CN107586851A - 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒 - Google Patents

一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN107586851A
CN107586851A CN201711071143.1A CN201711071143A CN107586851A CN 107586851 A CN107586851 A CN 107586851A CN 201711071143 A CN201711071143 A CN 201711071143A CN 107586851 A CN107586851 A CN 107586851A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
specially
reagent
internal control
nras
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711071143.1A
Other languages
English (en)
Inventor
喻德华
翟建新
罗玄
李鑫剩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd filed Critical Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201711071143.1A priority Critical patent/CN107586851A/zh
Priority to PCT/CN2017/110439 priority patent/WO2019084998A1/zh
Publication of CN107586851A publication Critical patent/CN107586851A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明针对现有试剂盒在灵敏度、成本、通量、操作方便性等方面存在不足的问题，提供一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，包括检测试剂，检测试剂由内控试剂、突变检测试剂和外控试剂组成。有益的技术效果：本发明的灵敏度高、通量高、适用样本范围广、低成本、操作方便。

Description

一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒
技术领域
本发明属于医疗检测技术领域，尤其涉及DNA检测材料，具体为一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒。本发明的产物适用于检测人类肿瘤的KRAS/NRAS/BRAF的基因突变。
背景技术
研究表明，癌症是环境因素与细胞遗传物质相互作用的结果，是多因素、多阶段与多基因作用的结果，是基因突变累积的结果，因此癌症是基因病。在人类众多的基因中，原癌基因和抑癌基因与癌症的发生发展密切相关。原癌基因和/或抑癌基因的突变可引起细胞癌变。癌症在形成实性肿块以前，与癌症相关的基因突变的过程已经发生，而且这个过程可能已长达十余年、甚至更长时间。在这期间，癌细胞还没有形成明显的肿块，但已有微量肿瘤DNA释放到循环血液中。通过测序，PCR等基因检测技术检测循环血液中这些基因的突变，可以筛查早期或超早期癌症，评估放化疗的疗效，预测靶向药物的疗效，监测术后早期复发等；对肿瘤组织进行基因突变检测，有助于了解肿瘤的产生、发展过程，判断肿瘤的类型和预后；有助于预测原癌基因相关抗肿瘤药物的疗效。基因突变常表现为杂合突变、缺失或插入突变等，突变检测对测序的质量要求很高。通过应用基因分析仪进行突变分析，可准确判断出杂合、缺失、插入突变等各种突变类型，结果准确客观。
结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是常见的消化道肿瘤之一，近年来应用基因检测的方法判断CRC预后及指导基因靶向治疗已成为重要手段。其中RAS基因是表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信号通路中的关键性靶点，在CRC演变过程中发挥了重要作用。抗EGFR抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)主要与内源性配体竞争性结合EGFR，阻断下游的RAS信号通路产生抗肿瘤效应。研究显示只有携带RAS野生型的CRC患者才能从抗EGFR治疗中获益。因此KRAS基因突变状态成为预示CRC患者能否从抗EGFR治疗中获益的有效指标，但是仍然有一部分KRAS野生型基因携带者无法从抗EGFR治疗中获益，这表明在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和PI3-KAKT-mTOR信号传导通路中存在的其他突变基因(例如NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN基因突变)可能导致CRC患者无法从抗EGFR治疗中获益，因此，研究CRC中KRAS/NRAS/BRAF基因突变情况，将对临床治疗具有重要意义。可以明确中国人群KRAS、NRAS和BRAF基因的突变特征，指导临床CRC的个体化治疗，为选择合适的临床治疗方案提供依据。目前用于临床的肿瘤基因突变检测技术主要有ARMS-PCR技术，一代测序技术，二代测序技术，数字PCR技术等。
ARMS-PCR(AmplificationRefractoryMutationSystem)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从引物的3’末端开始，而引物3’末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对(A-T，G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。常规的ARMS-PCR技术操作简便，检测时间较短，检测灵敏度一般在1％左右，在检测血液样本时，敏感性较低，检出率明显低于相应的肿瘤组织样本，同时检测通量也不如测序方法。
