CN105567854A - 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒 - Google Patents

一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105567854A
CN105567854A CN201610115008.1A CN201610115008A CN105567854A CN 105567854 A CN105567854 A CN 105567854A CN 201610115008 A CN201610115008 A CN 201610115008A CN 105567854 A CN105567854 A CN 105567854A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seqidno
arms
kras
gene
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610115008.1A
Other languages
English (en)
Inventor
黄理
刘海云
李保伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan Yinfeng Medical Laboratory Co Ltd
Original Assignee
Jinan Yinfeng Medical Laboratory Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan Yinfeng Medical Laboratory Co Ltd filed Critical Jinan Yinfeng Medical Laboratory Co Ltd
Priority to CN201610115008.1A priority Critical patent/CN105567854A/zh
Publication of CN105567854A publication Critical patent/CN105567854A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其特征在于，所述ARMS引物的序列如SEQ？ID？NO.1至SEQ？ID？NO.31所示。本发明还公开了含有上述ARMS引物。本发明在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，除了一般的内参对照外，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，双内参系统和对应的双重判读规则避免了现有技术的缺陷，提高了检测的准确性，减少了错误率；而且本发明的检测试剂盒中还含有用于对样品进行桑格测序的试剂，联合桑格测序技术和ARMS实时荧光定量技术，既能对已知基因的突变位点进行检测，又能发现新的突变位点，保证了检测的灵敏度。

Description

一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的引物组合及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的引物及其试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
根据世界肿瘤研究治疗领域权威机构NCCN推荐，肺癌患者，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)患者，建议进行EGFR基因突变检测。EGFR激活突变的存在对选择治疗用抗癌药物具有重要作用。而研究表明，EGFR的某些突变，尤其是它的19号外显子缺失突变，21号外显子点突变(L858R)，18号外显子点突变，20号外显子的点突变(T790M)，与络氨酸激酶抑制剂(TKIs)的疗效有高度的相关性。此外，在部分肺癌病人当中，同时存在着EGFR基因和KRAS基因的突变，而KRAS基因第2，3，4号外显子上的突变与络氨酸激酶抑制剂(TKIs)的疗效有负相关作用，当KRAS基因存在这些类型突变时，会对靶向EGFR的靶向抗癌药物产生抵抗。同时，BRAF基因在肺癌当中也存在不同程度的突变。这些突变中最主要的是第1799位核苷酸上的突变，导致缬氨酸突变成谷氨酸(V600E)，使患者对抗体类药物(如西妥昔单抗)产生抗药性。因此，检测EGFR、BRAF、KRAS基因的突变情况对指导临床肿瘤用药具有重要作用。
在检测人组织细胞样本中EGFR、KRAS、BRAF基因突变的现有技术中，通常采用探针技术对上述基因突变进行检测(如厦门艾德生物医药科技有限公司生产的EGFR基因检测试剂盒)。采用荧光探针技术虽然能够提高检测的特异性，但是使用成本过高，同时无法检测新型突变。另外采用荧光探针，通过突变组探针荧光起峰的Ct值大小进行判断的方法，其缺陷在于没有有效参照物，虽然引入了内参，但是内参与突变位点并不是同一位点，甚至不是同一种基因。而且，其Ct值的判断规则基于经验值，因此在检测时由于样本提取质量等因素，其检测效果并不理想，在实际应用中，可能会出现检测结果的不一致。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的引物试剂盒。本发明的试剂盒采用ARMS-PCR技术对上述基因突变进行检测，在ARMS-PCR技术中采用SYBR荧光方法，能够大幅降低成本；同时通过优化引物设计，在荧光收集阶段引入四步法(81℃收集荧光)，采用高性能的DNA聚合酶，最大限度减少非特异干扰，提高检测的可靠性和准确性。
此外，本发明的试剂盒还引入了双内参系统，提供了双重判读规则，提高了检测的准确性和灵敏度。
本发明中，所述EGFR、KRAS、BRAF基因突变的突变位点信息如下：
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，所述ARMS引物的序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.31所示。
上述ARMS引物中，对于EGFR、KRAS和BRAF基因每一突变位点的检测都包括有3条引物，其中：一条用于扩增正常位点，一条用于扩增突变位点，一条作为共用引物。
上述ARMS引物在制备检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒中的应用也是本发明的保护范围。
