CN101875971A - Braf基因突变的快速检测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQID No：1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列。本发明的试剂盒采用饱和探针和高分辨率溶解曲线分析技术，完成对样品基因型的判断，从而为多种肿瘤包括甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、肠癌、卵巢癌等的选择用药和诊断提供指导。

Description

BRAF基因突变的快速检测

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种BRAF基因突变的高灵敏快速检测。

背景技术

BRAF基因属于RAF家族成员，位于染色体7q34，大小为190Kb，含有七个转录区，包括18个外显子，编码一个67KD-99KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞的增殖、分化和凋亡。BRAF基因可在甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中发生突变。2002年Davie等在66％的恶性黑色素瘤和一系列的其它肿瘤中检测到BRAF基因体细胞突变，该突变主要见于BRAF基因11和15外显子的激酶结构域内，80％以上的突变都是15外显子1799位核苷酸上的单碱基颠换，致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。之后，不同国家和地域的学者在甲状腺乳头状癌(papillarythyroid cancer，PTC)中检测到了BRAF^v6ooE突变。由于该突变中在599位的苏氨酸活化性磷酸化位点附近插入了一个负性调节残基，可模拟活化区域的磷酸化过程，使BRAF基因与维持其失活态的ATP结合环活化区的联系中断，从而级联式激活，并通过RAS-RAF-MEK-MAPK激酶信号传导通路而引起细胞的异常增殖和分化，最终导致肿瘤的形成。

B-Raf基因突变被发现存在于黑色素瘤、大肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤中。本检测试剂盒用于辅助临床医生筛选出病患B-Raf基因突变情况。为临床医生用药提供指导和依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。

检测BRAF基因突变，对判断肿瘤的发生和发展后以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义。(1)正常人血检中出现BRAF基因异常，提示存在肿瘤易感性；(2)大量研究表明，无BRAF基因突变的结直肠癌等肿瘤患者，经帕尼单抗和爱比妥靶向药物治疗疗效明显，因此，通过检测BRAF基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。

恶性肿瘤病人血浆或血清中存在高水平的循环DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细胞。新近研究已经从癌症患者血浆或血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变，表明这是检测肿瘤相关基因改变的一条新途径。由于取材方便，血浆分子检测迅速成为肿瘤研究的一个热点。目前，血浆突变检测可以作为肿瘤分子诊断的一种新方法。

由于BRAF基因的突变对如甲状腺乳头状癌等肿瘤的相关性，所以检测BRAF的突变基因对及早诊断和治疗癌症有很大的临床意义。本发明主要是利用高分辨率溶解曲线分析来进行BRAF基因突变的高灵敏快速检测。

本试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRAF突变，协助临床医生实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。

目前普遍应用的BRAF基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序：该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法不适用于临床要求。

临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免污染的BRAF基因突变检测技术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性和高灵敏度的要求。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便和有效避免污染的检测BRAF基因突变的试剂盒，解决了现有技术中进行BRAF基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、精确度低和污染等问题，尤其提供了除组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测

本发明提供的技术方案是：

一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列。

优选的，所述连续核苷酸序列所述连续核苷酸序列为SEQ ID No：3～20序列之一的正向或反向核苷酸序列。

优选的，所述引物为SEQ ID No：3～20序列之一的正向引物或反向引物。

优选的，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液	终浓度1～10×；
		dNTPs	0.1～0.5mM；
引物序列	终浓度为0.1～0.5μM；
		模板DNA	0.1～1.5ng/μL；
TaqDNA聚合酶	0.01～0.10U/μL；
		MgCl2	终浓度为1～3mM；
荧光染料	1～3×。

优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液	终浓度1～5×；
		dNTPs	0.2～0.3mM；
引物序列	终浓度为0.2～0.3M；
		模板DNA	0.5～1.0ng/μL；
TaqDNA聚合酶	0.03～0.06U/μL；
		MgCl2	终浓度为2～3mM；
荧光染料	1～2×。

优选的，所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料，ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