测序技术是对核酸的序列直接进行测定来检测基因突变的情况，测序技术近年来发展迅速，从第一代的sanger测序法，到第二代高量测序，再到最新一代的单分子测序，检测通量及灵敏度有了大幅提高。Sanger测序法利用在DNA合成反应体系中，混入一定比例带有同位素标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，使DNA合成延伸终止在不同的核苷酸上，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和显影获得待测DNA的碱基序列。二代测序技术又称为高通量测序技术，各家公司的测序技术原理有一定差异。高通量测序一次能够并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，测序深度远高于一代测序技术，但测序的片段长度较短。但高通量测序的检测过程繁琐，耗时需要几天，成本也较高。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR(RealTimePCR)基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。该方法的仪器和试剂成本较高，操作繁琐，通量也有限，目前市场上很难推广。
此外，常规的ARMS-PCR技术操作简便，检测时间较短，检测灵敏度一般在1％左右，在检测血液样本时，敏感性较低，检出率明显低于相应的肿瘤组织样本，同时检测通量也不如测序方法。Sanger测序技术的检测特异性和通量均较高，但是方法本身灵敏度不高，也不能检测大片段缺失重排，且需预先PCR和电泳才可以测序，耗时耗力，不适合大规模的应用。二代测序技术在测序深度上有了很大的提高，因此敏感性比一代测序有了提升，但检测成本、灵敏度及操作的方便性等方面均不如ARMS-PCR技术。数字PCR应用于肿瘤基因突变检测，其技术原理决定了其有着极高的检测灵敏度和特异性。主要劣势是成本高、操作繁琐，通量也较低，一个反应只能检测一个突变位点。
发明内容
本发明针对目前检测方法在灵敏度、成本、通量、操作方便性等方面存在的不足，在ARMS-PCR技术的基础上，通过对反应体系和扩增引物的优化，设计开发出一种高灵敏、高通量、低成本、操作简单的结直肠癌基因突变检测试剂、试剂盒。具体如下：
一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，包括检测试剂，检测试剂由内控试剂、突变检测试剂和外控试剂组成。
内控试剂包括内控引物R。
内控引物R的序列5'-3'具体为：GGCGCATTAATTACGGAAGAACCAGCT。
突变检测试剂包括：KRM1-R、KRM3-R、KRM4-R、KRex3-R、KRM5-R、NRex3-R和NRM3-R；其中，
KRM1-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAT；
KRM3-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAA；
KRM4-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACT；
KRex3-R的序列5'-3'具体为：TTATGGCAAATACACAAAGAAA；
KRM5-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACG；
NRex3-R的序列5'-3'具体为：CTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTT；
NRM3-R的序列5'-3'具体为：AGCCCTTCGCCTGTCCTCATGTAT；
外控试剂包括外控引物R。
外控引物R的序列5'-3'具体为：CCAGGTTGGATCATATTCGTCCACAAA。
进一步说，本发明所述的检测试剂的内控试剂还包括：内控探针Pb、内控引物F和外控引物F。其中，
内控探针Pb的序列5'-3'具体为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB。
内控引物F的序列5'-3'具体为：GGCGCCTTCATGTTTATCCACTGTGTGGT；
外控引物F的序列5'-3'具体为ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；
突变检测试剂还包括：KRM2-R、KRM6-R、KRM7-R、KRM9-R、BRex15-R、NRex2-R、KRM8-F、BRM1-F、NRM4-F、KRex2-F、KRex4-F、NRex3-F、NRM1-F和NRM2-F。其中，
KRM2-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAG；
KRM6-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACA；
KRM7-R的序列5'-3'具体为：TCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGT；
KRM9-R的序列5'-3'具体为：AGTGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT；
BRex15-R的序列5'-3'具体为：TCCACAAAATGGATCCAGACAA；
NRex2-R的序列5'-3'具体为：AAGTGGTTCTGGATTAGCTGGAT；
KRM8-F的序列5'-3'具体为：GGATATTCTCGACACAGCAGGTCAC；
BRM1-F的序列5'-3'具体为：AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA；
NRM4-F的序列5'-3'具体为：CCGCATACTGGATACAGCTGGACG；
