CN114592022A - 一种基于dna模板的长链tna合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA模板的长链TNA合成方法。该方法属于非天然核酸合成技术领域，具体步骤：获得DNA模板及对应引物；配置TNA引物延伸的反应体系；特定温度下进行以DNA为模板的TNA引物延伸反应；取小部分反应产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验，检验引物延伸反应是否成功进行；TNA产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，分离模板DNA和TNA，切胶回收TNA。相比于固相合成，本发明可以有效地合成长达300nt的TNA，大幅提高了TNA合成的长度上限，并降低了合成的成本。为较长的TNA合成提供了优良的合成方式，支持了TNA在分子生物学中的研究和应用。
Description
技术领域
本发明属于非天然核酸TNA合成技术领域，涉及一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，更具体的是；涉及一种通过工程化改造的聚合酶以DNA模板合成长单链苏糖核酸(TNA)的方法。
背景技术
苏糖核酸(TNA)是一种非天然核酸，它可与DNA或RNA形成稳定的双螺旋结构，同时能够储存和传递遗传信息。由于TNA化学结构简单，结构与天然核酸不同，因此TNA更耐受核酸酶的降解，在苛刻条件下更加稳定，在细胞环境中能更稳定地发挥作用。基于此，TNA在生物学、医学领域中有巨大的应用潜力。目前，已有研究筛选得到TNA酶和TNA适体。
固相合成受限于长度，目标TNA链越长，合成产率边际递减，成本边际提高。因此，固相合成不适用于长链TNA的合成，限制了TNA在不同领域的研究。
针对以上问题，开发一种成本更低，产率更高，且可以大规模合成TNA长链的合成技术是研发重点。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，具体是一种基于DNA模板、通过聚合酶催化的长链TNA分子合成方法，该发明可以实现较长的TNA链合成，相比于固相合成成本更低、产率更高。
技术方案：本发明所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其具体操作步骤如下：
(1)、选择特定的TNA的序列；
(2)、通过固相合成等方法获得TNA对应的DNA模板；
(3)、配置TNA延伸的反应体系，进行TNA延伸；
(4)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验所获得的TNA；
(5)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收TNA。
进一步的，在所述步骤(1)中，选择特定的TNA的序列是TNA酶、TNA适体或是和体内RNA形成互补配对可进行基因沉默的TNA中的一种；
包括核酸酶、干扰序列及适体。
进一步的，在所述步骤(2)中，通过固相合成等方法获得TNA对应的DNA模板具体是通过固相合成获取所需的DNA模板，或使用聚合酶合成、酶切等方法获得所需的单链DNA片段作为模板。
进一步的，在所述步骤(3)中，进行TNA延伸的具体操作方法是：
首先，利用获得的DNA模板和引物，与水和反应缓冲液混合，后在90℃下退火至4℃，置于冰上；
然后，加入Mn2+离子和Kod-RI DNA聚合酶；
最后，加入苏糖核苷三磷酸，在55℃下进行引物延伸反应，即TNA转录。
进一步的，在所述步骤(4)中，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验具体是：通过红外荧光扫描成像仪观察DNA引物部分有Cy5.5荧光基团的TNA链延伸情况，检验转录是否成功。
进一步的，在所述步骤(5)中，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收TNA具体是：通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，分离DNA模板和TNA，在紫外光照射下，观察并切下全长TNA部分所对应的条带，通过浸泡凝胶回收得到TNA分子。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点：相比于固相合成，本发明可以有效地合成长达300nt的TNA，大幅提高了TNA合成的长度上限，并降低了合成的成本。为较长的TNA合成提供了优良的合成方式，支持了TNA在分子生物学中的研究和应用。
附图说明
图1是本发明实施例的流程图；
图2为本发明制备DNA模板的结果图；
图3为本发明制备的100nt、200nt、300nt TNA的结果图；其中1、2、3为100nt、200nt、300nt的TNA所在泳道，1M、2M、3M为100nt、200nt、300nt的DNA对照所在泳道，N为无模板对照。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其具体操作步骤如下：
(1)、选择需要合成TNA的序列，比如核酸酶、干扰序列、适体；具体的是：选择合成的序列可以是TNA酶或TNA适体，也可以是和体内RNA形成互补配对可以进行基因沉默的TNA，具有选择的范围广、通用性好的特点；
现有的研究基础上选取有应用潜力的功能性长TNA序列，可以通过本发明以高效率、低成本地进行合成；
(2)、获得需要的TNA对应的DNA模板，可以通过固相合成等方法获取；通过固相合成获取所需的DNA模板、使用聚合酶合成或酶切等方法获得所需要的单链DNA片段作为模板；
具体操作方法是：
固相合成：DNA通过固相亚磷酰胺法合成，反应溶液中的亚磷酰胺单体通过缩合反应形成磷酸酯键，并依次延伸；
酶切：确认需要的DNA片段和切割位点，使用对应的酶进行酶切消化；充分反应后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所需片段，用核酸染色剂染色，然后在紫外光下收取对应条带的凝胶，浸泡凝胶回收DNA；
(3)、配置TNA延伸的反应体系，进行TNA延伸；具体操作方法是：
首先，将所得的DNA模板和引物在与水和反应缓冲液混合后，升温至90℃后退火至4℃，并置于冰上；其中，模板和引物的终浓度均为100nM；
反应缓冲液为10×溶液，包含：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mMMgSO4，1％Triton，pH＝8.8；