本发明的另一目的在于一种检测BRAF基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取包括含有BRAF基因的第十一外显子BRAF11或第十五外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；

(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRAF基因进行PCR扩增；

(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点检测。

优选的，所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变组织中提取，进行PCR反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，40～50个循环。

优选的，所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶解曲线法的条件为：92～97℃变性1min；40℃复性1min；然后初始溶解温度60℃开始程序升温溶解至95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30～50次每秒。

本发明的又一目的在于提供一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的BRAF基因突变检测方面的应用，本试剂盒选用各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。

BRAF基因序列如SEQ ID No：21所示，所述的突变常发生在BRAF的第11个外显子的突变和发生在BRAF的第15个外显子的突变：

BRAF基因外显子	突变类型	突变位点核苷酸	突变编码子
				外显子11		G463G465G468
外显子15	错义突变(missense)	1799T＞A1796T＞A	V600EV599E

本发明提供了一种检测BRAF基因突变的试剂盒，适用于BRAF第11外显子G463、G465、G468的突变和第15个外显子1799T＞A的突变，所述的试剂盒包括以下试剂：阴性对照DNA、用于扩增样本DNA中BRAF基因的引物、用于扩增样本DNA中BRAF基因的PCR反应试剂。

较佳地，所述试剂盒还包含反应所需的buffer、dNTP、引物、荧光染料、MgCl₂、Taq酶。

所述的PCR引物，用化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端10-50个序列的模板，以及与之配对的反向序列。所述的PCR引物，下表所示的引物对：

所述的PCR引物，用于扩增BRAF基因靶序列，优选为下表所示的引物对，BRAF的第11个外显子的序列SEQ ID No：1；CGAGTGATGATTGGGAGATTCCTGATGGGCAGATTACAGTGGGACAAAGAATTGGATCTGGATCATTTGGAACAGTCTACAAGGGAAAGTGGCATGGTAAGTATGTAATGTGGTGACA；BRAF的第15个外显子的序列SEQ ID No：2；TTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATT。

所述的阴性对照DNA，用常规方法从正常人组织中提取获得的DNA。所述的正常人组织，包括外周血、体液、腔道的脱落物，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。

所述的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、MgCl2、Taq酶、DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括三羟甲基氨基甲烷盐(Tris·Cl)，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；酸碱度(pH值)8.0-9.0(20℃)。所述的PCR缓冲液，，包括10x缓冲液，终浓度15mM的氯化镁，终pH 8.7。所述的dNTP混合液，包括10mMdATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液。所述的荧光染料，包括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYTO 9染料。所述的MgCl₂为10-30mM MgCl₂。所述的MgCl₂为25mM MgCl₂。

所述的Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP，延伸速率2-4kb/min at 72℃，存储缓冲液10-40mM Tris·cl，50-200mM氯化钾(KCL)，0-5.0mM二硫苏糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2.0％(V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40，0-2.0％(V/V)吐温20(Tween 20)，30-70％(v/v)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer)：pH 7.0-10.0(20℃)

所述的存储缓冲液，包括终浓度为20mM Tris·cl、100mM KCL、1mM DTT、0.1mM EDTA、0.5％(V/V)Nonidet P-40、0.5％(V/V)Tween 20、50％glycerol(v/v)。稳定剂的终pH值为9.0。

所述的DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的DNA。

所述的患者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、粪便、病变组织、肿瘤组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。

利用试剂盒进行检测时，包括PCR扩增和HRM程序，其反应条件(PCR反应条件和HRM的条件)如下表所示：

更为优选的，

最为优选的，

本发明在另一方面，提供了一种检测BRAF基因突变的方法，该方法是检测来自于待测个体样本中的BRAF基因是否存在突变位点，其突变位置分别是第11外显子G463、G465、G468点突变和第15外显子V600E(T1799A)点突变。

