CN114908083B - 一种双链环状dna体外快速合成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双链环状DNA体外快速合成的方法，所述方法包括获得感兴趣的内源性eccDNA序列片段；然后根据序列片段的起止位点在设计PCR扩增引物，引物5‘端带上II型限制性内切酶识别位点序列；设计并合成linker DNA的寡核苷酸序列SS和AS；通过高温变性低温退火将SS和AS互补连接为带有粘性末端的双链DNA；将扩增得到的产物与同样来源于内源eccDNA连接位点的linker DNA进行混合；对混合物进行酶切‑连接的循环反应，获得足够多的eccDNA；再消化去除反应体系中的线性片段；经纯化后最终可得到忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA。本发明的有益效果在于，可在体外快速高效合成eccDNA，且该合成的eccDNA可高度遵循于生物体内存在的eccDNA序列。

Description

一种双链环状DNA体外快速合成的方法

技术领域

本发明涉及基于生物DNA序列的基因合成领域，具体涉及一种双链环状DNA体外快速合成的方法。

背景技术

环状DNA是自然界普遍存在的一种DNA分子形式，如细菌或酵母等微生物的基因组DNA、细菌质粒、线粒体DNA等等都是环状DNA分子。此外，真核生物中还有一类特殊的环状DNA分子，它们从染色体中分离或脱落下来，游离于正常基因组之外，以特殊的方式参与生理或病理过程。在真核生物中，由于它们是在染色体之外独立存在的DNA分子，因此统称为染色体外DNA，又因为是环状结构，因此称其为染色体外环状DNA(extrachromosomalcircular DNA)，简称eccDNA。

近年来研究表明，大多数肿瘤组织中存在eccDNA，而这些eccDNA往往携带着肿瘤驱动基因，且它的富集通常会促进癌基因的扩增，从而增加了癌基因的可塑性和不稳定性，因此其对肿瘤细胞的进化可能存在着重要意义，这一发现使eccDNA迅速引起了科学界的重视。2018年，Moller, H. D.等从健康人的肌肉和血液细胞中分离到超过十万种的eccDNA分子，其中绝大部分携带基因或基因片段，长度往往在100 bp～10 kb之间。该研究表明eccDNA可能普遍存在。近几年，在高通量测序技术及相关生信分析软件的开发应用，使我们能在整体层面对eccDNA有了更深入的了解，但对感兴趣的单个eccDNA的功能验证，目前仅能合成1kb以下长度的环状DNA用于下游功能检测，且步骤繁琐，合成得率低，耗时耗力。与传统基因功能验证不同的是，eccDNA的数量和类型（包括序列信息）在不同细胞和不同应激条件下具有高度的异质性。这就要求eccDNA的合成需要高度遵循于内源eccDNA的序列信息，否则会引起功能解析的偏颇。因此，从现有的科研进展来看，eccDNA合成方法学的缺失仍然是目前该领域研究的技术痛点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种双链环状DNA体外快速合成的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双链环状DNA体外快速合成的方法，所述方法包括：

获得感兴趣的内源性eccDNA序列片段；

然后根据eccDNA的起止位点在基因组上设计PCR扩增引物，并带上II型限制性内切酶识别位点序列；

设计并合成linker DNA的寡核苷酸序列SS和AS；

通过高温变性低温退火将SS和AS互补连接为带有粘性末端的双链DNA；

将扩增得到的产物与同样来源于内源eccDNA连接位点的linker DNA进行混合；

对混合物进行酶切-连接的循环反应，获得足够多的eccDNA；

随后用Exonuclease V (NEB, #M0345L) 或Plasmid-Safe-DnaseI (Lucigen, #E3110K) 消化去除反应体系中的线性片段；

