CN110468211B - 膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法 - Google Patents
膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法 Download PDFInfo
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
本发明公开了一种膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法。本发明中首次采用了单侧富集‑单分子特异性引物（单引物）模式进行扩增子富集技术；扩大引物的适用范围、增加有效模板使用量，特别是大大提高检测低频突变样本的检测限。其次，本发明中单分子特异性引物由特异性序列和测序序列组成，可有效提供多重PCR的特异性和引物利用率。本发明将该技术应用到膀胱癌肿瘤突变基因检测领域中，制备出相应的试剂，能够高效灵敏地检测出膀胱癌相关肿瘤基因的突变情况，并给予临床应用提供指导意见。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法。
背景技术
泌尿系肿瘤主要包括膀胱癌、肾癌、尿道癌等，且膀胱癌是最多见的泌尿系肿瘤。目前膀胱癌检查主要依靠影像学检查和病理学检查等，但一般价格昂贵且是侵入性的手段；尿细胞学检查方便、无创，但灵敏度不是很高；膀胱镜检查是诊断膀胱癌的金标准，也是术后复发监测的主要手段之一，但是是侵入性的，也可能导致相关的并发症；这些缺陷限制了膀胱癌的早期诊断和治疗、以及预后监测等。
不断有研究者进行膀胱癌肿瘤分子水平上的研究，Guo等采用Sanger测序法对膀胱癌患者的肿瘤和相应的外周血样本进行全基因组测序，确定了FGFR3、TP53、PIK3CA 和RB1等在恶性肿瘤普遍存在的突变基因，但全基因组测序需要检测大量的序列，成本昂贵，只适合肿瘤全基因组关联等方面的研究，对于临床应用距离较远。Longo等运用靶向外显子测序技术检测pTis-pT4b期的膀胱癌样本，通过对此类高危膀胱癌患者阶段性的体细胞突变分析，确认了该期患者特征性的基因突变及突变谱；但外显子测序存在一定局限性，无法针对非编码基因进行测序，因而无法对目的基因相关的内含子调控基因进行检测，另外还无法识别无效的拷贝等，在临床应用上出现假阴性的情况。还有采用单细胞测序技术对膀胱癌进行研究的，膀胱癌具有高度的异质性，在实际应用中需要检测不同细胞群的基因信息，增加实验流程和成本，临床应用受到局限性。Emil等采用ddPCR技术对膀胱癌中的FGFR3、PIK3CA基因热点突变情况进行研究，发现尿液和血浆中FGFR3和PIK3CA突变DNA水平升高表明膀胱癌晚期进展和转移；虽然ddPCR技术能够提供检测极低水平下循环肿瘤DNA所需的灵敏度，但只有更为广泛的测序结果才能提供更为详尽的信息进行临床相关改变的综合分析。在其诸多研究中，主要针对膀胱癌发生的某一方面的分子机理等研究，并不适用于膀胱癌的早期发现和预后监测等。鉴于此，需要提供一种高精确度的膀胱癌肿瘤基因突变检测方法。
传统的基因突变检测方法中，采用双侧引物进行扩增，因待检测区域片段化是随机的，片段完整性较差的模板不能同时被双侧引物覆盖，导致痕量模板丢失，影响检测限。也有采用单侧富集-链成环（背靠背引物）模式和单侧富集-巢式PCR 引物（巢式PCR引物）模式的；而单测富集-链成环模式无单分子标签技术降噪，单测富集-巢式PCR引物模式采用双引物导致引物3’端与待检位点必须保留一定距离，进而也会存在少量模板丢失，因此均严重影响检测限。
而本发明中首次采用了单侧富集-单分子特异性引物（单引物）模式进行扩增子富集技术（如图1所述）；扩大引物的适用范围、增加有效模板使用量，特别是大大提高检测低频突变样本的检测限。其次，本发明中单分子特异性引物由特异性序列和测序序列组成，可有效提供多重PCR的特异性和引物利用率。再次，本发明提供的末端修复反应液和连接反应液，优化了建库流程，实现了扩增子富集之前无需进行预扩增（PCR-Free技术），降低了因PCR 扩增引入错误概率。最后，本发明中提供带单分子标签接头技术，可进一步纠正建库和测序引物的错误。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种针对膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物，序列包括SEQ ID No.1-156所示序列。其中膀胱癌检肿瘤突变基因包括ARID1A、AR、CDKN2A、EP300、ERBB2、FGFR3、HRAS、KDM6A、KMT2C、KMT2D、MET、PIK3CA、RB1、STAG2、TERT、TP53、TSC1、VHL、KRAS等。
申请人经过前期大量探索和验证总结出该方法，利用该方法设计合成的单分子特异性引物可有效提供多重PCR的特异性和模板利用率。
所述的针对膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物设计方法：含有靶向序列和测序引物序列，所述的靶向序列为与待测突变区域上游或者下游特异性互补的序列。
进一步的，上述设计方法中，所述的靶向序列要满足的条件具体包括：
1）靶向序列长度为20-100碱基对；
2）靶向序列的退火温度为50-80℃；
3）靶向序列的3’端碱基为C或G。
进一步的，上述设计方法中需要满足：所述的单分子特异性引物的3’端距离待测突变位点或区域1-30个碱基对。
进一步地，每条特异性引物均需要加入相同序列“AGATGTGTATAAGAGACAG” （即通用引物的一部分，便于进行最后通用引物扩增步骤），便于后续实验。上游特异性引物为SEQID NO.1- SEQ ID NO.78（共78条），下游特异性引物为SEQ ID NO.79- SEQ ID NO.156（共78条）。
进一步地，上游和下游特异性引物组筛选出75条有效上游特异性引物和77条有效下游特异性引物，每条引物扩增效率存在差异，之间存在模板竞争情况。为保证每条引物的扩增效率，需要进行浓度梯度测试，获得组合中每种引物的最佳浓度。结果如下：
表1：特异性引物组最优组合情况表
本发明的第二个目的是提供膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂盒，能够准确、高效地检测尿液中膀胱癌肿瘤基因突变，其结果与肿瘤组织中结果一致，不仅无创，而且能够提供早期筛查服务，也能为术后患者进行预后监测。
该试剂盒包括SEQ ID No.1-156所示序列中的特异性引物。
进一步的，所述的膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂盒，优选包括以下三种组合之一：（1）和（2），（3）和（4），（5）和（6）：
（1）按照上表1组合一中的浓度配制上游特异性引物组；
（2）按照上表1组合一中的浓度配制下游特异性引物组；
（3）按照上表1组合二中的浓度配制上游特异性引物组；
（4）按照上表1组合二中的浓度配制下游特异性引物组；
（5）按照上表1组合三中的浓度配制上游特异性引物组；
（6）按照上表1组合三中的浓度配制下游特异性引物组。
进一步的，所述的膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂盒，还包括：对片段化核酸进行末端修复补平加A的末端修复反应试剂和对核酸进行分子标签接头连接的连接反应试剂。
所述的对片段化核酸进行末端修复补平加A的末端修复反应试剂，包括：反应活性剂、反应酶和反应稳定剂；配制1L末端修复反应试剂，以下每种组分的浓度均是在整个试剂体系中的浓度：
反应活性剂包括：5-500mM pH 8.0的 Tris-HCl、50-1000mM NaCl、50-200nMdNTPs、0.5-4 mM ATP、1-100mM DTT 、50-250mM MgCl2；其中的百分比以无菌水体积为计算基准；
反应酶为具有5’-3’DNA 聚合酶活性、5’-3’外切酶活性与3’-5’外切酶活性以及产物3’端加碱基A的功能酶组成的酶混合物；优选包括：1-50U的Taq DNA 聚合酶、10-50U的3’-5’exo klenow片段、2-100U的T4 DNA聚合酶；
反应稳定剂为稳定酶活性的试剂；优选包括： 0.05-1% Tween 20、1-50% 甘油、20-100 µg/mL BSA, 0.02%-0.1% Triton X-100， 0.1%-1%β-巯基乙醇，其中的百分比以无菌水体积为计算基准。