其中，所述的检测方法包括如下步骤：

(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本

(2)用上述试剂盒中的阴性DNA，引物及试剂，以第(1)步中提取的DNA为模板进行实时荧光定量PCR

(3)PCR反应条件及HRM条件见下表：

进行数据分析，运行溶解曲线观察峰图是否呈光滑的单峰，再运行Genescan自动分析，通过与阴性进行对比来判断样本是否发生了待检测的BRAF位点的突变。

所述的方法中，通过使用所述的试剂盒、DNA模板，按所述的反应条件在荧光定量PCR仪上进行序列扩增、运行溶解曲线，进行数据分析，得到分型的图谱。所述的荧光定量PCR仪，包括LightCyeler 480(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、ABI7500(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、ABI7900(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、QiagenRotor-Gene 6000(德国Qiagen公司，杜塞尔多夫，德国)、Idaho LightScanner(美国Idaho公司，爱达荷州，美国)。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照，加入MIX，进行PCR反应，配套的基因分型软件即可自动区分野生型与突变型。采用的阴性对照样品可以包括BRAF-463和BRAF-1799阴性对照样品。

本发明的试剂盒可以提供与肿瘤用药选择和诊断相关的BRAF基因突变的快速检测，所述的肿瘤，包括胰腺癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、急性白血病、结直肠癌、甲状腺乳头状癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴细胞癌。较为优选的，所述的肿瘤包括胰腺癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、急性白血病、结直肠癌和甲状腺乳头状癌。

检测BRAF基因突变的用于PCR反应的试剂盒，适用于BRAF第十一外显子及第十五外显子突变的检测。本发明检测BRAF基因突变时，所述引物用于扩增BRAF基因靶向序列，包括以下引物对：(1)第一引物序列含有BRAF-463的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有BRAF-463的至少15个连续的核苷酸；(2)第一引物序列含有BRAF-1799的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有BRAF-1799的至少15个连续的核苷酸。

优选的，本发明的检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本

(2)用上述的试剂盒和引物，以步骤(1)提取的核酸、阴性对照为模板，进行实时定量PCR检测

(3)分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，与阴性对照参比，判断样本DNA中KRAS基因的各位点是否突变。

在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲液(buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl₂、Taq酶。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。

引物设计遵循以下原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15～30碱基之间。④G+C含量在40％～60％之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

引物设计的软件有Primer Premier 5，Beacon Designer 7。

本发明所用引物由上海英潍捷基公司通过亚磷酰胺三酯法合成，亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。具体方法如下：1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引物。

本发明中使用的引物序列选自采用以下序列之一的任意引物：

SEQ ID No：3	5’-GATTTGGTAGACG-3’
		SEQ ID No：4	5’-ACTATTTCCTTTG-3’
SEQ ID No：5	5’-GAAAACACTTGGTAGA-3’
		SEQ ID No：6	5’-AAAGAAACTTTTGGAG-3’
SEQ ID No：7	5’-TCAACTTGGTAGACGGGACTC-3’
		SEQ ID No：8	5’-CAAGTCACCACATTACATACTTACC-3’
SEQ ID No：9	5’-CGAAGGTTTTCTTTTTCTGTTTGGCTTGAC-3’
		SEQ ID No：10	5’-CTGCAGTTTTTATTTCCCATAATTTTTGTT-3’
SEQ ID No：11	5’-ACAACTTTTTTACTGTTTTTATCAAGAAAACACTTG-3’
		SEQ ID No：12	5’-CTTATATCCTATTATGACTTGTCACAATGTCACCAC-3’
SEQ ID No：13	5’-TTGTTAGACATAC-3’
		SEQ ID No：14	5’-AGCTCTTACCATC-3’

SEQ ID No：3	5’-GATTTGGTAGACG-3’
		SEQ ID No：15	5’-TTATACCTAAACTCTTC-3’
SEQ ID No：16	5’-ACGTAGTAACTCAGCAG-3’
		SEQ ID No：17	5’-TGATTTCCTTTACTTACTACACCTCAG-3’
SEQ ID No：18	5’-TTAAATAGCCTCAATTCTTACCATCC-3’
		SEQ ID No：19	5’-GGACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTG-3’
SEQ ID No：20	5’-CAGCACTGAAACTGGTTTCAAAATATTCGT-3’