经纯化后最终可得到忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA。

需要指出的是，本发明中的感兴趣片段还可以是线性DNA片段，例如包括特定基因的片段、病毒DNA片段、定制化合成的线性DNA片段等。

需要说明的是，识别位点序列为BsmBI、BbsI、BsaI、AarI或其他II型限制性内切酶位点，具体根据线性片段中是否有该酶切位点来选择。

需要说明的是，所述寡核苷酸序列SS和AS分别为：

5’-agggcCGTCAGTCCAGATATCTTTGc-3’；

3’-gGCAGTCAGGTCTATAGAAACgttat-5’。

需要进一步说明的是，在本发明中，寡核苷酸序列SS和AS中间的互补序列（即大写碱基）及粘性末端序列（即小写碱基）可根据实际环状DNA的序列决定。

需要说明的是，合成后的linker DNA为带有粘性末端的双链片段。

需要说明的是，酶切-连接循环反应具体为：1ug的内源性eccDNA线性片段与1ul（100uM）的linker DNA混合，同时往混合体系中添加1ul T4 DNA ligase（Thermofisher #EL0016）,2ul T4 ligase buffer, 1ul BsmBI（Thermofisher #FD0454），最后加去离子水补齐到20ul，将这20ul混合体系置于37℃ 中酶切5min，22℃连接10min，如此进行10个循环，最后置于37℃彻底酶切反应30min，接着置于75℃灭活所有反应酶。

需要说明的是，采用DNA外切酶将酶切-连接循环反应后剩余的线性DNA消化去除，只保留环状DNA。

需要说明的是，当本发明中的eccDNA序列片段难以通过PCR扩增，可采用以下步骤进行目的片段制备：

设计引物A扩增PUC19质粒中的AmpR+Ori片段，接着通过测序和生信分析获取感兴趣的内源性eccDNA序列，然后根据eccDNA的起止位点在基因组上设计PCR扩增引物B，引物B的5’端带上II型限制性内切酶识别位点序列和AmpR+Ori片段两端15-20bp的同源序列；

将引物A和引物B扩增得到的片段使用TaKaRa In-fusion试剂盒无缝连接，使其形成一个带有氨苄抗性并可进行复制的质粒；

将质粒转化到感受态细胞中，挑取阳性克隆菌进行PCR和酶切验证，随后将含序列正确质粒的菌液扩大培养后，获得足量的正确质粒并将其用于制备忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA中。

本发明的有益效果在于，可在体外快速高效合成eccDNA，且该合成的eccDNA可高度遵循于生物体内存在的eccDNA序列。

附图说明

图1为本发明实施例1的流程图。

图2为本发明实施例2所提供的快速合成eccDNA流程示意图；

图3本发明实施例1中copGFP阅读框扩增示意图及eccDNA-GFP合成示意图；

图4为本发明实施例1中eccDNA-GFP单酶切和双酶切验证示意图；

图5为本发明实施例1中eccDNA-GFP接头处序列Sanger测序结果示意图；

图6本发明实施例1中EccDNA-GFP可在细胞中表达绿色荧光。

具体实施方式

以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

本发明为一种双链环状DNA体外快速合成的方法，所述方法包括：

获得感兴趣的内源性eccDNA序列片段；

然后根据eccDNA的起止位点在基因组上设计PCR扩增引物，并带上II型限制性内切酶识别位点序列；

设计并合成linker DNA的寡核苷酸序列SS和AS；

通过高温变性低温退火将SS和AS互补连接为带有粘性末端的双链DNA；

将扩增得到的产物与同样来源于内源eccDNA连接位点的linker DNA进行混合；

对混合物进行酶切-连接的循环反应，获得足够多的eccDNA；

随后用Exonuclease V (NEB, #M0345L) 或Plasmid-Safe-DnaseI (Lucigen, #E3110K) 消化去除反应体系中的线性片段；

经纯化后最终可得到忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA。

需要指出的是，本发明中的感兴趣片段还可以是线性DNA片段，例如包括特定基因的片段、病毒DNA片段、定制化合成的线性DNA片段等。

需要说明的是，识别位点序列为BsmBI、BbsI、BsaI、AarI或其他II型限制性内切酶位点，具体根据线性片段中是否有该酶切位点来选择。

需要说明的是，所述寡核苷酸序列SS和AS分别为：

5’-agggcCGTCAGTCCAGATATCTTTGc-3’；

3’-gGCAGTCAGGTCTATAGAAACgttat-5’。

需要说明的是，在本发明中，寡核苷酸序列SS和AS中间的互补序列（即大写碱基）及粘性末端序列（即小写碱基）根据实际环状DNA的序列决定。

需要说明的是，合成后的linker DNA为带有粘性末端的双链片段。

需要说明的是，酶切-连接循环反应具体为：1ug的内源性eccDNA线性片段与1ul（100uM）的linker DNA混合，同时往混合体系中添加1ul T4 DNA ligase（Thermofisher #EL0016）,2ul T4 ligase buffer, 1ul BsmBI（Thermofisher #FD0454），最后加去离子水补齐到20ul，将这20ul混合体系置于37℃ 中酶切5min，22℃连接10min，如此进行10个循环，最后置于37℃彻底酶切反应30min，接着置于75℃灭活所有反应酶。