根据本发明的第二方面，提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒，包括：上述用于检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物和用于扩增第一内参的引物；
所述第一内参为GAPDH基因，用于扩增第一内参的引物序列如SEQIDNO.32和SEQIDNO.33所示。
所述ARMS引物中，用于扩增正常位点的引物和共用引物扩增得到对应突变位点的正常基因位点，作为第二内参。
上述试剂盒中，还包括如下试剂：DNA聚合酶、10×DNA聚合酶缓冲液、SYBR-Green-I、高纯水、阳性对照品和4种dNTP混合物。
优选的，所述DNA聚合酶为TaqHSDNA聚合酶。
进一步的，上述试剂盒中还包括用于对样品进行桑格测序的试剂，所述试剂中包含用于扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一个、两个或全部的一个或多个外显子区域的扩增引物对。
其中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的扩增引物对如SEQIDNO.34和SEQIDNO.35所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的扩增引物对如SEQIDNO.36和SEQIDNO.37所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的扩增引物对如SEQIDNO.38和SEQIDNO.39所示；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的扩增引物对如SEQIDNO.40和SEQIDNO.41所示；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的扩增引物对如SEQIDNO.42和SEQIDNO.43所示；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的扩增引物对如SEQIDNO.44和SEQIDNO.45所示；
用于扩增KRAS基因的外显子4的区域的扩增引物对如SEQIDNO.46和SEQIDNO.47所示；
用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的扩增引物对如SEQIDNO.48和SEQIDNO.49所示。
所述用于对样品进行桑格测序的试剂中，还包含对EGFR、KRAS和BRAF基因扩增产物进行测序的测序引物；其序列分别如SEQIDNO.34、SEQIDNO.37、SEQIDNO.39、SEQIDNO.41、SEQIDNO.43、SEQIDNO.44、SEQIDNO.46和SEQIDNO.48所示。
作为一种具体的应用形式，上述试剂盒的组成包括：用于检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物、TaqHSDNA聚合酶、TaqHSDNA聚合酶10×缓冲液、SYBR-Green-I(1:30000)、高纯水、阳性对照品、4种dNTP混合物和用于对样品进行桑格测序的试剂。
上述试剂盒在制备检测或辅助检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明进一步提供一种非诊断目的的利用上述试剂盒检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的方法，采用上述ARMS引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增，在81℃采集荧光信号，根据Ct值对检测结果进行判读，若ΔCt-1≈ΔCt-2(差别在1个循环内)，ΔCt-2>8，则检测结果为阴性；
若ΔCt-1>ΔCt-2，ΔCt-2<8，则检测结果为阳性。
进一步的，若ΔCt-2<4，则为强阳性；如果4<ΔCt-2<8，则为弱阳性。
其中，ΔCt-1：突变组Ct值减去第一内参组Ct值；
ΔCt-2：突变组Ct值减去第二内参组Ct值。
上述方法，所述PCR扩增的条件为：95℃预变性3分钟；按95℃20秒，68℃25秒，72℃25秒，扩增反应15个循环；再按95℃20秒，64℃20秒，72℃20秒，81℃20秒，扩增反应30个循环。
本发明的有益效果：
(1)本发明在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，除了一般的内参对照外，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，即与对应的突变位点一致的正常基因位点作为第二内参，这样能够确保检测的一致性。双内参系统和对应的双重判读规则避免了现有技术的缺陷，判读基于综合判断，并不依赖经验值，能够给出更可靠的突变比例数据，提高了检测的准确性，减少了错误率。
(2)本发明在ARMS实时荧光定量技术中，采用SYBR荧光方法，能够大幅降低检测的成本，同时通过优化引物设计，在荧光收集阶段引入四步法(81度收集荧光)，采用高性能的DNA聚合酶，最大限度减少非特异干扰，提高检测的可靠性和准确性。
(3)本发明的检测试剂盒中，联合桑格测序技术和ARMS实时荧光定量技术，既能对已知基因的突变位点进行检测，又能发现新的突变位点，保证了检测的灵敏度和准确度。
附图说明
图1：EGFRExon-19-ARMS已知阳性样本实时荧光定量扩增曲线图；
图2：KRASExon-2-ARMS已知阳性样本实时荧光定量扩增曲线图；
图3：采用未经优化的引物检测KRASExon-4的样本实时荧光定量扩增曲线图；
图4：采用经优化后的引物检测KRASExon-4的样本实时荧光定量扩增曲线图；