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

1.高通量：1次可同时检测该突变位点10-384个样本

2.高敏度：在肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1％的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。本发明试剂盒由于灵敏度非常高，可以使用在各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。这采用现有技术中的检测方法是不可能实现的。

3.特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性高达100％。直接未知杂合突变鉴定准确性100％，特异性100％。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；

图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图；

图3为本发明实施例阴性对照DNA的电泳图；

图4为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；

图5为本发明实施例不同活性的酶进行PCR扩增的电泳图；

图6为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的溶解曲线图；

图7为本发明实施例不同MgCl₂终浓度进行PCR-HRM的溶解曲线图和得到的PCR产物电泳图；

图8为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；

图9为本发明实施例灵敏度实验图；

图10为本发明实施例准确度实验图；

图11为本发明应用例甲状腺乳头状癌患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。

图12为本发明应用例正常人血浆标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；

图13为本发明应用例甲状腺乳头状癌患者血浆模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。

图14为本发明应用例甲状腺乳头状癌患者血清模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。

图15为本发明应用例黑色素瘤患者血清模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1：引物的设计、合成及验证

按照BRAF突变第11外显子和第15外显子的序列，进行引物设计。对引物的不同序列长度进行扩增比较，筛选特异性好的引物。

引物片段大小的引物进行PCR扩增的特异性结果图1所示，图1a为5-9bp的引物PCR扩增的电泳图，图1b为13-16bp的引物PCR扩增的电泳图，图1c为18-24bp的引物PCR扩增的电泳图，图1d为25-29bp的引物PCR扩增的电泳图，图1e为30-37bp的引物PCR扩增的电泳图，图1f为39-45bp的引物PCR扩增的电泳图。

表1不同引物大小的PCR扩展结果

引物(bp)	5-9	13-16	18-24	25-29	30-37	39-45
							特异性	特异性很差	特异性差	特异性好	特异性较好	特异性差	特异性很差

根据表1结果和图1所示，可知最佳引物为18-24bp大小的引物。

引物合成：上海Invtrogen公司合成

引物验证：用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对合成的引物进行鉴定，包括以下步骤：

使用加有7M尿素的16％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃，2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，约2-3小时后，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色；得到电泳图如图2所示。

实施例2阴性对照DNA的制作

阴性对照DNA的提取：

1、抽取正常人外周血2.5ml于枸橼酸钠(1∶9)抗凝管中。

2、抗凝管中的血8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。

3、血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)，

4.DNA提取：将抗凝血8000rpm离心5min，吸出上层的血浆，用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。

5.定量：使用Nano 1000定量仪，测定DNA浓度。合格指标：1，符合OD值A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0要求之间，再将DNA定量稀释到10ng/ul。

6.电泳鉴定：提取的DNA用1.0％的琼脂糖凝胶120V电泳25min，电泳条带比较单一，比较纯，电泳结果如图3；测序鉴定：将提取的DNA进行PCR扩增后送英潍捷基测序，测序结果如图4。上述鉴定结果表明，按上述方法所获得的DNA样品符合阴性对照的要求。

实施例3：肿瘤组织DNA的提取

样本采集：

取新鲜组织块50～100mg以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在0.5cm以下，放入装有1.5ml体积RNAlater的冻存管中，充分混匀。(30分钟内完成)

室温下放置1-2小时，4℃冰箱过夜，第二天转至-20℃长期保存。

DNA提取：

使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。

DNA纯化：(若提取的DNA，OD值A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0，没有在标准范围内，则需要此步骤)

加入等体积的氯仿-异戊醇(25∶1)，向下翻转离心管5min以充分混匀，13000rpm离心10min小心吸出上清液至另一1.5ml离心管；

加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇匀，沉淀DNA13000rpm离心3min，轻轻倒去上清液，加入70％乙醇洗一次，13000rpm，离心3min，去上清液，倒置5-10min(倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸管吹打使DNA充分溶解。

