CN114196740A - 用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒 - Google Patents

用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及基因检测的技术领域，具体公开了用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒。检测方法包括：S1、提取得到样本DNA；制备引物探针混合液，包括：合成引物和探针，每个目标基因至少设计两个结合目标基因的探针，引物的核苷酸序列的碱基为四种或四种以下；引物上修饰有小分子化合物和能够形成二级结构的核苷酸序列，小分子化合物选自硫代磷酸寡核苷酸、甲基化寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、次黄嘌呤核苷酸或铑金属插入剂中的一种或几种；引物和探针混合得到引物探针混合液；S2、进行PCR反应；S3、对检测数据进行分析，得到不同位点的基因类型。本申请的检测方法检测准确且效率高。

Description

用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品 和检测试剂盒
技术领域
本申请涉及基因突变检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种用于同时识别多种基因突变的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒。
背景技术
多重基因检测是行业内的难题，目前大多数技术只能实现有限重基因的检测。近些年，部分技术可以做到十多重基因的检测，比如多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、多色熔解曲线分析技术(multicolor melting curve analysis，MMCA)和微流控技术（如Filmarray产品）等，但是这些检测手段都存在着不同的技术问题。其中的MLPA技术，因探针设计困难费时、试剂昂贵、需要和毛细管电泳等复杂仪器配合使用等，使得其应用受限。其中的微流控技术则需要借助微流控相关的复杂仪器，而且其检测灵敏度不能满足实际应用的要求。
在解决这些行业难题的过程中，一些研究者开始尝试采用数字PCR技术来辅助提高基因突变检测的准确度和信号数。数字PCR是一种核酸分子绝对定量的技术，基于这个技术，科学家们可以在同一张二维结果图中通过调节探针的荧光强度，以区分多个信号，从而实现对多重基因突变的检测。但是，将该技术用于多重基因突变的检测时，其依然受到同一体系内引物数量的限制：当检测多重基因突变时，需要设置多个引物，而引物数量的增加会增加二聚体等非特异性扩增产物产生并影响目标基因扩增结果的可能性。
因此，亟需开发一种新的超多重基因突变的检测方法，来克服现有技术存在的难题。
发明内容
为了进一步实现超多重基因突变的准确检测，本申请提供一种用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒。
第一方面，本申请提供了用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法，采用如下的技术方案：
用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法，包括以下步骤：
S1、提取得到样本DNA；
制备得到引物探针混合液，包括以下步骤：
S11、合成目标基因扩增和检测用的引物和探针，所述引物和探针为多个；每个所述目标基因至少设计有两个检测用探针，用于覆盖目标基因的不同区域；合成所述引物核苷酸序列的碱基包含四种或者四种以下；
S12、使得所述引物的5’端添加有能够形成二级结构的核苷酸序列，且使得所述引物上修饰有小分子化合物，即得到PCR扩增用引物；
所述小分子化合物选自硫代磷酸寡核苷酸、甲基化寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、次黄嘌呤核苷酸或铑金属插入剂中的一种或几种；
S13、将所述PCR扩增用引物和所述探针共同溶解于核酸溶解用缓冲液中，得到引物探针混合液；
S2、配制PCR反应体系后进行PCR反应，所述PCR反应体系包括所述样本DNA和所述引物探针混合液；进行PCR反应；
S3、PCR反应结束后对检测数据进行分析，得到不同位点的基因类型。
