CN113881739A - 氧化含锯齿末端核酸分子的方法及还原方法与文库构建法 - Google Patents

Abstract

一种氧化含锯齿末端核酸分子的方法及还原方法与文库构建法，氧化含锯齿末端核酸分子的方法包括：提供待测样本，所述待测样本中的至少部分核酸分子具有锯齿末端，使所述待测样本中核酸分子的5‑甲基胞嘧啶残基(5mC)、5‑羟甲基胞嘧啶残基(5hmC)中的至少一种氧化，获得氧化产物。通过对未进行末端修复的待测样本中的核酸分子锯齿末端进行氧化，得到可用于还原的核酸分子，使得待测样本中核酸分子锯齿末端的甲基化水平真实还原，从而提高甲基化检测的准确性。

Description

氧化含锯齿末端核酸分子的方法及还原方法与文库构建法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种氧化含锯齿末端核酸分子的方法及还原方法与文库构建法。

背景技术

早在1925年，在DNA双螺旋结构鉴定之前，DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰最主要的形式是5mC及其衍生修饰，被认为是DNA的“第五种碱基”。DNA甲基化在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。最近研究表明，cell-free DNA(以下简称cfDNA)甲基化特征是肿瘤早期筛查的重要标志物。

重亚硫酸盐(例如，亚硫酸氢钠)可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后的 PCR过程中，采用U耐受的聚合酶，将U识别为胸腺嘧啶(T)，实现C到T的转化，从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome b isulfitesequencing，WGBS)将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95％的C会被转化为 T)，可覆盖全基因组70～99％的胞嘧啶，实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是，重亚硫酸盐处理会使DNA 大量降解，需要较高的DNA投入量，对于DNA含量较少的样本不友善，例如血浆游离D NA。另外，重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T，而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95％以上，因此使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库，碱基平衡性差(AT 占比>80％)，测序时需要添加15％的噬菌体PhiX DNA平衡，造成测序数据大量浪费。最后WGBS产生的数据测序质量差，而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismar k)，比对率较差，通常只有70％左右，进一步造成数据的浪费。

公开号为CN 110820050 A的中国专利表明，在一定条件下，甲基化C可以被10-11转位酶(TET酶)转为羧基化C、醛基化C，通过有机硼烷(例如吡啶硼烷)可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，经过测序，可以识别为T，进而区分甲基化C与未甲基化C。基于此原理发明的全基因组甲基化非亚硫酸盐文库构建技术，有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷，同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。

有文献报道，双链cfDNA存在平末端和锯齿末端两种形式。锯齿末端呈单链突出(参见图1，参考文献：Detection and characterization of jagged ends of double-stranded DNA in plasma，DOI:10.1101/gr.261396.120)，在cfDNA中的比例可以达到87.8％；而且在循环肿瘤DNA(circulating DNA，ctDNA)中，锯齿末端的比例会相对增加。而针对这类锯齿末端结构，现有的先建库后转化的方法会造成cfDNA甲基化测序时锯齿末端信号降低(参见图2，参考文献：Detection and characterization of jagged ends ofdouble-stranded DNA in plasma，DOI:10.1101/gr.261396.120)。现有的文库构建方法不能真实反映cfDNA等含有锯齿末端的核酸分子的甲基化状态。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种氧化含锯齿末端的核酸分子的方法，包括：

提供待测样本，所述待测样本中的至少部分核酸分子具有锯齿末端，使所述待测样本中核酸分子的5-甲基胞嘧啶残基(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶残基(5hmC)中的至少一种氧化，获得氧化产物，所述氧化产物含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种，所得的氧化产物中，核酸分子的锯齿末端的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基 (主要是CpG位点上的5-甲基胞嘧啶残基)中的至少一种也被氧化。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种还原含锯齿末端的核酸分子的方法，包括：

使第一方面方法得到的所述氧化产物与有机硼烷接触，使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基、 5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种转化为二氢尿嘧啶残基，得到含有二氢尿嘧啶残基的核酸分子，即为还原产物；有机硼烷使得氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而使得核酸分子中氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种转化为二氢尿嘧啶残基，得到还原产物，即为可用于末端修复的产物，所述还原产物中，锯齿末端的CpG位点中氧化的5-甲基胞嘧啶残基可以被还原为二氢尿嘧啶残基。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种文库构建方法，包括对第一方面方法的连接产物进行扩增，得到可用于上机测序的文库。

