CN110592217A - 一种检测外周血游离dna中kras基因突变的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测外周血游离dna中kras基因突变的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒，包括针对KRAS基因的7个热点突变位点而设计的特异性PCR引物和特异性TaqMan探针。本发明还公开了该试剂盒的应用，采用试剂盒检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的方法，包括如下步骤：S1：待测样本处理和模板DNA提取；S2：进行荧光PCR扩增；S3：检测荧光信号，以达到设定阈值时所需要的Ct值作为结果判断的标准，鉴定KRAS基因是否发生突变。采用本发明的试剂盒，能够用于外周血游离DNA样本中的人KRAS基因突变的快速检测，操作快速，方法简便，检测灵敏度高，特异性好，结果准确。

Description

一种检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒及其应用。
背景技术
KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信号通路的调控。KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因，其最常见的突变位点主要在2号外显子的第12、13密码子以及3号外显子的第61位密码子上。其中，第12、13密码子突变频率较高，占90％以上。KRAS基因处于EGFR信号传导的下游通路，调控EGFR的活化状态，起到“分子开关”的作用，当KRAS基因发生激活突变后，将促使肿瘤细胞不受控制地增殖，最终导致靶向药物失去对EGFR的抑制作用。
研究结果提示，KRAS基因第2号外显子第12、13位密码子的突变状态与阻断EGFR的单克隆抗体——西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)的疗效明确相关，KRAS野生型的患者可以从西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗中获得最大化的生存效益。2009年，美国临床肿瘤学会(ASCO)建议对于转移性结直肠癌患者，在选择抗EGFR的单抗药物(西妥昔单抗或帕尼单抗)治疗前应检测KRAS基因状态。美国《国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2011年)也指出，使用西妥昔单抗或帕尼单抗的患者应检测肿瘤KRAS基因突变状态。中国卫生部颁布的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》中推荐西妥昔单抗用于治疗KRAS基因状态野生型患者。
随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测人KRAS基因突变，包括测序、基因芯片、探针杂交等。荧光定量PCR(Q-PCR)技术在人KRAS基因突变诊断领域的应用也已越来越广泛，越来越为人所重视，在人KRAS基因突变的实验诊断中，Q-PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，猝灭剂在3'端。PCR反应体系中，加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，该探针位于其中一条引物的下游若干个碱基位置。探针完整时，荧光基团发生的荧光信号被猝灭基团所吸收，不能发出荧光；当进行PCR扩增反应时，Taq酶的5'-3'酶活性将探针酶切降解，发光基团和猝灭基团分离，从而发出荧光信号，荧光信号强度与模板量成正比。常用荧光基团有FAM，VIC等。
TaqMan-MGB探针的猝灭基团采用了非荧光猝灭基团，本身不发荧光，可以大大降低本底信号强度；同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。在获得同样Tm值的情况下，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，降低了探针设计的难度以及合成的成本，同时可以更有效地区分不同的基因型。
外周血游离DNA是血中游离于细胞外的的机体内源性DNA片段。1994年，在肿瘤病人的血液中检测到RAS基因的突变，1997年Lo等发现孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA。应用分子生物学手段对循环游离核酸的研究兴趣日益增加，血中游离DNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要价值。
外周血液中癌细胞的突变DNA是存在于大量野生型基因背景下的极为稀少的突变基因，其存在比率一般小于0.2％，能否准确无创地检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高的检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒及其应用。
为解决上述技术问题，根据KRAS基因第2号外显子第12、13位密码子的野生型基因序列和7种热点突变基因序列设计一种检测试剂盒，所述的KRAS基因突变具体详见表1：
表1：KRAS基因第12、13位密码子的7种热点突变
COSMIC 氨基酸变化 氨基酸变化 碱基变化
516 G12C Gly12Cys GGT>TGT
517 G12S Gly12Ser GGT>AGT
518 G12R Gly12Arg GGT>CGT
520 G12V Gly12Val GGT>GTT
521 G12D Gly12Asp GGT>GAT
522 G12A Gly12Ala GGT>GCT
532 G13D Gly13Asp GGC>GAC
本发明提出的技术方案为：
一种检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒，包括针对KRAS基因的以下7个热点突变位点而设计的特异性PCR引物和特异性TaqMan探针：
(1)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为T的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12C-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(2)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12S-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(3)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为C的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12R-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(4)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为T的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12V-