KR101775953B1 - 돌연변이 유전자 검사 방법 및 킷트 - Google Patents

돌연변이 유전자 검사 방법 및 킷트 Download PDF

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Abstract

해결하려는 과제: 정상 DNA와 함께 존재하는 다수 개의 결실 돌연변이 DNA 등을 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하려는 것.
해결수단: PCR 증폭용 프라이머 셋트와, 플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하여 정상 DNA 증폭을 억제하는 프라이머 및 프로브 셋트를 포함하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법을 제공한다. 이를 이용하면 정상 DNA 증폭을 효율적으로 억제하고 미량의 돌연변이 DNA를 증폭할 수 있다.

Description

돌연변이 유전자 검사 방법 및 킷트 {Detection methods of mutation and the kits}
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응 (real-time PCR, RT-PCR)을 이용하여 돌연변이 유전자를 검사하는 방법 및 이를 이용한 돌연변이 유전자 검사 킷트에 관한 것으로서, 좀 더 자세하게 설명하면 결실 또는 부가 돌연변이 (deletion or addition mutation)를 효과적으로 검사하는 방법 및 킷트에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 정상 (비결실 또는 야생형) 유전자 증폭을 효율적으로 억제하고 미량의 돌연변이 (결실 또는 부가 돌연변이 등) 유전자를 증폭하여 검출할 수 있는 새롭고 효과적인 방법과 킷트에 관한 것이다.
유전자의 돌연변이 분석은 인간 유전질환 진단, 약물 유전학, 약물 개발 그리고 미생물학 등 다양한 과학 분야에서 그 중요성이 강조되면서 빠르게 성장하고 있는 분야이다. 유전학 분야에서 돌연변이는 DNA를 구성하는 염기서열의 변화를 말하며 전좌, 역위를 비롯하여 특정 유전자의 삽입/결실과 단일염기 다형성 (SNP) 등이 포함된다. 암호화 부위의 돌연변이는 유전자의 기능, 단백질의 구조 또는 발현에 영향을 줄 수 있기 때문에 종양 및 유전질환 연구와 진단에서 주요한 분자 마커로 사용되고 있다 (Kim, S. & Misra, A. 2007. Annu. Rev. Biomed. Eng., 9: 289-320). 특히 종양, 예를 들면, 폐암, 간암, 식도암, 구강암, 위암, 갑상선암, 자궁암, 유방암, 뇌종양, 난소암, 췌장암, 담도암, 피부암, 전립선암, 백혈병 등에 있어서 유전자 변이가 발견될 수 있으며, 이들 변이 유전자로는 EGFR (epidermal growth factor receptor; 상피세포 성장인자 수용체), KRAS, TP53, JAK2, BRCA1, BRCA2 등 다수의 암 관련 유전자가 알려져 있다. 이 중에서 폐암의 경우를 보면 폐암의 80% 정도를 차지하는 비소세포성암 (NSCLC, non-small cell lung cancer)과 EGFR 유전자의 변이가 밀접한 연관이 있음이 밝혀지고 있다. EGFR 변이는 엑손 18, 19, 20에서 점 돌연변이, 결실, 부가 등의 변이가 관찰되는데, 이중 특히 키나아제 도메인인 엑손 19 중 20 bp 내외의 염기 부위에 결실이 빈번히 발생하고 있으며, 엑손 19의 변이는 EGFR 변이형 폐암의 약 50~55%를 차지하는 주요 변이이다 (Mitsudomi and Yatabe 2010, FEBS J. 2010;277(2):301-308). 이와 더불어 엑손 21의 점 돌연변이를 포함하면 전체 EGFR 변이의 약 90%를 차지한다. 이들 변이의 유무 또는 변이형에 따라 항암제 예컨대 티로신 키나아제 억제제의 반응이 달라질 수 있다. 그러므로 변이의 정확한 검출은 치료 및 환자의 예후 관찰에 있어 매우 주요하다. 특히 암의 초기진단과 암이 전이를 예견하기 위한 방법으로 혈액 진단과 같은 액상 생체검사 (liquid biopsy)와 같이 소량의 암세포, 또는 암 유래 유전물질로부터 변이 유전자를 검출하는 방법이 매우 주요한 기술로 대두하고 있다. 이러한 임상학적 요구에 따라, 검출 민감도 및 특이도가 높은 기술의 개발이 요구되고 있다.
현재는 종양 등의 질환 유전자 변이를 높은 신뢰도와 민감도로 빠르고 경제적으로 분석할 수 있는 다양한 방법들이 개발되고 있다. 현재까지 알려진 주요 돌연변이 검출 방법 (EGFR mutatation tests)에는 직접 염기서열 결정법, PCR-SSCP, Taqman PCR, Cycleave PCR, PCR-RFLP, PNA-LNA PCR clamp, Scorpion ARMs SMAP, MEMO-PCR 등의 기술이 알려져 있으며, 이들의 감도 (변이 DNA 검출 %)는 0.1 ~ 25% 수준으로 매우 낮다. 대부분의 암은 체세포 돌연변이이므로 이들은 정상세포와 혼재되어 있어 정상세포 유래의 DNA의 증폭을 배제하고 돌연변이 세포 유래의 DNA를 특이적으로 증폭하는 기술이 요구된다. 정상 DNA의 증폭을 억제하고 돌연변이 DNA를 선택적으로 증폭하는 PCR 방법으로는 블로킹 프라이머 (blocking primer)를 이용하는 PCR 클램핑 (PCR clamping) 법 및 이와 유사한 REMS-PCR (Restriction endonuclease selective PCR), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid)를 사용하는 방법 (Nagai Y, Cancer Res 2005; 65: 72767282), 한국등록특허공보 10-1312241호에 기재된 MEMO-PCR (mutant enrichment with terminal-modified oligonucleotide PCR) 기술이 개발되었으나, LNA와 PNA는 원료의 제조 비용이 비싼 단점이 있으며, 정상 DNA의 증폭을 완전히 억제하지는 못한다. 또한, MEMO-PCR 기술은 PCR 증폭산물을 염기분석하여 확인하는 방법으로는 적절하지만 실시간 중합효소 연쇄반응에 적용하기에는 기술적인 한계가 있다.
돌연변이를 확인하는 가장 효율적인 방법으로 실시간 중합효소 연쇄반응법이 있는데, 이 방법은 빠르며, 분석 비용이 저렴하고 쉽게 자동화가 가능하기 때문에 돌연변이를 확인하기 위하여 가장 광범위하게 사용되는 방법이며 그 활용도는 더욱 커지고 있다. 또한, 이 방법은 기존의 일반 PCR과 달리 아가로즈 겔을 이용하는 전기영동 분석이 필요 없어 오염에 의한 분석 오류를 최소화할 수 있는 장점도 있다.
RT-PCR로 돌연변이를 분석하는 방법 중 가장 대표적인 것은 가수분해 프로브 방식인 TaqMan 프로브를 이용하는 분석방법이며, 이에 적용된 기본 원리는 Taq DNA 폴리머레이즈가 보유하고 있는 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성을 이용하는 것이다. 1991년 Holland 등은 주형 DNA와 상보적 염기서열을 갖는 프로브를 사용할 경우 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성에 의해 특정 PCR 반응을 실시간으로 확인할 수 있음을 밝혔다. 또한, 이때 사용되는 프로브는 주형 DNA와 100% 상보성을 갖는 경우뿐 아니라 5'-말단의 비상보적 플랩 (flap) 부위를 갖는 프로브도 구분없이 Taq DNA의 5→3' 엑소뉴클레이즈 활성에 의해 분해됨을 확인하였다 (Holland P. M. et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 7276-7280). 이후 이 방법을 기반으로 형광 안료로 수식된 프로브를 활용한 다양한 RT-PCR 기법들이 개발되어 여러 분야에서 광범위하게 활용되고 있다 (Heid, C. A. et al., 1996. Genome Res. 6. 986-994.; Livak K. J. 1999. Genet. Anal., 14:143-149).
본 출원인의 대한민국 등록특허 제1598398호에는 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하여 변이를 검출하는 RT-PCR 방법이 제시되어 있다. Taq DNA 폴리머레이즈를 포함한 원핵생물 패밀리 A 폴리머레이즈는 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성 이외에 5-플랩을 제거하는 엔도뉴클레이즈 (Flap endonuclease; FEN) 활성을 동시에 가지고 있는 것으로 알려져 있다 (Lyamichev, V. et al. 1993. Science, 260: 778-783). 상기 특허는 FEN 활성을 제어하는 독특한 방법 (Novel SNP Typing System; 본 명세서에서 "NSTS"와 혼용함)을 제시하고 있다. 단, 이 발명에는 SNP와 같은 비교적 짧은 부위 (1 내지 5 염기)의 변이를 효과적으로 검출할 수 있으나, 동일한 부위에 여러 가지 유형의 결실 또는 부가 돌연변이가 있는 경우 이를 검출하는 데는 한계가 있다. 예컨대 폐암과 관련이 있는 EGFR 변이 중 엑손 19 위치의 결실은 유사 부위에 수십여 개의 변이가 알려져 있다 (The Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, COSMIC; http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). 이 변이들을 검출하기 위한 한 방법으로 상기 NSTS 시스템을 사용할 경우 이들 다수의 변이에 특화된 각각의 프라이머 및 프로브를 만들어야 한다. 각각의 유전변이를 검출하기 위한 다수의 PCR 셋트를 구성할 경우 개발과 진단에 많은 시간과 경비가 소요되어 매우 비경제적이고 비효율적이다. 그러므로, 상기 변이 부위를 한 가지 PCR 셋트로 모두 검출이 가능하도록 구성하는 것이 중요하다.
