CN112795620A - 双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒 - Google Patents
双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
一种核酸双链环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒。本发明的核酸双链环化方法，包括：提供正向引物和反向引物，均包含一个U碱基，二者的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，正向引物与反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；使用引物对扩增核酸片段得到扩增产物；使用USER酶将扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；使两端的粘性末端结构互补连接形成双链结构，该双链结构的一条链闭合，另一条链具有N个碱基缺失。本发明用于WGBS文库构建，能够降低WGBS文库因单链环化偏向性造成的甲基化率偏高的现象。
Description
技术领域
本发明涉及测序技术领域，具体涉及一种双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒。
背景技术
华大基因的测序平台BGISEQ-500和MGI2000作为一个开放性平台，提供一站式测序操作流程，测序流程清晰明确，不仅提供可选的文库制备系统和样本加载系统，而且支持多种配套文库制备方案，采用优化的联合探针锚定聚合技术(cPAS)和改进的DNA纳米球(DNB)核心测序技术，是行业领先的高通量测序平台之一。
而此类平台对应的测序文库，在构建时，需要将PCR文库变性为单链，借助桥接寡核苷酸(splint oligo)进行单链DNA的自我环化，最后形成一个闭合的单链环状DNA，再滚环复制成纳米球(DNB)进行测序。该环化过程的效率较低，并非所有的单链DNA都能自我连接成环，且单链这种形状更容易形成二级结构，从而造成最后环化产物的偏向性，特别是对甲基化测序(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)这种富含AT碱基的文库，偏向性更为突出，最终表现为甲基化率偏高。
发明内容
本申请提供一种双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒，通过巧妙设计的带有U碱基的引物，PCR产物能够进行粘性末端的双链环化，降低了现有WGBS文库因单链环化偏向性造成的甲基化率偏高的现象。
根据第一方面，一种实施例中提供一种双链核酸环化方法，包括如下步骤：
提供一对用于扩增双链核酸片段的引物对，该引物对包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，上述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与上述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，上述正向引物的U碱基5’端上游序列与上述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；
使用上述引物对扩增双链核酸片段得到扩增产物，该扩增产物两端分别包含上述正向引物和反向引物的序列；
使用USER酶将上述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从上述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在上述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；
在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，其中上述环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
在优选实施例中，上述N是1-7的任一整数。
在优选实施例中，上述剩余核酸序列的长度为2-20nt。
根据第二方面，一种实施例中提供一种甲基化测序文库构建方法，包括如下步骤：
提供两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段；
使用重亚硫酸盐(Bisulfite)处理上述两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段，使非甲基化的C碱基转换成U碱基；
通过PCR扩增重亚硫酸盐处理后的转换产物，使U碱基转换成T碱基，从而获得扩增产物，其中上述PCR扩增使用的引物对包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，上述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与上述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，上述正向引物的U碱基5’端上游序列与上述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；
使用USER酶将所述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；
在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，该环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
在优选实施例中，上述方法还包括：提供基因组DNA，对基因组DNA依次进行打断、末端修复、加A尾和甲基化接头连接得到的甲基化接头连接产物，作为两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段。