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(5)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12D-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(6)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为C的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12A-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(7)针对KRAS基因第13位密码子第2位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G13D-F：TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(8)与目标核酸KRAS杂交的特异性TaqMan探针，其序列如SEQ ID NO：9所示，所述特异性TaqMan探针的序列及其修饰如下：
KRAS-Probe：FAM-AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ1。
上述的试剂盒，优选的，还包括特异性扩增内参基因ACTB基因的PCR内控引物和特异性检测ACTB基因的内控探针：
(9)以ACTB基因作为扩增模板的一对PCR内控引物，其序列分别如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示：
ACTB-F：AGTGTGACATGGTGTATCTCTGCCT；
ACTB-R：AGAGGCGTACAGGGATAGCACA；
(10)以ACTB基因作为杂交对象的一条内控探针，其序列如SEQ ID NO：12所示，所述内控探针的序列及其修饰如下：
ACTB-Probe：VIC-ACAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCC-BHQ1。
上述的试剂盒，优选的，还包括与目标核酸野生型基因进行杂交的阻滞剂探针，其序列如SEQ ID NO：13所示，所述阻滞剂探针的序列及其修饰如下：
KRAS-LNA-Blocker：TGGAGCTGGTGGCGTAGGC-Pho，其中标记下划线的碱基进行锁核酸化修饰，所述-Pho表示进行磷酸化修饰。
上述的试剂盒，优选的，还包括以KRAS基因作为扩增模板的一对PCR外控引物，其序列分别如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-EC-F：ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT。
上述的试剂盒，优选的，还包括Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg2+、5×PCR缓冲液、PCR增强剂和二甲基亚枫。
试剂盒其他组分：
本发明所述的试剂盒中还可包含其它配合所述探针和/或引物的检测试剂。例如当该试剂盒是一种荧光PCR试剂盒时，其中还可包括特异性扩增待测基因的非突变位点引物对，以及PCR缓冲液等试剂。
所述的试剂盒中还可包括说明所述的探针的使用方法的使用说明书，以用于指导本领域技术人员正确地使用。
利用本发明所述的试剂盒，可以非诊断性地检测KRAS基因具体某位点突变，具体过程为：以经过Sanger测序法确认的样本，采用试剂盒与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因样本的KRAS基因具体某位点突变情况。
基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述试剂盒在检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的应用，以KRAS基因第12位和第13位密码子的7种突变为检测对象，通过优化引物探针组合，将荧光定量PCR技术(TaqMan探针法)与经过锁核苷酸(LNA)修饰的阻滞探针技术相结合，从而实现在外周血样品中快速准确、简单地检测7种突变，检测突变的能力高达0.1％～0.5％。
上述的应用，优选的，野生型及其他7种突变型以经过基因工程构建的质粒作为模板，建立荧光PCR检测KRAS基因7种突变的反应体系并用于KRAS基因突变的快速检测，采用所述试剂盒检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的具体方法，包括如下步骤：
S1：待测样本处理和模板DNA提取；
S2：进行荧光PCR扩增；
S3：检测荧光信号，以达到设定阈值时所需要的Ct值作为结果判断的标准，鉴定KRAS基因是否发生突变。
所述步骤S1中，样本适用范围包括血液、血浆等标本。
优选的，所述荧光PCR扩增的反应体系中，每50μL荧光PCR扩增反应体系中含有：Taq酶和UNG酶共2个单位，l0mM的dNTPs和2.5mM的dUTP共0.4μL，100mM的Mg2+0.75μL，5×PCR缓冲液10μL，10μM的各条引物序列1～2μL，10μM的各条探针序列3～4μL，LNA阻滞剂1～2μL，待测样本DNA模板5μL，PCR增强剂2μL，二甲基亚枫1.25μL，以及余量的水。
更优选的，所述荧光PCR扩增的反应条件为：
第一阶段，95℃5min，1个循环；
第二阶段，95℃15s，60℃30s，6个循环；
第三阶段，95℃15s，70℃30s，77℃10s，60℃20s，72℃35s，44个循环；其中，72℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光；
第四阶段，40℃30s，1个循环。
更优选的，在荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号的Ct值，具体是采用荧光PCR扩增仪在退火阶段(第三阶段)收集荧光，反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，样本扩增得到的Ct值为突变检测Ct值，内控引物扩增得到的Ct值为质控检测Ct值，根据△Ct值＝突变检测Ct值-质控检测Ct值的公式计算△Ct值，并进行结果判读，当△Ct值≤4为发生突变的阳性结果，当△Ct值＞4为没有发生突变的阴性结果。
下面对本发明作进一步说明：
本发明将荧光定量PCR技术(TaqMan探针法)与经过锁核苷酸(LNA)修饰的阻滞探针技术相结合，发展了一种可以高效检测基因突变的荧光PCR方法，将该发明用于检测人KRAS基因第12和第13位密码子发生的突变，分别采用针对其不同突变方式设计的引物及特定设计的锁核苷酸修饰的阻滞探针对待测样品进行检测，并对PCR程序进行了改良。在特定的温度下，阻滞探针与野生型样品DNA结合使其无法得到扩增，而突变型样品则发生解链并与特异性的引物结合退火，随后只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物，发出荧光信号从而被检测到。
在普通的PCR反应过程中，当温度升至95℃时，DNA双链会解开形成单链，随后温度下降至55-60℃时，引物会退火并在特定位置与模板DNA结合，在温度继续升至72℃后，聚合酶开始DNA合成，多次重复这个过程就可以得到大量的目的基因片段。