본 발명의 목적은 정상 DNA와 함께 존재하는 돌연변이 DNA를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 한 가지 프라이머 및 프로브 셋트로 하나의 돌연변이 부위에 발생한 다수의 돌연변이를 검출하는 효과적인 방법을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 빈번하게 발생하는 결실 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하려는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 DNA 중합효소의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하는 기술을 활용하여 정상 DNA의 증폭을 억제하고 돌연변이 DNA를 효과적으로 검출하는 PCR 방법, 특히 RT-PCR 방법을 발명하였다.
본 발명에서 용어, "NSTS (Novel SNP Typing System)"는 DNA 폴리머레이즈의 뉴클레이즈 활성의 특이도를 이용한 본 출원인의 새로운 SNP 검출용 시스템을 총괄적으로 지칭하며, 구체적인 내용은 한국특허 제1598398호에 개시되었다. 좀 더 자세히 설명하면, "NSTS"는 프로브가 표적 염기서열과 혼성화 결합 후 형성되는 프로브의 5' 말단 구조에 따라서 DNA 폴리머레이즈의 뉴클레이즈 활성이 달라지는데, 이 현상을 이용하여 SNP 등의 유전자 돌연변이를 구별할 수 있는 검사 시스템을 의미한다.
본 발명에서 증폭용 전방 프라이머와 증폭용 후방 프라이머는 야생형 및 돌연변이 DNA 염기서열에 공통적인 서열 또는 그 상보서열을 포함하고, 돌연변이 해당영역 밖에서 주형 DNA와 결합하여 주형 DNA의 증폭에 사용되는 프라이머를 말한다. 상기 "돌연변이 해당영역"이라 함은 돌연변이 DNA에서는 야생형 DNA와 다른 서열을 가지고 결실, 부가 또는 결실/부가된 염기서열 부분 즉, 돌연변이 영역을 말하고, 야생형 DNA에서 "돌연변이 해당영역"이라 함은 상기 돌연변이 DNA의 돌연변이 영역에 대응하는 부분을 말한다.
본 발명에서 "증폭억제용 프라이머" 또는 "NSTS 프라이머"는 필히 돌연변이 해당영역을 포함하며, 야생형 DNA와 동일한 염기서열을 갖고, 5' 말단의 연속되는 5 염기 이상, 바람직하게는 5~30 염기가 증폭용 전방 프라이머의 3' 말단과 중첩되며, 3' 말단은 돌연변이 해당영역 내에 위치하거나 또는 돌연변이 해당영역을 지나 연장되며, 3' 미스매치에 의해 또는 돌연변이 해당영역에 결합하지 못하여 돌연변이 해당영역을 증폭시키지 않는 프라이머를 말한다.
본 발명에서 "증폭억제용 프로브" 또는 "NSTS 프로브"는 야생형 DNA와 상보적인 염기서열을 갖고, 플랩 구조를 제외한 5' 말단이 상기 증폭억제용 프라이머의 5' 말단으로부터 24~38 염기에 위치하고, 5' 말단의 2~5 염기가 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA의 서열과 매치되지 않아 플랩 구조를 나타내어 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 작동하지 않도록 하고, 상기 증폭억제용 프라이머와 함께 작동하여 상기 전방 프라이머의 작동을 차단함으로써 야생형 DNA의 증폭을 억제하는 프로브를 말한다.
본 발명에서 용어 "TaqMan™ 프로브"는 양 말단에 리포터와 퀀처 기능이 가능한 형광물질이 결합된 변형 올리고뉴클레오타이드 프로브를 말하며, 표적 염기서열과 프로브 간의 결합 강도에 따라 Tm 값이 달라지는 것을 이용하여 돌연변이를 검사하는 용도로 이용하는 것을 말한다. 구체적으로 리포터로 FAM (6-carboxyfluorescein), 퀀처로 BHQ1 (black-hole-quencher 1), TAMRA (tetramethylrhodamine) 등을 이용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 RT-PCR로 돌연변이 유전자를 검출하는 방법 및 킷트에 관한 것이고, 이에 필요한 증폭용 프라이머 셋트 (전방 프라이머와 후방 프라이머), 정상 DNA의 증폭을 억제하는 증폭억제용 프라이머 (NSTS 프라이머)와 증폭억제용 프로브 (NSTS 프로브), 그리고 증폭 산물의 검출을 위해 양 말단이 수식된 프로브 {앙쪽 표지 프로브 (dual labeled probe) 또는 TaqMan™ 프로브} 또는 비수식 프로브를 포함하여 돌연변이 유전자를 검출하는 방법 및 킷트에 관한 것이다.
본 발명은 DNA 폴리머레이즈를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 있어서,
돌연변이 DNA를 포함하는 주형 DNA;
야생형 DNA 및 돌연변이 DNA 염기서열에 공통적인 서열 또는 그 상보서열을 포함하고, 돌연변이 해당영역 밖에서 주형 DNA와 결합하는 증폭용 전방 프라이머 및 증폭용 후방 프라이머;
돌연변이 해당영역을 포함하며, 야생형 DNA와 동일한 염기서열을 갖고, 5' 말단의 연속되는 5 염기 이상의 염기서열이 상기 증폭용 전방 프라이머의 3' 말단과 중첩되며, 3' 말단이 돌연변이 해당영역 내에 위치하거나 또는 돌연변이 해당영역을 지나 위치하며, 3' 말단 미스매치에 의해 또는 돌연변이 해당영역에 결합하지 못하여 돌연변이 해당영역을 증폭시키지 않는 증폭억제용 프라이머; 및
야생형 DNA와 상보적인 염기서열을 갖고, 플랩 구조를 제외한 5' 말단이 상기 증폭억제용 프라이머의 5' 말단으로부터 24~38 염기에 위치하며, 5' 말단의 2~5 염기가 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA의 서열과 매치되지 않아 플랩 구조를 나타내어 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 작동하지 않도록 하고, 상기 증폭억제용 프라이머와 함께 작용하여 상기 전방 프라이머의 작동을 차단함으로써 야생형 DNA의 증폭을 억제하는 증폭억제용 프로브;를 가하여 반응시킴을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
상기 증폭억제용 프라이머의 설명에서 "동일한" 서열이라 함은 야생형 DNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 염기서열을 말하며, 염기서열이 100% 동일한 경우뿐만 아니라, 예컨대 증폭억제용 프라이머의 전장 20~40 염기 중 내부의 1 염기 또는 불연속적인 2 염기가 야생형 DNA 서열과 비교할 때 차이가 있으나, 전체적으로 야생형 DNA와 상보적인 서열에 결합하는 정도로 볼 때 Tm 값 차이가 미미한 서열을 포함하는 의미로 "동일한 서열"이라는 표현을 사용하였다.
