿拉伯糖使其终浓度为0.2％，混匀后，37℃静置2小时，然后37℃摇床培养2小时。

e)将上述菌体涂布于含有氨苄青霉素100μg/ml、卡那霉素50μg/ml的LB固体平板，42℃过夜培养。

f)挑取单菌落，验证重组子，验证正确的重组质粒即为含有干扰GUS基因的amiRNAs表达载体。

实验结果表明，获得amiRNAs表达载体的阳性克隆率达到100％。

实施例2：

利用本发明的方法构建以模式植物拟南芥的一种miRNA——miR319a为骨架，干扰拟南芥八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的amiRNAs表达载体。

1)含干扰PDS基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒的构建

首先构建一个包含由RNA聚合酶II型启动子(CaMV35S)控制的miR319a表达单元(CaMV35S-miR319a-NOS)的供体质粒载体，在该供体质粒载体中包含的miR319a的5’侧翼序列和3’侧翼序列之间引入gfp基因表达单元，得到供体骨架载体pDonor319a-gfp。根据在线软件设计干扰PDS基因的amiRNAs靶序列，根据miR319a的5’侧翼序列和3’侧翼序列设计一对反扩供体骨架载体pDonor319a-gfp的引物④——pD319a-1和引物⑤——pD319a-2，根据miR319a的环序列序列设计一对引物⑥——p319a-PDS1和引物⑦——p319a-PDS2，设计好的引物序列为：

pD319a-1：5’ctctcttttgtattccaatttagctcga 3’；

pD319a-2：5’ctacatatatattcctaaaacatcaagagtccc 3’；

p319a-PDS1：5’ggaatatatatgtagctcgcggatcataaatcgatct tcacaggtcgtgatatgattca 3’；

p319a-PDS2：5’gaatacaaaagagagctagcggatcatattcgatca tcaaagagaatcaatgatccaa 3’；

其中，斜体为干扰PDS基因的amiRNAs的靶序列，小写灰色阴影部分为与反扩供体骨架载体pDonor319a-gfp的PCR产物的15nt同源区，下划线部分为与miR319a环序列的退火序列。以质粒pDonor319a-gfp为模板，利用引物pD319a-1和pD319a-2进行PCR扩增，以带有完整miR319a序列的质粒为模板，利用引物p319a-PDS1和p319a-PDS2进行PCR扩增，获得的两种PCR产物经乙醇沉淀后按1：5～10的比例混合，然后转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，筛选获得的重组质粒，即为含有干扰PDS基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒。实验结果表明，阳性克隆率大于80％。

2)amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上

首先构建一个植物amiRNAs受体骨架载体：在植物双元载体pCAMBIA2300的多克隆位点处引入一phes基因表达单元，同时该phes基因表达单元两端携带I-SceI酶切位点及与供体载体pDonor319a-gfp中的amiRNAs表达单元两端同源的50bp序列，获得植物双元受体载体pR-2300。

采用接合辅助的遗传整合克隆(MAGIC)的方式(操作步骤同实施例1)，将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，获得含有携带干扰PDS基因的靶序列的amiRNAs表达单元的植物amiRNAs表达载体。实验结果表明，获得植物amiRNAs表达载体的阳性克隆率达到100％。

Claims (6)

1.一种快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法，其特征在于步骤为：

一)含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建

1)选择并改造供体骨架载体，在miRNA5’与3’侧翼序列之间克隆一筛选标记基因或报告基因表达单元，在5’侧翼序列的前面添加一个控制植物amiRNAs表达的启动子，在3’侧翼序列的后面添加一终止子序列，得到植物amiRNAs的供体骨架载体；

2)引物设计，根据在线软件或相关运算规则，设计针对目的基因进行RNA干扰的靶序列，首先以miRNA的环序列为基础，设计一条长度与其相同的引物①；然后根据前面所述的amiRNAs的供体骨架载体上miRNA的5’侧翼序列和3’侧翼序列，设计一对PCR引物②和③，该对引物应该在与amiRNAs供体骨架载体特异性退火的序列5’末端加上已设计的靶序列TS1、TS2，除此之外，引物②还应在5’末端加上与引物①特异性退火的序列LSP1，引物③的5’末端还应加上引物①5’末端的10-15nt序列HR，使两者末端产生10-15bp的同源序列；

3)PCR扩增，利用2)中设计的引物①②③，以前面所述的amiRNAs供体骨架载体为模板，经套式PCR扩增，获得的PCR产物含有amiRNAs供体骨架载体上的miRNA的侧翼序列和干扰目的基因的靶序列，而且PCR产物5’和3’末端分别带有部分miRNA的环序列，同时PCR产物缺失了amiRNAs骨架载体中的筛选标记基因或报告基因表达单元；