依据上述实施例的一种氧化含锯齿末端核酸分子的方法及还原方法与文库构建法，通过对未进行末端修复的待测样本中的核酸分子锯齿末端进行氧化，得到可用于还原的核酸分子，使得待测样本中核酸分子锯齿末端的甲基化水平真实还原，从而提高甲基化检测的准确性。

附图说明

图1为现有的cfDNA锯齿末端结构图。

图2为现有的cfDNA测序结果图。

图3为现有的非重亚硫酸盐甲基化检测原理图。

图4为本发明一实施例中的非重亚硫酸盐甲基化检测原理图。

图5为实施例1的文库片段分布图。

图6为基于现有的非重亚硫酸盐甲基化检测方法计算得到的cfDNA甲基化水平结果图。

图7为基于本发明一实施例的非重亚硫酸盐甲基化检测方法计算得到的cfDNA甲基化水平结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

本文中，如无特别说明，“CpG位点”是指胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点。

如本文所用，术语“cfDNA”是指在患者外周血液中循环的DNA，亦称“循环细胞游离D NA”、“细胞游离DNA”，可互换使用。细胞游离DNA中的DNA分子的中值大小可以小于1kb(例如，在50bp至500bp、80bp至400bp或100bp至1,000bp的范围内)，也可能存在中值大小超出此范围的片段。细胞游离DNA可能含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，即在癌症患者血液中自由循环的肿瘤DNA或循环胎儿DNA(如果受试者是怀孕的女性)。cfDNA可以高度片段化，并且在一些情况下，平均片段大小可以为约165bp至250bp(Newman等，Nat Med.2014 20: 548-54)。通过离心全血以去除所有细胞，然后从剩余的血浆或血清中分离DNA来获得cfDN A。这样的方法是众所周知的(参见，例如，Lo等,Am J Hum Genet 1998；62:768-75)。循环细胞游离DNA通常是双链的，但是可以通过变性使其成为单链。循环细胞游离DNA中包含完整双链DNA分子和不完整双链DNA分子，完整双链DNA分子和不完整双链DNA分子的主要区别在于末端，对于完整双链DNA，末端为互补配对的完整双链，对于不完整双链，末端具有突出的单链，原始样本的DNA分子中没有可与该单链互补的另一条单链，亦称“锯齿末端”，现有技术中，要对cfDNA或其他含有锯齿末端的样本进行测序时，通常是先进行末端修复，使得锯齿末端转化为完整的双链末端。

本文中，如无特别说明，“锯齿末端”是指DNA分子中的单链突出端，锯齿末端通常出现在取自生物体的原始cfDNA样本、打断的基因组DNA样本或cfDNA样本等等样本中。

本文中，DNA上胞嘧啶残基的化学结构示意如下：

本文中，DNA上5-甲基胞嘧啶(5mC)残基的化学结构示意如下：

本文中，“甲基化C”主要包括5-甲基胞嘧啶，通常还可以进一步包括5-羟甲基胞嘧啶。

本文中，DNA上5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)残基的化学结构示意如下：

本文中，DNA上5-羧基胞嘧啶(5caC)残基的化学结构示意如下：

本文中，DNA上5-醛基胞嘧啶(5fC，亦称5-甲酰基胞嘧啶)残基的化学结构示意如下：

本文中，DNA上二氢尿嘧啶(DHU)残基的化学结构示意如下：

在公开号为CN 110820050 A和CN 111971386 A的中国专利中，cfDNA会先进行末端修复、加A和加接头，随后进行TET酶和吡啶硼烷的转化反应。由于cfDNA锯齿末端呈单链，如果锯齿末端CpG位点发生甲基化，末端修复后，新生成的链中CpG位点不会发生甲基化。图3所示为常规非重亚硫酸盐甲基化检测方法原理图，图3中，线1a、2a代表 cfDNA原始序列，线1a、2a形成中间互补的双链，双链两端具有锯齿末端，线1b、2b代表末端修复新生成的序列，线1c、1d、2c、2d代表测序接头。虚线框表示最终可检测到的甲基化信号，可以看到末端修复新生成的序列(线1b、2b区域)检测不到甲基化信号，最终导致cfDNA3’端甲基化水平降低。导致其3’末端甲基化水平会显著降低(图6)，造成整条链甲基化水平降低，不能真实反映cfDNA的甲基化状态。