在优选实施例中，上述方法还包括：对上述甲基化接头连接产物进行磁珠纯化。
在优选实施例中，上述N是1-7的任一整数。
在优选实施例中，上述剩余核酸序列的长度为2-20nt。
在优选实施例中，上述方法还包括：在上述双链DNA片段中混合内参DNA，使上述双链DNA片段和上述内参DNA一起进行文库构建。
在优选实施例中，上述连接酶是T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、或TaqDNA连接酶。
在优选实施例中，上述正向引物和反向引物的序列如下所示：
正向引物(5’-3’)：CAGAACGACAUGGCTACGA(SEQ ID NO：1)；
反向引物(5’-3’)：ATGTCGTTCTGUGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：2)。
在优选实施例中，上述方法还包括：对上述环状双链结构的核酸进行滚环扩增得到多拷贝串联扩增产物。
根据第三方面，一种实施例中提供一种甲基化测序文库构建试剂盒，包括引物对，该引物对用于对两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段进行扩增，上述引物对包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，上述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与上述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，上述正向引物的U碱基5’端上游序列与上述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补。
在优选实施例中，上述试剂盒还包括：USER酶，用于切除上述扩增产物中的U碱基，进而形成单核苷酸缺口，从上述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在上述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构。
在优选实施例中，上述试剂盒还包括：连接酶，用于使USER酶酶切之后的两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，该环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
在优选实施例中，上述试剂盒还包括：甲基化接头、重亚硫酸盐、末端修复和加A尾的试剂中的一种或多种。
在优选实施例中，上述N是1-7的任一整数。
在优选实施例中，上述剩余核酸序列的长度为2-20nt。
在优选实施例中，上述引物对为：
正向引物(5’-3’)：CAGAACGACAUGGCTACGA(SEQ ID NO：1)；
反向引物(5’-3’)：ATGTCGTTCTGUGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：2)。
本发明通过巧妙设计的带有U碱基的引物，使PCR产物能够进行粘性末端的双链环化，降低了现有WGBS文库因单链环化偏向性造成的甲基化率偏高的现象；双链环状产物为一条链带有至少一个核苷酸的缺失(gap)，另一条链为闭合环的特殊结构，这种含有缺口结构的序列可直接进行滚环扩增，无需添加额外的滚环引物，使实验更简洁高效。
附图说明
图1为本发明实施例中核酸双链环化原理示意图；
图2为本发明实施例中全基因组甲基化测序文库构建方法流程示意图；
图3为本发明实施例中全部C碱基的甲基化水平检测结果图；
图4为本发明实施例中CpG位点甲基化水平检测结果图；
图5为本发明实施例中CHG位点甲基化水平检测结果图；
图6为本发明实施例中CHH位点甲基化水平检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明的一种实施例中提供一种核酸双链环化方法，包括如下步骤：
提供一对用于扩增双链核酸片段的引物对，该引物对包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，上述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与上述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，上述正向引物的U碱基5’端上游序列与上述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；
使用上述引物对扩增双链核酸片段得到扩增产物，该扩增产物两端分别包括上述正向引物和反向引物的序列；
使用USER酶将上述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从上述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在上述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；
在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，该环状双链结构的核酸一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
作为一种示例性的说明，如图1所示，采用如下正向引物和反向引物对核酸片段进行PCR扩增。
正向引物(5’-3’)：CAGAACGACAUGGCTACGA(SEQ ID NO：1)；
反向引物(5’-3’)：ATGTCGTTCTGUGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：2)。