以常规方法设计多种引物和探针用于PCR扩增时，常出现非特异性扩增产物（交互配对和错配）的情况。而本申请中，在合成引物时，可以选用四种碱基或者仅仅选用三种碱基（缺失碱基A、碱基G、碱基C或者碱基T中的任意一种），以显著降低扩增时的非特异性结合。随后在扩增得到的引物的5’端加入能够形成二级结构的核苷酸序列，降低引物之间产生二聚体，减少非特异性扩增。本申请的方案，通过对引物的特殊设计、结合在引物的5’端加入可形成二级结构的核苷酸序列、并加入小分子化合物，不断加强引物和目标基因的结合强度和稳定性，显著降低非特异性扩增的产生，使多重PCR得以实现。
其中的小分子化合物的添加作用在于，尤其是当合成所述引物的核苷酸序列仅仅含有三种碱基时，以硫代磷酸寡核苷酸、甲基化寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、次黄嘌呤核苷酸或铑金属插入剂中的一种或多种作为所缺失碱基的替代，以提高引物的稳定性以及引物的目标基因的结合稳定性。其中的肽核酸（PNA）可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。锁核酸（LNA）是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。次黄嘌呤核苷酸或脱氧次黄嘌呤也可以作为通用碱基，用以替代缺失碱基。因此，当小分子化合物为肽核酸、锁核酸、次黄嘌呤核苷酸以及脱氧次黄嘌呤中的一种或多种时，可以用作通用碱基，在引物合成时替代缺失的碱基，以提高引物和目的基因的结合稳定性。
而在进行探针设计时，本申请基于双探针脱落技术。现有的单探针脱落技术中，需要设计两个探针：脱落探针和参考探针，其中的脱落探针仅仅和野生型序列互补而跳过突变序列，参考探针用于和突变位点的相邻位点进行杂交并且与突变和野生型等位基因进行互补，从而实现对不同基因型的识别检测。但是，单探针脱落技术中的两个探针，仅仅有一个探针用于识别野生型基因，使得检测效率低。
因此，本申请中的探针脱落技术中，每个目标基因设置至少两个探针，且设置的探针中没有参照探针；多个不同探针均结合目标基因，且覆盖目标基因的不同区域，以实现对目标基因突变位点的全面检测，从而增强探针使用效率，一次检测就实现对目标基因中多种基因类型的同时检测，以使得试剂设计更加高效、工艺更加简便、成本更低。
可选的，合成所述引物的核苷酸序列包含三种碱基且不同时包括碱基G和碱基C。
可选的，所述小分子化合物通过额外添加的方式和所述引物连接；S12包括以下步骤：所述引物的5’端添加可形成三维结构的核苷酸序列，得到初始修饰引物；将所述初始修饰引物加入到缓冲液中，所述缓冲液包括小分子化合物，反应，得到PCR扩增用引物。
可选的，所述小分子化合物在所述缓冲液中的浓度为4~12μM，所述小分子化合物和初始修饰引物的摩尔比为0.7~1:1。
通过采用上述技术方案，当选择的小分子化合物为铑金属插入剂时，小分子化合物是以加入缓冲液中后再添加至引物上。其进一步的添加方法包括：首先，在制备PCR扩增用引物时，合成引物；随后在该引物的5’端连接一段可以形成三维结构的核苷酸序列后得到初始修饰引物；最后通过将得到的初始修饰引物和含有小分子化合物的缓冲液混合后，实现在初始修饰引物上添加小分子化合物目的，最终得到PCR扩增用引物。小分子化合物的添加目的为增强引物和模板结合区的结合强度。在该方案中，通过添加适量的小分子化合物，以达到优异的降低错配和增加结合强度的效果。
可选的，所述样本DNA包括cfDNA。
一般来讲，所述cfDNA的长度为150-200bp；本申请的方案能够实现对短链核苷酸片段上基因突变的高效准确的检测。
可选的，所述探针的核苷酸序列长度为10~30bp。
通过采用上述技术方案，且探针的核苷酸序列较短，使得PCR扩增的效率更高且使得碱基错配的可能性显著降低；此外，较短的探针，能够促使荧光素和淬灭基团足够接近，以减少背景荧光，进而使得检测结果更加准确；同时较短的探针更适合检测血液中的小片段cfDNA。
可选的，所述PCR反应体系中不包括三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
可选的，在所述引物探针混合液中，每条所述PCR扩增用引物的浓度为7~12μM，每条所述探针的浓度为7~12μM。
可选的，步骤S12反应时，先加热至50~80℃，随后保温；然后降温至28~32℃，保温后即可。
可选的，多个所述探针中不包含参考探针。
第二方面，本申请提供了采用上述检测方法进行多种基因类型检测的检测产品。
第三方面，本申请提供了采用上述检测方法进行多种基因类型检测的检测试剂盒。