根据第一方面，在一实施例中，提供一种氧化含锯齿末端的核酸分子的方法，包括：

提供待测样本，所述待测样本中的至少部分核酸分子具有锯齿末端，使所述待测样本中核酸分子的5-甲基胞嘧啶残基(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶残基(5hmC)中的至少一种氧化，获得氧化产物，所述氧化产物含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种，氧化产物中，核酸分子的锯齿末端的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基(主要是CpG位点上的5-甲基胞嘧啶残基)中的至少一种也被氧化；该步骤对待测样本中几乎所有 DNA分子上的CpG位点中的5-甲基胞嘧啶残基进行氧化，尤其是使得DNA分子锯齿末端(末端突出的单链DNA)的CpG位点的5-甲基胞嘧啶残基也被氧化，而现有技术中，由于是先对待测样本进行末端修复，再进行氧化，因此，末端修复后，含有CpG位点的单链的互补链上，CpG位点上的未甲基化的胞嘧啶残基，无法在后续还原过程中转化为DHU，从而造成甲基化信号降低，最终造成测序结果不能真实反映锯齿末端的甲基化水平。

在一实施例中，待测样本中核酸分子末端和非末端的CpG位点、CHG位点、CHH位点等位点中的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基均会被氧化，可用于后续的还原，将包括锯齿末端在内的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基还原为DHU，从而使得锯齿末端的甲基化水平被真实还原。该氧化步骤相对于现有技术，显著增强了锯齿末端的甲基化信号，从而提高了含锯齿末端的核酸分子甲基化测序的准确性。

在一实施例中，核酸分子中含有5-甲基胞嘧啶残基(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶残基(5hm C)的位点包含CpG位点、CHG位点、CHH位点中的至少一种，H为非G碱基，即鸟嘌呤之外的碱基。5-甲基胞嘧啶残基(5mC)主要位于CpG位点。可以通过对测序数据分析，获得各种位点上的甲基化水平。

在一实施例中，核酸分子中含有5-甲基胞嘧啶残基(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶残基(5hm C)的位点包含CpG位点、CHG位点、CHH位点中的全部。

在一实施例中，氧化过程中，主要包括将5mC依次转化为5hmC、5fC、5caC。待测样本中5mC的数量通常约为5hmC的10倍。

在一实施例中，本发明主要用于检测胞嘧啶的甲基化水平，甲基化水平通常可以由软件计算得到。

在一实施例中，所述氧化的5-甲基胞嘧啶包括5-羧基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5f C)、5-羟甲基胞嘧啶中的至少一种。

在一实施例中，以酶促方式使所述待测样本中的核酸分子的CpG位点的5-甲基胞嘧啶氧化。末端和非末端的甲基化CpG都会被氧化。

在一实施例中，所使用的酶包括但不限于十-十一易位(Ten-ElevenTranslocation，简称T ET)酶。TET酶包括但不限于TET1、TET2、TET3等等TET家族酶。TET酶通常可以从市场上购买得到，例如，可以购自NEB公司。

在一实施例中，所述氧化步骤中，氧化反应体系中含有TET酶、含有Fe²⁺的硫酸盐、氧化缓冲液。

在一实施例中，所述含有Fe²⁺的硫酸盐包括但不限于Fe(NH₄)₂(SO₄)₂、Fe(SO₄)₂等等中的至少一种。例如，文献《Distributive Processing by the Iron(II)/α-Ketoglutarate-Dependent Ca talytic Domains of the TET Enzymes Is Consistentwith Epigenetic Roles for Oxidized 5-M ethylcytosine Bases》(doi:10.1021/jacs.6b03243)公开了可使用Fe(SO₄)₂。

在一实施例中，所述氧化缓冲液含有缓冲剂、NaCl、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷(ATP)、二硫苏糖醇(DTT)中的至少一种。

在一实施例中，所述氧化缓冲液含有缓冲剂、NaCl、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷(ATP)、二硫苏糖醇(DTT)中的全部。