图1中，正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，正向引物的U碱基5’端上游序列(CAGAACGACA)的核苷酸数(图1中是10个)与反向引物的U碱基5’端上游序列(ATGTCGTTCTG)的核苷酸数(图1中是11个)相差1个核苷酸，并且除了相差的1个核苷酸以外，正向引物的U碱基5’端上游序列与上述反向引物的U碱基5’端上游序列反向互补。使用正向引物和反向引物扩增核酸片段得到扩增产物(图1中结构一所示的PCR产物结构)，该扩增产物两端分别具有正向引物和反向引物的序列(图1中阴影部分序列)。使用USER酶酶切扩增产物，使正向引物和反向引物上U碱基被切除，从缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构(图1中结构二)。在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，该环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有1个核苷酸缺失(图1中结构三左端条形框后面的下划线A碱基在互补链上没有对应的配对碱基，因此其互补链上该位置形成一个缺失)。
需要说明的是，本发明中，“U碱基5’端上游序列”是指正向引物或反向引物中靠近5’末端的一段序列，该段序列从5’末端碱基开始直到U碱基，但不包括该U碱基。
本发明的USER酶酶切步骤中，U碱基被切除产生粘性末端结构的原因在于：USER酶将U碱基切除后产生一个单核苷酸的缺失，从缺口至5’末端的剩余核酸序列的结构会变得不稳定，与互补链结合的键能不足，进而发生链解离，脱离产物主体而形成粘性末端结构。一般而言，从缺口至5’末端的剩余核酸序列长度为2-20nt，即剩余核酸序列的碱基数量在2个至20个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、15个、20个等)容易发生链解离进而形成粘性末端结构，而如果剩余核酸序列的碱基数量过多，比如20至30个碱基，那么键能相对较高，结构相对稳定，不容易发生解离。另外，为实现切除U碱基产生粘性末端结构的目的，也可以在引物上多设计几个U碱基。
如图1所示，正向引物的U碱基5’端上游序列核苷酸数与反向引物的U碱基5’端上游序列核苷酸数相差的核苷酸数量N个，可以是1-7个核苷酸。因此，环化后形成的双链结构核酸的一条链闭合，另一条链具有1-7个核苷酸缺失(图1中结构四)。
如图2所示，本发明的另一个实施例中提供一种全基因组甲基化测序文库构建方法，包括如下步骤：
提供两端分别连接有甲基化接头的基因组DNA；
使用重亚硫酸盐(Bisulfite)处理两端分别连接有甲基化接头的基因组DNA，使非甲基化的C碱基转换成U碱基；
通过PCR扩增重亚硫酸盐处理后的转换产物，使U碱基转换成T碱基，从而获得扩增产物，其中上述PCR扩增使用的引物对包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，上述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与上述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，上述正向引物的U碱基5’端上游序列与上述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；
使用USER酶将上述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从上述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在上述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；
在连接酶(例如，T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、或Taq DNA连接酶等)作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核苷酸，该环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
在优选实施例中，本发明的全基因组甲基化测序文库构建方法还包括：对基因组DNA依次进行打断、末端修复、加A尾和甲基化接头连接得到的甲基化接头连接产物，作为两端分别连接有甲基化接头的基因组DNA。其中，接头是指双链核酸分子，甲基化接头是指接头的胞嘧啶C全部被甲基化修饰的接头。进一步地，本发明的全基因组甲基化测序文库构建方法还包括：对上述甲基化接头连接产物进行磁珠纯化。
本发明的全基因组甲基化测序文库构建方法，通过巧妙设计的带有U碱基的引物，使所有扩增产物的两端都带有U碱基，经过USER酶切后，产生带有粘性末端的双链DNA产物。本发明方法将现有技术的借助桥接寡核苷酸(splint oligo)单链DNA环化改为粘性末端的双链DNA环化，降低了由单链DNA二级结构造成的环化片段的偏向性，提高了环化效率，特别是降低了现有WGBS文库因单链环化偏向性造成的甲基化率偏高的现象。双链环状产物为一条链带有至少一个核苷酸的缺失(gap)，另一条链为闭合环的特殊结构，这种结构可直接进行滚环扩增，无需添加额外的滚环引物，使实验更简洁高效。此外，本发明的双链环化方法同样适用于测序平台的其他类型文库，如DNA文库、外显子文库和RNA文库，适用性广。
在优选实施例中，上述方法还包括：在上述基因组DNA中混合内参DNA，使上述基因组DNA和上述内参DNA一起进行文库构建。内参DNA的存在是衡量建库质量的重要指标。根据内参DNA在最终文库中的存在情况能够判断建库质量好坏。
本发明实施例中，内参DNA，例如可以是用于确定甲基化转化效率的商业化标准品DNA，该DNA的所有胞嘧啶C都没有经过甲基化修饰，例如，选择完全没有被甲基化的λ(噬菌体)DNA，或者pUC19(质粒)DNA作为内参DNA。
在优选实施例中，本发明的全基因组甲基化测序文库构建方法还包括：对连接产物进行磁珠纯化，获得纯净的全基因组甲基化测序文库。