加入终浓度为0.25mg/mL的Kod-RI DNA聚合酶，和终浓度为0.2mM的MnCl2，最后加入终浓度为10μM的tNTPs，在55℃条件下，反应12小时；
其中，引物5’端带有荧光基团Cy5.5；
然后，加入Mn2+离子和Kod-RI DNA聚合酶；
最后，加入苏糖核苷三磷酸(tNTPs)，在55℃下进行引物延伸反应，即TNA转录；
(4)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验所获得的TNA；具体操作方法是：
进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，通过红外荧光扫描成像仪观察DNA引物部分有Cy5.5荧光基团的TNA链延伸情况，检验转录是否成功；
具体的是：取0.1pmol得到的TNA延伸反应体系，进行20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析延伸反应是否成功进行；
(5)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收TNA；具体操作方法是：
通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，分离DNA模板和TNA，在紫外光照射下，观察并切下全长TNA部分所对应的条带，通过浸泡凝胶回收得到TNA分子；
具体的是：
首先，将所得TNA延伸产物，进行20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，在紫外光照下切胶回收对应的TNA条带；
然后，将凝胶泡在水中，在60℃下，摇晃震动12小时，分离回收水相；
最后，将回收的水相进行除盐和冻干，得到TNA分子。
实施例
随机选取质粒pET26b来制备长度为200nt、300nt的DNA模板；通过不对称PCR获取单链，然后通过制备的DNA模板进行TNA的引物延伸，结果显示可通过本方法，可利用Kod-RI聚合酶合成长度为300nt的长链TNA；整个反应过程如图1所示；
1、合成不对成PCR所需的引物
表1合成的引物名称及序列
其中，T7为质粒pET26b的通用引物，R200、R300分别为下游200bp、300bp位置对应的下游引物；通过调整引物长度，可将其调整为接近的Tm值，约为49℃；100Tem为通过固相合成直接获得的100nt DNA模板；通过固相合成可获得大量上述引物；
2、进行不对称PCR：
由于较长的DNA模板无法固相合成，因此使用不对称PCR的方法制备固定长度的DNA单链作为TNA引物延伸的模板；
按照表2配置不对称PCR的反应体系，随后在PCR仪进行不对称PCR，反应条件为：95℃4min，30×【95℃30sec，44℃30sec，72℃30sec】，72℃5min；
表2质粒的不对称PCR反应体系
3、琼脂糖凝胶电泳切胶回收单链DNA：
在不对称PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图2所示；琼脂糖凝胶电泳与Marker条带对应的深色条带为双链PCR产物，下方较浅色的为制备所得的单链DNA；
其中，使用TBE缓冲液配置成的1.5％的琼脂糖凝胶，电泳条件为100V，45min，或延长时间，直至单链与双链分离；
借助凝胶成像系统的紫外光照射，利用DNA凝胶回收试剂盒，切胶回收单链DNA；
4、基于DNA模板的TNA引物延伸：
在成功制备模板链后，使用tNTP进行引物延伸反应；引物延伸反应体系如表3；
其中，10×反应缓冲液(ThermoPol buffer)的配方为:200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.8；
如需制备多的TNA产物，可按比例扩大表3的反应体系；
表3引物延伸的反应体系
具体操作如下：
(1)、混合引物、模板、反应缓冲液和水，加热至90℃5min，然后在10分钟内以10℃/min，退火至4℃，然后置于冰上3min；
(2)、退火时，将聚合酶和MnCl2预先混合，然后加入至反应体系中；
(3)、加苏糖核苷三磷酸(tNTP)开始反应；在55℃孵育12h；
(4)、反应结束后，取3μL反应体系溶液与20μL终止缓冲液混合，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，检验反应是否成功，电泳功率为60w，时间为1h，通过红外荧光扫描成像仪观察DNA引物部分有Cy5.5荧光基团的TNA链延伸情况，结果如图3；从图中可知，成功制备长度为300nt的TNA。由于凝胶较长，因此分为两次拍摄，主要产物在图的上半部分；
其中，终止缓冲液(stop buffer)：1×TBE，20mM EDTA，7M urea，pH 8；
(5)、再次进行大体系变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
在紫外线照射下，切下300nt TNA所在的条带(因为TNA的分子量小于对应长度DNA，因此在300nt DNA条带对应位置下方)。将凝胶泡在水中，在60℃下，摇晃震动12小时，分离回收水相；
最后，将回收的水相进行除盐和冻干，得到TNA分子。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其特征在于，其具体操作步骤如下：
(1)、选择特定的TNA的序列；
(2)、通过固相合成等方法获得TNA对应的DNA模板；
(3)、配置TNA延伸的反应体系，进行TNA延伸；
(4)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验所获得的TNA；
(5)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收TNA。
2.根据权利要求1所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其特征在于，
在所述步骤(1)中，特定的TNA的序列包括TNA酶、TNA适体或是和体内RNA形成互补配对可进行基因沉默的TNA。
3.根据权利要求1所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其特征在于，
在所述步骤(2)中，通过固相合成等方法获得TNA对应的DNA模板具体是通过固相合成获取所需的DNA模板，或使用聚合酶合成、酶切等方法获得所需的单链DNA片段作为模板。
4.根据权利要求1所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，进行TNA延伸的具体操作方法是：