KRex2-F的序列5'-3'具体为：ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；
KRex4-F的序列5'-3'具体为：GTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC；
NRex3-F的序列5'-3'具体为：GGTGAAACCTGTTTGTTGGACATA；
NRM1-F的序列5'-3'具体为：CGCCCTGGTGGTGGTTGGAGCAT；
NRM2-F的序列5'-3'具体为：AACGGGTGGTGGTTGGAGCTGA。
本发明所述的试剂盒，包括辅助试剂和耗材。其中，辅助试剂包括Taq酶和PCR反应缓冲液。耗材为荧光PCR管。
本发明所述的试剂盒，用于对与结直肠癌相关的3个癌基因KRAS、NRAS和BRAF的14个突变位进行同时检测的检测。
为了更好地体现本发明的特点，现将各引物序列及反应瓶的配置，列表阐述如下：
本发明技术方案带来的有益效果
1.高灵敏度：检测灵敏度最高可达到0.1％(25ngDNA背景)，远高于传统检测技术，与数字PCR相当。
2.高通量：一次可检测KRAS/NRAS/BRAF3个癌基因的14个常见突变位点。
3.适用样本范围广：可用于肿瘤组织样本(新鲜组织，FFPE，冰冻组织等)，体液样本(如血液、尿液等)。
4.低成本：检测成本不及数字PCR的30％，性价比高。
5.操作方便：只需在反应管内加入DNA模板，即可上机完成检测，人工操作少，整个检测过程不超过2小时(不包括核酸纯化过程)。
具体实施方式
现对本发明的技术特点与优点进一步阐述如下：
一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，包括用于基因突变的检测试剂，所述检测试剂由内控试剂、突变检测试剂和外控试剂组成。
内控试剂包括内控引物R。
内控引物R的序列5'-3'具体为：GGCGCATTAATTACGGAAGAACCAGCT。
突变检测试剂包括：KRM1-R、KRM3-R、KRM4-R、KRex3-R、KRM5-R、NRex3-R和NRM3-R。其中，
KRM1-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAT；
KRM3-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAA；
KRM4-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACT；
KRex3-R的序列5'-3'具体为：TTATGGCAAATACACAAAGAAA；
KRM5-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACG；
NRex3-R的序列5'-3'具体为：CTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTT；
NRM3-R的序列5'-3'具体为：AGCCCTTCGCCTGTCCTCATGTAT；
外控试剂包括：外控引物R；
外控引物R的序列5'-3'具体为：CCAGGTTGGATCATATTCGTCCACAAA。
进一步说，内控试剂还包括内控探针Pb。内控探针Pb的序列5'-3'具体为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB。
进一步说，内控试剂还包括内控引物F。突变检测试剂还包括KRM8-F和BRM1-F。外控试剂还包括外控引物F。其中，
内控引物F的序列5'-3'具体为：GGCGCCTTCATGTTTATCCACTGTGTGGT。
KRM8-F的序列5'-3'具体为：GGATATTCTCGACACAGCAGGTCAC；
BRM1-F的序列5'-3'具体为：AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA。
外控引物F的序列5'-3'具体为ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG。
进一步说，突变检测试剂还包括：KRM2-R、KRM6-R、KRM7-R、KRM9-R、BRex15-R和NRex2-R。其中，
KRM2-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAG；
KRM6-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACA；
KRM7-R的序列5'-3'具体为：TCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGT；
KRM9-R的序列5'-3'具体为：AGTGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT；
BRex15-R的序列5'-3'具体为：TCCACAAAATGGATCCAGACAA；
NRex2-R的序列5'-3'具体为：AAGTGGTTCTGGATTAGCTGGAT。
进一步说，突变检测试剂还包括：NRM4-F、KRex2-F、KRex4-F、NRex3-F、NRM1-F和NRM2-F。其中，
NRM4-F的序列5'-3'具体为：CCGCATACTGGATACAGCTGGACG；
KRex2-F的序列5'-3'具体为：ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；
KRex4-F的序列5'-3'具体为：GTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC；
NRex3-F的序列5'-3'具体为：GGTGAAACCTGTTTGTTGGACATA；
NRM1-F的序列5'-3'具体为：CGCCCTGGTGGTGGTTGGAGCAT；
NRM2-F的序列5'-3'具体为：AACGGGTGGTGGTTGGAGCTGA。
优选的技术方案是：本发明的内控试剂还包括：内控探针Pb、内控引物F和外控引物F。其中，
内控探针Pb的序列5'-3'具体为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB；