实施例4：血液中血浆DNA的提取

抽取病人外周血1-2ml于枸橼酸纳(1∶9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管，吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。

然后进行DNA提取，可以按照如下步骤：血浆用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。

实施例5血液中血清DNA的提取

抽取病人外周血1-2ml至非抗凝的收集管，8000rpm离心5分钟，吸取血清移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。

然后进行DNA提取，可以按照如下步骤：血清用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血清DNA的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。

实施例6石蜡切片组织DNA的提取

刮削5-10μm厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2-3层)。用二甲苯脱蜡后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit(德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作说明提取DNA，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。

实施例7：PCR-HRM条件优化实验

1)热启动Taq酶选择

用不同厂家的酶进行实验，选择活性比较高的酶，结果如下表和图5，图5中1、2、3、4分别为HotStarTaq酶、FastStartTaq酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G快速热启动DNA聚合酶的酶活性检测结果图，根据该图最终确定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活性最高。

表2不同厂家的热启动Taq酶活性

酶的类型	HotStarTaq酶①	FastStartTaq酶②	Taq CE DNAPolymerase③	KAPA2G快速热启动DNA聚合酶④
					厂家	德国Qiagen公司	Roche公司	上海超世生物科技有限公司	KAPABiosystem
活性	活性好	活性好	活性较好	活性较差

2)荧光染料的选择

用不同厂家的染料进行实验，选择结合效果好的染料；实验结果如图6所示，图6中1、2、3、4、5分别为Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo荧光染料的实验结果，据图可知最佳染料为Eva Green和LC Green。

表3不同厂家的染料的荧光结合效果

荧光染料种类	Eva Green①	LC Green②	SYBRGreen③	DAPI④	Flamingo⑤
						厂家	Biotium公司	idaho公司	ABI公司	Roche公司	ABI公司
结合效果	结合效果好	结合效果好	结合效果不好，且会抑制PCR反应	结合效果不好	结合效果不好

染料Eva Green和LC Green的效果最好。

3)PCR条件的优化

在退火温度、Mgcl2浓度两方面PCR条件进行优化调整，结果如表：

表4不同MgCl₂终浓度和退火温度的PCR扩增结果

60℃时，MgCl2浓度为2.0mM，2.5mM的实验图如图7(BRAF-463和BRAF-1799)所示，可以看出，选择退火温度为60℃，Mgcl2终浓度为2.5mM时为最佳的条件。

4)HRM条件优化

HRM条件的优化：溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面调整

表5不同检测荧光次数和起始熔解温度的熔解曲线效果

最佳HRM条件的确定：

温度	时间
		95℃	1min
40℃	1min
		65℃	1s
95℃	每秒检测荧光40次

5)DNA来源样本

分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中进行检测模板DNA，检测结果如下表和图8所示：

表6不同来源的模板DNA检测结果

模板DNA来源	外周血	口腔拭子	组织	石蜡切片
					检测效果	可以检测	可以检测	可以检测	可以检测

图8A～D分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片的检测结果，由图可知，外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。

6)灵敏度实验

用实施例1～5获得的材料和优化的条件，确定检测的灵敏度。实验中，同时放入阴性对照样本、1％突变样本、5％突变样本、10％突变样本、15％突变样本。如图9和表七所示：

如图9所示，经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1％。其他检测方法对照文献Mutation Research 635(2007)105-117的检测方法灵敏度数据，如下表所示，本试剂盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1％。

表7本试剂盒与其它检测方法灵敏度比较

检测方法	检测灵敏度
		RFLP	3-6
SOMA	3
		APEX	3-6
DHPLC	3-12
		TTGE	50
Direct sequencing	50
		HRM	1