图5：EGFRExon-18-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图6：EGFRExon-19-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图7：EGFRExon-20-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图8：EGFRExon-21-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图9：KRASExon-2-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图10：KRASExon-3-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图11：KRASExon-4-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图12：BRAFExon-15-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
图13：EGFRExon-18样本测序结果图；
图14：EGFRExon-19阳性样本测序结果图；
图15：EGFRExon-20样本测序结果图；
图16：EGFRExon-21样本测序结果图；
图17：KRASExon-2阳性样本测序结果图；
图18：KRASExon-3样本测序结果图；
图19：KRASExon-4样本测序结果图；
图20：BRAFExon-15样本测序结果图；
上述荧光定量扩增曲线图中，纵坐标为荧光值(dR)，横坐标为循环数(cycles)。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：用于检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物的设计与筛选
本发明在进行ARMS引物设计时，利用Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性，当引物的3’端不能与模板完全配对，则PCR扩增不能进行。将引物的3’端设计为仅与突变模板匹配，而与正常模板不匹配，该引物只能扩增突变模板，而对正常模板不扩增，从而达到分型的目的。
本发明同时还设计了用于扩增人EGFR、KRAS、BRAF基因对应突变位点的正常基因位点的引物序列，以其扩增得到的正常基因位点作为第二内参。
本实施例经优化筛选设计了人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物。其序列分别如下：
EGFRExon-18-F-WT-ARMS:5’-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGG-3’(SEQIDNO.1)；
EGFRExon-18-F-ARMS:5’-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA-3’(SEQIDNO.2)；
EGFRExon-18-R-ARMS:5’-CGGGATCCCAGACCATGAGAGGCCCTG-3’(SEQIDNO.3)；
EGFRExon-19-R-WT-ARMS:5’-TGGCTTTCGGAGATGTTGC-3’(SEQIDNO.4)；
EGFRExon-19-R-ARMS:5’-GTTGGCTTTCGGAGATGTTTTG-3’(SEQIDNO.5)；
EGFRExon-19-F-ARMS:5’-GCCAGTTAACGTCTTCCTTCTC-3’(SEQIDNO.6)；
EGFRExon-20-F-WT-ARMS:5’-CACCGTGCAGCTCATCAC-3’(SEQIDNO.7)；
EGFRExon-20-F-ARMS:5’-CACCGTGCAGCTCATCAT-3’(SEQIDNO.8)；
EGFRExon-20-R-ARMS:5’-CCTGATTACCTTTGCGATCTGC-3’(SEQIDNO.9)；
EGFRExon-21-F-WT-ARMS:5’-GTCAAGATCACAGATTTTGGGCT-3’(SEQIDNO.10)；
EGFRExon-21-F-ARMS:5’-GTCAAGATCACAGATTTTGGGCG-3’(SEQIDNO.11)；
EGFRExon-21-R-ARMS:5’-CAATACAGCTAGTGGGAAGGC-3’(SEQIDNO.12)；
KRASExon-2-WT-F-ARMS:5’-TGGTAGTTGGAGCTGGTGG-3’(SEQIDNO.13)；
KRASExon-2-34A-F-ARMS:5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’(SEQIDNO.14)；
KRASExon-2-34T-F-ARMS:5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’(SEQIDNO.15)；
KRASExon-2-34C-F-ARMS:5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’(SEQIDNO.16)；
KRASExon-2-35A-F-ARMS:5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’(SEQIDNO.17)；
KRASExon-2-35T-F-ARMS:5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3’(SEQIDNO.18)；
KRASExon-2-35C-F-ARMS:5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’(SEQIDNO.19)；
KRASExon-2-37-F-ARMS:5’-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT-3’(SEQIDNO.20)；
KRASExon-2-38-F-ARMS:5’-TGGTAGTTGGAGCTGGTGA-3’(SEQIDNO.21)；
KRASExon-2-R-ARMS:5’-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3’(SEQIDNO.22)；
KRASExon-3-F-ARMS:5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’(SEQIDNO.23)；
KRASExon-3-R-ARMS:5’-CTCATTGCACTGTACTCCTCG-3’(SEQIDNO.24)；
KRASExon-3-R-WT-ARMS:5’-CCTCATTGCACTGTACTCCTCT-3’(SEQIDNO.25)；