4)同源重组转化筛选，获得的PCR产物直接转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，在大肠杆菌体内经同源重组自环化，得到含有干扰目的基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒；

二)将人工微RNAs表达单元克隆到植物双元载体上

1)选择并改造受体载体，首先在植物双元载体上克隆一大肠杆菌条件致死基因表达单元，而且该表达单元两端分别带有一个I-SceI酶切位点以及一段与含有amiRNAs表达单元的供体质粒同源的50bp序列，将其转入大肠杆菌BUN21(pML300)中；

2)采用接合辅助的遗传整合克隆方法将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，验证重组子，选出植物人工微RNA表达载体。

2.一种快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法，其特征在于步骤为：

一)含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建

1)选择并改造供体骨架载体，首先在miRNA5’与3’侧翼序列之间克隆一筛选标记基因或报告基因表达单元，在5’侧翼序列的前面添加一个控制植物amiRNAs表达的启动子，在3’侧翼序列的后面添加一终止子序列，得到植物amiRNAs的供体骨架载体；

2)引物设计，根据在线软件或相关运算规则，设计干扰目的基因的靶序列，根据前面所述的amiRNAs的供体骨架载体上miRNA5’侧翼序列和3’侧翼序列，设计一对引物④和⑤；同时根据该miRNA的环序列，再设计一对引物⑥和⑦，该引物应该在与所选用的植物miRNA的环序列特异性退火的序列5’末端依次加上已设计的靶序列TS1、TS2，以及引物④和引物⑤的5’末端的10-15nt序列HR1、HR2，使两PCR产物末端分别产生10-15bp的同源序列；

3)PCR扩增，利用2)中设计的引物④和⑤，以前面所述的amiRNAs供体骨架载体为模板，进行PCR扩增；利用引物⑥和⑦，以含有所选用的植物miRNA的环序列的载体为模板，进行PCR扩增；

4)同源重组转化筛选，获得的两种PCR产物经乙醇沉淀后按1：5～10比例混合转化至大肠杆菌DH10β感受态细胞，在大肠杆菌体内经同源重组后，得到含有干扰目的基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒；

二)人工微RNAs表达单元克隆到植物双元载体上

1)选择并改造受体载体，首先在植物双元载体上克隆一大肠杆菌条件致死基因表达单元，而且该表达单元两端分别带有一个I-SceI酶切位点以及一段与含有amiRNAs表达单元的供体质粒同源的50bp序列，将其转入大肠杆菌BUN21(pML300)中；

2)采用接合辅助的遗传整合克隆方法将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，验证重组子，选出植物人工微RNA表达载体。

3.根据权利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法，其特征在于采用接合辅助的遗传整合克隆方法将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上的具体操作步骤如下：

a)将构建的携带有包含amiRNAs表达单元的供体质粒的大肠杆菌DH10β接种于含有氨苄青霉素(Amp)100μg/ml、葡萄糖0.2％的LB平板，将含有植物双元受体载体的大肠杆菌BUN21(pML300)接种于含有卡那霉素50μg/ml、壮观霉素50μg/ml和葡萄糖0.2％的LB平板，于30℃过夜培养；

b)挑取已长出的单菌落接种于5ml相应的液体培养基过夜培养；

c)第二天，分别于4000rpm室温离心5min，收集菌体，将收集的两种菌体分别重悬于1ml LB液体，重复上述离心重悬操作1-3次，将两种菌体各取40μl分别加入到两支不同的试管中，试管内含有2ml添加了0.2％鼠李糖的LB培养基，于30℃摇2小时左右，使两试管中菌体的OD₂₆₀值达到0.15～0.25；

d)1：1混合上述两种菌体，加阿拉伯糖使其终浓度为0.2％，混匀后，37℃静置2小时，然后37℃摇床培养2小时；

e)将上述菌体涂布于含有氨苄青霉素100μg/ml、卡那霉素50μg/ml的LB固体平板，42℃过夜培养；

f)挑取单菌落，验证重组子，选出植物人工微RNA表达载体。

4.根据权利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法，其特征在于将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上的方法还可以通过传统的酶切连接的方法或者Gateway重组的方式来实现。

5.根据权利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法，其特征在于构建的含有植物amiRNAs表达单元的载体所用到的载体可以是能在大肠杆菌体内复制的所有载体。

6.根据权利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法，其特征在于所述的植物amiRNAs表达载体包括以所有植物miRNA结构为骨架构建的含有植物amiRNAs表达单元的载体；控制植物amiRNAs表达的启动子可以是组成型、诱导型、细胞或组织特异性启动子。

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