在一实施例中，氧化缓冲液的pH为4.3～8，优选为4.3～7.5，更优选为6。

在一实施例中，可以使用现有的氧化反应体系进行氧化，例如，可以使用公开号为CN1 10820050A的中国专利《全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建》中的氧化反应体系。

在一实施例中，所述核酸分子包含DNA。

在一实施例中，所述待测样本包括但不限于cfDNA样本、打断的基因组DNA样本等等。基因组DNA可以通过超声等方法打断。

在一实施例中，所述待测样本包括但不限于体液样本、组织样本中的至少一种。

在一实施例中，所述体液样本包括但不限于血液、血浆、血清、唾液、胸膜腔内液、脑脊液、精液、尿液等等中的至少一种。

在一实施例中，所述组织样本包括人或动物体的各种组织样本。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种还原含锯齿末端的核酸分子的方法，包括：

使第一方面方法得到的所述氧化产物与有机硼烷接触，使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基、 5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种转化为二氢尿嘧啶残基，得到含有二氢尿嘧啶残基的核酸分子，即为还原产物；有机硼烷使得氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而使得核酸分子中氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5- 羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种转化为二氢尿嘧啶残基，得到还原产物，即为可用于末端修复的产物。

在一实施例中，还原产物中，锯齿末端的CpG位点、CHG位点、CHH位点等等位点中氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基被还原为二氢尿嘧啶残基。该方法能真实反映cfDNA的甲基化水平，先对待测样本进行氧化、还原处理，锯齿末端的甲基化C会转化成DHU，可用于后续的修复步骤，经过后续的末端修复后，新生成的链中，DHU位点的互补碱基将会对应T；最终的测序数据中，双链3’末端被读作A或者T，从而实现双链检测甲基化信号，使cfDNA甲基化水平计算更真实。

在一实施例中，所述有机硼烷包含选自硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。

在一实施例中，所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。

在一实施例中，所述氮杂环包含任选经1～4个低级烷基取代的吡啶。

在一实施例中，所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。

在一实施例中，所述有机硼烷为吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷中的至少一种。

在一实施例中，先将第一方面方法得到的所述氧化产物纯化，然后将纯化的所述氧化产物与有机硼烷接触，使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基，得到含有二氢尿嘧啶残基的DNA。

在一实施例中，所述纯化包括但不限于磁珠纯化、柱纯化中的至少一种，可采用常规的磁珠纯化法和/或柱纯化法进行纯化。

在一实施例中，还原体系中含有有机硼烷、有机酸盐。

在一实施例中，所述有机酸盐包括但不限于醋酸钠。有机酸盐主要是为有机硼烷提供酸性环境，促进还原反应的进行。

在一实施例中，还原体系中有机酸盐的pH可以为4.0～4.5，优选为4.3。

在一实施例中，还原体系中有机酸盐的浓度可以为3M。

在一实施例中，还包括修复步骤，包括对还原产物进行末端修复，获得修复产物。修复产物中，DHU所在链的互补链上，对应的碱基为A，可以在后续的测序数据分析步骤中被检测到，从而将DHU所在的位点准确识别为原始序列中的5-甲基胞嘧啶残基位点。

在一实施例中，修复步骤中，还包括对修复产物进行加“A”反应，然后在产物末端连接接头，获得连接产物。

在一实施例中，还包括先对还原产物进行纯化，然后对纯化的还原产物进行末端修复。

在一实施例中，对还原产物进行纯化的方法可以为柱纯化。可采用常规的柱纯化法进行纯化。

在一实施例中，还包括对连接产物进行纯化。

在一实施例中，对连接产物进行纯化的方法可以为磁珠纯化。磁珠纯化法为常规的纯化方法。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种文库构建方法，包括对第一方面方法的连接产物进行扩增，得到可用于上机测序的文库。

在一实施例中，还可以在扩增之后，使用探针进行杂交捕获，并再次进行扩增，获得可用于上机测序的文库。

在一实施例中，本发明创新性地构建了先识别甲基化碱基并进行转化，再进行双链建库的方法。

在一实施例中，本发明的方法能还原cfDNA锯齿末端在基因组上的真实甲基化状态，而现有技术中，无论是基于传统重亚硫酸盐甲基化检测方法，或者基于非重亚硫酸盐甲基化检测方法，都无法检测锯齿末端的甲基化状态。