KRASExon-4-F-ARMS:5’-GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3’(SEQIDNO.26)；
KRASExon-4-R-ARMS:5’-GTGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTCT-3’(SEQIDNO.27)；
KRASExon-4-R-WT-ARMS:5’-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGC-3’(SEQIDNO.28)；
BRAFExon-15-F-WT-ARMS:5’-TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3’(SEQIDNO.29)；
BRAFExon-15-F-ARMS:5’-TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3’(SEQIDNO.30)；
BRAFExon-15-R-ARMS:5’-AGTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3’(SEQIDNO.31)。
上述ARMS引物中，WT-ARMS表示用于扩增正常位点的引物。
用于扩增第一内参(内参-1)的引物序列如下：
内参-GAPDH-F-ARMS:5’-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3’(SEQIDNO.32)；
内参-GAPDH-R-ARMS:5’-TTTCTGAGCCAGCCACCAG-3’(SEQIDNO.33)。
实施例2：用于检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物的特异性考察
分别以含有EGFR、KRAS、BRAF基因突变的阳性样本为检测对象，分别采用实施例1筛选的ARMS引物进行检测。
检测的反应体系为：TaqHSDNA聚合酶(1unit)；
TaqHSDNA聚合酶10×缓冲液；
SYBR-Green-I(1:30000)；
ARMS引物(0.1–0.5uM)；
模板DNA(1-10ng)；
4种dNTP混合物(0.2mM)；
高纯水。
PCR反应条件：
选取SYBR荧光通道模式，荧光定量PCR反应程序如下：
注：*,此步收集荧光。
结果为：用于检测EGFR基因突变的引物ARMS引物仅能特异性扩增含EGFR基因突变的阳性样本，而对于含有其他类型基因突变的阳性样本无扩增曲线。以含EGFRExon-19突变的阳性样本为例，其实时荧光定量扩增曲线图如图1所示。
同样的，用于检测KRAS基因突变的ARMS引物也仅能特异性扩增所对应的含KRAS基因突变的阳性样本，而对于含有其他类型基因突变的阳性样本无扩增曲线。以含KRASExon-2突变的阳性样本为例，其实时荧光定量扩增曲线图如图2所示。
上述结果表明本发明实施例1筛选得到的引物是经过严格的设计和验证的，具有高度的特异性。
对比例1：
ARMS引物的特异性对检测结果的准确性尤为重要，为提高准确性，需对ARMS引物序列进行人工调整优化，以满足特异性扩增的需求。
以检测KRASExon-4的引物为例，对于同一阴性样本，即不存在突变。因此突变位点引物曲线应该不起峰，或者起峰很晚且与内参之间应该相差10个循环以上。若对ARMS引物不进行优化，其ARMS引物如下：
KRASExon-4-F-ARMS:5’-GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3’
KRASExon-4-R-ARMS:5’-GTGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT-3’；
KRASExon-4-R-WT-ARMS:5’-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGC-3’
结果表明：以未进行优化的ARMS引物对阴性样本进行检测，其突变位点引物组起峰，且与内参之间相差8个循环左右，结果如图3所示，检测效果不理想，容易出现假阳性的检测结果；而采用本发明优化后的ARMS引物(实施例1中SEQIDNO.26-SEQIDNO.28所示的引物)进行检测，其突变位点引物组不起峰，检测效果理想，结果如图4所示。
实施例3：用于扩增EGFR、KRAS、BRAF基因的桑格测序引物
本发明还提供了用于扩增EGFR、KRAS、BRAF基因的桑格测序引物，包括扩增引物和测序引物。
其中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的扩增引物对为：
EGFRExon-18-F:5’-CCGCTCGAGCTGAGGTGACCCTTGTCTC-3’(SEQIDNO.34)；
EGFRExon-18-R:5’-CGGGATCCCAGACCATGAGAGGCCCTG-3’(SEQIDNO.35)；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的扩增引物对为：
EGFRExon-19-F:5’-GCCAGTTAACGTCTTCCTTCTC-3’(SEQIDNO.36)；
EGFRExon-19-R:5’-GATGTGGAGATGAGCAGGGTC-3’(SEQIDNO.37)；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的扩增引物对为：
EGFRExon-20-F:5’-AAGCCACACTGACGTGCC-3’(SEQIDNO.38)；
EGFRExon-20-R:5’-CCTGATTACCTTTGCGATCTGC-3’(SEQIDNO.39)；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的扩增引物对为：
EGFRExon-21-F:5’-GCAGGGTCTTCTCTGTTTCAG-3’(SEQIDNO.40)；
EGFRExon-21-R:5’-CAATACAGCTAGTGGGAAGGC-3’(SEQIDNO.41)；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的扩增引物对为：
KRASExon-2-F:5’-GGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTG-3’(SEQIDNO.42)；