또한, 본 발명에서 상기 돌연변이 DNA는 연속되는 3 이상의 염기가 결손 또는 부가된 것임을 특징으로 한다. 본 발명의 방법으로는 연속되는 3 이상의 염기 결손 또는 부가 돌연변이를 탐지할 수 있으며, 상한은 없으나, 바람직하게는 연속되는 3 이상 100 이하의 염기 결손 또는 부가를 탐지할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 증폭억제용 프로브는 3' 말단이 블로킹된 것임을 특징으로 한다. 증폭억제용 프로브의 3' 말단 블로킹은 예컨대 아민기, 인산염, 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 바이오틴 중 선택된 1종을 이용하여 3' 말단 수산화기를 제거하거나 수산화기에 보호기를 결합시키는 것을 특징으로 하지만, 블로킹 방법이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 실시간 중합효소 연쇄반응 산물을 확인하기 위하여 검출용 수식 프로브 또는 검출용 비수식 프로브를 부가함을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 실시간 중합효소 연쇄반응 산물의 검출은 직접 전기영동 방법, 직접 염기서열분석방법, 삽입물질을 가하는 방법 또는 리포터와 퀀처로 이중 수식된 프로브를 사용하는 방법으로 수행함을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 돌연변이 DNA를 포함하는 주형 DNA, 야생형 DNA와 돌연변이 DNA 염기서열에 공통적인 서열 또는 그 상보서열을 포함하고 돌연변이 해당영역 밖에서 주형 DNA와 결합하는 증폭용 전방 프라이머, 증폭용 후방 프라이머, 그리고 내열성 DNA 폴리머레이즈를 포함하는 유전자 돌연변이 검사용 중합효소 연쇄반응 킷트에 있어서,
돌연변이 해당영역을 포함하며, 야생형 DNA와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖고, 5' 말단의 연속되는 5 염기 이상이 상기 증폭용 전방 프라이머의 3' 말단과 중첩되며, 3' 말단이 돌연변이 해당영역 내에 위치하거나 또는 돌연변이 해당영역을 지나 위치하며, 3' 말단 미스매치에 의해 또는 돌연변이 해당영역에 결합하지 못하여 돌연변이 해당영역을 증폭시키지 않는 증폭억제용 프라이머; 및
아생형 DNA와 상보적인 염기서열을 갖고, 플랩 구조를 제외한 5' 말단이 상기 증폭억제용 프라이머의 5' 말단으로부터 24~38 염기에 위치하고, 5' 말단의 2~5 염기가 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA의 서열과 매치되지 않아 플랩 구조를 나타내는 증폭억제용 프로브;를 포함함을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이 DNA는 연속되는 3 염기 이상이 결손 또는 부가된 것임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 증폭억제용 프로브의 3' 말단이 블로킹된 것임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 증폭억제용 프로브의 3' 말단이 아민기, 인산염, 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 바이오틴 중 선택된 1종을 이용하여 3' 말단 수산화기가 제거되거나 수산화기에 보호기가 결합되어 블로킹된 것임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 실시간 중합효소 연쇄반응 산물을 확인하기 위한 검출용 수식 프로브 또는 검출용 비수식 프로브가 부가된 것을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 비수식 프로브가 삽입제임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 수식 프로브가 리포터와 퀀처로 이중 수식된 프로브임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 킷트의 실제적인 예로서,
증폭용 전방 프라이머 서열은 5'-AAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3' (서열번호 83),
증폭억제용 프라이머 서열은 5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCA-3' (서열번호 86),
증폭억제용 프로브 서열은 3'-pAGTTCCTTAATTCTCTTCGTTagg-5'임 (서열번호97) (주: 5' 말단의 agg는 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA 서열과 매치되지 않음을 나타내기 위하여 소문자로 기재하였음)을 특징으로 하는 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 엑손 19의 결실 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 EGFR 돌연변이 검사용 킷트에서
검출용 프로브 서열은 5'-TGCTTTGCTGTGTGGGGGTCC-3' (서열번호 80),
증폭용 후방 프라이머 서열은 5'-GTCTAGAGCAGAGCAGCTGCCA-3' (서열번호 77)임을 특징으로 하는 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 엑손 19의 결실 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
본 발명에서는 증폭억제용 프라이머와 증폭억제용 프로브를 통해 증폭용 프라이머 셋트 즉, 증폭용 전방 프라이머 및 증폭용 후방 프라이머에 의한 야생형 DNA의 증폭을 효율적으로 억제하는 수단을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 돌연변이 유전자 검출 방법을 수행하는 진단조성물이 포함되는 유전자 검출용 킷트에 관한 것으로서, DNA 폴리머레이즈, 주형으로서 돌연변이 DNA, 증폭용 전방 프라이머, 증폭용 후방 프라이머, 증폭억제용 프라이머 및 증폭억제용 프로브를 포함한다. 주형으로서 야생형 DNA를 더 포함할 수도 있다. 또한, 검출용 프로브를 더 포함할 수 있다. 상기 돌연변이 유전자 검출 방법 및 검출용 킷트는 돌연변이 검출, 종양의 진단, 면역질환의 진단 등에 이용할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 방법은 고형암, 혈액암 등 다양한 암의 진단뿐만 아니라, 암조직 절편, 혈액 또는 여타 임상시료 내에 존재하는 순환 암세포 (circulating tumor cell; CTC), CT-DNA (circulating tumor DNA), CT-RNA (circulating tumor RNA) 등을 포함하는 임상시료에 널리 적용할 수 있으며, 적용 범위가 어느 특정한 질병 또는 특정 임상시료에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 제공하는 돌연변이 검출방법은 EGFR (epidermal growth factor receptor), KRAS, TP53, JAK2, BRCA1, BRCA2 등 다수의 암 관련 유전자의 변이 등에 적용할 수 있으며, 어느 특정한 유전자의 변이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 PCR 특히 RT-PCR 방법을 기반으로 돌연변이 유전자를 검출하기 위하여 정상 (야생형) 유전자와 돌연변이 유전자에 공통인 염기서열 또는 그 상보서열을 가진 전방 프라이머와 후방 프라이머로 구성된 증폭용 프라이머 셋트, 그리고 야생형 DNA 염기서열에는 포함되나 돌연변이 DNA 염기서열에는 포함되지 않는 염기서열 또는 그 상보서열을 포함하는 증폭억제용 프라이머와 증폭억제용 프로브로 구성된 정상 DNA 증폭억제용 올리고뉴클레오타이드 셋트, 그리고 증폭 산물을 검출하기 위한 검출용 프로브 (예컨대 TaqMan 프로브 등)를 제공한다. 단, 본 발명에서 증폭 산물의 검출은 직접전기영동, 직접 염기서열분석 또는 SYBRgreen 등의 삽입물질 (intercalating agent) 사용 등을 통한 형광검출로도 가능하므로, 반드시 검출용 프로브를 사용해야 하는 것은 아니다.
본 발명의 구성을 좀 더 구체적으로 설명하기 위하여 본 발명자들은 폐암에서 자주 발견되는 EGFR의 엑손 19 결실부위를 검출하는 방법을 구체적인 실시예로 들어 실험하였다. 그러나, 본 발명이 EGFR 엑손 19 돌연변이를 검출하는 방법에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 증폭용 프라이머 셋트와 증폭억제용 올리고뉴클레오타이드 셋트를 하나의 킷트로 하여 하나의 돌연변이 영역에 해당하는 다수 개의 변이를 한 번에 검사할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 최대한의 검출 민감도를 보장하기 위해 정상 (야생형) DNA의 증폭은 억제하고 돌연변이 DNA 증폭을 허용하는 방법을 제공한다. 증폭억제용 프라이머는 정상 DNA를 주형으로 하는 증폭용 전방 프라이머에 의한 중합을 억제하는 반면, 돌연변이 DNA를 주형으로 하는 DNA 중합은 억제하지 않는다. 또한, 증폭억제용 프라이머는 증폭용 프라이머가 없을 때 정상 DNA를 주형으로 하는 증폭용 프라이머로 작용하는데, 이 증폭 반응은 증폭억제용 프로브에 의하여 억제된다. 이때 증폭억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트 즉, 증폭억제용 프라이머와 증폭억제용 프로브는 정상 DNA의 염기서열에 없는 돌연변이 영역 즉 결손부위나 부가부위, 결손 및 부가부위의 염기서열 또는 그 상보서열을 포함하여 구성되기 때문에, 증폭억제용 올리고뉴클레오타이드 셋트를 가하지 않는 경우에는 증폭용 프라이머 셋트에 의하여 돌연변이 DNA를 주형으로 하는 증폭이 억제되지 않는다.
본 발명에서 증폭용 전방 프라이머는 정상 DNA 및 돌연변이 DNA에 모두에 존재하는 염기서열 또는 그 상보서열을 가지며, 증폭용 전방 프라이머의 3' 말단이 돌연변이 DNA의 결손 염기서열로부터 0 내지 10 염기가 떨어져 있고, 전체 길이가 보통 10 내지 40 염기, 바람직하게는 20~35 염기로 구성되는 통상의 PCR 증폭용 프라이머이다.
본 발명에서 증폭용 후방 프라이머는 정상 DNA 및 돌연변이 DNA 모두에 존재하는 염기서열 또는 그 상보서열을 가지며, PCR 증폭시 전방 프라이머와 같이 작용하여 돌연변이 DNA의 결손 염기서열을 포함하는 산물을 증폭할 수 있도록 구성되며, 후방 프라이머로부터 전방 프라이머 서열까지의 거리, 즉 증폭 산물의 크기에 제한은 없다. 후방 프라이머는 10 내지 40 염기로 구성되는 통상의 PCR 증폭용 프라이머와 동일하거나 유사한 크기로 제조한다.
본 발명에서 증폭억제용 프라이머 (또는 NSTS 프라이머)는 야생형 DNA와 동일한 염기서열을 갖고, 5' 말단의 연속되는 5 염기 이상이 증폭용 전방 프라이머의 3' 말단부위의 서열과 중첩된다.
본 발명에서 증폭억제용 프로브 (또는 NSTS 프로브)는 야생형 DNA와 상보적인 염기서열을 갖고, 플랩 구조를 제외한 5' 말단이 상기 증폭억제용 프라이머의 5' 말단으로부터 24~38 염기에 위치하며, 5' 말단의 2 내지 5 염기가 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA의 염기서열과 매치되지 않아 플랩 구조를 나타낸다.
본 발명에서 증폭 산물을 확인하기 위한 방법으로는 증폭 산물의 직접 전기영동, 제한효소 절단 후 전기영동, 증폭 산물의 직접 염기서열분석 또는 SYBRgreen 등의 삽입제 (intercalating agent) 사용, TaqMan 프로브와 같은 이중표지 프로브 등을 통한 형광검출 방법이 있으며, 바람직하게는 형광검출 방법, 더욱 바람직하게는 증폭 산물 내부의 서열 또는 그 상보서열과 동일한 염기서열로 구성된 5 내지 20 염기, 더욱 바람직하게는 7 내지 15 염기로 구성되는 양쪽 표지 프로브를 이용한다.