所述的对核酸进行分子标签接头连接的连接反应试剂，包括：连接增强剂、高效连接酶、分子标签接头；配制1L连接反应试剂，以下每种组分的浓度均是在整个试剂体系中的浓度：
连接增强剂包括1-4 mM ATP、1-100mM NAD+、1-200 mM DTT、0.05-1% Tween 20、5-50% 各类分子大小的PEG聚合物（包括PEG4000、PEG6000、PEG8000等中的一种或多种），其中的百分比以无菌水体积为计算基准；
高效连接酶为催化粘端或平端双链或单链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合的连接酶；高效连接酶由一种或多种连接酶组成；
优选高效连接酶包括：T4-DNA连接酶、Taq DNA连接酶和E·coli DNA连接酶等，连接酶用量为300-1800U；
所述的分子标签接头为完全或部分互补的双链；分子标签接头包括分子标签序列和测序引物序列；分子标签序列由8-12个随机核苷酸组成。
本发明的第三个目的是提供一种膀胱癌肿瘤突变基因文库构建试剂盒，其包含上述膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂盒所包含的试剂。
本发明的第四个目的是提供膀胱癌肿瘤突变基因文库构建方法。
包括以下步骤：
（1）对待检DNA样本的片段化核酸进行末端修复补平加A；
（2）对末端修复补平加A的片段化核酸进行分子标签接头连接；
（3）将上游特异性引物组和下游特异性引物组，分别与分子标签引物组合，对连接接头产物进行扩增子法靶向富集；SEQ ID No.1-78所示序列为根据各个突变区域上游设计的上游特异性引物组；SEQ ID No.79-156所示序列为根据各个突变区域下游设计的下游特异性引物组；
（4）对扩增子法靶向富集产物进行PCR富集；对PCR富集产物进行文库构建。
进一步的，上游特异性引物组和下游特异性引物组优选包括以下三种组合之一：（1）和（2），（3）和（4），（5）和（6）：
（1）按照说明书表1组合一中的浓度配制上游特异性引物组；
（2）按照说明书表1组合一中的浓度配制下游特异性引物组；
（3）按照说明书表1组合二中的浓度配制上游特异性引物组；
（4）按照说明书表1组合二中的浓度配制下游特异性引物组；
（5）按照说明书表1组合三中的浓度配制上游特异性引物组；
（6）按照说明书表1组合三中的浓度配制下游特异性引物组。
进一步的，所述的突变包括点突变、缺失、插入、基因扩增、基因甲基化、基因融合中的一种或多种。
进一步的，核酸片段包括DNA或RNA；来源包括动物、植物或微生物。本发明片段化DNA包括血浆游离DNA、尿液上清DNA、片段化的膀胱组织DNA或片段化的尿液沉淀DNA。
该方法进一步具体包括以下步骤：
1)片段化DNA加入末端修复补平加A反应液，对片段化DNA进行修复加A；
2)在步骤1）后直接加入连接反应液，对修复后核酸连接上接头；
3)在步骤2）后，对接头产物进行纯化，以除去未用完的连接接头；
4)在步骤3）后，将纯化产物等分成2份，分别使用“上游特异性引物组+分子标签”和“下游特异性引物组+分子标签”进行特异性扩增，以获得带分子标签的特异性扩增产物；
5)在步骤4）后，分别对上游特异性产物和下游特异性产物进行纯化，以去除多余的特异性引物和分子标签；
6）在步骤5）后，分别对纯化后的上游和下游特异性产物引入通用引物，得到完整的文库；
7）对步骤6）的扩增产物进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
本发明的高通量文库构建方法，可以用于Roche、Illumina 、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因等高通量测序平台。
本发明膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂在使用时主要解决现有检测技术捕获突变DNA片段特异性低、检测超低频基因突变准确性低的技术问题。
本发明的优势：
1、本发明设计的特异性引物组，减少痕量cfDNA的丢失，提高了模板利用率，保证文库有足够的测序深度。
2、本发明提供的膀胱癌基因突变特异性引物组最优组合情况，使得每条引物在特异性引物组中达到较高的扩增效率，高效灵敏地检测尿液中膀胱癌肿瘤基因突变情况。
3、本发明的建库方法中，直接采用连接上接头的模板进行特异性引物组扩增，中间减少了模板富集步骤，降低由聚合酶产生的基因突变。
4、本发明的文库构建方法，步骤简单、减少人为失误概率；节省实验时间，提高建库效率。
5. 本发明提供的建库方法，可以用于不同的测序平台，可以广泛地被应用，便于推广。
6. 本发明的试剂盒检测中，包括尿路系统疾病相关主要影响基因：ARID1A、AR、CDKN2A、EP300、ERBB2、FGFR3、HRAS、KDM6A、KMT2C、KMT2D、MET、PIK3CA、RB1、STAG2、TERT、TP53、TSC1、VHL、KRAS。
7. 本发明提供的膀胱癌基因突变检测试剂盒，能够高效灵敏地检测出膀胱癌相关肿瘤基因的突变情况，并给予临床应用提供指导意见。
附图说明
图1为本发明方法中扩增子富集捕获原理与现有技术中其他富集捕获方法原理的比较。
图2为突变位点检测原理图。
图3为实施例1中2%琼脂糖凝胶电泳检测文库结果；
M: 100 bp DNA Marker；1：上游特异性引物组文库；2：下游特异性引物组文库。
图4a为实施例2中16例临床样本尿液上清文库电泳检测结果；
图4b为实施例2中16例临床样本尿液沉淀文库电泳检测结果；
图4c为实施例2中16例临床样本癌组织文库电泳检测结果；
M: 100bp DNA Marker；
U为对应样本上游特异性引物组文库；
D为对应样本下游特异性引物组文库。
图5为实施例3中2%琼脂糖凝胶文库电泳检测结果，
M：100bp DNA marker；
U为对应样本上游特异性引物组文库；
D为对应样本下游特异性引物组文库；
S0-T4为对应样本编号；S0-U为S0样本上游特异性文库，S0-D为S0样本下游特异性文库，其余样本以此类推。
具体实施方式
根据本发明一种典型的实施方式，使用本发明试剂盒进行膀胱癌片段化DNA检测，包括以下步骤：1）根据膀胱癌待检基因位点或区域设计特异性引物；2）对片段化DNA进行末端修复补平加“A”； 3）对修复后的产物连接接头；4）对连接上接头的产物进行分子标签和特异性引物的PCR扩增；5）对特异性产物进行测序引物的引入；6）以及对文库产物的检测。传统的片段化文库构建中，对加入接头的模板进行PCR预扩增，使得模板达到一定的量；采用PCR预扩增时，由聚合酶产生的某次错误突变会以指数级形式被无限放大，增加噪音来源。本发明中将原始模板加上接头后，直接进行特异性扩增，减少了预扩增时的错误突变，提高检测的灵敏度。传统的扩增子靶向富集技术中，采用双侧引物进行扩增，因待检测区域片段化是随机的，片段完整性较差的模板不能同时被双侧引物覆盖，导致痕量模板丢失，影响检测限。本发明采用单侧引物富集的方法，分别在检测区域/位点设计上游和下游引物，即使模板只含有单侧引物的结合位点，也可以与上游或者下游特异性引物配对，进行PCR富集。本发明扩大了引物的适用范围，增加了有效模板的使用量，提高了检测的检测限。
图2为突变位点检测原理图。图中待检测位点为点突变、插入、缺失或者基因融合位置。Index引物用于区分不同样本。特异性引物既可设计在待测区域左侧，又可设计在待测区域右侧，一般情况下上下游特异性引物都需要，但是当一侧富含GC区域不能满足引物设计要求或者其中一条引物扩增效率较低情况下只需要上游或者下游特异性引物即可。通用引物为测序需要的P5、P7引物。
接头在使用前需要先退火成“Y”字型。
综上所述，本发明方法既可提高有效模板利用率，又可以提高检测灵敏性，特别适用于低频突变样本检测。
以Illumina平台为例，结合实施例对本发明进一步说明。
实施例 1片段化DNA进行膀胱癌肿瘤检测基因（panel）测序
1.1 接头设计
ADT-1:
5' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCCCTGCGTGACGT*Y-3' 见SEQ ID NO.157所示。
ADT-2: 5'-P-ACGTCACGCAGGGGAGAGCCAGGGATGACTAGG-3' SEQ ID NO.158所示。