在优选实施例中，本发明的全基因组甲基化测序文库构建方法还包括：对环状双链结构的核酸进行滚环扩增得到多拷贝串联扩增产物，这种扩增产物可以形成DNA纳米球等结构，适用于在相应的测序平台上进行测序。
需要说明的是，本发明中正向引物和反向引物只要具有所描述的结构特征即可，对具体序列没有特别限定。在本发明的一个实施例中，正向引物和反向引物的序列如下所示：
正向引物(5’-3’)：CAGAACGACAUGGCTACGA(SEQ ID NO：1)；
反向引物(5’-3’)：ATGTCGTTCTGUGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：2)。
相应地，本发明实施例也提供一种甲基化测序文库构建试剂盒，包括引物对，该引物对用于对两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段进行扩增，上述引物对包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，上述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与上述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，上述正向引物的U碱基5’端上游序列与上述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补。
在优选实施例中，本发明实施例的试剂盒还包括：USER酶，用于切除所述扩增产物中的U碱基，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构。
在优选实施例中，本发明实施例的试剂盒还包括：连接酶，例如，T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、或Taq DNA连接酶等，用于使USER酶酶切之后的两端的粘性末端结构互补连接形成双链结构，该双链结构的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
在优选实施例中，上述试剂盒还包括：甲基化接头、重亚硫酸盐、末端修复和加A尾的试剂中的一种或多种，其中，甲基化接头用于对基因组DNA进行接头连接；重亚硫酸盐用于对两端分别连接有甲基化接头的基因组DNA进行碱基转换，即使非甲基化的C碱基转换成U碱基；末端修复和加A尾的试剂分别用于对片段化的基因组DNA进行末端修复和连接A核苷酸。
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例：
本实施例进行两组文库的构建。
对照组采用商业化试剂盒(1000005251-MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒)方法，即不含U碱基的PCR引物和单链环化对人源标准品DNA(NA12878)进行全基因组甲基化WGBS文库构建。
实验组利用本发明的双链环化方法，即含U碱基的PCR引物和双链环化对人源标准品DNA(NA12878)进行全基因组甲基化WGBS文库构建与测序。
具体步骤如下：
(1)样本打断
两组文库各取1μg基因组DNA和内参非甲基化的lamda DNA分别用Covaris E210打断，将DNA打断成100-600bp DNA碎片，主带≈250bp，打断反应体积为80μL，打断参数为Duty/cycle(0％)10；Intensity 5；Cycle/burst 200；Time(s)55；Cycle 5。
(2)打断纯化
提前30分钟取出AMPure XP磁珠置于室温，使用前充分震荡混匀；吸取64μLAMPureXP磁珠至80μL打断产物中，用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟；瞬时离心，将不粘管置于磁力架，静置2分钟至液体澄清，移液器吸取上清至新的不粘管中；吸取32μL AMPure XP磁珠至144μL上清中，用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟；瞬时离心，将不粘管置于磁力架，静置2分钟至液体澄清，移液器吸取并弃掉上清；保持不粘管固定于磁力架上，加入500μL新鲜配制的80％乙醇，室温静置1分钟后小心弃去上清；重复上一步骤一次，尽量吸干管底液体；打开不粘管管盖，室温干燥3分钟；将不粘管从磁力架上取下，加入42μL TE缓冲液进行DNA洗脱，移液器吹打混匀并室温下溶解5分钟；瞬时离心，将不粘管置于磁力架上，静置2分钟至液体澄清，将40μL上清液转移到新PCR管中。
(3)末端修复与加“A”
各取打断纯化后的20ng NA12878样本和0.4ng非甲基化lamda DNA样本混匀，补充无核酸酶的水(NF water)至总体积40μL，加入10μL的BGI平台DNA文库末端修复反应液，置于37℃温度下，反应30min，65℃温度下15min，降温至4℃。
(4)甲基化接头连接
向上述两组反应液中加入5μL的2μM的试剂盒甲基化接头混合物(Adapter Mix，含至少4种标签序列barcode)和连接酶反应液25μL，23℃孵育30min；使用QIAquickPCRPurification Kit进行柱纯化，使用22μL洗脱缓冲液洗脱。
(5)Bisulfite处理和纯化
使用EZ DNA Methylation-GoldKit对接头连接产物进行Bisulfite处理和纯化，具体步骤按照官网说明书操作进行。
(6)PCR扩增
对照组使用商业化试剂盒常规PCR引物进行扩增。反应体系50μL(DNA20μL，引物混合物5μL，2X KAPA U+racil Mix 25μL)，在PCR仪上进行如下反应：95℃3min，(98℃20s，62℃20s，72℃30s，共12个循环)，72℃3min，4℃∞。