内控引物F的序列5'-3'具体为：GGCGCCTTCATGTTTATCCACTGTGTGGT；
外控引物F的序列5'-3'具体为ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG。
突变检测试剂还包括：KRM2-R、KRM6-R、KRM7-R、KRM9-R、BRex15-R、NRex2-R、KRM8-F、BRM1-F、NRM4-F、KRex2-F、KRex4-F、NRex3-F、NRM1-F和NRM2-F。其中，
KRM2-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAG；
KRM6-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACA；
KRM7-R的序列5'-3'具体为：TCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGT；
KRM9-R的序列5'-3'具体为：AGTGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT；
BRex15-R的序列5'-3'具体为：TCCACAAAATGGATCCAGACAA；
NRex2-R的序列5'-3'具体为：AAGTGGTTCTGGATTAGCTGGAT；
KRM8-F的序列5'-3'具体为：GGATATTCTCGACACAGCAGGTCAC；
BRM1-F的序列5'-3'具体为：AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA；
NRM4-F的序列5'-3'具体为：CCGCATACTGGATACAGCTGGACG；
KRex2-F的序列5'-3'具体为：ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；
KRex4-F的序列5'-3'具体为：GTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC；
NRex3-F的序列5'-3'具体为：GGTGAAACCTGTTTGTTGGACATA；
NRM1-F的序列5'-3'具体为：CGCCCTGGTGGTGGTTGGAGCAT；
NRM2-F的序列5'-3'具体为：AACGGGTGGTGGTTGGAGCTGA。
本发明所述的试剂盒，包括辅助试剂和耗材。其中，辅助试剂包括Taq酶和PCR反应缓冲液；耗材为荧光PCR管。
进一步说，在所述的试剂盒中，荧光PCR管为8联式，各管由在1逐个编号至8，其中，内控引物F、内控引物R和内控探针Pb均添加在反应管1～7中；其中，
KRM1-R和KRM2-R添加在反应管1中；KRex2-F添加在反应管1～3、5和8中；KRM3-R、KRM6-R添加在反应管2中；KRM4-R和KRM7-R添加在反应管3中；KRex3-R、KRex4-F、KRM8-F和KRM9-R添加在反应管4中；BRex15-R、KRM5-R和BRM1-F添加在反应管5中；NRex3-F、NRM1-F和NRM3-R添加在反应管6中；NRex2-R添加在反应管6和7中；NRex3-R、NRM2-F和NRM4-F添加在反应管7中；外控引物F添加在反应管8中；外控引物R添加在反应管8中。
进一步说，所述的试剂盒，在25ngDNA背景下，检测灵敏度最高可达到0.1％；能够同时对KRAS/NRAS/BRAF3个癌基因的14个突变位点进行检测；能够用于肿瘤组织样本或体液样本的检测；经过核酸纯化后的检测过程不超过2小时。
采用本发明所述的试剂盒用于对与结直肠癌相关的突变位点的检测。具体地说，是对与结直肠癌相关的3个癌基因KRAS、NRAS和BRAF的14个突变位进行同时检测的检测。
实施例一：
1)引物序列设计
2)样本制备
使用FFPEDNA提取试剂盒提取石蜡包埋组织样本切片，将提取的DNA用TE稀释至2ng/ul。
3)仪器
ABI7500、nanodrop2000、高速离心机、低速离心机、恒温干浴器、漩涡震荡仪、冰箱。
4)试剂盒的组成
试剂盒由KBN8联PCR反应条、KBN阳性对照组成。
反应条每孔的基本组成为：1×PCRBuffer,2～8pmoldNTPs,1.5～4.0mMMgCl2,1×SybrGreenI，0.5～2UHSTaq,0.1～1UUNG酶。按表1)在8联管中依次加入各引物探针，终浓度为100～400nM。
5)检测过程
在8联条每个反应孔内加入5μl2ng/μl的待测样本，盖好8联条的管盖，按以下程序上机检测。
95℃，2～10min。
95℃，5～16sec，62℃，40～60sec；共计15个循环。
95℃，5～16sec，60℃，40～60sec，72℃，30～60sec(收集SYBR和VIC荧光信号)；共计25个循环。
6)结果判定
阳性结果判定：根据荧光PCR扩增曲线的拐点设置阈值，1～7号反应管，SYBR通道Ct值在20以内为阳性结果，Ct值在20至22之间的为灰区，Ct值大于22的为阴性。
质量控制：VIC通道为内控信号，SYBR与VIC均无扩增信号的为无效结果。8号反应管为外控，SYBR通道Ct值在10至16之间的，模板DNA有效，否则需增加或减少上样量。

Claims (10)

1.一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，包括检测试剂，其特征在于，检测试剂由内控试剂、突变检测试剂和外控试剂组成；
内控试剂包括：内控引物R；
内控引物R的序列5'-3'具体为：GGCGCATTAATTACGGAAGAACCAGCT；
突变检测试剂包括：KRM1-R、KRM3-R、KRM4-R、KRex3-R、KRM5-R、NRex3-R和NRM3-R；其中，
KRM1-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAT；
KRM3-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAA；
KRM4-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACT；