以上ADT-1序列中的N可以是8个随机碱基，*Y为硫代修饰的A/T碱基；ADT-2中P为磷酸化修饰，2条序列需退火成“Y”型接头。上游特异性引物和下游特异性引物分别位于检测点左侧和右侧。特异性引物的5’端均需要加入相同序列“AGATGTGTATAAGAGACAG” 见SEQID NO.159（这个序列是通用引物部分序列）。每条引物先使用0.5µM的浓度混合成上游特异性引物组和下游特异性引物组。具体基因位点特异性引物序列如表2所示。
表2：特异性引物序列
备注：实施例1中对设计合成的156条特异性引物进行整体检测，检测其引物合成情况是否适合该文库构建方法；实施例2中筛选出152条扩增效率较高的特异性引物（即表1中所示的152条引物），因4条引物扩增效率较低（但同突变位点又能较好的被其对应的上游或者下游特异性引物覆盖）影响整个特异性引物组的数据质量，故在最优引物组合中剔除了该4条扩增效率低的引物。
Index引物：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index-7] GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’ 见SEQID NO.160，
index-7代表7个随机碱基，用于区分不同样品。
通用引物序列如下：
P5端引物:
5’-AATGATACGGAGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAG-3’见 SEQ ID NO.161。
P7端引物:
5’- CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’见SEQ ID NO.162。
1.2实验步骤
1.2.1取2mL正常人尿液上清，按照MagMAX Cell Free DNA Isolation Kit（ThermoFisher Cat.A29319）说明书操作，提取游离DNA。
1.2.2末端修复
每升末端修复反应液由以下含量组分组成：250mM Tris-HCl（pH 8.0）、500mMNaCl、100 nM dNTPs、2 mM ATP、0.1% Tween 20、10mM DTT 、50mM MgCl2、Taq DNA 聚合酶50U、3’-5’exo klenow片段20U、T4 DNA聚合酶6U、50% 甘油、20µg/mL BSA, 0.05%TritonX-100， 0.5%β-巯基乙醇。
按照下表3配制反应体系：
表3
涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于热循环仪上按照下表4所列程序：
表4
1.2.3连接反应
每升连接反应液由以下含量组分组成：2mM ATP、50mM NAD+、50 mM DTT、0.05%Tween 20、20% PEG6000、T4 DNA连接酶800U。
按照下表5配制连接反应体系：
表5
将反应管从热循环仪上取下置于冰盒上，加入接头和连接反应液，涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于热循环仪上按照下表6所列程序运行：
表6
1.2.4纯化
将反应管从热循环仪上取下，加入30µL AMPure XP Beads进行纯化，45µLElution Buffer洗脱
1.2.5 特异性扩增
按照下表7配制PCR反应体系：
表7
涡旋混匀，瞬时离心，执行下表8所列程序：
表8
1.2.6 PCR产物纯化
使用60µL AMPure XP Beads进行纯化，25µL Elution Buffer洗脱。
1.2.7 通用引物扩增
按照下表9配制PCR反应体系：
表9
PCR反应程序如下：98℃，45 s,1循环；(98℃，15 s, 60℃，30 s, 72℃，30 s)10循环；72℃，1min,1循环；4℃保存。
取5µL反应产物2%凝胶电泳检测，结果如图3所示，表明文库构建成功。剩余产物1.0×XP回收，最后使用25µL洗脱液洗脱，即为上机文库。
1.2.8 文库质检
按照KAPA Library Quantifcation Kit (Kapabiosystems, Cat No.KK4854)说明书进行操作，使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测，参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
1.2.9 上机测序
按照HiSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及150 bp双端测序。
1.3实验结果：
1.3.1文库电泳检测分析结果
根据电泳分析结果（图3），文库为弥散条带，主要集中在200-500bp之间；条带亮度明亮，与预期结果一致。
1.3.2测序质控数据
将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行引物扩增效率、uniq分子数等分析，用于评估文库的特异性，分析结果见表10。
膀胱癌肿瘤检测基因（panel）所包含的基因特异性引物整体上表现良好，个别基因位点的上游或下游引物因设计问题，表现稍差。可以通过改变引物浓度进行调整，或者重新设计引物，或者该突变位点在上游引物或下游引物中的一个表现良好亦可。
表10：片段化DNA膀胱癌检测基因（panel）测序结果
实施例2
根据上述实施例1，对16例T1-T2期膀胱癌患者进行膀胱癌肿瘤基因检测
2.1样本准备
收集16例膀胱癌患者手术前尿液原液、膀胱癌手术病灶部位组织样本；提取尿液上清cfDNA，尿液沉淀和癌组织基因组DNA；基因组DNA进行片段化处理得到片段化DNA。
2.2文库构建
按照实施例1中的建库步骤进行建库，其中特异性引物组采用的为表1中的上游特异性引物组最优组合一和下游特异性引物组最优组合一。
2.3 文库质检及上机测序
按照实施例1中方法对文库进行文库质控和上机测序。
2.4实验结果
2.4.1 文库电泳检测分析结果
根据部分样本电泳分析结果（图4a，4b，4c），尿液上清因模板起始量不同而使文库亮度有所差异；尿液沉淀和癌组织文库在亮度方面也是有所差异，但文库主要片段集中在200-500bp之间。
2.4.2 测序结果
表11：16例临床样本点突变结果
表11中列出16例临床样本的测序结果，本发明中16例膀胱癌临床样本的尿液上清、尿液沉淀和组织一致性较强，且检测到相关基因位点突变频率较高。16例临床样本检测得出本试剂盒灵敏度为93.3%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为50%。因样本212是病理阴性样本，但在尿液上清中检测到VHL基因突变，该基因与肾病疾病相关性较强，需要进一步的研究是否能够提供早期疾病预警。
实施例3 检测限测试
3.1 低频突变标准品准备
使用cfDNA标准品（Horizon Discovery, HD780）进行KRAS 基因2外显子G12D位点检测，突变频率分别为0%、0.1%、1%、5%，分别命名为：S0、S1、S2、S3。使用实施例2中临床样本191的打断后组织DNA与野生型打断后DNA进行稀释，稀释后突变频率分别为0%、0.1%、1%、5%，分别命名为T0、T1、T2、T3以及临床样本191号DNA原液T4进行检测。
3.2文库构建
按照实施例1中的建库步骤进行建库，其中特异性引物组采用的为表1中上游特异性引物组最优组合一和下游特异性引物组最优组合一。
3.3 文库质检及上机测序
按照实施例1中方法对文库进行文库质控和上机测序。
3.4实验结果
3.4.1 文库电泳检测分析结果
根据电泳分析结果（图5）。
3.4.2 测序数据分析结果
表12
上述表12中检测数据与理论数据偏差在5%以内，在检测允许偏差范围；通过标准品和临床样本梯度稀释制成的标准品偏差范围均在允许范围内，且可以检测到突变频率为0.1%以上的样本，方法灵敏度高。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本发明中膀胱癌肿瘤检测基因包括但不限于上述基因，随着数据库的更新或者研究的深入，均可以对本试剂盒中的检测基因及特异性引物组进行更新。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来讲，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或者替换，都应视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南大地同年生物科技有限公司
<120> 膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法