实验组使用本发明设计的带U碱基的引物进行PCR扩增。反应体系50μL(DNA 22μL，正向引物1.5μL，反向引物1.5μL，2X KAPA U+racil Mix 25μL)，在PCR仪上进行如下反应：95℃3min，(98℃20s，60℃20s，72℃30s，共12个循环)，72℃3min，4℃∞。
正向引物(5’-3’)：CAGAACGACAUGGCTACGA(SEQ ID NO：1)；
反向引物(5’-3’)：ATGTCGTTCTGUGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：2)。
(7)实验组PCR产物USER酶切
取330ng纯化后的实验组PCR产物，使用USER酶(NEB，M5505S)酶切产生粘性末端，反应体系50μL(DNA 43μL,10X CutSmartbuffer 5μL，USER酶2μL)，37℃孵育20min，使用1.2X Ampure XP磁珠纯化(60μL)，50μL洗脱缓冲液洗脱。
(8)DNA环化
对照组取330ng PCR产物，补TE缓冲液至60μL，加10μL商业化试剂盒中的splintoligo95℃变性孵育3min，加入环化反应混合液(12μL 10×splint Buffer，1.2μL连接增强剂，0.5μLT4DNA连接酶，36μL无核酸酶的水)，37℃孵育60min。
实验组环化反应体系：50μL酶切纯化DNA产物，10μL 10×splint Buffer(不含splint oligo)，1μL连接增强剂，0.5μLT4DNA连接酶，38.5μL无核酸酶的水，共100μL环化体系，37℃孵育60min。
(9)环化产物纯化出库
对照组在环化反应结束后立即在体系中加8μL试剂盒消化反应液(消化缓冲液0.8μL，消化酶I 3.9μL，消化酶III 1.3μL，水2μL)，37℃孵育30min；反应完成后，加入15μL终止缓冲液(stop buffer)，使用纯化磁珠进行纯化，磁珠使用量为170μL；用Qubit ssDNAKit检测消化后的单链环状产物，-20℃保存备用。
实验组环化反应完成后，不用消化，直接加入10μL试剂盒终止缓冲液(stopbuffer)，使用纯化磁珠进行纯化，磁珠使用量为1.2X(132μL)；用Qubit dsDNAKit检测双链环状产物，-20℃保存备用。
(10)DNB制备
实验组：取20ng双链环化DNA文库，补水至20μL，加20μL DNB制备缓冲液(不含滚环引物)，加入40μLDNB聚合酶混合液I和4μLDNB聚合酶混合液II，涡旋混匀短暂离心，PCR仪上30℃孵育25min，取出，加入20μLDNB终止缓冲液，移液器和阔口吸头缓慢吹打混匀，切勿震荡及剧烈吹打，4℃保存备用。
对照组：按照常规单链方式进行DNB制备。即取6ng单链环化DNA文库，补水至20μL，加20μL DNB制备缓冲液(含滚环引物)，加入40μL DNB聚合酶混合液I和4μL DNB聚合酶混合液II，涡旋混匀短暂离心，PCR仪上30℃孵育25min，取出，加入20μLDNB终止缓冲液，移液器和阔口吸头缓慢吹打混匀，切勿震荡及剧烈吹打，4℃保存备用。
(11)上机测序与结果
采用MGI2000测序仪进行测序；
NA12878_ssT4：表示NA12878样本单链环化文库(对照组)；
NA_dsT4B-0104：表示NA12878样本双链环化文库(实验组)；
甲基化水平(甲基化率)：指支持甲基化的reads数/(支持甲基化的reads数+不支持甲基化的reads数)。
如图3和表1所示，双链环化的文库(实验组)其全部C位点的甲基化率(2.92％)相比单链环化的文库(对照组，3.552％)有降低和改善。
表1全部C碱基的甲基化水平
| NA12878_ssT4对照组 | NAdsT4B-0104实验组 | |
| 全部C碱基甲基化率(％) | 3.552 | 2.92 |
如图4和表2所示，双链环化的文库(实验组)其全部CpG位点的甲基化率(48.94％)相比单链环化的文库(对照组，53.67％)有明显降低和改善。
表2 CpG位点甲基化水平
| NA12878_ssT4对照组 | NAdsT4B-0104实验组 | |
| CpG甲基化率(％) | 53.674 | 48.949 |
如图5和表3所示，双链环化的文库(实验组)其全部CHG位点的甲基化率(0.54％)相比单链环化的文库(对照组，0.82％)有明显降低和改善。
表3 CHG位点甲基化水平
| NA12878_ssT4对照组 | NAdsT4B-0104实验组 | |
| CHG甲基化率(％) | 0.821 | 0.545 |
如图6和表4所示，双链环化的文库(实验组)其全部CHH位点的甲基化率(0.62％)相比单链环化的文库(对照组，0.86％)有明显降低和改善。
表4 CHH位点甲基化水平
| NA12878_ssT4对照组 | NAdsT4B-0104实验组 | |
| CHH甲基化率(％) | 0.862 | 0.622 |
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (10)
1.一种双链核酸环化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
提供一对用于扩增双链核酸片段的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，所述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与所述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，所述正向引物的U碱基5’端上游序列与所述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；
使用所述引物对扩增所述双链核酸片段得到扩增产物，所述扩增产物两端分别包含所述正向引物和反向引物的序列；
使用USER酶将所述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；