特别地，在检测KRAS基因突变的过程中，野生型DNA占据绝大多数，而突变形式的DNA比例极低，当DNA单链退火形成双链时，突变DNA会与野生型DNA形成杂合形式的双链，这种杂合链在突变位置的碱基是不匹配的，因此其Tm值相比纯合双链会降低。针对此种Tm值的差异，我们对PCR程序进行了优化。
我们设计了一种3'端被磷酸化的阻滞剂探针，该探针仅与野生型DNA结合并可以阻止其扩增。另外，我们对该阻滞剂探针的个别碱基进行了锁核苷酸(LNA)修饰，该修饰可以提高探针的Tm值，增强与DNA的结合力。
通过实验，我们确定了阻滞剂探针与突变DNA形成的杂合双链的Tm值，并据此设定一个温度Tc。在温度为Tc时，只有含有突变的杂合DNA会发生解链，而阻滞剂与野生型DNA形成的纯合DNA则仍保持双链状态(其Tm较Tc要高)；随后温度降低，特异性引物退火并与带有突变的DNA结合，在聚合酶的作用下进行DNA合成，完成PCR反应发出荧光并被检测到。
在获得了本发明的探针后，为了便于使用和商品化，可以将所述的探针集成于一个试剂盒中。因此，本发明还包括了包含本发明的探针的试剂盒。例如当该试剂盒是一种荧光PCR试剂盒时，其中还可包括特异性扩增KRAS基因的特定突变区域的引物对，用于扩增内参基因的引物和探针，以及PCR缓冲液等试剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的试剂盒，能够用于外周血游离DNA样本中的人KRAS基因突变的快速检测，操作快速，方法简便，检测灵敏度高，特异性好，结果准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为样本中不含KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变的野生型样本的荧光PCR扩增曲线；
图2为样本中含有KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变的荧光PCR扩增曲线；
图3为灵敏度分析实验结果图；
图4为特异性分析实验结果；
图5为重复性分析实验结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例：
一种本发明的检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒，包括针对KRAS基因的以下7个热点突变位点而设计的特异性PCR引物和特异性TaqMan探针：
(1)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为T的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12C-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(2)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12S-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(3)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为C的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12R-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(4)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为T的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12V-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(5)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12D-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(6)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为C的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12A-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(7)针对KRAS基因第13位密码子第2位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G13D-F：TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(8)与目标核酸KRAS杂交的特异性TaqMan探针，其序列如SEQ ID NO：9所示，所述特异性TaqMan探针的序列及其修饰如下：
KRAS-Probe：FAM-AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ1。
上述的试剂盒，优选的，还包括特异性扩增内参基因ACTB基因的PCR内控引物和特异性检测ACTB基因的内控探针：
(9)以ACTB基因作为扩增模板的一对PCR内控引物，其序列分别如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示：
ACTB-F：AGTGTGACATGGTGTATCTCTGCCT；
ACTB-R：AGAGGCGTACAGGGATAGCACA；
(10)以ACTB基因作为杂交对象的一条内控探针，其序列如SEQ ID NO：12所示，所述内控探针的序列及其修饰如下：
ACTB-Probe：VIC-ACAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCC-BHQ1；
(11)与目标核酸野生型基因进行杂交的阻滞剂探针，其序列如SEQ ID NO：13所示，所述阻滞剂探针的序列及其修饰如下：
KRAS-LNA-Blocker：TGGAGCTGGTGGCGTAGGC-Pho，其中标记下划线的碱基进行锁核酸化修饰，所述-Pho表示进行磷酸化修饰；
(12)以KRAS基因作为扩增模板的一对PCR外控引物，其序列分别如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-EC-F：ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT。
以KRAS基因第12位和第13位密码子的7种突变为检测对象，通过优化引物探针组合，将荧光定量PCR技术(TaqMan探针法)与经过锁核苷酸(LNA)修饰的阻滞探针技术相结合，从而实现在外周血样品中快速准确、简单地检测7种突变，检测突变的能力高达0.1％～0.5％。
本实施例的试剂盒用于KRAS基因突变检测的应用：
以检测临床采集的血浆样本KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变为例。根据Cosmic数据公布的KRAS基因12外显子的野生型基因序列和突变基因序列比较分析，设计一对引物和探针分别为KRAS-G12D-F、KRAS-G12D-R、KRAS-Probe。根据Cosmic数据公布的ACTB基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为：ACTB-F、ACTB-R、ACTB-Probe。