可选的，所述检测试剂盒包括所述引物探针混合液；所述引物探针混合液内含有所述PCR扩增用引物和所述探针；每目标基因对应有至少两个所述探针。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请基于数字PCR技术，在合成引物时，首先仅仅选用三种碱基，以显著降低扩增时的非特异性结合；并在引物的5’端加入可形成三维结构的核苷酸序列和引入小分子化合物，能够显著降低引物之间产生二聚体，减少非特异性扩增，并能够提高引物对模板的结合特异性和结合强度、结合稳定性，可以实现单反应体系多重扩增。而在进行探针设计时，基于双探针脱落技术，每个目标基因设置至少两个探针，且设置的探针中不含有参照探针；多个不同探针均结合目标基因，且覆盖目标基因的不同区域，以实现对目标基因突变位点的全面检测，从而通过一次检测实现对目标基因多个基因类型或者基因突变的同时检测，检测过程更加高效。
2、本申请中选择探针的核苷酸序列长度为10~30bp，探针的核苷酸序列较短，使得PCR扩增的效率更高且使得碱基错配的可能性显著降低；此外，检测时背景荧光比较弱，进而使得检测结果更加准确；并且短的探针更适合检测血液中的小片段cfDNA。
附图说明
图1是本申请的技术方案进行突变检测的原理示意图；
图2是本申请实施例1中检测的肺癌基因位点KRAS突变位点的聚类分析图；
图3是本申请实施例4中检测的结直肠癌基因位点PIK3CA和BRAF突变位点的聚类分析图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
如图1所示，本申请通过设计至少两个探针，多个不同探针均结合目标基因，且覆盖目标基因的不同区域，以实现对目标基因突变位点的全面检测。针对不同的突变型，其最终在聚类分析图上的不同位置处出现不同荧光显色的聚类：横坐标和纵坐标上对应的是不同通道上出现的不同突变型基因的荧光聚类；对角线上的是对应基因野生型的荧光聚类。
实施例1 肺癌相关的多种基因突变的数字扩增检测方法和检测试剂盒
针对肺癌的用于同时识别多种基因突变的数字扩增检测方法，包括以下步骤：
S1、提取得到样本DNA和引物探针混合液的制备
I、样本DNA的提取
入组病例：对上海中山医院胸外科2020年1月至2020年12月就诊的肺部结节患者进行研究，根据胸部CT及血液肺癌肿瘤指标（包括KRAS）检查结果，均无法确定其为肺癌还是肺良性疾病。所有患者均选择接受手术治疗，术前采外周静脉血50mL，根据肿瘤术后病理结果，将样本分为肺癌及肺良性疾病组(肺良性疾病包括炎性假瘤、硬化性血管瘤、肺结核球等)。
研究方法：应用dPCR技术研究两组样本外周血cfDNA突变情况，具体的操作步骤包括：
①从外周静脉血中采集分离20mL血浆及白细胞；
②将采集的样本在4℃条件下，1900g离心10min，得到血浆层；
③在4℃条件下，16000g离心10min，去除细胞残留；
④采用cfDNA提取试剂盒（QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen，Valencia，CA，USA)）获取cfDNA。
研究结果：在入组的肺癌病人中，约48.1%发现了KRAS基因中的一种或几种突变。在所有检测到KRAS基因突变的肺癌病人中，通过卡方检验发现其与肺良性疾病患者有显著的统计学差异。
其中，对于肺癌病人，其KRAS突变基因及突变位点，如表1所示，在反应体系中，通过数字PCR技术以及本实施例的特殊引物、探针和缓冲液，可实现对KRAS基因61个突变位点的检测。
表1 本申请检测的肺癌相关目标基因的突变位点
Figure 518063DEST_PATH_IMAGE001
研究结论：在肺癌患者的外周血cfDNA中发现KRAS基因突变，突变基因包含表1所述突变位点。KRAS基因的特定位点突变，可为肺癌患者的临床诊断和用药指导提供参考，对于影像学和肿瘤指标难以确诊的肺结节患者，提供更加合理有效的个体化指导。
II、引物探针混合液的制备
S11、合成目标基因扩增和检测用的引物和探针，所述引物和探针为多个；每个所述目标基因至少设计有两个检测用探针；合成所述引物的核苷酸序列只包括三种碱基且不同时包括碱基A和碱基T。
具体为：
按照引物和探针的设计原则，根据Cosmic数据公布的人类KRAS野生型基因序列，以KRAS的突变位点为基础，来设计特异性引物和探针，如表2所示。突变型荧光探针5’端连接有荧光报告基团FAM；3’端连接有荧光淬灭基团BHQ1；野生型荧光探针5’端连接的荧光报告基团HEX；3’端连接有荧光淬灭基团BHQ2。荧光报告基团和淬灭基团还可以根据具体的平台进行合理选择。
表2反应管中肺癌基因突变位点检测引物探针序列
Figure 435203DEST_PATH_IMAGE002
将上述针对表1所示目标基因位点的引物和探针设计的扩增用的初始修饰引物，送到生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