在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，其中所述环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
2.根据权利要求1所述的核酸双链环化方法，其特征在于，所述N是1-7的任一整数；
任选地，所述剩余核酸序列的长度为2-20nt。
3.一种甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
提供两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段；
使用重亚硫酸盐处理所述两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段，使非甲基化的C碱基转换成U碱基；
通过PCR扩增重亚硫酸盐处理后的转换产物，使U碱基转换成T碱基，从而获得扩增产物，其中所述PCR扩增使用的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，所述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与所述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，所述正向引物的U碱基5’端上游序列与所述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；
使用USER酶将所述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；
在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，其中所述环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。
4.根据权利要求3所述的甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述方法还包括：提供基因组DNA，对基因组DNA依次进行打断、末端修复、加A尾和甲基化接头连接得到的甲基化接头连接产物，作为所述两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段；
任选地，所述方法还包括：对所述甲基化接头连接产物进行磁珠纯化。
5.根据权利要求3所述的甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述N是1-7的任一整数；
任选地，所述剩余核酸序列的长度为2-20nt。
6.根据权利要求3所述的甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述方法还包括：在所述双链DNA片段中混合内参DNA，使所述双链DNA片段和所述内参DNA一起进行文库构建。
7.根据权利要求3所述的甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述连接酶是T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、或Taq DNA连接酶。
8.根据权利要求3所述的甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的序列如下所示：
正向引物(5’-3’)：CAGAACGACAUGGCTACGA(SEQ ID NO：1)；
反向引物(5’-3’)：ATGTCGTTCTGUGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：2)。
9.根据权利要求3所述的全基因组甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述环状双链结构的核酸进行滚环扩增得到多拷贝串联扩增产物。
10.一种甲基化测序文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对，所述引物对用于对两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段进行扩增，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，所述正向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数与所述反向引物的U碱基5’端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，所述正向引物的U碱基5’端上游序列与所述反向引物的U碱基5’端上游序列至少部分反向互补；
任选地，所述试剂盒还包括：USER酶，用于切除所述扩增产物中的U碱基，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5’末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；
任选地，所述试剂盒还包括：连接酶，用于使USER酶酶切之后的两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，其中所述环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失；
任选地，所述试剂盒还包括：甲基化接头、重亚硫酸盐、末端修复和加A尾的试剂中的一种或多种；
任选地，所述N是1-7的任一整数；
任选地，所述剩余核酸序列的长度为2-20nt；任选地，所述引物对为：
正向引物(5’-3’)：CAGAACGACAUGGCTACGA(SEQ ID NO：1)；
反向引物(5’-3’)：ATGTCGTTCTGUGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：2)。
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