首先，利用获得的DNA模板和引物，与水和反应缓冲液混合，后在90℃下退火至4℃，置于冰上；
然后，加入Mn2+离子和Kod-RIDNA聚合酶；
最后，加入苏糖核苷三磷酸，在55℃下进行引物延伸反应，即TNA转录。
5.根据权利要求1所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验具体是：通过红外荧光扫描成像仪观察DNA引物部分有Cy5.5荧光基团的TNA链延伸情况，检验转录是否成功。
6.根据权利要求1所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其特征在于：在所述步骤(5)中，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收TNA具体是：通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，分离DNA模板和TNA，在紫外光照射下，观察并切下全长TNA部分所对应的条带，通过浸泡凝胶回收得到TNA分子。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317684A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-12 | 南京大学 | 一种基于tna分子的细胞内镁离子成像的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1936020A (zh) * | 1994-12-09 | 2007-03-28 | 基因库公司 | 用特定序列组合体检测核酸的方法 |
| WO2014107502A2 (en) * | 2013-01-04 | 2014-07-10 | Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Methods and compositions for replication of threose nucleic acids |
| US20150275192A1 (en) * | 2012-04-19 | 2015-10-01 | Medical Research Council | Polymerase capable of producing non-dna nucleotide polymers |
| US20160097069A1 (en) * | 2014-08-19 | 2016-04-07 | John Chaput | Modified polymerases for replication of threose nucleic acids |
| US20160145606A1 (en) * | 2014-11-25 | 2016-05-26 | John Chaput | Nuclease-Resistant DNA Analogues |
| CN114317684A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-12 | 南京大学 | 一种基于tna分子的细胞内镁离子成像的方法 |
-
2022
- 2022-03-30 CN CN202210322009.9A patent/CN114592022A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1936020A (zh) * | 1994-12-09 | 2007-03-28 | 基因库公司 | 用特定序列组合体检测核酸的方法 |
| US20150275192A1 (en) * | 2012-04-19 | 2015-10-01 | Medical Research Council | Polymerase capable of producing non-dna nucleotide polymers |
| WO2014107502A2 (en) * | 2013-01-04 | 2014-07-10 | Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Methods and compositions for replication of threose nucleic acids |
| US20160138063A1 (en) * | 2013-01-04 | 2016-05-19 | John Chaput | Methds and compositions for replication of threose nucleic acids |
| US20160097069A1 (en) * | 2014-08-19 | 2016-04-07 | John Chaput | Modified polymerases for replication of threose nucleic acids |
| US20160145606A1 (en) * | 2014-11-25 | 2016-05-26 | John Chaput | Nuclease-Resistant DNA Analogues |
| CN114317684A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-12 | 南京大学 | 一种基于tna分子的细胞内镁离子成像的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NICHOLAS CHIM等: "Structural basis for TNA synthesis by an engineered TNA polymerase", NATURE COMMUNICATIONS，, no. 8, pages 2 * |
| 王瑶等: "功能性非天然核酸的体外筛选及应用于肿瘤靶向治疗的研究", 第十一届全国化学生物学学术会议论文摘要（第一卷）, pages 95 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317684A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-12 | 南京大学 | 一种基于tna分子的细胞内镁离子成像的方法 |
| CN114317684B (zh) * | 2021-12-15 | 2023-12-26 | 南京大学 | 一种基于tna分子的细胞内镁离子成像的方法 |
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