S12、所述引物经修饰后备用，所述修饰包括以下步骤：
S121、将设计好的引物的5’端添加上核苷酸序列“CCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGG（如SEQ ID NO.9所示）”，得到扩增用的初始修饰引物。
S122、将合成得到的初始修饰引物，加入到缓冲液中加热至70℃，保温5min，然后冷却至30℃，保温25min，得到PCR扩增用引物。
其中，缓冲液的组分为：290mM NaC1，4.5mM MgC12，18mM Tris(pH7.3)。缓冲液中还包括10μM的小分子化合物，小分子化合物为铑金属插入剂，且铑金属插入剂和初始修饰引物的摩尔比为0.7:1。通过X单晶衍射数据的分析，测定检测的核苷酸序列5’端序列存在三维结构。
S13、将用于检测表1所示位点的上游引物、下游引物（即S122中的PCR扩增用引物）和用于检测表1所示位点的荧光探针1和荧光探针2（即S11中合成得到的各探针）共同溶解于TE溶液中，制成引物探针混合溶液。上游引物、下游引物、荧光探针1和荧光探针2在引物探针混合液中的浓度均为10μM。
引物探针混合液的配制方法为：将上游引物、下游引物、荧光探针1和荧光探针2四种成分的干粉分别用TE缓冲液稀释至各探针、引物的浓度分别为100μM，备用。
S2、配制PCR反应体系后进行PCR反应，所述PCR反应体系包括所述样本DNA和所述引物探针混合液。
具体的，按照表3配制PCR反应体系。
表3反应体系（总体积20μL）
Figure 949361DEST_PATH_IMAGE003
其中，PCR Mix购买自NEB，并加入终浓度0.1%的Triton-X-100，1U热稳定焦磷酸酶，5μg/μL的BSA，按照ddH2O、PCR mix、探针、引物、模板DNA的顺序，将上述样品按照表3中反应体系中20μL的添加量加入0.2mLPCR管中，使用轻柔涡旋将混合体系混匀15s，并通过短时离心将溶液收集到试管底部。将配制好的不同比例的反应体系上样到PCR芯片上，形成微反应单元。将芯片放入数字PCR仪中，按照表4中PCR反应条件进行PCR反应。
其中，所述PCR Mix中，不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分。
表4 PCR反应条件
Figure 141308DEST_PATH_IMAGE004
S3、PCR反应结束后对检测数据进行分析，得到不同位点的基因类型。
具体为：
扩增结束后，通过电脑分析，对两个通道的有效荧光阳性点进行判读，并对结果进行分析，如图2所示，图2为临床样本检测结果图（即肺癌基因位点KRAS突变位点的聚类分析），纵坐标为FAM荧光通道，横坐标为HEX荧光通道。由实验结果分析可看出，通过聚类分析可以检测出对应的信号，对应于表1所示全部61个基因位点。
通过将突变信号（MUT）除以对应的野生型信号（WT）可以计算出目标基因群的突变丰度。进一步地，将本实施例与现有方法学（NGS）结果的一致性比较结果发现，通过本实施例共完成143例临床血液样本检测（每例都做过NGS检测），其中与NGS结果一致的有133例，不一致的有10例，一致率为93%。
针对肺癌的用于同时识别多种基因突变的检测试剂盒，包括PCR扩增用引物和探针、TE缓冲液和PCR混合液。
PCR混合液购买自NEB，并加入终浓度0.1%的Triton-X-100，1U热稳定焦磷酸酶，5μg/μL的BSA，还包括PCR mix，其中PCR mix不包括三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分。
检测试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
阳性质控品的制备方法为：表1所示每一基因突变位点野生型和突变型的序列各200bp，合成后，分别装入质粒载体pET-23d(+)(Promega)。使用Qubit 3.0进行定量，计算两种类型质粒的拷贝数浓度，根据拷贝数比例1:3000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50，1:10混合两种质粒，之后通过超声将质粒混合物打断为约180bp的片段，定量到20ng/μL，作为梯度阳性质控品。
阴性质控品由上述含有野生型的质粒单独构成，然后采用同样方法打断为约180bp的片段，定量到20ng/μL，作为阴性质控品。
实施例2肺癌相关的多种基因突变的数字扩增检测方法和检测试剂盒
针对肺癌的用于同时识别多种基因突变的数字扩增检测方法：本实施例和实施例1的区别在于，所选用的小分子化合物是直接加在引物上的，即所选用的引物是经锁核酸修饰后获得的。此外在步骤S122中，其缓冲液内不再添加小分子化合物。