<130> 无
<160> 162
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
cactctggag caggagcaat tcagttggg 29
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
aataccaggc catcacagct tttgtttttc ttgttg 36
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
cttccgcaac ttacacgtgg acgaccagat g 31
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ccttgtcaac cctgtttttc tccctcttat tgttccctac 40
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
ctgctaatca agtcacacat ggtgagcg 28
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
ccaattcccc tgcaaacttc gtcctccaga g 31
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
cgcgcaggta ccgtgcgaca tcgcgatggc 30
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
gagagtggcg gggtcggcgc agttgggc 28
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
tctacaggct gccggaaagg taatgactct g 31
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
agagggctct tgcccatggc actgaggctg 30
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
caacagggca tatttgggca tgtccaccaa g 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
tgcactgccc agccctggtc acctacaaca c 31
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
gccagggtat gtggctacat gttcctgatc tcc 33
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
tggtgaccga ggacaacgtg atgaagatcg c 31
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
agtggcggtg gtggtgaggg agggggtggc 30
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
gccaggcctc aacgcccatg tctttgcagc g 31
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<213> 人工序列(Artificial)
<400> 17
tgggcttctt cctgttcatc ctggtggtg 29
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 18
cctcaaaaga cttggtgttg ttgatggcaa acacac 36
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
tcgtattcgt ccacaaaatg gttctggatc ag 32
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 20
atggacctag gcactctcta tgaatcctgc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 21
tacgatctac tggaattcct aatgggccaa cagctgac 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 22
cactcactct acctcataac cgcacaaacc tgac 34
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 23
ctaaccacat attttaattt tacagttgga aaataaacg 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 24
cattttttaa ctacatttat gtattcatga agacctg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 25
aacttccaca ggtatttgta gcagagtttc acttttg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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cttatttcag aaataatttg aatttcctaa tgggttc 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gaagatcttt atgaagcaaa tgttccagtg tatagg 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 28
gcagtacagt aaataccact atctctattg aatacg 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 29
gcactgtatt taaatattta aaagatagag gagtttc 37
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 30
gtgttctgga caaagcagga agatgtgact g 31
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 31
aggccctgct cgatgacttt gattacaaac tccg 34
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 32
acctgatcca gttgtttctg gatcttgctc tgctg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 33
caagagtaca cactcctcat ttggataggc ttgtaag 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 34
ctaaccaagt tctttctttt gcacagggca ttttgg 36
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 35
gactgcagaa tccaactgta aaagatctta ttggc 35
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 36
cacgggtaat aatttttgtc ctttctgtag gctggatg 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 37
gagacatgta tgataaagaa tactatagtg tacacaac 38
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 38