본 발명의 PCR에 사용되는 DNA 폴리머레이즈 종류에 특별한 제한은 없으나, 구체적인 예로서는 써머스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus), 써머스 써모필러스 (Thermus thermophilus), 써머스 플라부스 (Thermus flavus), 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 써모코커스 고르고나리우스 (Thermococcus gorgonarius), 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 써모코커스 코다카라엔시스 (Thermococcus kodakaraensis), 파이로코커스 워에세이 (Pyrococcus woesei), 파이로코커스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus), 아에로파이룸 퍼닉스 (Aeropyrum pernix), 아퀴펙스 애올리쿠스 (Aquifex aeolicus), 술포로부스 토코다이 (Sulfolobus tokodaii), 파이롤로부스 퓨마리 (Pyrolobus fumarii) 및 메타노피루스 칸드레리 (Methanopyrus kandleri)로 이루어진 군에서 선택된 내열성 DNA 폴리머레이즈 또는 울트라 DNA 폴리머레이즈 등을 포함하는 야생형 또는 그 유래의 변이형 내열성 DNA 폴리머레이즈를 들 수 있다. 내열성 DNA 폴리머레이즈는 인공적으로 합성된 내열성 DNA 폴리머레이즈를 포괄한다.
본 발명에서 시료는 검출하고자 하는 돌연변이 유전자를 포함하고 있는 시료가 모두 포함된다. 구체적으로는 인간을 포함하는 동물, 세균, 식물, 바이러스, 배양한 세포, 인간을 포함하는 동물, 식물 등의 생물에서 적취한 시료에서 분리한 핵산 및 그 유래의 서열을 토대로 인공 합성된 핵산을 모두 포함한다. 더욱 바람직하게는 시료는 인간 유래의 임상시료 (종양괴, 혈액, 기타 세포 및 혈액을 포함하는 적출물 등)이며, 그로부터 확보한 핵산을 포함하는 시료이다. 이들 시료, 또는 적절한 핵산 분리 과정을 통해 확보한 핵산 시료, 그리고 그 시료로부터 증폭 또는 인공 합성된 핵산을 포함하는 시료이다. 본 발명의 시료 채취방법, 채취시기, 핵산 분리 또는 증폭 방법, 핵산 단편의 크기, 순도, 농도 등이 본 발명의 한계를 결정하는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의하면, 정상 유전자의 염기서열에는 포함되나 돌연변이 유전자의 염기서열에는 포함되지 않는 염기서열 또는 그 상보서열을 포함하여 구성된 증폭억제용 프라이머와 증폭억제용 프로브로 구성된 정상 DNA 증폭억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트에 의해 정상 DNA 증폭이 효율적으로 억제되는 효과를 제공한다.
본 발명에 따르면, 정상 유전자의 증폭을 효과적으로 억제하고 정상 유전자와 함께 존재하는 돌연변이 유전자를 증폭함으로써 돌연변이 유전자의 존재를 높은 민감도와 높은 특이도로 실시간으로 검출할 수 있는 경제적인 유전자 돌연변이 검출 방법이 제공된다.
본 발병의 방법은 대한민국 특허 제1598398호의 NSTS의 기술을 결손 돌연변이 검출에 적용한 것으로 하나의 킷트로 다수의 결손 돌연변이를 동시에 진단할 수 있는 효과적이고 경제적인 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 유전변이를 수반하는 질병, 예를 들면 종양과 같은 질병의 진단 및 치료 후의 암의 전이, 재발, 잔존하는 암의 검출과 같은 임상적 이용, 유전자 변형 농축산물 등의 검사 등 다양한 분야에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 사용한 프라이머 및 프로브의 배치 구성도이다.
도 2는 전방 프라이머, NSTS 프라이머, NSTS 프로브에 의한 증폭을 확인한 RT-PCR 시험 결과이다. 시험을 위한 프라이머 및 프로브로서 (A)에서는 전방 프라이머, 후방 프라이머, TaqMan 프로브를, (B)에서는 NSTS 프라이머, 후방 프라이머, TaqMan 프로브를, (C)에서는 NSTS 프라이머, 후방 프라이머, NSTS 프로브, TaqMan 프로브를, (D)에서는 NSTS 프라이머, 후방 프라이머, NSTS 프로브, 전방 프라이머를 사용하였다. 주형 유전자로서 정상 DNA 1×105 복제수 (-□-), 돌연변이 DNA 1×105 복제수 (-●-), 미첨가 (-)하여 시험하였다.
도 3은 전방 프라이머와 NSTS 프라이머의 중첩의 정도에 따른 정상 DNA의 증폭 억제 효과에 대한 시험 결과이다. 사용한 전방 프라이머는 (A)에서는 F4, (B)에서는 F8, (C)에서는 F9, (D)에서는 F10, (E)에서는 F11, (F)에서는 F12이다. 주형 유전자로서 정상 DNA 1×105 복제수(-□-), 돌연변이 DNA 1×105 복제수 (-●-), 미첨가 (-)하여 시험하였다.
도 4는 NSTS 프로브의 종류에 따른 증폭억제를 확인한 RT-PCR 시험 결과이다. (A)는 P2-2, (B)는 P3-1의 NSTS 프로브를 사용하였으며, 다른 조건은 두 시험에서 동일하다. 주형 유전자로서 정상 DNA 1×105 복제수(-□-), 돌연변이 DNA 1×105 복제수 (-●-), 미첨가 (-)하여 시험하였다.
도 5는 NSTS 프로브의 종류에 따른 NSTS 프라이머의 전방 프라이머 작용 억제효과 시험이다. 사용한 NSTS 프로브는 표시한 바와 같이 각각 NSTS 프로브 1, 2, 3이며, (A)에서는 NSTS 프라이머, NSTS 프로브, 후방 프라이머, TaqMan 프로브를, (B)에서는 전방 프라이머, 후방 프라이머, NSTS 프라이머, NSTS 프로브, TaqMan 프로브를 사용하였다. 주형 유전자로서 정상 DNA 1×105 복제수 (-●-); 돌연변이 DNA 1×105 복제수(-○-); 미첨가 (-)를 사용하였다.
도 6은 NSTS 프라이머와 NSTS 프로브에 대한 정상 DNA와 변이 DNA의 구분 정도를 내부 프라이머를 사용하는 방법 (MEMO)과 비교하여 시험한 RT-PCR 결과이다. (A)에서는 전방 프라이머, 후방 프라이머, TaqMan 프로브를, (B)에서는 NSTS 프라이머, NSTS 프로브, 후방 프라이머, TaqMan 프로브를, (C)에서는 전방 프라이머, 후방 프라이머, NSTS 프라이머, NSTS 프로브, TaqMan 프로브를, (D)에서는 내부 프라이머, 후방 프라이머, TaqMan 프로브를, (E)에서는 전방 프라이머, 후방 프라이머, 내부 프라이머, TaqMan 프로브를 사용하였다. 주형 유전자로는 돌연변이 DNA 1×105 복제수 (-●-); 정상 DNA 1×10 5 복제수(-■-); 정상 DNA 1×104 복제수(-▲-); 정상 DNA 1×103 복제수(-◆-); 정상 DNA 1×102 복제수(-○-); 미첨가 (-)를 사용하였다.
도 7은 정상 DNA의 증폭을 억제하기 위한 NSTS 프라이머/프로브의 효과 (A)와 내부 프라이머 (MEMO) (B)의 효과를 비교한 시험 결과이다. (A)에서는 전방 프라이머, 후방 프라이머, NSTS 프라이머, NSTS 프로브, TaqMan 프로브를, (B)에서는 전방 프라이머, 후방 프라이머, 내부 프라이머, TaqMan 프로브를 사용하였다. 주형 DNA로는 정상 DNA 3x106 복제수에 돌연변이 DNA를 각각 3x106 (-●-), 3x105 (-■-), 3x104 (-▲-), 3x103 (-○-), 3x102 (-□-), 3x101 (-△-), 3x100 (-◇-) 복제수로 첨가하였고, 돌연변이 DNA 미첨가 (--), 주형 DNA 미첨가 (―)를 대조구로 하였다.
도 8은 돌연변이 DNA의 종류 및 사용량에 따른 변이의 구별에 대한 시험 결과이다. (A)에서는 돌연변이 DNA 6225를, (B)에서는 돌연변이 DNA 12382를, (C)에서는 돌연변이 DNA 13550을 각각 정상 DNA 3x105 복제수에 첨가하여 주형 DNA로 사용하였다. 주형 DNA로는 3x 105 복제수 (-●-), 3x104 (-■-), 3x103 (-▲-), 3x102 (-○-), 3x101 (-□-), 3x100 (-△-) 복제수로 연속 희석하여 첨가하였고, 돌연변이 DNA 미첨가 (-◇-), 주형 DNA 미첨가 (―)를 대조구로 하였다.
도 9는 24종의 EGFR 엑손 19 결손 변이 검출 RT-PCR 시험 결과이다. 동일한 프라이머 및 프로브 셋트로 구성된 한 종류의 킷트로 24종의 변이 DNA와 정상 DNA 주형을 시험한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
DNA 시료 준비 및 프라이머 , 프로브 , RT- PCR
아래와 같이 EGFR 유전자의 정상 DNA 시료와 24종의 돌연변이 DNA 시료를 준비하였다. 프라이머 EGFR-e19-F (5'-AGGCCTAGACGCAGCATCATTAAA-3')(서열번호 1)와 EGFR-e19-R (5'-ACCAAAAACAATACCCATGCTCCA-3')(서열번호 2)을 이용하여 사람 정상 DNA를 주형으로 하여 PCR 진행하여 EGFR-e19-야생형 (정상 DNA 또는 정상 유전자)을 확보하였다. 이를 주형으로 표 1의 각 돌연변이에 해당하는 프라이머 셋트를 사용하여 돌연변이 DNA를 제조하였다. 예를 들어 COSM6223 돌연변이는 EGFR-e19-F와 6223의 R1 프라이머를 셋트로 하여 PCR로 단편 1을 확보하고, EGFR-e19-R과 6223의 F2 프라이머를 셋트로 하여 PCR로 단편 2를 확보하였다. 얻은 단편 1과 단편 2를 주형으로 하여 다시 EGFR-e19-F와 EGFR-e19-R 프라이머를 셋트로 하여 PCR로 전체 단편을 확보하고 이를 TOPcloner TA kit (enzynomics cat.EZ001)를 사용하여 pTOP V2 벡터에 클로닝하였다. 제조한 돌연변이 DNA는 염기서열분석으로 확인하였다. 이와 같은 방법으로 전체 24종의 돌연변이 DNA 플라스미드를 제조하여 표 1의 돌연변이 DNA로 사용하였다. 돌연변이 DNA 및 정상 DNA의 복제수는 광학밀도를 측정, 계산하여 결정하며, Hind Ⅲ로 처리하여 사용하였다.