锁核酸通过市售获得，可以是购自北京赛百盛基因技术有限公司合成的锁核酸寡聚链。
其他同实施例1。
针对肺癌的用于同时识别多种基因突变的检测试剂盒
本实施例和实施例1的区别在于，其中PCR扩增用引物是本实施例制备得到的，其他同实施例1。
实施例3肺癌相关的多种基因突变的数字扩增检测方法和检测试剂盒
针对肺癌的用于同时识别多种基因突变的数字扩增检测方法
本实施例和实施例1的区别在于，小分子化合物选用的是肽核酸，肽核酸是在步骤S2添加，具体为：在PCR Mix中，添加有终浓度为0.35μM的肽核酸。并且在步骤S122中，其缓冲液内不再添加小分子化合物。
其他同实施例1。
针对肺癌的用于同时识别多种基因突变的检测试剂盒
本实施例和实施例1的区别在于，其中PCR扩增用引物是本实施例制备得到的，其他同实施例1。
最终采用该方法也能够获得对肺癌相关突变基因（如表1所示的KRAS基因61个突变位点）的准确检测。
实施例4结直肠癌相关的多种基因突变的数字扩增检测方法和检测试剂盒
针对结直肠癌的用于同时识别多种基因突变的数字扩增检测方法，包括以下步骤：
S1、提取得到样本DNA和引物探针混合液的制备
I、样本DNA的提取
入组病例：对上海中山医院肛肠外科2019年1月至2019年12月就诊的结直肠癌患者进行研究，根据CT及血液结直肠癌肿瘤指标（包括PIK3Ca和BRAF）检查结果，均无法确定其为结直肠癌还是结直肠良性疾病。所有患者均选择接受手术治疗，术前采外周静脉血50mL，根据肿瘤术后病理结果，将样本分为结直肠癌还是结直肠良性疾病。
研究方法：应用dPCR技术研究两组样本外周血cfDNA突变情况，具体的操作步骤包括：
①从外周静脉血中采集分离20mL血浆及白细胞；
②将采集的样本在4℃条件下，1900g离心10min，得到血浆层；
③在4℃条件下，16000g离心10min，去除细胞残留；
④采用cfDNA提取试剂盒（QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen，Valencia，CA，USA)）获取cfDNA。
研究结果：在入组的结直肠癌病人中，部分病人中检测出PIK3CA和BRAF基因中的一种或几种突变，而在肺良性疾病患者中，未发现PIK3CA和BRAF基因突变。在所有检测到PIK3CA和BRAF基因突变的结直肠癌病人中，
通过卡方检验发现其与结直肠良性疾病患者有显著的统计学差异。
其中，对于结直肠癌病人，其PIK3CA和BRAF突变基因及突变位点，如表5所示，在反应体系中，通过数字PCR，和本实施例采用的特殊引物和缓冲液，可实现PIK3CA和BRAF等2个基因总共41个突变位点的检测。
表5本申请检测的目标基因的突变位点
Figure 955680DEST_PATH_IMAGE005
研究结论：在结直肠癌患者的外周血ctDNA中发现PIK3CA和BRAF基因突变，突变基因包含表5所述突变位点，而在良性肿瘤中未发现其突变。PIK3CA和BRAF基因的特定位点突变，可为结直肠癌的诊断及鉴别诊断提供参考，对于影像学和肿瘤指标难以确诊的结直肠患者，提供更加合理有效的个体化指导。
II、引物探针混合液的制备
S11、合成目标基因扩增和检测用的引物和探针，所述引物和探针为多个；每个所述目标基因至少设计有两个检测用探针；合成所述引物的核苷酸序列只包括三种碱基且不同时包括碱基G和碱基C。
具体为：
引物及探针设计步骤：
1、首先在Ensemble数据库中确定包含PIK3CA和BRAF基因突变位点的cDNA序列；
2、通过BLAST确定该cDNA序列在DNA上所对应的外显子序列；
3、根据所得外显子序列，通过GenomeBrower确定所对应的完整DNA序列(包括外显子和内含子)；
其中，PIK3CA和BRAF的突变位点、突变基因如表6所示。
4、按照上述引物和探针的设计原则，以上述PIK3CA和BRAF突变基因对应的DNA序列为模板，利用ION AMPLISEQ DESIGNER在线设计网站设计出覆盖表5所示目标基因位点的引物和探针，如表6所示。突变型荧光探针5’端连接有荧光报告基团FAM；3’端连接有荧光淬灭基团BHQ1；野生型荧光探针5’端连接的荧光报告基团CY3；3’端连接有荧光淬灭基团BHQ2。荧光报告基团和淬灭基团还可以根据具体的平台进行合理选择。
表6反应管中结直肠癌基因突变位点检测引物探针序列
Figure 512564DEST_PATH_IMAGE006
将上述表6所示目标基因位点的引物和探针，送到生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