aatgacaaag aacagctcaa agcaatttct acacgag 37
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gtcgtgcatg tgggatgtat ttgaagcacc tgaatagg 38
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<213> 人工序列(Artificial)
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<213> 人工序列(Artificial)
<400> 41
ttcgtaagtg ttactcaaga agcagaaagg gaag 34
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<213> 人工序列(Artificial)
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aatggctttg aatctttggc cagtacctc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 43
aacttgtttg attacacaga cactctagta tctgg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 44
aattaatgat gattttaaat tcagcaagtg atcaacc 37
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 45
catctttaaa gagaaatttg ctaaagctgt gggac 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 46
tcctttagca aacttctgaa tgacaacatt tttcatatg 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 47
cgaaagtttt atcaaagcag aaggcaactt gacaag 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 48
acaactatga gttaatataa cccacagatt tctg 34
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<213> 人工序列(Artificial)
<400> 49
tagtatcata tatgatgagt atatgatgga tacagtc 37
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<213> 人工序列(Artificial)
<400> 50
aggagagggc ggggccgcgg aaagg 25
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 51
aatcagaggc ctggggaccc tgggcaacca g 31
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 52
ccagccccag ctgctcacca tcgctatctg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 53
ctcatggtgg gggcagcgcc tcacaacctc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 54
tgtggaatca acccacagct gcacagggca g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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ccctcctccc agagacccca gttgcaaacc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 56
cggctcatag ggcaccacca cactatgtcg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 57
gtggcaagtg gctcctgacc tggagtcttc 30
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 58
agtgtgatga tggtgaggat gggcctccgg ttc 33
<210> 59
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 59
tgatgatggt gaggatgggc ctccggttca tg 32
<210> 60
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 60
agctcgtggt gaggctcccc tttcttgcgg ag 32
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 61
cggtctctcc caggacaggc acaaacacgc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 62
gagtgtaaag gctcagggtt cacgctggcg 30
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 63
actgctctcc ggcattctcg cagttggctt tg 32
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 64
ggctgcagtc ttatgacatg acccagtaac gag 33
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 65
aagagtccgg cccggaggaa ctggg 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 66
cgtgctgcgc tcggtgaact cgcgcgagcc 30
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 67
tcccaggtca tcttctgcaa tcgcagtc 28
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 68
ggcgagccgc agccctaccc aacgctgccg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 69
tgggccaccg tgcccagcca ccggtgtggc 30
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 70
ttgcttgtcc cgataggtca cctttggctc ttcag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 71
caaactgaat tatttgtgcc atctctcaat gttgacg 37
<210> 72
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 72
accctagtct gccactgagg atttggtttt tgc 33
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 73
gtgtatactc tgaaagagcg atgcctccag gttg 34
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 74
aggagactgg acatcgtcag gtcgctctac 30
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 75