KRASExon-2-R:5’-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3’(SEQIDNO.43)；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的扩增引物对为：
KRASExon-3-F:5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’(SEQIDNO.44)；
KRASExon-3-R:5’-CAAGTTACTCCACTGCTCTAATCC-3’(SEQIDNO.45)；
用于扩增KRAS基因的外显子4的区域的扩增引物对为：
KRASExon-4-F:5’-CCGCTCGAGGGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3’(SEQIDNO.46)；
KRASExon-4-R:5’-CGGGATCCGAAGCAATGCCCTCTCAAGAG-3’(SEQIDNO.47)；
用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的扩增引物对为：
BRAFExon-15-F:5’-TCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3’(SEQIDNO.48)；
BRAFExon-15-R:5’-AGTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3’(SEQIDNO.49)。
测序引物为上述扩增引物对中的一条，其具体如下：
EGFRExon-18:5’-CCGCTCGAGCTGAGGTGACCCTTGTCTC-3’(SEQIDNO.34)；
EGFRExon-19:5’-GATGTGGAGATGAGCAGGGTC-3’(SEQIDNO.37)；
EGFRExon-20:5’-CCTGATTACCTTTGCGATCTGC-3’(SEQIDNO.39)；
EGFRExon-21:5’-CAATACAGCTAGTGGGAAGGC-3’(SEQIDNO.41)；
KRASExon-2:5’-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3’(SEQIDNO.43)；
KRASExon-3:5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’(SEQIDNO.44)；
KRASExon-4:5’-CCGCTCGAGGGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3’(SEQIDNO.46)；
BRAFExon-15:5’-TCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3’(SEQIDNO.48)。
实施例4：检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒
本发明的试剂盒包括：用于检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物和用于扩增第一内参的引物(实施例1筛选得到)；
还包括：TaqHSDNA聚合酶、DNA聚合酶10X缓冲液、SYBR-Green-I、高纯水、阳性对照品和4种dNTP混合物，以及对样品进行桑格测序的试剂(包含实施例3中的桑格测序引物)。
该试剂盒的制备方法为：将用于检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变每一个突变位点的ARMS引物分别单独包装，每一突变位点的检测都包括有3条引物，其中：一条用于扩增正常位点，一条用于扩增突变位点，一条作为共用引物。
该试剂盒的使用方法为：
1.利用ARMS引物检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变，具体步骤为：
(1)样本DNA提取：采用天根DNA提取试剂盒DP331，并严格按照此试剂盒说明书进行操作。
(2)DNA浓度测定：OD260/280比值在1.9-2.1之间为佳。
(3)PCR扩增：
PCR扩增体系成分：
注：操作必须严格分区进行，ARMS实时荧光定量体系配制(模板除外)必须在体系配制专区进行，而模板的添加需在另一专区进行，不能和其他成分在一个区内进行，避免模板之间的交叉污染。
实施例中所用的模板DNA由客户提供。
PCR反应条件：
选取SYBR荧光通道模式，荧光定量PCR反应程序如下：
注：*,此步收集荧光。
(4)结果判读：
每一个基因突变位点的检测，都拥有双内参，第一内参(内参-1)为GAPDH基因，内第二内参(内参-2)为对应突变位点的正常基因位点。
当模板中没有相应基因突变时(即阴性样本)：
判读规则一：ΔCt-1≈ΔCt-2(差别在1个循环内)
判读规则二：ΔCt-2>8
当模板中存在相应基因突变时(即阳性样本)：
内参-1的Ct值小于内参-2的Ct值，因为突变发生，对应的WT模板数目减少。
判读规则一：ΔCt-1>ΔCt-2
判读规则二：ΔCt-2<8
同时，如果ΔCt-2<4，则为强阳性；如果4<ΔCt-2<8，则为弱阳性。
双内参判读规则的设计方案，能够有效判别基因突变的存在，提高检测的准确性和灵敏度，减少漏检率。
注：
ΔCt-1：突变组Ct值减去内参-1组Ct值。
ΔCt-2：突变组Ct值减去内参-2组Ct值。
2.利用试剂盒中对样品进行桑格测序的试剂对样品进行测序，目的是：一方面辅助验证ARMS检测结果的准确性；另一方面，重点针对ARMS检测结果为阴性的样本，以发现新的基因突变，具体步骤为：
(1)样本DNA提取：采用天根DNA提取试剂盒DP331，并严格按照此试剂盒说明书进行操作。
(2)DNA浓度测定：OD260/280比值在1.9---2.1之间为佳。
(3)PCR扩增：
PCR扩增体系成分：
注：操作必须严格分区进行，PCR扩增体系配制(模板除外)必须在体系配制专区进行，而模板的添加需在另一专区进行，不能和其他成分在一个区内进行，避免模板之间的交叉污染。
PCR扩增程序：
(4)PCR产物纯化：
纯化酶采用USBExoSAP-ITPCRProductCleanup(货号78200)。并严格按照其说明书进行操作。模板量(PCR产物)为5uL，纯化酶加2uL。
(5)测序反应：