S12、所述引物经修饰后备用，所述修饰包括以下步骤：
S121、将设计好的引物的5’端添加上核苷酸序列将设计好的引物的一端添加上核苷酸序列“TCCTCATCTGTCGAGACTCACTATAGGAAGAGATGTCAACTCGTGCACGAGTTGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATATTGGAGGAAGCTCGAGCTGGAGGAAAAGTGAGTCTCGACAGATGAGGA（如SEQ IDNO.21所示）”，得到扩增用的初始修饰引物。
S122、将合成得到的初始修饰引物，加入到缓冲液中加热至70℃，保温5min，然后冷却至30℃，保温25min，得到PCR扩增用引物。
其中，缓冲液的组分为：300mM NaC1，5mM MgC12，20mM Tris(pH 7.6)。缓冲液的组分还包括5μM的小分子化合物，小分子化合物为甲基化寡核苷酸，且甲基化寡核苷酸和初始修饰引物的摩尔比为0.8:1。通过X单晶衍射数据的分析，测定检测的核苷酸序列5’端序列存在三维结构。
S13、将用于检测表5所示位点的上游引物、下游引物（即S122中的PCR扩增用引物）和用于检测表5所示位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针（即S11中合成得到的各探针）共同溶解于TE溶液中，制成引物探针混合溶液。各上游引物、下游引物、荧光探针在引物探针混合液中的浓度均为10μM。
引物探针混合液的配制方法为：将上游引物、下游引物、荧光探针1和荧光探针2四种成分的干粉分别用TE缓冲液稀释至各探针、引物的浓度分别为100μM，备用。
S2、配制PCR反应体系后进行PCR反应，PCR反应体系包括样本DNA和引物探针混合液。
具体的，按照表7配制PCR反应体系。
表7反应体系（总体积20μL）
Figure 310755DEST_PATH_IMAGE007
其中，PCR Mix购买自NEB，并加入终浓度0.1%的Triton-X-100，1U热稳定焦磷酸酶，5μg/μL的BSA，按照ddH2O、PCR mix、探针、引物、模板DNA的顺序，将上述样品按照表7反应体系中20μL的添加量加入0.2mLPCR管中，使用轻柔涡旋将混合体系混匀15s，并通过短时离心将溶液收集到试管底部。将配制好的不同比例的反应体系上样到PCR芯片上，形成微反应单元。将芯片放入数字PCR仪中，按照表8中PCR反应条件进行PCR反应。
其中，所述PCR Mix中，不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）组分。
表8 PCR反应条件
Figure 509655DEST_PATH_IMAGE008
S3、PCR反应结束后对检测数据进行分析，得到不同位点的基因类型。
具体为：
扩增结束后，通过电脑分析，对两个通道的有效荧光阳性点进行判读，并对结果进行分析，如图3所示，图3为临床样本检测结果图（即结直肠癌基因位点PIK3CA和BRAF突变位点的聚类分析），纵坐标为FAM荧光通道，横坐标为HEX荧光通道。由实验结果分析可看出，通过聚类分析可以检测出对应的信号，对应于表5所示全部41个基因位点。
通过将突变信号（MUT）除以对应的野生型信号（WT）可以计算出目标基因群的突变丰度。采用上述方法，完成了108例临床血液样本检测（每例都做过NGS检测），其中与NGS结果一致的有107例，不一致的有2例（因为panel设计不一样），一致率为98%。
申请人还对血清、血浆、外周血、胸腔积液、体液或者组织来源的DNA进行表5所示基因位点突变的检测，且重复性良好。通过本实施例所述检测方法，可实现对结直肠癌基因突变位点的灵敏检测，且无非特异性扩增，特异性好。可以添加多种引物进行检测，可以有效地节省反应过程中的底物。
针对直肠癌的用于同时识别多种基因突变的检测试剂盒，包括引物探针混合液和PCR混合液。
引物探针混合液包括缓冲液、在缓冲液中的探针和在缓冲液中的初始修饰引物。缓冲液的组分为：300mM NaC1，5mM MgC12，20mM Tris(pH 7.6)。缓冲液的组分还包括5μM的小分子化合物，小分子化合物为锁核酸，且锁核酸和初始修饰引物的摩尔比为0.8:1，各初始修饰引物和各探针在缓冲液中的含量为10μM。
PCR混合液购买自NEB，并加入终浓度0.1%的Triton-X-100，1U热稳定焦磷酸酶，5μg/μL的BSA，还包括PCR mix，其中PCR mix不包括三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分。
试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