在一实施例中，提供一种用于非重亚硫酸盐cell-free DNA锯齿末端甲基化检测的方法，包括如下步骤：

步骤A：取30ng人源cfDNA。

步骤B：对上述DNA片段进行TET酶氧化，得到TET酶氧化后的DNA片段；

步骤C：取TET酶处理的DNA，再进行有机硼烷还原处理，得有机硼烷还原产物；

步骤D：对所述吡啶硼烷还原的产物进行柱纯化回收；

步骤E：对上步DNA进行末端修复和加A；

步骤F：使用连接酶连接修复-加A产物、接头以及分子条形码(index)，得到加接头的d sDNA(双链DNA)；

步骤G：对上述DNA模板进行PCR扩增，完成文库构建。

在一实施例中，步骤B中，TET酶氧化反应体系组成如下：50mM HEPES(pH＝6.0)、100mM NaCl、1mMα-酮戊二酸盐(即α-ketoglutarate，亦称α-KG)、2mM抗坏血酸(as corbicacid)、1.2mM ATP、1mM DTT、100μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂。缓冲体系组成成分为HE PES(pH 6.0)盐溶液。α-酮戊二酸盐和Fe(NH₄)₂(SO₄)₂盐为TET的辅酶。

在一实施例中，步骤C中，有机硼烷还原反应体系组成如下：35μL DNA、600mM醋酸钠(pH＝4.3)缓冲液、1M吡啶硼烷。

在一实施例中，步骤E和F中的反应条件，可按照现有的dsDNA末端修复和加A方法，以及现有的接头连接反应进行，例如，可采用

Ultra^TM II DNA Library PrepKit 中的试剂进行。

在一实施例中，步骤G中的PCR反应，需要特定的扩增酶，例如使用KAPA HIFI Uracil聚合酶。

在一实施例中，还包括对步骤G制得的文库进行二代测序，依据步骤F中使用的接头和 index，可采用相应的Illumina平台或者MGI、Gene+Seq等平台进行。

在一实施例中，步骤B获得TET酶氧化的DNA片段后、步骤F获得加接头的dsDNA 后、步骤G获得扩增产物后，还独立地包括纯化步骤。纯化可采用磁珠(例如Axygen磁珠) 进行。

实施例1

本实施例中，如无特别说明，所使用的磁珠为购自美国Axygen公司的磁珠，亦称Axyg en磁珠，产品名称

AxyPrep Magnetic Bead Purification Kits，货号MAG-PCR-CL- 250。

本实施例中，如无特别说明，“室温”是指23℃±2℃。

本实施例中，如无特别说明，“80％乙醇”均是指体积百分浓度为80％的乙醇，亦称“80％ V/V乙醇”，是由乙醇与NF-H₂O(无核酸酶水，亦称Nuclease-Free Water)按照80:20的体积比配制而成。

本实施例中，“low TE”是指TE缓冲液，亦称TE Buffer，购自Invitrogen，货号1209001 5。组成如下：10mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA。

本实施例提供非重亚硫酸盐cfDNA锯齿末端甲基化检测方法，按如下步骤进行：

(1)取30ng人源cfDNA样本(cfDNA样本量可以为30～100ng，本实施例为30ng)。

(2)TET酶氧化反应

1)冰上配制如下TET酶氧化反应体系：

表1

注：TET酶购自NEB公司。

“-”表示无对应数据。

TET酶氧化缓冲液的组成如下：167mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH6.0)、333mM NaCl、3.3mMα-KG(α-酮戊二酸盐)、6.67mM抗坏血酸、4mM三磷酸腺苷(ATP)、 8.33mMDTT。