测序反应体系成分:
测序反应程序：
(6)测序反应产物纯化上机(ABI3130XL测序仪)：
a)加入1μL125mMEDTA到管底，然后加入1μL3MNaAc到管底。
b)加入25μL100％酒精，封严之后震荡混匀，室温放置15min。
c)4000-5000rpm离心30min，马上倒置96孔板，离心至350rpm停止离心。
d)加入35μL70％酒精，4500rpm4℃离心15min,马上倒置96孔板，离心至300rpm停止离心，重复1次。
e)待酒精挥发之后，加入10μL甲酰胺溶解DNA。
f)95℃变性4min，冰上冷却4min，上机。
实施例5：试剂盒的灵敏度检测
取含有EGFR突变基因片断DNA的质粒(由济南银丰医学检验有限公司制备得到)，配制成突变质粒数目为1000个拷贝、100个拷贝、10个拷贝，作为样品。
然后采用实施例4的试剂盒进行检测。
结果表明本发明的试剂盒最低能够检测到含量低至10个拷贝的突变。
实施例6：临床样本检测
在检测者知情同意的情况下，选取100例检测样本，采用本发明实施例4的试剂盒进行检测。
检测结果表明，所检测的100例样本中有6例发生了基因突变。
作为对比，所有样本同时采用专利CN104818318A中提供的检测试剂盒和检测方法进行检测，结果表明：发生基因突变的有4例。采用本实施例试剂盒的检测出的阳性样本，而采用专利CN104818318A中提供的检测试剂盒未检测出基因突变的，经测序证明，其为阳性样本。
所有的样本均经过直接测序检测验证，结果与采用本发明的试剂盒的分型检测结果完全一致，说明本发明的试剂盒及其检测方法准确、有效，特异性强，检测结果无假阳性和假阴性。部分样本的ARMS荧光定量检测结果和测序结果分别如图5-图20所示。
另外，本发明试剂盒还大幅的降低了检测的成本，一般的双标探针合成价格约为1000元/条，使用工作浓度0.2umol/L，一般能做3,000-5,000个反应；而本发明所采用的SYBR-Green-I染料100uL价格为600元左右(购自Invitrogen公司)，按照终浓度1:30000-1:50000使用，能够做150,000-250,000个反应。检测成本显著降低。

Claims (10)

1.一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其特征在于，所述ARMS引物的序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.31所示。
2.权利要求1所述的ARMS引物在制备检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒中的应用。
3.一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的ARMS引物和用于扩增第一内参的引物；
所述第一内参为GAPDH基因，用于扩增第一内参的引物序列如SEQIDNO.32和SEQIDNO.33所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中，还包括如下物质中的至少一种：DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、SYBR-Green-I和4种dNTP混合物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为TaqHSDNA聚合酶。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括用于对样品进行桑格测序的试剂，所述试剂中包含用于扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一个、两个或全部的一个或多个外显子区域的扩增引物对。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物对包括：用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.34和SEQIDNO.35所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.36和SEQIDNO.37所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.38和SEQIDNO.39所示；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.40和SEQIDNO.41所示；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.42和SEQIDNO.43所示；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.44和SEQIDNO.45所示；
用于扩增KRAS基因的外显子4的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.46和SEQIDNO.47所示；
用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的扩增引物对，如SEQIDNO.48和SEQIDNO.49所示。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述用于对样品进行桑格测序的试剂中，还包含对EGFR、KRAS和BRAF基因扩增产物进行测序的测序引物；其序列分别如SEQIDNO.34、SEQIDNO.37、SEQIDNO.39、SEQIDNO.41、SEQIDNO.43、SEQIDNO.44、SEQIDNO.46和SEQIDNO.48所示。
9.权利要求3-8任一项所述的试剂盒在制备检测或辅助检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的产品中的应用。
10.一种非诊断目的的利用上述试剂盒检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的ARMS引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增，在81℃采集荧光信号，根据Ct值对检测结果进行判读，若ΔCt-1的ΔCt-2差别在1个循环内，ΔCt-2>8，则检测结果为阴性；
若ΔCt-1>ΔCt-2，ΔCt-2<8，则检测结果为阳性。