需要说明的是，采用DNA外切酶将酶切-连接循环反应后剩余的线性DNA消化去除，只保留环状DNA。

需要说明的是，当本发明中的eccDNA序列片段难以通过PCR扩增，可采用以下步骤进行目的片段制备：

设计引物A扩增PUC19质粒中的AmpR+Ori片段，接着通过测序和生信分析获取感兴趣的内源性eccDNA序列，然后根据eccDNA的起止位点在基因组上设计PCR扩增引物B，引物B的5’端带上II型限制性内切酶识别位点序列和AmpR+Ori片段两端15-20bp的同源序列；

将引物A和引物B扩增得到的片段使用TaKaRa In-fusion试剂盒无缝连接，使其形成一个带有氨苄抗性并可进行复制的质粒；

将质粒转化到感受态细胞中，挑取阳性克隆菌进行PCR和酶切验证，随后将含序列正确质粒的菌液扩大培养后，获得足量的正确质粒并将其用于制备忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA中。

实施例1

通过以下实施例进一步陈述本发明所具备优点。本实施例拟合成一个可表达绿色荧光蛋白的双链环状DNA。

步骤1，选取,pMax-copGFP质粒作为模板，在其CMV增强子起始点设计正向引物，并在正向引物5’端加上5个保护碱基（atcaa）和BsmBI酶切位点（CGTCTC），在其copGFP阅读框3’端适当位置设计反向引物，同时在反向引物的5’端加上5个保护碱基（cttaa）和BsmBI酶切位点（CGTCTC），接着通过DNA多聚酶链式反应（PCR）将包含增强子和启动子的copGFP片段（1788bp）进行线性扩增，如图3所示。

步骤2，设计并合成linker DNA寡核苷酸序列SS和AS，其中，序列分别为：

5’-agggcCGTCAGTCCAGATATCTTTGc-3’；

3’-gGCAGTCAGGTCTATAGAAACgttat-5’；

1uloligo SS 和1uloligo AS混合，并加入2ul 10X NEB Buffer2, 加入去离子水补齐到20ul，95℃变性5min，接着95℃反应10s, 一共150个循环，每个循环降0.5℃，直至降到20℃保持5min, 最后于4℃保存，执行这一变性退火程序，oligo SS和AS可形成带有粘性末端的双链DNA linker片段；

步骤3，将步骤1中得到的1788kb长的线性片段与步骤2得到的双链linker DNA片段混合，进行酶切-连接循环反应：1ug的内源性eccDNA线性片段与1ul（100uM）的linkerDNA混合，同时往混合体系中添加1ul T4 DNA ligase（Thermofisher #EL0016）,2ul T4ligase buffer, 1ul BsmBI（Thermofisher #FD0454），最后加去离子水补齐到20ul，将这20ul混合体系置于37℃ 中酶切5min，22℃连接10min，如此进行10个循环，最后置于37℃彻底酶切反应30min，接着置于75℃灭活所有反应酶。

步骤4，利用Cycle-Pure-Kit（Omega，#D6492-02）对步骤3中产物进行纯化，纯化后产物为Purified product A；

步骤5，接着加入PSD酶（Plasmid-Safe-DnaseI）消化纯化产物中残留的线性片段，具体是，往80ul的Purified product A中加入4ulPSD酶，5ul ATP溶液，10X PSD 反应buffer，并加入去离子水补齐到100ul，将这100ul混合体系置于37℃反应过夜，最后置于70℃反应30min使PSD酶失活。

步骤6，利用Cycle-Pure-kit对步骤5中产物进行纯化，纯化后产物为Purifiedproduct B;

步骤7，对纯化后产物Purified product B进行单酶切和双酶切验证，以确保产物是正确的eccDNA序列；具体是，单酶切体系为：取1ulPurified product B，加入1ul NheI限制性内切酶，1ul 10X FastDigestgreenbuffer，最后加入去离子水补齐到10ul，置于37℃反应1小时，4℃保存；双酶切反应：取1ulPurified product B，加入1ul NheI限制性内切酶，1ul XhoI限制性内切酶,1ul 10X FastDigestgreenbuffer， 最后加入去离子水补齐到10ul，置于37℃反应1小时,4℃保存。