각 실시예의 프라이머 및 프로브는 본 출원인인 (주)제노텍의 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다. RT-PCR은 ABI7500 Real-Time PCR Systems 또는 CFX9600 Real-Time System을 사용하여 증폭을 확인하였다.
아래 표 1은 EGFR 엑손 19 돌연변이 DNA 목록 및 서열을 나타낸다. 표 1에 기재된 서열은 서열번호 3~서열번호 75이다.
돌연변이
(COSMIC ID)		 돌연변이 서열 (5'->3') 프라이머 프라이머 서열 (5'->3')
Wild type CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA - -
COSM6223 CCCGTCGCTATCAA***************AACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CGGAGATGTTTTGATAGCGACGGGAAT
F2 CGTCGCTATCAAAACATCTCCGAAAGC
COSM6225 CCCGTCGCTATCAAG***************ACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CGGAGATGTCTTGATAGCGACGGGAAT
F2 CGCTATCAAGACATCTCCGAAAGCC
COSM12678 CCCGTCGCTATCAAGG***************CATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 GGAGATGCCTTGATAGCGACGGGAAT
F2 TCGCTATCAAGGCATCTCCGAAAGCC
COSM12369 CCCGTCGCTATCAAGGAAT***************CTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 GGCTTTCGGAGATTCCTTGATAGCGAC
F2 TATCAAGGAATCTCCGAAAGCCAACAAGG
COSM12386 CCCGTCGCTATCAAGG***************TATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CGGAGATACCTTGATAGCGACGGGAATT
F2 TCGCTATCAAGGTATCTCCGAAAGCC
COSM13550 CCCGTCGCTATCAA*********AATTCCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 ATGTTGGAATTTTGATAGCGACGGGAAT
F2 TCGCTATCAAAATTCCAACATCTCCGAAAG
COSM13551 CCCGTCGCTATCAA***************AATATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 AGATGGAATTTTGATAGCGACGGGAATTTT
F2 GCTATCAAAATTCCATCTCCGAAAGCCA
COSM13552 CCCGTCGCTATCAA************AATTCCATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 TTTCGGAATTTTGATAGCGACGGGAAT
F2 TCGCTATCAAAATTCCGAAAGCCAACAA
COSM12385 CCCGTCGCTATCAA******************AATTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CGGAGATATTTTGATAGCGACGGGAAT
F2 GTCGCTATCAAAATATCTCCGAAAGCCAA
COSM12370 CCCGTCGCTATCAAGGAAT******************CGAAAGCCAACAAGGAA R1 TGGCTTTCGATTCCTTGATAGCGACGG
F2 TATCAAGGAATCGAAAGCCAACAAGGAA
COSM6255 CCCGTCGCTATCAAGGAA******************CCGAAAGCCAACAAGGAA R1 GCTTTCGGTTCCTTGATAGCGACGGGA
F2 TATCAAGGAACCGAAAGCCAACAAGGAA
COSM12384 CCCGTCGCTATCAAGG******************TTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 GCTTTCGGAACCTTGATAGCGACGGGA
F2 GCTATCAAGGTTCCGAAAGCCAACAAGG
COSM12387 CCCGTCGCTATCAAGGAA******************CAGAAAGCCAACAAGGAA R1 GGCTTTCTGTTCCTTGATAGCGACGG
F2 CAAGGAACAGAAAGCCAACAAGGAAA
COSM18427 CCCGTCGCTATCAAGG******************TCTCGAAAGCCAACAAGGAA R1 GCTTTCGAGACCTTGATAGCGACGGGA
F2 TCAAGGTCTCGAAAGCCAACAAGGAAAT
COSM6220 CCCGTCGCTATCAAGGA******************TCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 TTTCGGATCCTTGATAGCGACGGGA
F2 CTATCAAGGATCCGAAAGCCAACAAGG
COSM12728 CCCGTCGCTATCAAG******************TCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 TTCGGAGACTTGATAGCGACGGGAA
F2 CGCTATCAAGTCTCCGAAAGCCAACAA
COSM12367 CCCGTCGCTATCAAGG******************CTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CTTTCGGAGCCTTGATAGCGACGGGA
F2 TATCAAGGCTCCGAAAGCCAACAAGG
COSM12382 CCCGTCGCTATCAAGGAA*********CCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 GAGATGTTGGTTCCTTGATAGCGACGG
F2 GAACCAACATCTCCGAAAGCCAACAA
COSM12383 CCCGTCGCTATCAAGGAA************CCATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CGGAGATGGTTCCTTGATAGCGACGG
F2 AAGGAACCATCTCCGAAAGCCAACAA
COSM12422 CCCGTCGCTATCAAGGA*********GCCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 AGATGTTGGCTCCTTGATAGCGACGGG
F2 GGAGCCAACATCTCCGAAAGCCAAC
COSM6218 CCCGTCGCTATCAAGGAA*********GCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 GAGATGTTGCTTCCTTGATAGCGACGGG
F2 CAAGGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAA
COSM6210 CCCGTCGCTATCAAGGAAT************CATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CGGAGATGATTCCTTGATAGCGACGGG
F2 ATCAAGGAATCATCTCCGAAAGCCAACA
COSM12403 CCCGTCGCTATCAAGGAA***************CAACCGAAAGCCAACAAGGAA R1 CTTTCGGTTGTTCCTTGATAGCGACGGG
F2 TATCAAGGAACAACCGAAAGCCAACAAGG
COSM12419 CCCGTCGCTATCAAGGA************GCAATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA R1 TCGGAGATTGCTCCTTGATAGCGACGGG
F2 CAAGGAGCAATCTCCGAAAGCCAACA
실시예 1:
결손 돌연변이 DNA와 정상 DNA의 구분을 위한 방법으로 NSTS 방법의 적용이 적절하며, NSTS 프라이머와 NSTS 프로브 셋트가 정상 DNA의 증폭을 억제함을 확인하는 시험이다. 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 아래와 같다.
* 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머: 5'- ttaaaattcccgtcgctatca-3'
후방 프라이머: 5'- gtctagagcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머: 5'-tcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브: 5'-gagttgcttctcttaattccttga-p-3'
(진한 글씨 두 염기는 비상보적임)
TaqMan 프로브: 5'-FAM- tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건조건:
95℃, 3분(1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 30초 (45회 반복)
* PCR 반응물 조성
돌연변이 DNA (1x105 복제수)와 정상 DNA (1x105 복제수) 각각 2 ul, 상기 프라이머와 TaqMan 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul), NSTS 프로브, NSTS 프라이머 각 1 ul (20 pmol/ul) 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 하였다.
상기 시험용 프라이머와 프로브 중에서 증폭용 프라이머 셋트 (전방 프라이머와 후방 프라이머) 그리고 검출용 TaqMan 프로브를 첨가하고, 증폭억제용 올리고뉴클레오타이드 셋트 (NSTS 프라이머 및 NSTS 프로브)를 첨가하지 않고 RT-PCR을 수행한 결과는 도 2의 A와 같이 정상 DNA (-□-)와 돌연변이 DNA (-●-) 모두 증폭되었다. 후방 프라이머와 NSTS 프라이머와 TaqMan 프로브만 첨가하여 RT-PCR을 수행한 결과는 도 2B와 같으며, 이는 NSTS 프라이머가 돌연변이 DNA를 증폭하지 않으며, 정상 DNA (-□-)만을 증폭함을 말해준다. 또, NSTS 프라이머와 후방 프라이머, TaqMan 프로브를 첨가하고 NSTS 프로브 (진한 글씨 두 염기는 비상보적임)를 첨가하여 RT-PCR을 수행한 결과는 도 2C와 같이 정상 DNA (-□-)와 돌연변이 DNA (-●-) 모두 증폭되지 않았다. 이는 NSTS 프로브가 NSTS 프라이머를 사용한 정상 DNA의 증폭을 억제한 결과이다. 마지막으로 모든 프라이머 셋트 및 프로브를 첨가하여 RT-PCR을 수행한 결과, 도 2D와 같이 돌연변이 DNA의 증폭이 원활하게 이루어지고 (Ct = 26) 정상 DNA의 증폭이 크게 억제 (Ct = 41)되었다. 이러한 결과로 볼 때 전방 프라이머는 NSTS 프라이머에 의해 억제되고, NSTS 프라이머는 NSTS 프로브에 의해 억제되어 정상 DNA의 증폭이 크게 억제됨을 확인할 수 있으며, 그에 반해 NSTS 프라이머가 결손영역이 존재하는 돌연변이 DNA와 결합 (hybridization)이 이루어지지 않아 NSTS 프로브에 의해 억제 되지 아니하고, 증폭용 프라이머 셋트 (전방 프라이머와 후방 프라이머)에 의해 돌연변이 DNA의 증폭이 원활하게 이루어진다. 상기 결과들을 종합해 보면, 증폭억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트에 의해 정상 DNA 증폭이 억제되고, 반면 돌연변이 DNA는 증폭용 프라이머 셋트에 의해 원활하게 증폭하여 RT-PCR로 돌연변이 DNA와 정상 DNA를 구분할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2:
NSTS 프라이머가 정상 DNA의 증폭을 원활하게 억제하기 위해 중첩되는 정도를 확인하기 위한 시험으로, 전방 프라이머의 종류를 다양하게 하여 RT-PCR을 수행한 시험이다. 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 아래와 같다. 단, 전방 프라이머는 각 한 종류만 첨가하여 시험하였다.