KRex3-R的序列5'-3'具体为：TTATGGCAAATACACAAAGAAA；
KRM5-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACG；
NRex3-R的序列5'-3'具体为：CTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTT；
NRM3-R的序列5'-3'具体为：AGCCCTTCGCCTGTCCTCATGTAT；
外控试剂包括：外控引物R；
外控引物R的序列5'-3'具体为：CCAGGTTGGATCATATTCGTCCACAAA。
2.根据权利要求1所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，内控试剂还包括：内控探针Pb；内控探针Pb的序列5'-3'具体为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB。
3.根据权利要求1所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，内控试剂还包括内控引物F；突变检测试剂还包括KRM8-F和BRM1-F；外控试剂还包括外控引物F；其中，
内控引物F的序列5'-3'具体为：GGCGCCTTCATGTTTATCCACTGTGTGGT；
KRM8-F的序列5'-3'具体为：GGATATTCTCGACACAGCAGGTCAC；
BRM1-F的序列5'-3'具体为：AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA；
外控引物F的序列5'-3'具体为ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG。
4.根据权利要求1所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，突变检测试剂还包括：KRM2-R、KRM6-R、KRM7-R、KRM9-R、BRex15-R和NRex2-R；其中，
KRM2-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAG；
KRM6-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACA；
KRM7-R的序列5'-3'具体为：TCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGT；
KRM9-R的序列5'-3'具体为：AGTGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT；
BRex15-R的序列5'-3'具体为：TCCACAAAATGGATCCAGACAA；
NRex2-R的序列5'-3'具体为：AAGTGGTTCTGGATTAGCTGGAT。
5.根据权利要求3所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，突变检测试剂还包括：NRM4-F、KRex2-F、KRex4-F、NRex3-F、NRM1-F和NRM2-F；其中，
NRM4-F的序列5'-3'具体为：CCGCATACTGGATACAGCTGGACG；
KRex2-F的序列5'-3'具体为：ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；
KRex4-F的序列5'-3'具体为：GTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC；
NRex3-F的序列5'-3'具体为：GGTGAAACCTGTTTGTTGGACATA；
NRM1-F的序列5'-3'具体为：CGCCCTGGTGGTGGTTGGAGCAT；
NRM2-F的序列5'-3'具体为：AACGGGTGGTGGTTGGAGCTGA。
6.根据权利要求1所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，内控试剂还包括：内控探针Pb、内控引物F和外控引物F；其中，
内控探针Pb的序列5'-3'具体为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB；
内控引物F的序列5'-3'具体为：GGCGCCTTCATGTTTATCCACTGTGTGGT；
外控引物F的序列5'-3'具体为ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；
突变检测试剂还包括：KRM2-R、KRM6-R、KRM7-R、KRM9-R、BRex15-R、NRex2-R、KRM8-F、BRM1-F、NRM4-F、KRex2-F、KRex4-F、NRex3-F、NRM1-F和NRM2-F；其中，
KRM2-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCAG；
KRM6-R的序列5'-3'具体为：CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACA；
KRM7-R的序列5'-3'具体为：TCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGT；
KRM9-R的序列5'-3'具体为：AGTGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT；
BRex15-R的序列5'-3'具体为：TCCACAAAATGGATCCAGACAA；
NRex2-R的序列5'-3'具体为：AAGTGGTTCTGGATTAGCTGGAT；
KRM8-F的序列5'-3'具体为：GGATATTCTCGACACAGCAGGTCAC；
BRM1-F的序列5'-3'具体为：AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA；
NRM4-F的序列5'-3'具体为：CCGCATACTGGATACAGCTGGACG；