阳性质控品的制备方法为：表5所示每一基因突变位点野生型和突变型的序列各200bp，合成后，分别装入质粒载体pET-23d(+)(Promega)。使用Qubit 3.0进行定量，计算两种类型质粒的拷贝数浓度，根据拷贝数比例1:3000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50，1:10混合两种质粒，之后通过超声将质粒混合物打断为约180bp的片段，定量到20ng/μL，作为梯度阳性质控品。
阴性质控品由上述含有野生型的质粒单独构成，然后采用同样方法打断为约180bp的片段，定量到20ng/μL，作为阴性质控品。
实施例5 结直肠癌相关的多种基因突变的数字扩增检测方法和检测试剂盒
本实施例和实施例4的区别在于，步骤S121中，于设计好的引物5’端添加可形成三维结构的核苷酸序列和实施例4不同，本实施例中添加的核苷酸序列为“ACTCATCTGTGAGACTCACTATAGGAAGAGATGTCAACTCGTGCACGAGTTGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATATTGGAGGAAGCTCGAGCTGGAGGAAAAGTGAGTCTCACAGATGAGT（如SEQ ID NO.22所示）”，得到扩增用的初始修饰引物。
其他步骤同实施例4，进行PCR扩增后发现，将该可形成三维结构的核苷酸序列添加至设计好的引物的5’端时，在循环次数为25次时，已经出现了明显的非特异性扩增；而在以实施例4的方案进行PCR扩增时，循环至少120次时，仍未出现非特异性扩增。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 南京普济生物有限公司
<120> 用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccgccgcggc cgccgcct 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgccgccgcg tccgcgc 17
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cccgcccctc cgggg 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccggggcgcc gcggg 15
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tgccgccgcc gctgctgcct 20
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cgccaccttc gccg 14
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gtacctctct ccc 13
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ggaagcagca 10
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ccctggggga gtattgcgga ggaaggg 27
<210> 10
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acataaaaaa ata 13
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aaaaattcaa tttctaa 17
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aaatatttta taat 14
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aacttcaaaa caaacaaaac aaaacaca 28
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tgagataacc tg 12
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gcagtagaaa taatc 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gatagtaata ccactctgtc 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ttcagattag aataccattt ctta 24