CN201610115008.1A 2016-03-01 2016-03-01 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒 Pending CN105567854A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610115008.1A CN105567854A (zh) 2016-03-01 2016-03-01 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610115008.1A CN105567854A (zh) 2016-03-01 2016-03-01 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105567854A true CN105567854A (zh) 2016-05-11

Family

ID=55878470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610115008.1A Pending CN105567854A (zh) 2016-03-01 2016-03-01 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567854A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105886650A (zh) * 2016-06-08 2016-08-24 广州凯普医药科技有限公司 Kras基因突变检测试剂盒
CN106282363A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 北京晋祺生物科技有限公司 一种kras基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
CN106755551A (zh) * 2017-03-20 2017-05-31 陈超 一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用
CN107385066A (zh) * 2017-08-17 2017-11-24 浙江大学 检测egfr基因突变的引物对、试剂盒、检测方法及应用
CN107400716A (zh) * 2017-08-24 2017-11-28 上海生物芯片有限公司 人braf基因v600e突变的pcr检测方法、引物、探针及试剂盒
CN107586851A (zh) * 2017-11-03 2018-01-16 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN107988369A (zh) * 2017-12-28 2018-05-04 北京雅康博生物科技有限公司 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒
CN108841940A (zh) * 2018-07-11 2018-11-20 上海兰卫医学检验所股份有限公司 一种提高荧光pcr实验检测效率的方法及系统
CN111500727A (zh) * 2020-04-30 2020-08-07 北京和合医学诊断技术股份有限公司 用于检测kras基因和braf基因突变的引物组及其应用方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443626A (zh) * 2011-09-22 2012-05-09 厦门艾德生物医药科技有限公司 肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒
CN102796816A (zh) * 2012-07-06 2012-11-28 陕西北美基因股份有限公司 一种体外准确检测kras基因突变的方法
CN103305625A (zh) * 2013-07-08 2013-09-18 广东省人民医院 检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用
CN103865993A (zh) * 2012-12-18 2014-06-18 深圳华大基因研究院 肿瘤靶向药物有效性检测、突变富集方法、引物对及试剂
CN104450948A (zh) * 2014-12-31 2015-03-25 北京圣谷同创科技发展有限公司 癌症检测方法、试剂盒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443626A (zh) * 2011-09-22 2012-05-09 厦门艾德生物医药科技有限公司 肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒
CN102796816A (zh) * 2012-07-06 2012-11-28 陕西北美基因股份有限公司 一种体外准确检测kras基因突变的方法
CN103865993A (zh) * 2012-12-18 2014-06-18 深圳华大基因研究院 肿瘤靶向药物有效性检测、突变富集方法、引物对及试剂
CN103305625A (zh) * 2013-07-08 2013-09-18 广东省人民医院 检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用
CN104450948A (zh) * 2014-12-31 2015-03-25 北京圣谷同创科技发展有限公司 癌症检测方法、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALOIS H. LANG等: "Optimized Allele-Specific Real-Time PCR Assays for the Detection of Common Mutations in KRAS and BRAF", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