2)反应条件：37℃，80min。

3)加入1μL蛋白酶K(0.8U)到氧化反应体系中，50℃孵育1h。

4)产物加入1.8×磁珠。

5)震荡混匀，离心。

6)室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

7)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

8)吸去上清。

9)加入200μL的80％V/V乙醇。

10)静置30s。

11)吸掉乙醇。重复使用80％V/V乙醇漂洗一次。

12)室温下挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

13)37μL的无酶水洗脱。

(3)吡啶硼烷还原反应

1)配制如下还原反应体系：

表2

组分	体积
		3M醋酸钠(pH＝4.3)	10μL
10M吡啶硼烷	5μL
		DNA	35μL
总体积	50μL

表2中各组分浓度为初始浓度，混合形成50μL反应体系后，各组分浓度对应减小。

2)反应条件：37℃，1200rpm孵育16h。

3)采用离心柱(本实施例为Zymo-IC spin column)纯化DNA。洗脱体积52μL。

(4)末端修复和加A及加接头

1)末端修复和加A反应体系如下：

表3

混合物组分	体积
		cfDNA	50μL
末端修复&加A-缓冲液	7μL
		末端修复&加A-酶混合物	3μL
总体积	60μL

修复反应条件：

表4

步骤	温度	时间
			末端修复	20℃	30min
加A	65℃	30min
			HOLD	4℃	∞

注：热盖温度为85℃。

2)连接反应：

表5

组分	体积
		末端修复&加A产物	60μL
接头储液	3μL
		PCR级水	16μL
连接增强液	1μL
		DNA连接酶预混液	30μL
总体积	110μL

连接增强液、DNA连接酶预混液为NEBNext末端修复/加dA尾模块中自带的试剂。

接头购自华大智造，MGIEasy DNA Adapters-96(Plate)kit，货号：1000005282。

孵育条件：20℃，时间30min。

3)连接后纯化

纯化体系如下：

表6

纯化步骤如下：

a)震荡混匀，离心。

b)室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

c)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

d)吸去上清。

e)加入200μL 80％乙醇。

f)静置30s。

g)吸掉乙醇。重复使用80％乙醇漂洗一次。

h)室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

i)加入25μL无酶水洗脱DNA。

(5)文库扩增

1)配制如下PCR扩增反应体系：

表7

组分	体积
		KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2X)	25μL
MGI的引物	2.5μL
		吡啶硼烷处理的DNA	22.5μL
总体积	50μL

推荐体系中的引物最终浓度为0.5～2μM，本实施例中引物终浓度具体为0.75μM。

2)反应条件如下：

表8

3)上述PCR反应的产物，用0.9X Axygen磁珠纯化，纯化体系如下：

表9

组分	体积
		上步扩增产物	50μL
Axygen磁珠	45μL
		总体积	95μL

纯化步骤如下

A.震荡混匀，离心。

B.室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

C.将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

D.吸去上清。

E.加入200μL 80％乙醇。

F.静置30s。

G.吸掉乙醇。

H.室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

I.加入25μL low TE洗脱文库DNA。并使用LIFE Qubit dsDNA HS Assay Kit 试剂盒(货号：Q32854)检测浓度，浓度约100ng/μL。

J.使用Qsep 100(台湾光鼎)检测文库片段分布，图5为文库片段分布图。

(6)测序和生信分析计算甲基化水平

每个样品使用MGI T7平台PE150模式测序90G，参照公开号为CN111755072A的中国专利《一种同时检测甲基化水平、基因组变异和插入片段的方法及装置》(具体参照该专利说明书第56～61段，即步骤S2、S4)的方法计算cfDNA甲基化水平，计算结果如图7 所示，可见，本实施例的建库方法可以真实还原cfDNA甲基化水平。

对比例1

本对比例中，如无特别说明，对应各步骤所使用的方法、试剂、组分浓度同实施例1。

本对比例提供常规非重亚硫酸盐cfDNA锯齿末端甲基化检测，检测步骤如下：

(1)取与实施例1相同的人源cfDNA样本30ng，具体为同一人的血浆DNA。

(2)末端修复和加A

1)末端修复和加A反应体系如下：

表10

修复反应条件如下：

表11

步骤	温度	时间
			末端修复	20℃	30min
加A	65℃	30min
			HOLD	4℃	∞

注：热盖温度为85℃。

2)连接反应体系如下：

表12

组分	体积
		末端修复&加A产物	60μL
接头储液(15μM)	3μL
		PCR级水	16μL
连接增强液	1μL
		DNA连接酶预混液	30μL
总体积	110μL