* 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머:
① 5'- aggtgagaaagttaaaattcccgt-3' (F4)
② 5'- agaaagttaaaattcccgtcg-3' (F8)
③ 5'- aaagttaaaattcccgtcgct-3' (F9)
④ 5'- agttaaaattcccgtcgctat-3' (F10)
⑤ 5'- ttaaaattcccgtcgctatca-3' (F11)
⑥ 5'- taaaattcccgtcgctatcaa-3' (F12)
후방 프라이머: 5'- gtctagagcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머: 5'-ccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브： 5'-ggattgcttctcttaattccttga-p-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM-tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건조건:
95℃, 3분(1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 30초 (45회 반복)
* PCR 반응물 조성
돌연변이 DNA (1x105 복제수)와 정상 DNA (1x105 복제수) 각 2 ul, 상기 프라이머와 TaqMan 프로브 각 1 ul (10 pmol/ul), NSTS 프로브, NSTS 프라이머 각 1 ul (20 pmol/ul) 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 하였다. 단, 각 전방 프라이머에서 진한 글씨 부분은 NSTS 프라이머와 동일한 염기 서열영역이다. 동일한 염기 서열영역은 DNA 주형에 전방 프라이머와 NSTS 프라이머가 경쟁적으로 결합이 가능한 영역으로 제공된다. 이러한 영역의 제공이 NSTS 프라이머에 의한 증폭억제에 필수적으로 여겨지며, 전방 프라이머 중 F4는 정상 DNA의 증폭을 완전하게 억제하지 못하였으나, 다른 전방 프라이머 (F8, F9, F10, F11 및 F12)는 정상 DNA의 증폭을 원활하게 억제하였다 (도 3). 이 결과로 볼 때 전방 프라이머와 NSTS 프라이머는 최소 5 내지 6 염기가 동일하게 구성되어야 증폭을 원활하게 억제할 수 있다.
실시예 3:
NSTS 프로브의 구성 조건에 대한 시험이다. 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 하기의 기록과 같다. 단, NSTS 프로브는 각 한 개의 종류만 첨가하여 시험하였다.
*시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머: 5'-aaagttaaaattcccgtcgct-3'
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머: 5'-ccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브 ：
① 5'-ggattgcttctcttaattccttga-p-3' (P2-2, Mis+3)
② 5'-gagttgcttctcttaattccttga-p-3' (P3-1, Mis+2)
TaqMan 프로브 : 5'-FAM-tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건조건:
95℃, 3분(1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 (50회 반복)
* PCR 반응물 조성
돌연변이 DNA (1x107 복제수)와 정상 DNA (1x107 복제수) 각 2 ul, 상기 프라이머와 TaqMan 프로브 각 1 ul (10 pmol/ul), NSTS 프로브 1 ul (40 pmol/ul), NSTS 프라이머 1 ul (20 pmol/ul) 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 하였다.
NSTS 프로브의 3' 말단은 중합효소의 기질로 사용되지 못하도록 인산기 (phosphate)를 결합시켰으며, NSTS 프로브의 5' 말단은 DNA 중합효소의 5' 플랩엔도뉴클레이즈 활성의 원활한 억제를 위해 DNA 주형과 매치되지 않는 염기를 2개 또는 3개 도입하여 구성하였다. 이에 따라 두 NSTS 프로브를 각각 사용하면 두 경우 모두 정상적인 DNA의 증폭은 억제되고 돌연변이 DNA의 증폭은 원활하게 이루어짐을 확인하였다 (도 4). 또한, 본 실시예는 ABI7500 Real-Time PCR Systems으로 시험한 결과로서, RT-PCR 기기에 따른 차이도 존재하지 않음을 알 수 있다.
실시예 4:
NSTS 프로브의 길이에 따른 NSTS 프라이머의 전방 프라이머 작용 억제효과에 대한 시험이다. 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 아래와 같다. 단, NSTS 프로브는 각 한 종류만 첨가하여 시험하였다.
* 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머 : 5'- agaaagttaaaattcccgtcg-3'
후방 프라이머 : 5'- gtctagatcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머 : 5'-cccgtcgctatcaaggaattaagag-3'
NSTS 프로브 1：5'-gagttgcttctcttaattccttgatag-p-3'
NSTS 프로브 2：5'-gagttgcttctcttaattccttgatagc-p-3'
NSTS 프로브 3：5'-gagttgcttctcttaattccttgatagcg-p-3'
TaqMan 프로브 : 5'-FAM-tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건:
95℃, 3분(1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 (50회 반복)
* PCR 반응물 조성
돌연변이 DNA (1x105 복제수)와 정상 DNA (1x105 복제수) 각 2 ul, 상기 프라이머와 TaqMan 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul), NSTS 프로브, NSTS 프라이머 각 1 ul (20 pmol/ul) 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul로 맞추어 사용하였다.
NSTS 프로브 1보다 염기 1개가 더 길어진 NSTS 프로브 2와 2개의 염기가 더 길어진 NSTS 프로브 3을 사용하였다. 모든 시험구는 정상 DNA 1 x 105 복제수와 돌연변이 DNA 1x 105 복제수를 혼합하여 주형으로 사용하였다. 전방 프라이머가 첨가되지 않은 시험구의 경우 NSTS 프로브 길이가 더 짧아 Tm 값이 낮아진 NSTS 프로브 1에서 소량의 정상 DNA의 증폭 (Ct 값 = 약 41)이 일어났으나 (도 5A), 증폭용 전방 프라이머가 포함된 RT-PCR의 경우 오히려 NSTS 프로브의 길이가 더 길어진 NSTS 프로브 2 및 3에서 더 높은 정상 DNA의 증폭 (각 Ct 값 = 34 및 32)이 나타났다 (도 7B). 이는 NSTS 프로브의 길이에 따라 Tm 값이 높아질수록 증폭억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트가 정상 DNA를 효과적으로 억제하지 않을 수 있음을 보여준다. 이는 높은 Tm 값으로 인해 상대적으로 NSTS 프로브 2와 3이 NSTS 프로브 1보다 NSTS 프라이머와 상보결합 (hybridization)이 강하게 이루어짐으로써 핫 스타트 효과 (Hot-start effect)가 증대되고, 이에 따라 초기 PCR 과정에서 증폭용 전방 프라이머에 의한 정상 DNA의 증폭을 효과적으로 억제하지 못해 일부 정상 DNA의 증폭이 이루어짐에 따라 발생하는 결과로 볼 수 있다.
실시예 5:
증폭억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트를 이용한 돌연변이 검출 민감도를 확인한 시험이다. 이를 위한 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 아래와 같다.
* 시험용 프라이머와 프로브 (도 6A)
전방 프라이머: 5'-ggaaagttaaaattcccgtcgct-3'
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM- tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 시험용 프라이머와 프로브 (도 6B)
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머: 5'-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브：5'-gagttgcttctcttaattccttga-p-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM-tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 시험용 프라이머와 프로브 (도 6C)
전방 프라이머: 5'-ggaaagttaaaattcccgtcgct-3'
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머: 5'-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브：5'-gagttgcttctcttaattccttga-p-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM- tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 시험용 프라이머와 프로브 (도 6D)
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
내부 프라이머: 5'-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-p-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM-tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 시험용 프라이머와 프로브 (도 6E)
전방 프라이머: 5'-ggaaagttaaaattcccgtcgct-3'
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
내부 프라이머: 5'-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-p-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM- tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건:
95℃, 3분 (1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 (50회 반복)
* PCR 반응물 조성
돌연변이 DNA (1x105 복제수)와 돌연변이 DNA (1x105 복제수부터 1x102 복제수까지 희석된 것) 각 6 ul, 상기 프라이머와 TaqMan 프로브 각 1 ul (10 pmol/ul), NSTS 프로브 (40 pmol/ul), NSTS 프라이머 (20 pmol/ul), 내부 프라이머 (50 pmol/ul) 각 1 ul씩 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 하여 사용하였다.