利用上述试剂盒的荧光定量PCR体系检测临床采集的血浆样本KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变的方法包括如下步骤：
1.样本处理和模板提取
1)用EDTA抗凝采血管采集血液，4℃离心装有血样的采血管12min，转速2000rpm，随后将上清转移至干净的1.5ml离心管，4℃离心8min，转速10000rpm；
2)将上清取2ml转移至15ml离心管内，加入3ml裂解液GHH，200μL蛋白酶K，30μL磁珠，以及1μL Carrier RNA，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10s，使磁珠和核酸充分结合；
3)将离心管置于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管，加入750μL缓冲液GDF，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管；
4)加入750μL漂洗液PWG，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管，重复加入PWG溶液步骤一次；
5)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min，加入65μL洗脱缓冲液TBC，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56℃孵育5min，将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于适当条件保存，即得到待测样本DNA模板。
2.采用本实施例的试剂盒对待测样本DNA模板进行荧光PCR扩增，其反应体系为：
荧光PCR扩增的反应条件是：
第一阶段，95℃5min，1个循环；
第二阶段，95℃15s，60℃30s，6个循环；
第三阶段，95℃15s，70℃30s，77℃10s，60℃20s，72℃35s，44个循环；其中，72℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光；
第四阶段，40℃30s，1个循环。
反应过程中检测荧光信号的Ct值，是采用ABI 7500荧光PCR扩增仪退火阶段(第三阶段)收集荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳性质控)。反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，样本扩增得到的Ct值为突变检测Ct值，内控引物扩增得到的Ct值为质控检测Ct值，计算△Ct值(△Ct值＝突变检测Ct值-质控检测Ct值)并进行结果判读，当△Ct值≤4为发生突变的阳性结果，当△Ct值＞4为没有发生突变的阴性结果。
图1为样本中不含KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变的野生型样本的荧光PCR扩增曲线；图2为样本中含有KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变的荧光PCR扩增曲线。
共采收集100份临床血液样本，用本实施例的试剂盒进行荧光PCR检测，同时采用传统的测序法进行验证。本实施例的荧光PCR方法与传统测序检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统测序方法。
3.灵敏度分析：
以合成的含有KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变的质粒DNA与合成的含有KRAS野生型序列的质粒DNA进行不同比例的配比，在总浓度为1500拷贝数的条件下，本发明的PCR荧光检测方法最低可检测1％突变率，绝对拷贝数为10-15copies，见图3。
4.特异性分析：
以合成的含有KRAS基因GGT>GAT(G12D)突变的质粒DNA做对照，将合成的含有KRAS基因GGT>TGT(G12C)突变、GGT>AGT(G12S)突变、GGT>CGT(G12R)突变、GGT>GTT(G12V)突变、GGT>GCT(G12A)突变、GGC>GAC(G13D)突变的六种质粒DNA进行混合，随后进行GGT>GAT(G12D)突变的检测。如图4的结果显示，其他六种突变的混合质粒DNA没有检测到GGT>GAT(G12D)突变，而对照的GGT>GAT(G12D)突变质粒检测结果为GGT>GAT(G12D)突变阳性。
5.重复性实验
分别取10例经传统测序方法验证为阳性和阴性的样品，重复10次进行荧光PCR扩增，如图5所示，10次Ct值相差不大于0.2个循环。
以上实验证明，本发明的试剂盒，能够用于外周血游离DNA样本中的人KRAS基因突变的快速检测，操作快速，方法简便，检测灵敏度高，特异性好，结果准确。
序列表
<110> 湖南艾佳生物科技股份有限公司
<120> 一种检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atataaactt gtggtagttg gagctt 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atataaactt gtggtagttg gagcta 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atataaactt gtggtagttg gagctc 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atataaactt gtggtagttg gagctgt 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atataaactt gtggtagttg gagctga 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atataaactt gtggtagttg gagctgc 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taaacttgtg gtagttggag ctggtga 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctctattgt tggatcatat tcgt 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agctgtatcg tcaaggcact cttgc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtgtgacat ggtgtatctc tgcct 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agaggcgtac agggatagca ca 22
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acagatcatg tttgagacct tcaacaccc 29
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggagctggt ggcgtaggc 19