KRex2-F的序列5'-3'具体为：ATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；
KRex4-F的序列5'-3'具体为：GTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC；
NRex3-F的序列5'-3'具体为：GGTGAAACCTGTTTGTTGGACATA；
NRM1-F的序列5'-3'具体为：CGCCCTGGTGGTGGTTGGAGCAT；
NRM2-F的序列5'-3'具体为：AACGGGTGGTGGTTGGAGCTGA。
7.根据权利要求6所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括辅助试剂和耗材；其中，辅助试剂包括Taq酶和PCR反应缓冲液；耗材为荧光PCR管。
8.根据权利要求7所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，荧光PCR管为8联式，各管由在1逐个编号至8，其中，
内控引物F、内控引物R和内控探针Pb均添加在反应管1～7中；
KRM1-R和KRM2-R添加在反应管1中；
KRex2-F添加在反应管1～3、5和8中；
KRM3-R、KRM6-R添加在反应管2中；
KRM4-R和KRM7-R添加在反应管3中；
KRex3-R、KRex4-F、KRM8-F和KRM9-R添加在反应管4中；
BRex15-R、KRM5-R和BRM1-F添加在反应管5中；
NRex3-F、NRM1-F和NRM3-R添加在反应管6中；
NRex2-R添加在反应管6和7中；
NRex3-R、NRM2-F和NRM4-F添加在反应管7中；
外控引物F和外控引物R添加在反应管8中。
9.根据权利要求7或8任一所述的一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于，在25ngDNA背景下，本试剂盒的检测灵敏度最高可达到0.1％；本试剂盒能够同时对KRAS/NRAS/BRAF3个癌基因的14个突变位点进行检测；本试剂盒能够用于肿瘤组织样本或体液样本的检测；本试剂盒经过核酸纯化后的检测过程不超过2小时。
10.采用权利要求1至6任一所述的KRAS/NRAS/BRAF基因突变检测试剂盒的用途，其特征在于，用于对与结直肠癌相关的3个癌基因KRAS、NRAS和BRAF的14个突变位进行同时检测。
CN201711071143.1A 2017-11-03 2017-11-03 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒 Pending CN107586851A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711071143.1A CN107586851A (zh) 2017-11-03 2017-11-03 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
PCT/CN2017/110439 WO2019084998A1 (zh) 2017-11-03 2017-11-10 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711071143.1A CN107586851A (zh) 2017-11-03 2017-11-03 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107586851A true CN107586851A (zh) 2018-01-16

Family

ID=61044757

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711071143.1A Pending CN107586851A (zh) 2017-11-03 2017-11-03 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN107586851A (zh)
WO (1) WO2019084998A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019084998A1 (zh) * 2017-11-03 2019-05-09 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN116397027A (zh) * 2022-12-29 2023-07-07 北京阅微基因技术股份有限公司 联合检测kras/nras/braf基因分型的复合扩增体系及试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747157A (zh) * 2012-07-16 2012-10-24 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN103695555A (zh) * 2013-12-25 2014-04-02 上海星耀医学科技发展有限公司 K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒及检测方法
CN104818317A (zh) * 2014-05-20 2015-08-05 厦门艾德生物医药科技有限公司 一次性检测肠癌多重基因突变的引物、探针、检测体系和试剂盒
CN105567854A (zh) * 2016-03-01 2016-05-11 济南银丰医学检验有限公司 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒
CN105256019B (zh) * 2015-10-14 2018-11-16 武汉海吉力生物科技有限公司 Mthfr和mtrr基因多态性检测引物组及试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2984185B1 (en) * 2013-04-08 2019-06-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods and compositions for treating cancer