步骤8，对单酶切、双酶切的产物Purified product B进行琼脂糖凝胶电泳，同时对eccDNA-GFP接头处序列进行Sanger测序，其结果如图4和图5所示，从图中可看出本实施例中合成的eccDNA-GFP是序列正确的环状DNA分子；

同时，为进一步验证通过上述方法所合成的eccDNA的功能，在本发明中，将其转染至HEK 293T细胞中，48h后在荧光倒置显微镜下观察，可以发现合成的带GFP阅读框的eccDNA能在细胞中表达绿色荧光蛋白，如图6所示，从而进一步证明了本发明实施例合成的eccDNA是可在细胞中发挥功能的环状DNA分子。

实施例2

本发明的另一实施例是，当eccDNA序列片段难以通过PCR扩增时，可采用以下步骤进行目的片段制备（如图2所示）：

设计引物A扩增PUC19质粒中的AmpR+Ori片段，接着通过测序和生信分析获取感兴趣的内源性eccDNA序列，然后根据eccDNA的起止位点在基因组上设计PCR扩增引物B，引物B的5’端带上II型限制性内切酶识别位点序列和AmpR+Ori片段两端15-20bp的同源序列；

将引物A和引物B扩增得到的片段使用TaKaRa In-fusion试剂盒无缝连接，使其形成一个带有氨苄抗性并可进行复制的质粒；

将质粒转化到感受态细胞中，挑取阳性克隆菌进行PCR和酶切验证，随后将含序列正确质粒的菌液扩大培养后，获得足量的正确质粒并将其用于制备忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA中。

在该实施例中，主要解决的是eccDNA序列片段难以通过PCR扩增时的情况。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种双链环状DNA体外快速合成的方法，其特征在于，所述方法包括：

获得pMax-copGFP质粒或PUC19质粒中感兴趣的内源性eccDNA序列片段；

然后根据eccDNA的起止位点在基因组上设计PCR扩增引物，并带上II型限制性内切酶识别位点序列；

设计并合成linker DNA的单链寡核苷酸序列SS和AS；

通过高温变性低温退火将SS和AS互补连接为带有粘性末端的双链DNA；

将扩增得到的产物与同样来源于内源eccDNA连接位点的linkerDNA进行混合；

对混合物进行酶切-连接的循环反应，获得足够多的eccDNA；

随后用ExonucleaseV或Plasmid-Safe-DnaseI消化去除反应体系中的线性片段；

经纯化后最终可得到忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA；

其中，所述寡核苷酸序列SS和AS为：

5’-agggcCGTCAGTCCAGATATCTTTGc-3’；

3’-gGCAGTCAGGTCTATAGAAACgttat-5’；

酶切-连接循环反应具体为：1μg的内源性eccDNA线性片段与1μL的linker DNA混合，同时往混合体系中添加1μL T4DNAligase、2μL T4ligasebuffer、1μL BsmBI，最后加去离子水至20μL，将这20μL混合体系置于37℃中酶切5min，22℃连接10min，如此进行10个循环，最后置于37℃彻底酶切反应30min，接着置于75℃灭活所有反应酶。

2.根据权利要求1所述的双链环状DNA体外快速合成的方法，其特征在于，合成后的linker DNA为带有粘性末端的双链片段。

3.根据权利要求1所述的双链环状DNA体外快速合成的方法，其特征在于，采用DNA外切酶将酶切-连接循环反应后剩余的线性DNA消化去除，只保留环状DNA。

4.根据权利要求1所述的双链环状DNA体外快速合成的方法，其特征在于，还包括对于难以通过PCR扩增的片段，采用以下步骤进行目的片段制备：

设计引物A扩增PUC19质粒中的AmpR+Ori片段，接着通过测序和生信分析获取感兴趣的内源性eccDNA序列，然后根据eccDNA的起止位点在基因组上设计PCR扩增引物B，引物B的5’端带上II型限制性内切酶识别位点序列和AmpR+Ori片段两端15-20bp的同源序列；

将引物A和引物B扩增得到的片段使用TaKaRaIn-fusion试剂盒无缝连接，使其形成一个带有氨苄抗性并可进行复制的质粒；

将质粒转化到感受态细胞中，挑取阳性克隆菌进行PCR和酶切验证，随后将含序列正确质粒的菌液扩大培养后，获得足量的正确质粒并将其用于制备忠实于内源序列信息的无缝连接的eccDNA中。

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