ANNE JARRY等: "Real-time allele-specific amplification for sensitive detection of the BRAF mutation V600E", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105886650A (zh) * 2016-06-08 2016-08-24 广州凯普医药科技有限公司 Kras基因突变检测试剂盒
CN106282363A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 北京晋祺生物科技有限公司 一种kras基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
CN106755551A (zh) * 2017-03-20 2017-05-31 陈超 一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用
CN107385066A (zh) * 2017-08-17 2017-11-24 浙江大学 检测egfr基因突变的引物对、试剂盒、检测方法及应用
CN107385066B (zh) * 2017-08-17 2021-03-23 浙江大学 检测egfr基因突变的引物对、试剂盒、检测方法及应用
CN107400716A (zh) * 2017-08-24 2017-11-28 上海生物芯片有限公司 人braf基因v600e突变的pcr检测方法、引物、探针及试剂盒
CN107586851A (zh) * 2017-11-03 2018-01-16 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN107988369A (zh) * 2017-12-28 2018-05-04 北京雅康博生物科技有限公司 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒
CN107988369B (zh) * 2017-12-28 2020-11-17 北京雅康博生物科技有限公司 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒
CN108841940A (zh) * 2018-07-11 2018-11-20 上海兰卫医学检验所股份有限公司 一种提高荧光pcr实验检测效率的方法及系统
CN111500727A (zh) * 2020-04-30 2020-08-07 北京和合医学诊断技术股份有限公司 用于检测kras基因和braf基因突变的引物组及其应用方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105567854A (zh) 一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒
CN106520931B (zh) Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN110964814B (zh) 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法
CN103382503B (zh) Egfr基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒及检测方法
NZ566387A (en) Method to predict or monitor the response of a patient to an ErbB receptor drug by screening for mutations in an ErbB receptor
CN110541033B (zh) Egfr基因突变检测用组合物及检测方法
EP3218518A1 (en) Determining tumor load and biallelic mutation in patients with calr mutation using peripheral blood plasma
CN102304581A (zh) 用于检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法
CN105039514A (zh) 人类braf基因v600e突变检测试剂盒
JP2019537436A (ja) 進行性胃癌患者の手術後の予後または抗癌剤適合性予測システム
CN104017887A (zh) 人类braf基因突变检测引物对和探针及其试剂盒
CN101845520A (zh) 一种hpa等位基因分型检测试剂盒
CN106498029B (zh) 提高egfr的t790m突变的诊断效率的方法
CN106498028B (zh) Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒
CN103740843A (zh) 一种检测egfr基因外显子21l858r点突变的试剂盒和方法
CN103103259A (zh) 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物
CN107022621A (zh) Braf基因突变检测引物探针及其试剂盒
KR101775953B1 (ko) 돌연변이 유전자 검사 방법 및 킷트
CN106755551A (zh) 一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用
CN107058548A (zh) c‑kit基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN107604069A (zh) 基于Taqman‑MGB探针的人JAK2 V617F突变检测试剂盒和方法
CN110066873A (zh) 基于数字pcr技术检测egfr基因l858r突变的特异性引物、探针及试剂盒
CN102181536A (zh) 用于检测人类egfr基因19号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法
WO2018186687A1 (ko) 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법
CN107029238B (zh) Linc01094在诊治缺血性脑卒中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160511