CN104928355A (zh) * 2014-03-19 2015-09-23 李跃 检测braf基因突变的方法及其试剂盒
CN107586851A (zh) * 2017-11-03 2018-01-16 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747157A (zh) * 2012-07-16 2012-10-24 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN103695555A (zh) * 2013-12-25 2014-04-02 上海星耀医学科技发展有限公司 K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒及检测方法
CN104818317A (zh) * 2014-05-20 2015-08-05 厦门艾德生物医药科技有限公司 一次性检测肠癌多重基因突变的引物、探针、检测体系和试剂盒
CN105256019B (zh) * 2015-10-14 2018-11-16 武汉海吉力生物科技有限公司 Mthfr和mtrr基因多态性检测引物组及试剂盒
CN105567854A (zh) * 2016-03-01 2016-05-11 济南银丰医学检验有限公司 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐望红: "证据1", 《肿瘤流行病学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019084998A1 (zh) * 2017-11-03 2019-05-09 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN116397027A (zh) * 2022-12-29 2023-07-07 北京阅微基因技术股份有限公司 联合检测kras/nras/braf基因分型的复合扩增体系及试剂盒
CN116397027B (zh) * 2022-12-29 2023-10-10 北京阅微基因技术股份有限公司 联合检测kras/nras/braf基因分型的复合扩增体系及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019084998A1 (zh) 2019-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107955835A (zh) 一种检测brca1/2基因突变的引物池及检测方法
CN105349654B (zh) 一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒
CN104745679A (zh) 一种无创检测egfr基因突变的方法及试剂盒
CN105886648A (zh) 用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒
CN105112522A (zh) Her2基因扩增的检测引物组及试剂盒
CN103923975A (zh) 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
CN103923974A (zh) 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
CN110951843A (zh) 一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法
CN110938693A (zh) 用于检测braf基因突变的引物组、试剂盒及方法
CN111621566B (zh) 用于诊断肝癌和预测肝癌转移的血清miRNA标志物及其检测试剂盒
CN108949979A (zh) 一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN107586851A (zh) 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN107641649B (zh) 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
WO2020134950A1 (zh) 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒
CN110144386A (zh) 用于检测pole基因突变的引物、探针及试剂盒
CN103074438A (zh) 一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
CN110257514A (zh) 一种新的食管癌血液miRNA标志物及其应用
CN108998534A (zh) 一种kras基因突变检测的新方法
CN106755330B (zh) 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用
CN104630379A (zh) 非小细胞型肺癌标志物fam107a及其应用
CN108753981A (zh) Hoxb8基因的定量检测在结直肠癌预后判断中的应用
CN110684849A (zh) 基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法
CN103740820A (zh) 联合检测基因pten、vegf相对表达量的寡核苷酸和方法
CN108165633B (zh) 一种特异性阻抑引物体系及肿瘤ct-DNA突变检测的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180116

RJ01 Rejection of invention patent application after publication