如图9所示，本试剂盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1％。

6)HRM检测精度分析

用实施例1～5获得的材料和优化的条件，确定检测的精确度。实验中，用BRAF的引物检测肺癌患者石蜡切片组织，并与直接测序法相比较。如图10所示：

本试剂盒的检测结果如下表：

表8本试剂盒和测序检测对照表

样本编号	HRM	测序	样本编号	HRM	测序
						1	未分型	正常	21	未分型	正常
2	未分型	正常	22	未分型	正常
						3	未分型	正常	23	未分型	正常
4	未分型	正常	24	分型	突变

样本编号	HRM	测序	样本编号	HRM	测序
						5	未分型	正常	25	分型	突变
6	未分型	正常	26	未分型	正常
						7	未分型	正常	27	未分型	正常
8	分型	正常	28	未分型	正常
						9	未分型	正常	29	未分型	正常
10	未分型	正常	30	未分型	正常
						11	分型	突变	31	未分型	正常
12	分型	突变	32	分型	突变
						13	分型	突变	33	未分型	正常
14	未分型	正常	34	未分型	正常
						15	未分型	正常	35	未分型	正常
16	未分型	正常	36	未分型	正常
						17	未分型	正常	37	分型	突变
18	未分型	突变	38	未分型	正常
						19	分型	突变	39	未分型	正常
20	未分型	正常	40	分型	突变

结论：BRAF-1799引物检测40例石蜡组织切片样本实验中，本试剂盒检测出10例样本检测有突变分型，实际测序有9例突变，HRM和测序检测成功率100％，阳性检测出率达测序比较一致性100％，两种方法检测一致率为95％。从检测结果分析，本试剂盒检测突变的灵敏度超过测序。

应用例1甲状腺乳头状癌石蜡切片组织BRAF突变扫描

取甲状腺乳头状癌患者的石蜡切片30例，提取DNA作为模板。

使用仪器：LightCycler^TM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、刮削5-10μm厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2-3层)。

2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit(德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作说明提取DNA

引物序列：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl2)	2.0
MgCl2	0.4
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH2O	13.9

PCR和HRM反应条件：

结果讨论：

用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在甲状腺乳头状癌病人中检出BRAF G463突变的有5例(检出率大约为16.7％)，BRAF1799突变的有10例(检出率大约为33.3％)，图11A、11B为甲状腺乳头状癌病人石蜡切片组织中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图。符合国内外研究报道的甲状腺乳头状瘤中BRAF基因突变的几率。

应用例2甲状腺乳头状癌血浆的基因扫描

抽取病人(共20例)外周血1-2ml于枸橼酸钠(1∶9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管，吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞。提取血浆中的DNA作为模板。

使用仪器：LightCycler^TM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血浆。

2、用Qiagen Blood Mini kit(德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明提取血浆DNA。

引物序列：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl2)	2.0
MgCl2	0.4
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH2O	13.9

PCR和HRM反应条件：

得到如图12A、12B为正常人样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图以及如图13A、13B为甲状腺乳头状癌患者样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图。

结果讨论：用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在甲状腺乳头状癌病人中检出BRAF G463突变的有3例(检出率大约为15％)，BRAF1799突变的有5例(检出率大约为25％)。符合国内外研究报道的甲状腺乳头状瘤中BRAF基因突变的几率。

应用例3甲状腺乳头状癌血清BRAF突变检测

抽取病人(20例)外周血1-2ml于非抗凝管中，吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟，分离血清和细胞。血清小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞。提取血清中的DNA作为模板。

使用仪器：LightCycler^TM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。

2、用Qiagen Blood Mini kit(德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明提取血清DNA。

引物序列：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl2)	2.0
MgCl2	0.4

反应体系组分	加入的体积(μL)
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH2O	13.9

PCR和HRM反应条件：

结果讨论：

用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在甲状腺乳头状癌病人中检出BRAF G463突变的有3例(检出率大约为15％)，BRAF1799突变的有5例(检出率大约为25％)，图14A、14B为样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图。符合国内外研究报道的甲状腺乳头状瘤中BRAF基因突变的几率。