ggaacaagat ttacctctat tgttggatca tattcgtcc 39
<210> 76
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 76
aagaaagccc tccccagtcc tcatgtactg gtccc 35
<210> 77
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 77
cttcttgcta agtcctgagc ctgttttgtg tctac 35
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 78
ggaacagatc tgtatttatt tcagtgttac ttacctgtc 39
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 79
atgtcagagg tattcatact gggctgatac 30
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 80
gacctccagt aagggagggc aagaagatat g 31
<210> 81
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 81
cattgaaaac cagatcaggg gcgaagtaga gc 32
<210> 82
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 82
gatctctgcc atcatttccg gaaagtccac g 31
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 83
ggcttgactt tcccagaaag gatcttgggc 30
<210> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 84
cgctgcccaa cgcaccgaat agttacg 27
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 85
accgggccgg ggcgcggctg gacg 24
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 86
atgccggccc ccaccctggc tctgaccatt c 31
<210> 87
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 87
ctctgcagtc tttaaaccag aggag 25
<210> 88
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 88
ctctagtatc aacccaggaa taggaaatgt gagcgc 36
<210> 89
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 89
cttgtcaagc atttttttgt accattcctg cagtcgc 37
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 90
tcacagggac aggcagtcac acagctggcg 30
<210> 91
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 91
ctctgctgtc acctcttggt tgtgcagggg gcag 34
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 92
cccgcacccc agggccgggc tcacg 25
<210> 93
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 93
ggaactccac gtcgctgccc agcaccgccg tc 32
<210> 94
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 94
ctgcgcaggc ggcagagcgt cacagccgcc ac 32
<210> 95
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 95
agcgggagat cttgtgcacg gtgggggagc c 31
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 96
gtcattgatg gggagacgtg cctgttggac 30
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 97
ggcccctgag gagcgatgac ggaatataag 30
<210> 98
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 98
cgtgctgcaa gtgcagaggt attactacaa c 31
<210> 99
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 99
aaaggctgcc cagggcaggc aggacggact c 31
<210> 100
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 100
gtgaaaagcc aacaaggaag ctagtcctcc tattac 36
<210> 101
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 101
ttaatttaag gcttacctaa cttaagagct ccag 34
<210> 102
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 102
agttttcatc tgctggctgc aacaactgtg tc 32
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 103
gttcatgccc aatatggtat gaccaacatg gcttag 36
<210> 104
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 104
caatgaacag tgcctgcatt tatccagacc aaatc 35
<210> 105
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 105
aagcaatgtt gttgcaccag ccaatagcct gaacc 35
<210> 106
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 106
ggcaatcttg gcaatgtact atgtaggtct ttcg 34
<210> 107
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 107
gttgcagatt ggactactag agtgaagcaa attg 34
<210> 108
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 108
ttgtaagcac cttggagcca ctatcaaatg ctg 33
<210> 109
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 109
ctttcatagt gccactgccc tctatcccgt g 31
<210> 110
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 110
aggagcagat tggtgtacac cgcaagtccc ggaag 35
<210> 111
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 111