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
cacataaaca aatttt 16
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ataattaaaa atttcca 17
<210> 20
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
acacggtatt 10
<210> 21
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
tcctcatctg tcgagactca ctataggaag agatgtcaac tcgtgcacga gttgacatct 60
cttctccgag ccggtcgaaa tattggagga agctcgagct ggaggaaaag tgagtctcga 120
cagatgagga 130
<210> 22
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
actcatctgt gagactcact ataggaagag atgtcaactc gtgcacgagt tgacatctct 60
tctccgagcc ggtcgaaata ttggaggaag ctcgagctgg aggaaaagtg agtctcacag 120
atgagt 126

Claims (10)

1.用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取得到样本DNA；
制备得到引物探针混合液，包括以下步骤：
S11、合成目标基因扩增和检测用的引物和探针，所述引物和探针为多个；每个所述目标基因至少设计有两个检测用探针，用于覆盖目标基因的不同区域；合成所述引物核苷酸序列的碱基包含四种或者四种以下；
S12、使得所述引物的5’端添加有能够形成二级结构的核苷酸序列，且使得所述引物上修饰有小分子化合物，得到PCR扩增用引物；
所述小分子化合物选自硫代磷酸寡核苷酸、甲基化寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、次黄嘌呤核苷酸或铑金属插入剂中的一种或几种；
S13、将所述PCR扩增用引物和所述探针共同溶解于核酸溶解用缓冲液中，得到引物探针混合液；
S2、配制PCR反应体系后进行PCR反应，所述PCR反应体系包括所述样本DNA和所述引物探针混合液；进行PCR反应；
S3、PCR反应结束后对检测数据进行分析，得到不同位点的基因类型。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，合成所述引物的核苷酸序列包含三种碱基且不同时包含碱基C或者碱基G。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述小分子化合物通过额外添加的方式和所述引物连接；S12包括以下步骤：所述引物的5’端添加可形成三维结构的核苷酸序列，得到初始修饰引物；将所述初始修饰引物加入到缓冲液中，所述缓冲液包括小分子化合物，反应，得到PCR扩增用引物。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述小分子化合物在所述缓冲液中的浓度为4~12μM，所述小分子化合物和初始修饰引物的摩尔比为0.7~1:1。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述探针的核苷酸序列长度为10~30bp。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样本DNA包括cfDNA。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述引物探针混合液中，每条所述PCR扩增用引物的浓度为7~12μM，每条所述探针的浓度为7~12μM。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S12反应时，先加热至50~80℃，随后保温；然后降温至28~32℃，保温后即可。
9.采用权利要求1-8任一所述检测方法进行多种基因类型检测的检测产品。
10.采用权利要求1-8任一所述检测方法进行多种基因类型检测的检测试剂盒。
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