应用例4黑色素瘤血清BRAF突变扫描

抽取病人(20例)外周血1-2ml于非抗凝管中，吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟，分离血清和细胞。血清小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞。提取血清中的DNA作为模板。

使用仪器：

Light Cycler^TM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。

2、用Qiagen Blood Mini kit(德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明提取血清DNA。

引物序列：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl2)	2.0
MgCl2	0.4
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH2O	13.9

PCR和HRM反应条件：

结果讨论：用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在黑色素瘤人中检出BRAF G463突变的有8例(检出率大约为40％)，BRAF1799突变的有10例(检出率大约为50％)，图15A、15B为样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图。。符合国内外研究报道的黑色素瘤中BRAF基因突变的几率。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州工业园区为真生物医药科技有限公司

<120>BRAF基因突变的快速检测

<130>

<160>21

<170>PATENTIN VERSION 3.5

 

<210>1

<211>118

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

 

<400>1

cgagtgatga ttgggagatt cctgatgggc agattacagt gggacaaaga attggatctg    60

gatcatttgg aacagtctac aagggaaagt ggcatggtaa gtatgtaatg tggtgaca     118

 

<210>2

<211>161

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

 

<400>2

tttcctttac ttactacacc tcagatatat ttcttcatga agacctcaca gtaaaaatag    60

gtgattttgg tctagctaca gtgaaatctc gatggagtgg gtcccatcag tttgaacagt   120

tgtctggatc cattttgtgg atggtaagaa ttgaggctat t                       161

 

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>引物

 

<400>3

attcctgatg ggcagatt                                                 18

 

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>引物

 

<400>4

tcaccacatt acatactt                                                 18

 

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>5

cttgactttt ttactgttt                                                19

 

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>6

ccatgccact ttcccttgt                                       19

 

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>引物

 

<400>7

gtgatgattg ggagattcct gatg                                 24

 

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>引物

 

<400>8

acttaccatg ccactttccc ttgt                                 24

 

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>9

cgagtgatga ttgggagatt c                                    21

 

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>10

tgtcaccaca ttacatactt acc                                  23

 

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>11

tactgttttc ctttacttac t                                    21

 

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>12

tagcctcaat tcttaccatc c                                    21

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>13

tttcctttac ttactacacc                                  20

 

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>14

tcaattctta ccatccacaa                                  20

 

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>15

ttcataatgc ttgctctgat agg                              23

 

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>16

aactgttcaa actgatggga ccc                              23

 

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>17

ctgttttcct ttacttact                                   19

 

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>18

gcctcaattc ttaccatcc                                   19

 

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>引物

 

<400>19

tttcctttac ttactacacc tcag                                            24

 

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>20

aatagcctca attcttacca tcc                                             23

 

<210>21

<211>2163

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

 

<400>21

catcacacac tgggacctgt catggggtag ggggagggga gagggacagc attaagagaa     60

atacctaatg taaatgacaa gttaatgggt gcagcacacc aacatggcac atgtatacat    120

aagtaacaaa cctgcaagtt gtgcacatgt accctagaac ttaaagtata ataaaataaa    180

aaataaaaat aaattttttc catcctaata ttgacttcag tcttaaattt aagttttgta    240

ttttaagagt catactttta actactattc ttccagagaa tttttcttaa ggggatctct    300

tcctgtatcc ctctcaggca taaggtaatg tacttagggt gaaacataag gttttctttt    360

tctgtttggc ttgacttgac ttttttactg tttttatcaa gaaaacactt ggtagacggg    420

actcgagtga tgattgggag attcctgatg ggcagattac agtgggacaa agaattggat    480

ctggatcatt tggaacagtc tacaagggaa agtggcatgg taagtatgta atgtggtgac    540

attgtgacaa gtcataatag gatatgttta acaactttta ttttgtaaaa aatatcatca    600

aaggaaatat tcactgttcg catcaataaa ctattttgat tagtttcagg actcctccaa    660

aagtttctaa caaaaattat gggaaataaa aactgttcac agcagtcggg actcctacca    720

ttttattaca gtaataattt ttaaagggga attcctccag gttaactagt cctcaaaagg    780

attttatttt cttttagagt ctttcagctg ataattttat ttgtattata agtcacaagt    840

aaacatatta aaaatgtact taatggctgg gcgcagtggc ttatgcctgt aatcccagca    900

ctttgggaag ctgaggctgg ctgatcacga ggtcaggaga tcaagaccat actggccaac    960

atggtgaaac cccatctcta ctaaaaatac aaaaattagc tgggtgtgga agcacgtgcc    1020

tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc aggagaatca ctggaaccca ggaggcggag    1080