tggaaaagta gctcggtagt ctacagattc atttg 35
<210> 112
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 112
cagtgaattt tcttgccatc attgtccaac aaag 34
<210> 113
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 113
acatacagtt tcttgcagcc aagtctctgt gg 32
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 114
caaagccatc cacttcactg gcagctttgc 30
<210> 115
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 115
ggccaataca ttaccacatc tgacttggtg gtaaac 36
<210> 116
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 116
gaatctccat tttagcactt acctgtgact ccatag 36
<210> 117
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 117
agagtctcaa acacaaacta gagtcacaca cc 32
<210> 118
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 118
ggttcatttt ctcagttatc ttttcagttc aatgcatgc 39
<210> 119
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 119
ggatattgta tcataccaat ttctcgattg aggatc 36
<210> 120
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 120
aaccttactt tatttggatt tgatccagta acac 34
<210> 121
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 121
ggatttgatc cagtaacacc aatagggttc agc 33
<210> 122
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 122
taacttttaa tttcaagttt ctttgccaag atattac 37
<210> 123
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 123
atacgaactg gaaagatgct gcttttaata ttattac 37
<210> 124
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 124
acacaccaca ttttaacttt aaattgaaca aaagtg 36
<210> 125
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 125
gctacttact gagagccatg caagggattc c 31
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 126
cggtaagaca tcagtggaag ccacacatcc 30
<210> 127
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 127
ggtaagacaa tatgcagaaa atatttctaa ataccgacc 39
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 128
accttccagc tccgcctcct ccgcgcggac 30
<210> 129
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 129
ggtaggacct gatttcctta ctgcctcttg cttc 34
<210> 130
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 130
taacagttcc tgcatgggcg gcatgaaccg gag 33
<210> 131
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 131
gattcctcac tgattgctct taggtctggc c 31
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 132
tctccttcct cttcctacag tactcccctg 30
<210> 133
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 133
gaaggaaatt tgcgtgtgga gtatttggat gacag 35
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 134
cctgtgcagc tgtgggttga ttccacaccc 30
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 135
ttggctctga ctgtaccacc atccactaca actacatg 38
<210> 136
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 136
tcttgggcct gtgttatctc ctaggttggc tctgactgta ccaccatcca c 51
<210> 137
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 137
gctttatctg ttcacttgtg ccctgacttt caactc 36
<210> 138
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 138
atctactggg acggaacagc tttgaggtgc gtgtttg 37
<210> 139
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 139
tcctgagtag tggtaatcta ctgggacgga acagc 35
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 140
ggaggctttg actctccctt ttaccgagac 30
<210> 141
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 141
tggtaaccaa gctccacagc cagatcagac 30
<210> 142
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 142
gttaacttca tacattcatg tgaggactgc ccttgttc 38
<210> 143
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 143
gcggactgcg attgcagaag atgacc 26
<210> 144
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 144
gcagcacgac gcgcggactg cgattgcaga ag 32
<210> 145
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 145
cttcagaccg tgctatcgtc cctgctg 27