증폭용 프라이머 셋트와 TaqMan 프로브를 사용하여 정상 DNA를 3×105 복제수 내지 3×102 복제수 또는 3×105 복제수의 돌연변이 DNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하였다. 같은 농도의 돌연변이 DNA의 사용과 정상 DNA의 사용은 유사한 Ct 값을 보이며, 정상 DNA의 경우 농도 의존적으로 Ct 값의 차이를 나타내는 증폭이 이루어졌다 (도 6A). 이러한 정상 DNA의 증폭을 억제하기 위해 증폭억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트를 사용하는 방법과 MEMO의 방법에 사용되는 내부 프라이머 (또는 블로킹 프라이머)를 사용한 것을 비교하였다. 증폭 억제용 NSTS 프라이머와 NSTS 프로브를 첨가하고 증폭용 전방 프라이머를 첨가하지 않고 RT-PCR을 수행한 결과, 도 2C와 마찬가지로 모든 시험구에서 DNA가 증폭되지 않았으며 (도 6B), 반면 증폭용 전방 프라이머까지 모두를 첨가한 시험구에서는 도 2D와 마찬가지로 돌연변이 DNA를 주형으로 사용한 시험구만 증폭되는 결과 (Ct 값, 약 23)를 얻었다 (도 6C). 그러나, NSTS 프라이머와 NSTS 프로브를 사용하지 않고 내부 프라이머만 사용한 MEMO 방법을 준용할 경우 전방 프라이머를 사용하지 않고 내부 프라이머를 사용할 경우 증폭은 이루어지지 않으나 (도 6D), 전방 프라이머와 내부 프라이머를 사용하여 증폭할 경우 일부 정상 DNA의 증폭이 억제되기는 하나 여전히 상당한 수준의 증폭 (Ct 값, 약 28)이 이루어지고 또한 정상 DNA의 농도에 의존적으로 증폭이 이루어짐을 확인할 수 있다 (도 6E). 이러한 결과를 볼 때 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트에 의한 정상 DNA 증폭억제 효과가 블로킹 프라이머를 사용하는 MEMO 방법에 비해 현저히 우수한 방법임을 확인할 수 있다.
실시예 6:
증폭 억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트에 의한 검출 민감도에 관한 시험이며, 대조구로 MEMO 방법을 준용한 내부 프라이머 또는 블로킹 프라이머를 사용하여 시험하였다. 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 아래와 같다.
*시험용 프라이머와 프로브 (도 7A)
전방 프라이머: 5'-agaaagttaaaattcccgtcg-3'
후방 프라이머: 5'-gtctagatcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머: 5'-ccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브：5'-gagttgcttctcttaattccttga-p-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM- tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
*시험용 프라이머와 프로브 (도 7B)
전방 프라이머: 5'-ggaaagttaaaattcccgtcgct-3'
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
내부 프라이머：5'-gagttgcttctcttaattccttga-p-3'
TaqMan 프로브: 5'-FAM-tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건:
95℃, 3분(1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 (50회 반복)
* PCR 반응물 조성
1x106 복제수부터 1x100 복제수까지 희석된 돌연변이 DNA와 정상 DNA 1x106 복제수를 각각 1:1로 혼합하여 6 ul, 상기 프라이머 1 ul(10 pmol/ul), TaqMan 프로브 1 ul(15 pmol/ul), NSTS 프로브, NSTS 프라이머 각 1 ul (30 pmol/ul), 내부 프라이머 1 ul (30 pmol/ul) 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 RT-PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 하였다.
상기 시험에는 정상 DNA 3×106 복제수에 돌연변이 DNA를 10배씩 희석하여 첨가하여 DNA 3×106 ~ 3 복제수가 되도록 첨가하여 주형 DNA로 사용하여 RT-PCR을 실시하였다.
MEMO 기술을 준용한 방법에 의하면 도 7B와 같이 대부분 높은 Ct값을 보여 돌연변이 DNA 미혼합 시험구와 Ct 값의 큰 차이를 보이지 않으며, 구별 가능한 수준이 5%에 불과함을 알 수 있는 반면, 본 발명의 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트를 이용한 방법 (도 7A)에 의하면 돌연변이 농도에 매우 의존적으로 Ct 20에서 Ct 42까지 차이가 나게 증폭됨을 확인할 수 있었다. 이는 검출 감도가 최소 0.001% 이상으로서, 본 발명의 방법을 이용하면 돌연변이를 고감도로 검출할 수 있음을 말해준다.
실시예 7:
결손 돌연변이 DNA의 종류에 따른 증폭 억제용 NSTS 올리고뉴클레오타이드 셋트에 의한 검출 민감도에 관한 시험이며, 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 아래와 같다.
* 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머 : 5'-agaaagttaaaattcccgtcg-3'
후방 프라이머 : 5'-gtctagatcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머 : 5'-ccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브　： 5'-gagttgcttctcttaattccttga-p-3'
TaqMan 프로브 : 5'-FAM-tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건:
95℃, 3분(1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 (50회 반복)
* PCR 반응물 조성
1x105, 1x104, 1x103, 1x102, 1x101, 1x100 복제수로 희석된 3종의 돌연변이 DNA와 정상 DNA 1x105 복제수를 각각 1:1로 혼합하여 6 ul, 상기 프라이머 1 ul (10 pmol/ul), TaqMan 프로브 1ul (15 pmol/ul), NSTS 프로브, NSTS 프라이머 각 1ul (20 pmol/ul) 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 하였다.
돌연변이 DNA로는 표 1의 COSM 6225, 12382, 13550의 세 종류를 사용하였으며, 각각의 DNA를 정상 DNA 3×105 복제수에 각 돌연변이를 10배씩 연속 희석하여 0 내지 3×105 복제수를 첨가하여 시험하였다. 그 결과, 시험한 세 종류의 돌연변이 DNA 모두 정상 DNA와 정확하게 구별되었으며 농도 의존적으로 증폭이 이루어졌다. 모든 시험구에서 3 x 101 복제수 이상이 혼입 (0.01%)된 돌연변이 DNA는 모든 시험구에서 정확히 정상 DNA와 구별되었다. 단, 돌연변이 3 x 100 복제수의 혼입(0.001%)이 구별되는 시험구 (도 8A)도 있었다.
실시예 8:
단일한 돌연변이 검출용 킷트에 의한 다수의 결손 돌연변이 검출에 대한 실시예이다. 각 프라이머 및 프로브와 RT-PCR 조건은 아래와 같다. 단, 주형 DNA는 정상 DNA와 각 돌연변이 (표 1) DNA를 1x105 복제수로 각각 첨가하여 시험하였다.
* 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머: 5'-aaagttaaaattcccgtcgct-3'
후방 프라이머: 5'-gtctagagcagagcagctgcca-3'
NSTS 프라이머: 5'-ccgtcgctatcaaggaattaagagaagca-3'
NSTS 프로브：5'-ggattgcttctcttaattccttga-p-3'
TaqMan 프로브: 5'- FAM- tgctttgctgtgtgggggtcc-BHQ1-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건:
95℃, 3분 (1회)
95℃, 30초 - 50℃, 1분 30초 (45회 반복)
* PCR 반응물 조성
표 1에 표시된 24종의 돌연변이 DNA (1x105 복제수)와 정상 DNA (1x105 복제수) 각 2 ul, 상기 프라이머와 TaqMan 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul), NSTS 프로브, NSTS 프라이머 각 1 ul (20 pmol/ul) 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 5×PCR mix 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 하였다.
돌연변이 DNA 미첨가구와 정상 DNA 첨가구에서는 증폭곡선이 나타나지 않았으며, 24종의 돌연변이 첨가 시험구는 모두 증폭되었으며, Ct 값이 21 내지 24로 매우 일정하다 (도 9). 이러한 결과는 하나의 동일한 킷트로 유사한 영역의 다양한 결손 돌연변이를 정상 DNA와 확연하게 구분할 수 있음을 보여준다.