连接增强液、DNA连接酶预混液为NEBNext末端修复/加dA尾模块中自带的试剂。

孵育条件：20℃，时间30min。

3)连接后纯化

纯化体系如下：

表13

组分	体积
		接头连接产物	110μL
磁珠	88μL
		总体积	198μL

纯化步骤如下：

a)震荡混匀，离心。

b)室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

c)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

d)吸去上清。

e)加入200μL 80％乙醇。

f)静置30s。

g)吸掉乙醇。重复使用80％乙醇漂洗一次。

h)室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

i)加入22μL无酶水洗脱DNA。

(3)TET酶氧化反应

1)冰上配制如下TET酶氧化反应体系：

表14

组分	体积	终浓度
			接头连接的DNA	20μL	0.6ng/μL
TET酶氧化缓冲液(pH为6.0)	15μL	1×
			1.5mM Fe(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>	3.33μL	100μM
TET酶	4μL
			无酶水	补足至50μL
总体积	50μL

TET酶同实施例1。

2)反应条件：37℃,80min。

3)加入1μL蛋白酶K(0.8U)到氧化反应体系中，50℃孵育1h。

4)产物加入1.8×磁珠。

5)震荡混匀，离心。

6)室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

7)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

8)吸去上清。

9)加入200μL的80％乙醇。

10)静置30s。

11)吸掉乙醇。重复使用80％乙醇漂洗一次。

12)室温下挥发乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

13)使用37μL无酶水洗脱。

(4)吡啶硼烷还原反应

1)配制如下还原反应体系：

表15

组分	体积
		3M醋酸钠(pH＝4.3)	10μL
10M吡啶硼烷	5μL
		DNA	35μL

2)反应条件：37℃，1200rpm孵育16h。

3)采用离心柱(本对比例为Zymo-IC spin column)纯化DNA。洗脱体积25μL。

(5)文库扩增

1)配制如下PCR扩增反应体系：

表16

组分	体积
		KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2×)	25μL
MGI的引物*	2.5μL
		吡啶硼烷处理的DNA	22.5μL
总体积	50μL

注：*推荐体系中的引物最终浓度为0.75μM。

2)反应条件如下：

表17

3)取上述PCR反应的产物，用0.9×Axygen磁珠纯化。纯化体系如下：

表18

组分	体积
		上步扩增产物	50μL
Axygen磁珠	45μL
		总体积	95μL

纯化步骤如下：

A.震荡混匀，离心。

B.室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

C.将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

D.吸去上清。

E.加入200μL 80％乙醇。

F.静置30s。

G.吸掉乙醇。重复使用80％乙醇漂洗一次。

H.室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

I.加入25μL low TE洗脱文库DNA。并使用LIFE Qubit dsDNA HS Assay Kit 试剂盒(货号：Q32854)检测浓度，浓度约100ng/μL。

J.使用Qsep 100(台湾光鼎)检测文库片段分布。

(6)测序和生信分析计算甲基化水平

每个样品使用MGI T7平台PE150模式测序90G，参照公开号为CN111755072A的中国专利《一种同时检测甲基化水平、基因组变异和插入片段的方法及装置》(具体参照该专利说明书第56～61段，即步骤S2、S4中关于待测样本DNA测序数据的检测方法)的方法计算cfDNA甲基化水平，计算结果如图6所示，可见，cfDNA3’端甲基化水平显著降低。

图6、图7中，横坐标表示读段(Reads)上的位点(沿5’到3’方向)，纵坐标表示CG 位点的甲基化水平。本实施例未对5hmC进行封闭处理，因此，“CG位点的甲基化水平”是指5mC、5hmC两者的甲基化水平，主要为5mC的水平。“CG位点”包括CpG位点、CHG位点、 CHH位点，主要为CpG位点，H为非G碱基，即鸟嘌呤之外的碱基。

在一实施例中，本发明提供了一种能还原锯齿末端甲基化水平的方法，能真实反映cfDN A的真实甲基化水平。其具体原理如下：cfDNA首先使用TET酶氧化和有机硼烷(例如吡啶硼烷)还原，锯齿末端的甲基化C会转化成DHU，经过末端修复后，新生成的链中，DHU 位点的互补碱基将会对应T；最终的测序数据中，双链3’末端被读作A或者T，从而实现双链检测甲基化信号(图4)，使cfDNA甲基化水平计算更真实(图7)。

如果先修复并加A，再TET氧化、有机硼烷还原，读段5’端和中间部分的甲基化水平都是一致的，反映的结果则是基因组真实的甲基化水平；但是通过对对比例1构建的文库的测序数据进行分析后发现，3’末端甲基化水平明显降低(参见图6)，说明该方法使3’端计算的基因组甲基化水平不真实。而实施例1的方法则能还原真实的甲基化状态(参见图7，5’到3’甲基化水平一致)。