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 146
gcctaagcgc cgggcccgta cctcggtagc 30
<210> 147
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 147
tgtccgtcaa cattgagaga tggcacaaat aattc 35
<210> 148
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 148
gagagatggc acaaataatt cagtttggtt aacc 34
<210> 149
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 149
tgtacttacc acaacaacct tatcttttta aaaag 35
<210> 150
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 150
cgtagagcga cctgacgatg tccagtctcc tg 32
<210> 151
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 151
caatgcgctc ctgtgtcagc cgctccag 28
<210> 152
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 152
cttcaatctc ccatccgttg atgtgcaatg cg 32
<210> 153
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 153
gaggcctgct gaaaatgact gaatataaac ttgtgg 36
<210> 154
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 154
gtaattgatg gagaaacctg tctcttggat attctcg 37
<210> 155
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 155
aaggactctg aagatgtacc tatggtccta gtagg 35
<210> 156
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 156
acacaaaaca ggctcaggac ttagcaagaa gttatgg 37
<210> 157
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> Y为硫代修饰的简并碱基A或T
<400> 157
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnccctgcgt gacgty 56
<210> 158
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 158
acgtcacgca ggggagagcc agggatgact agg 33
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 159
agatgtgtat aagagacag 19
<210> 160
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> 第24和25个碱基之间插入7个作为分子标签的随机碱基
<400> 160
caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgt 45
<210> 161
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 161
aatgatacgg agaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60
ag 62
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 162
caagcagaag acggcatacg a 21
Claims (12)
1.膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物，其特征在于，包括SEQ ID No.1-156所示序列的引物。
2.膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物。
3.根据权利要求2所述的膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂盒，其特征在于，包括以下三种组合之一：（1）和（2），（3）和（4），（5）和（6）：
（1）按照说明书表1组合一中的浓度配制上游特异性引物组；
（2）按照说明书表1组合一中的浓度配制下游特异性引物组；
（3）按照说明书表1组合二中的浓度配制上游特异性引物组；
（4）按照说明书表1组合二中的浓度配制下游特异性引物组；
（5）按照说明书表1组合三中的浓度配制上游特异性引物组；
（6）按照说明书表1组合三中的浓度配制下游特异性引物组。
4.根据权利要求2所述的膀胱癌肿瘤突变基因检测试剂盒，其特征在于，还包括：对片段化核酸进行末端修复补平加A的末端修复反应试剂、对核酸进行分子标签接头连接的连接反应试剂。
5.膀胱癌肿瘤突变基因文库构建试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物。
6.根据权利要求5所述的膀胱癌肿瘤突变基因文库构建试剂盒，其特征在于，包括以下三种组合之一：（1）和（2），（3）和（4），（5）和（6）：
（1）按照说明书表1组合一中的浓度配制上游特异性引物组；
（2）按照说明书表1组合一中的浓度配制下游特异性引物组；
（3）按照说明书表1组合二中的浓度配制上游特异性引物组；
（4）按照说明书表1组合二中的浓度配制下游特异性引物组；
（5）按照说明书表1组合三中的浓度配制上游特异性引物组；
（6）按照说明书表1组合三中的浓度配制下游特异性引物组。
7.根据权利要求5所述的膀胱癌肿瘤突变基因文库构建试剂盒，其特征在于，还包括：对片段化核酸进行末端修复补平加A的末端修复反应试剂、对核酸进行分子标签接头连接的连接反应试剂。
8.膀胱癌肿瘤突变基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待检DNA样本的片段化核酸进行末端修复补平加A；
（2）对末端修复补平加A的片段化核酸进行分子标签接头连接；
（3）将上游特异性引物组和下游特异性引物组，分别与分子标签引物组合，对连接接头产物进行扩增子法靶向富集；SEQ ID No.1-78所示序列为根据各个突变区域上游设计的上游特异性引物组；SEQ ID No.79-156所示序列为根据各个突变区域下游设计的下游特异性引物组；
（4）对扩增子法靶向富集产物进行PCR富集；对PCR富集产物检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，上游特异性引物组和下游特异性引物组包括以下三种组合之一：（1）和（2），（3）和（4），（5）和（6）：
（1）按照说明书表1组合一中的浓度配制上游特异性引物组；
（2）按照说明书表1组合一中的浓度配制下游特异性引物组；
（3）按照说明书表1组合二中的浓度配制上游特异性引物组；
（4）按照说明书表1组合二中的浓度配制下游特异性引物组；
（5）按照说明书表1组合三中的浓度配制上游特异性引物组；
（6）按照说明书表1组合三中的浓度配制下游特异性引物组。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的突变包括点突变、缺失、插入、基因扩增、基因甲基化，基因融合中的一种或多种。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，核酸片段包括DNA或RNA。
12.一种膀胱癌肿瘤突变基因文库构建方法，其特征在于，是采用权利要求8-11任一项所述的方法中步骤4）获得的PCR扩增产物进行文库构建。
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