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ataaacttgt ggtagttgga gct 23

Claims (10)

1.一种检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，包括针对KRAS基因的以下7个热点突变位点而设计的特异性PCR引物和特异性TaqMan探针：
(1)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为T的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12C-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(2)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12S-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(3)针对KRAS基因第12位密码子第1位核苷酸由G突变为C的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12R-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(4)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为T的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12V-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(5)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12D-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(6)针对KRAS基因第12位密码子第2位核苷酸由G突变为C的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G12A-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(7)针对KRAS基因第13位密码子第2位核苷酸由G突变为A的一对上下游特异性PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-G13D-F：TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGA；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；
(8)与目标核酸KRAS杂交的特异性TaqMan探针，其序列如SEQ ID NO：9所示，所述特异性TaqMan探针的序列及其修饰如下：
KRAS-Probe：FAM-AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括特异性扩增内参基因ACTB基因的PCR内控引物和特异性检测ACTB基因的内控探针：
(9)以ACTB基因作为扩增模板的一对PCR内控引物，其序列分别如SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示：
ACTB-F：AGTGTGACATGGTGTATCTCTGCCT；
ACTB-R：AGAGGCGTACAGGGATAGCACA；
(10)以ACTB基因作为杂交对象的一条内控探针，其序列如SEQ ID NO：12所示，所述内控探针的序列及其修饰如下：
ACTB-Probe：VIC-ACAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCC-BHQ1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括与目标核酸野生型基因进行杂交的阻滞剂探针，其序列如SEQ ID NO：13所示，所述阻滞剂探针的序列及其修饰如下：
KRAS-LNA-Blocker：TGGAGCTGGTGGCGTAGGC-Pho，其中标记下划线的碱基进行锁核酸化修饰，所述-Pho表示进行磷酸化修饰。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括以KRAS基因作为扩增模板的一对PCR外控引物，其序列分别如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：8所示：
KRAS-EC-F：ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT；
KRAS-R：CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg2+、5×PCR缓冲液、PCR增强剂和二甲基亚枫。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的试剂盒在检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用所述试剂盒检测外周血游离DNA中KRAS基因突变的方法，包括如下步骤：
S1：待测样本处理和模板DNA提取；
S2：进行荧光PCR扩增；
S3：检测荧光信号，以达到设定阈值时所需要的Ct值作为结果判断的标准，鉴定KRAS基因是否发生突变。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述荧光PCR扩增的反应体系中，每50μL荧光PCR扩增反应体系中含有：Taq酶和UNG酶共2个单位，l0mM的dNTPs和2.5mM的dUTP共0.4μL，100mM的Mg2+0.75μL，5×PCR缓冲液10μL，10μM的各条引物序列1～2μL，10μM的各条探针序列3～4μL，LNA阻滞剂1～2μL，待测样本DNA模板5μL，PCR增强剂2μL，二甲基亚枫1.25μL，以及余量的水。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述荧光PCR扩增的反应条件为：
第一阶段，95℃5min，1个循环；
第二阶段，95℃15s，60℃30s，6个循环；
第三阶段，95℃15s，70℃30s，77℃10s，60℃20s，72℃35s，44个循环；其中，72℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光；
第四阶段，40℃30s，1个循环。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的应用，其特征在于，在荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号的Ct值，具体是采用荧光PCR扩增仪在退火阶段收集荧光，反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，样本扩增得到的Ct值为突变检测Ct值，内控引物扩增得到的Ct值为质控检测Ct值，根据△Ct值＝突变检测Ct值-质控检测Ct值的公式计算△Ct值，并进行结果判读，当△Ct值≤4为发生突变的阳性结果，当△Ct值＞4为没有发生突变的阴性结果。
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