<110> Genotech Corp. <120> Detection methods of mutation and the kits <130> Genotech160322-DelMutDetect <160> 97 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aggcctagac gcagcatcat taaa 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 accaaaaaca atacccatgc tcca 24 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaa 54 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cccgtcgcta tcaaaacatc tccgaaagcc aacaaggaa 39 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cggagatgtt ttgatagcga cgggaat 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgtcgctatc aaaacatctc cgaaagc 27 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cccgtcgcta tcaagacatc tccgaaagcc aacaaggaa 39 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cggagatgtc ttgatagcga cgggaat 27 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgctatcaag acatctccga aagcc 25 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cccgtcgcta tcaaggcatc tccgaaagcc aacaaggaa 39 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggagatgcct tgatagcgac gggaat 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcgctatcaa ggcatctccg aaagcc 26 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cccgtcgcta tcaaggaatc tccgaaagcc aacaaggaa 39 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggctttcgga gattccttga tagcgac 27 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tatcaaggaa tctccgaaag ccaacaagg 29 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cccgtcgcta tcaaggtatc tccgaaagcc aacaaggaa 39 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cggagatacc ttgatagcga cgggaatt 28 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tcgctatcaa ggtatctccg aaagcc 26 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cccgtcgcta tcaaaattcc aacatctccg aaagccaaca aggaa 45 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atgttggaat tttgatagcg acgggaat 28 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tcgctatcaa aattccaaca tctccgaaag 30 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 cccgtcgcta tcaaaatatc tccgaaagcc aacaaggaa 39 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agatggaatt ttgatagcga cgggaatttt 30 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gctatcaaaa ttccatctcc gaaagcca 28 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 cccgtcgcta tcaaaattcc atctccgaaa gccaacaagg aa 42 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tttcggaatt ttgatagcga cgggaat 27 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tcgctatcaa aattccgaaa gccaacaa 28 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cccgtcgcta tcaaaattcc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cggagatatt ttgatagcga cgggaat 27 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gtcgctatca aaatatctcc gaaagccaa 29 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 cccgtcgcta tcaaggaatc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tggctttcga ttccttgata gcgacgg 27 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tatcaaggaa tcgaaagcca acaaggaa 28 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 cccgtcgcta tcaaggaacc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gctttcggtt ccttgatagc gacggga 27 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tatcaaggaa ccgaaagcca acaaggaa 28 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 cccgtcgcta tcaaggttcc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gctttcggaa ccttgatagc gacggga 27 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gctatcaagg ttccgaaagc caacaagg 28 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 cccgtcgcta tcaaggaaca gaaagccaac aaggaa 36 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ggctttctgt tccttgatag cgacgg 26 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 caaggaacag aaagccaaca aggaaa 26 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 cccgtcgcta tcaaggtctc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gctttcgaga ccttgatagc gacggga 27 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tcaaggtctc gaaagccaac aaggaaat 28 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cccgtcgcta tcaaggatcc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 tttcggatcc ttgatagcga cggga 25 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ctatcaagga tccgaaagcc aacaagg 27 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 cccgtcgcta tcaagtctcc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ttcggagact tgatagcgac gggaa 25 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 cgctatcaag tctccgaaag ccaacaa 27 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 cccgtcgcta tcaaggctcc gaaagccaac aaggaa 36 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ctttcggagc cttgatagcg acggga 26 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 tatcaaggct ccgaaagcca acaagg 26 <210> 55 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 cccgtcgcta tcaaggaacc aacatctccg aaagccaaca aggaa 45 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gagatgttgg ttccttgata gcgacgg 27 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gaaccaacat ctccgaaagc caacaa 26 <210> 58 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cccgtcgcta tcaaggaacc atctccgaaa gccaacaagg aa 42 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 cggagatggt tccttgatag cgacgg 26 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 aaggaaccat ctccgaaagc caacaa 26 <210> 61 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 cccgtcgcta tcaaggagcc aacatctccg aaagccaaca aggaa 45 <210> 62 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 agatgttggc tccttgatag cgacggg 27 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 ggagccaaca tctccgaaag ccaac 25 <210> 64 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 cccgtcgcta tcaaggaagc aacatctccg aaagccaaca aggaa 45 <210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 gagatgttgc ttccttgata gcgacggg 28 <210> 66 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 caaggaagca acatctccga aagccaa 27 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 cccgtcgcta tcaaggaatc atctccgaaa gccaacaagg aa 42 <210> 68 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 cggagatgat tccttgatag cgacggg 27 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 atcaaggaat catctccgaa agccaaca 28 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 cccgtcgcta tcaaggaaca accgaaagcc aacaaggaa 39 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ctttcggttg ttccttgata gcgacggg 28 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 tatcaaggaa caaccgaaag ccaacaagg 29 <210> 73 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 cccgtcgcta tcaaggagca atctccgaaa gccaacaagg aa 42 <210> 74 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 tcggagattg ctccttgata gcgacggg 28 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 caaggagcaa tctccgaaag ccaaca 26 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ttaaaattcc cgtcgctatc a 21 <210> 77 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 gtctagagca gagcagctgc ca 22 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 tcgctatcaa ggaattaaga gaagca 26 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 79 gagttgcttc tcttaattcc ttga 24 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 80 tgctttgctg tgtgggggtc c 21 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 aggtgagaaa gttaaaattc ccgt 24 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 agaaagttaa aattcccgtc g 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 aaagttaaaa ttcccgtcgc t 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 agttaaaatt cccgtcgcta t 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 taaaattccc gtcgctatca a 21 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 ccgtcgctat caaggaatta agagaagca 29 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 87 ggattgcttc tcttaattcc ttga 24 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 cccgtcgcta tcaaggaatt aagag 25 <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 89 gagttgcttc tcttaattcc ttgatag 27 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 90 gagttgcttc tcttaattcc ttgatagc 28 <210> 91 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 91 gagttgcttc tcttaattcc ttgatagcg 29 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 ggaaagttaa aattcccgtc gct 23 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca 30 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 ggaaagttaa aattcccgtc gct 23 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 ggaaagttaa aattcccgtc gct 23 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 gagttgcttc tcttaattcc ttga 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 97 agttccttaa ttctcttcgt tagg 24

Claims (15)

  1. DNA 폴리머레이즈를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 있어서,
    돌연변이 DNA를 포함하는 주형 DNA;
    야생형 DNA 및 돌연변이 DNA 염기서열에 공통적인 서열 또는 그 상보서열을 포함하고, 돌연변이 해당영역 밖에서 주형 DNA와 결합하여 주형 DNA의 증폭에 사용되는 증폭용 전방 프라이머 및 증폭용 후방 프라이머;
    돌연변이 해당영역을 포함하며, 야생형 DNA와 동일한 염기서열을 갖고, 5' 말단의 연속되는 5 염기 이상의 염기서열이 상기 증폭용 전방 프라이머의 3' 말단과 중첩되며, 3' 말단이 돌연변이 해당영역 내에 위치하거나 또는 돌연변이 해당영역을 지나 위치하며, 3' 말단 미스매치에 의해 또는 돌연변이 해당영역에 결합하지 못하여 돌연변이 해당영역을 증폭시키지 않는 증폭억제용 프라이머; 및
    야생형 DNA와 상보적인 염기서열을 갖고, 플랩 구조를 제외한 5' 말단이 상기 증폭억제용 프라이머의 5' 말단으로부터 24~38 염기에 위치하며, 5' 말단의 2~5 염기가 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA의 서열과 매치되지 않아 플랩 구조를 나타내는 증폭억제용 프로브;를 가하여 반응시킴을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 돌연변이 DNA는 연속되는 3 이상의 염기가 결손 또는 부가된 것임을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 증폭억제용 프로브는 3' 말단이 블로킹된 것임을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 증폭억제용 프로브의 3' 말단은 아민기, 인산염, 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 바이오틴 중 선택된 1종을 이용하여 3' 말단 수산화기가 제거되거나 수산화기에 보호기가 결합되어 블로킹된 된 것임을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 실시간 중합효소 연쇄반응 산물을 확인하기 위하여 검출용 수식 프로브 또는 검출용 비수식 프로브를 부가함을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 실시간 중합효소 연쇄반응 산물의 검출은 직접 전기영동 방법, 직접 염기서열분석방법, 삽입물질을 가하는 방법 또는 리포터와 퀀처로 이중 수식된 프로브를 사용하는 방법으로 수행함을 특징으로 하는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법.
  7. 돌연변이 DNA를 포함하는 주형 DNA, 야생형 DNA와 돌연변이 DNA 염기서열에 공통적인 서열 또는 그 상보서열을 포함하고, 돌연변이 해당영역 밖에서 주형 DNA와 결합하는 증폭용 전방 프라이머 및 증폭용 후방 프라이머, 그리고 내열성 DNA 폴리머레이즈를 포함하는 유전자 돌연변이 검사용 중합효소 연쇄반응 킷트에 있어서,
    돌연변이 해당영역을 포함하며, 야생형 DNA와 동일한 염기서열을 갖고, 5' 말단의 연속되는 5 염기 이상이 상기 증폭용 전방 프라이머의 3' 말단과 중첩되며, 3' 말단이 돌연변이 해당영역 내에 위치하거나 또는 돌연변이 해당영역을 지나 위치하며, 3' 말단 미스매치에 의해 또는 돌연변이 해당영역에 결합하지 못하여 돌연변이 해당영역을 증폭시키지 않는 증폭억제용 프라이머; 및
    야생형 DNA와 상보적인 염기서열을 갖고, 플랩 구조를 제외한 5' 말단이 상기 증폭억제용 프라이머의 5' 말단으로부터 24~38 염기에 위치하고, 5' 말단의 2~5 염기가 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA의 서열과 매치되지 않아 플랩 구조를 나타내는 증폭억제용 프로브;를 더 포함함을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 돌연변이 DNA는 연속되는 3 염기 이상이 결손 또는 부가된 것임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 증폭억제용 프로브는 3' 말단이 블로킹된 것임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 증폭억제용 프로브의 3' 말단은 아민기, 인산염, 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 바이오틴 중 선택된 1종을 이용하여 3' 말단 수산화기가 제거되거나 수산화기에 보호기가 결합되어 블로킹된 것임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 실시간 중합효소 연쇄반응 산물을 확인하기 위한 검출용 수식 프로브 또는 검출용 비수식 프로브가 부가된 것을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 검출용 비수식 프로브는 삽입제임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 검출용 수식 프로브는 리포터와 퀀처로 이중 수식된 프로브임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  14. 청구항 7에 있어서,
    증폭용 전방 프라이머 서열은 5'-AAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3',
    증폭억제용 프라이머 서열은 5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCA-3',
    증폭억제용 프로브 서열은 3'-pAGTTCCTTAATTCTCTTCGTTagg-5'임을 특징으로 하는 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 엑손 19의 결실 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  15. 청구항 14에 있어서,
    검출용 프로브 서열은 5'-TGCTTTGCTGTGTGGGGGTCC-3',
    증폭용 후방 프라이머 서열은 5'-GTCTAGAGCAGAGCAGCTGCCA-3'임을 특징으로 하는 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 엑손 19의 결실 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
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