图4中，线1a、2a代表cfDNA原始序列，线1b、2b代表末端修复新生成的序列，线1 c、1d、2c、2d代表测序接头。虚线框表示最终可检测到的甲基化信号，可以看到末端修复新生成的序列可以检测到甲基化信号，可以还原cfDNA的真实甲基化水平。

常规非重硫亚硫酸盐方法检测cfDNA甲基化，会导致3’末端甲基化水平显著降低，不能真实反映cfDNA的甲基化状态。在一实施例中，本发明能还原cfDNA 3’端在基因组上的真实甲基化状态，能准确计算出cfDNA甲基化水平。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种氧化含锯齿末端的核酸分子的方法，其特征在于，包括：

提供待测样本，所述待测样本中的至少部分核酸分子具有锯齿末端，使所述待测样本中核酸分子的5-甲基胞嘧啶残基(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶残基(5hmC)中的至少一种氧化，获得氧化产物，所述氧化产物含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种，所述氧化产物中，核酸分子的锯齿末端的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种也被氧化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本的核酸分子中含有5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基的位点包含CpG位点、CHG位点、CHH位点中的至少一种，H为非G碱基；

和/或，所述氧化的5-甲基胞嘧啶包括5-羧基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)、5-羟甲基胞嘧啶中的至少一种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以酶促方式使所述待测样本中的核酸分子的CpG位点的5-甲基胞嘧啶氧化。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所使用的酶包括十-十一易位(TET)酶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，氧化反应体系中含有TET酶、含有Fe²⁺的硫酸盐、氧化缓冲液；

和/或，所述含有Fe²⁺的硫酸盐包括Fe(NH₄)₂(SO₄)₂、Fe(SO₄)₂中的至少一种；

和/或，所述氧化缓冲液含有缓冲剂、NaCl、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷(ATP)、二硫苏糖醇中的至少一种；

和/或，氧化反应体系的pH为4.3～8，优选为4.3～7.5，更优选为6；

和/或，所述核酸分子包含DNA；

和/或，所述待测样本包括cfDNA样本、打断的基因组DNA样本中的至少一种；

和/或，所述待测样本包括体液样本、组织样本中的至少一种；

和/或，所述体液样本包括血液、血浆、血清、唾液、胸膜腔内液、脑脊液、精液、尿液中的至少一种。

6.一种还原含锯齿末端的核酸分子的方法，其特征在于，包括：使权利要求1～5任意一项所述方法获得的氧化产物与有机硼烷接触，使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基、5-羟甲基胞嘧啶残基中的至少一种转化为二氢尿嘧啶残基，得到含有二氢尿嘧啶残基的核酸分子，即为还原产物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机硼烷包含选自硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物；

和/或，所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物；

和/或，所述氮杂环包含任选经1～4个低级烷基取代的吡啶；

和/或，所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶；

和/或，所述有机硼烷为吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷中的至少一种；

和/或，先将权利要求1～5任意一项所述方法获得的氧化产物纯化，然后将纯化的所述氧化产物与有机硼烷接触，使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基，得到含有二氢尿嘧啶残基的DNA；

和/或，所述纯化包括磁珠纯化、柱纯化中的至少一种；

和/或，还原体系中含有有机硼烷、有机酸盐；

和/或，所述有机酸盐包含醋酸钠；

和/或，还原体系中有机酸盐的pH为4.0～4.5。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括修复步骤，包括对还原产物进行末端修复，获得修复产物。

和/或，修复步骤中，还包括对修复产物进行加“A”反应，然后在产物末端连接接头，获得连接产物；

和/或，还包括先对还原产物进行纯化，然后对纯化的还原产物进行末端修复；

和/或，对还原产物进行纯化的方法包含柱纯化；

和/或，还包括对所述连接产物进行纯化；

和/或，对连接产物进行纯化的方法包含磁珠纯化。

9.一种文库构建方法，其特征在于，包括对权利要求8所述方法获得的连接产物进行扩增，得到可用于上机测序的文库。

10.如权利要求9所述的文库构建方法，其特征在于，还包括在扩增之后，使用探针进行杂交捕获，并再次进行扩增，获得可用于上机测序的文库。

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