gttgcagtga gctgagatta cgccactgca ctccaccctg gtgacagtga gactccgtct    1140

caaaaaaaaa aaattaacaa agaaactgca gcatcttcat tccaatgaag agcctttact    1200

gctcgcccag gagtgccaag agaatatctg ggcctacatt gctaaaatct aatgggaaag    1260

ttttaggttc tcctataaac ttaggaaagc atctcacctc atcctaacac atttcaagcc    1320

ccaaaaatct taaaagcagg ttatataggc taaatagaac taatcattgt tttagacata    1380

cttattgact ctaagaggaa agatgaagta ctatgtttta aagaatatta tattacagaa    1440

ttatagaaat tagatctctt acctaaactc ttcataatgc ttgctctgat aggaaaatga    1500

gatctactgt tttcctttac ttactacacc tcagatatat ttcttcatga agacctcaca    1560

gtaaaaatag gtgattttgg tctagctaca gtgaaatctc gatggagtgg gtcccatcag    1620

tttgaacagt tgtctggatc cattttgtgg atggtaagaa ttgaggctat ttttccactg    1680

attaaatttt tggccctgag atgctgctga gttactagaa agtcattgaa ggtctcaact    1740

atagtatttt catagttccc agtattcaca aaaatcagtg ttcttatttt ttatgtaaat    1800

agatttttta acttttttct ttacccttaa aacgaatatt ttgaaaccag tttcagtgta    1860

tttcaaacaa aaatatatgt cttataaaca gtgtttcata ttttattctt aaataaatat    1920

gaacccttaa aacgaatatt ttgaaaccag tttcagtgta tttcaaacaa aaatatatgt    1980

cttataaaca gtgtttcata ttttattcta aattgtttaa agtattttgt gttcaaaatg    2040

ttctgtgtac cctgttgaaa aaaaaaacag gtatgcaatt taaggcaggt gtgatccaca    2100

gccattatta tggttttgct aagagaacta ctccttttaa cagagaagct gtttcgcaat    2160

ctt                                                                  2163

Claims (10)

1.一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续核苷酸序列为SEQ ID No：3～20序列之一的正向或反向核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物为SEQ ID No：3～20序列之一的正向引物或反向引物。

4.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液              终浓度1～10×；

dNTPs                  0.1～0.5mM；

引物序列               终浓度为0.1～0.5μM；

模板DNA                0.1～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶           0.01～0.10U/μL；

MgCl₂                  终浓度为1～3mM；

荧光染料               1～3×。

5.根据权利要求4所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液              终浓度1～5×；

dNTPs                  0.2～0.3mM；

引物序列               终浓度为0.2～0.3M；

模板DNA                0.5～1.0ng/μL；

TaqDNA聚合酶           0.03～0.06U/μL；

MgCl₂                  终浓度为2～3mM；

荧光染料               1～2×。

6.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LC

PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

7.一种检测BRAF基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取包括含有BRAF基因的第十一外显子BRAF11或第十五外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；

(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRAF基因进行PCR扩增；

(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点(BRAF11和BRAF15)检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片中提取，进行PCR反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，40～50个循环。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶解曲线法的条件为：92～97℃变性1min；40℃复性1min；然后初始溶解温度60℃开始程序升温溶解至95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30～50次每秒。

10.一种PCR反应试剂盒在肿瘤用药选择和诊断相关的BRAF基因突变检测方面的应用。

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