CN105229175A - 用于扩增和测定rna融合基因变体的方法、区分它们的方法以及有关的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

单独地或进一步与检测、或检测并定量组合地扩增得自融合基因变体的RNA的方法，区分它们的方法，和在所述方法中使用的寡核苷酸引物和探针和试剂盒。

Description

用于扩增和测定RNA融合基因变体的方法、区分它们的方法以及有关的引物、探针和试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/800,593的优先权，且其在此通过引用以其整体并入。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子地提交，且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII拷贝（创建于2014年3月7日）被命名为11438WOO1_SEQ.txt，且大小为400,373字节。
技术领域
本公开内容涉及融合基因变体、单独或进一步与检测或者检测并定量组合地扩增聚合酶链式反应(PCR)诸如实时PCR的方法、区分融合基因变体的方法、寡核苷酸引物和探针，以及试剂盒。
背景技术
某些类型的人白血病通常与融合基因（具体而言，断裂点簇区(BCR)基因和Abelson鼠白血病(ABL)原癌基因的融合体）的存在有关，所述融合基因源自将22号染色体上的BCR基因的5' 部分与9号染色体上的ABL基因的3' 部分融合的染色体易位。由于BCR基因内的易位断点的异质性，已经观察到患者群体含有不同的BCR-ABL融合基因变体，其包括e1a2、b2a2、b3a2和e19a2，它们通过将BCR外显子e1、b2、b3或e19分别与ABL外显子a2并置的易位产生。
当前推荐的在治疗过程中监测疾病状态的方法是，通过将BCR-ABL转录物的水平与内源性持家基因的mRNA的水平进行对比，定期评估BCR-ABL mRNA的水平。例如，Jones等人描述了监测p210和p190 bcr-abl RNA融合体转录物(p210和p190是用于表示蛋白变体的命名)作为监测具有慢性髓性白血病的患者中的疾病负荷的方法(Jones等人, Am J. Clin. Pathol. 120: 42-48 (2003))。例如，Lee等人描述了筛查新诊断的具有急性成淋巴细胞性白血病的患者的p210和p190 bcr-abl RNA融合体转录物，并在治疗期间监测疾病的进程(Lee等人, Genome Res. 4: 283-287 (1995))。BCR-ABL mRNA的检测和定量也可能具有诊断和/或预后实用性。
在本领域中目前可得到的方法缺少检测RNA并将RNA与BCR-ABL变体（诸如e1a2、b2a2、b3a2和e19a2）区分开的能力。在一些情况下，所述方法限于在单个反应中检测单个BCR-ABL变体(例如，e1a2)或仅变体的子集(例如，b2a2和b3a2，但不检测e1a2或e19a2)。在不使用反射测试（诸如毛细管凝胶电泳）的情况下，检测超过一种变体（诸如b2a2和b3a2）的那些方法不能区分检测到的变体。反射测试可以破坏常规实验室工作流和造成污染。
多种癌症肿瘤（包括非小细胞肺癌、乳腺癌和结直肠癌）与棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的融合体有关，所述融合体源自将EML4基因的5' 部分与ALK基因的3' 部分融合的2号染色体上的倒位。由于倒位位点的异质性，已经观察到患者群体含有不同的EML4-ALK融合体变体，包括E13A20、E6aA20、E6bA20、E14A20和E20A20，它们通过将EML4外显子13 (E13)、外显子6a (E6a)、外显子6b (E6b)、外显子14 (E14)或外显子20 (E20)分别与ALK外显子20 (A20)并置的倒位产生。
表达EML4-ALK融合基因的肿瘤的鉴别是医学上有关的，这是由于它们对ALK酪氨酸激酶抑制剂疗法的潜在应答性和由于它们对EGFR拮抗剂疗法的一般无应答性。如BCR-ABL，本领域目前可得到的方法缺少检测RNA并将RNA与EML4-ALK变体区分开的能力。
一部分肺癌肿瘤与驱动蛋白家族成员5B (KIF5B)基因和Ret原癌基因(RET)的融合体有关，所述融合体源自将KIF5B基因的5' 部分与RET基因的3' 部分融合的10号染色体上的倒位。由于倒位位点的异质性，已经观察到患者群体含有不同的KIF5B-RET融合体变体，包括K15R12、K16R12、K22R12和K23R12，它们通过将KIF5B外显子15 (K15)、外显子16 (K16)、外显子22 (K22)或外显子23 (K23)分别与RET外显子12 (R12)并置的倒位产生。
表达KIF5B-RET融合基因的肿瘤的鉴别是医学上有关的，这是由于它们对酪氨酸激酶抑制剂疗法的潜在应答性。如BCR-ABL，本领域目前可得到的方法缺少检测RNA并将RNA与KIF5B-RET变体区分开的能力。
急性早幼粒细胞性白血病(APL)患者经常携带早幼粒细胞性白血病基因(PML)与视黄酸受体α基因(RARα)的融合体，其源自将15号染色体上的PML基因的5' 部分与17号染色体上的RARα基因的3' 部分融合的染色体易位。由于易位断点的异质性，已经观察到患者群体含有不同的PML-RARα融合基因变体（称作PML-RARαS形式、PML-RARαV形式和PML-RARαL形式），它们通过将PML外显子3 (P3)、PML外显子6的5' 区域(P6a)或PML外显子6的3' 区域(P6b)分别与RARα外显子3/4 (R3/4；在本文中将使用外显子命名R3，但是意图包括替代命名R4)并置的易位产生。
表达PML-RARα融合基因的白血病的鉴别是医学上有关的，这是由于它们对全反式-视黄酸(ATRA)疗法的高应答率。PML-RARα融合基因变体(形式S、V或L)的检测和区分也可能具有预后价值，因为不同的易位形式可能承载不同的预后。例如，与PML-RARα形式V和L相比，PML-RARα形式S可能与更差的预后有关。
考虑到前述内容，本公开内容寻求提供一种用于扩增、检测和/或定量得自基因融合体变体（诸如BCR-ABL、EML4-ALK、KIF5B-RET和PML-RARα基因融合体变体）的mRNA的方法，区分它们的方法，以及用在这样的方法中的材料和试剂盒。从本文中提供的详细描述将会明白这些和其它目的和优点、以及发明特征。
发明概述
提供了扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物。一种或多种引物可以被可检测地标记。所述方法可以进一步包括(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。所述第一基因和所述第二基因可以是断裂点簇区(BCR)基因和Abelson鼠白血病(ABL)原癌基因、棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因、驱动蛋白家族成员5B (KIF5B)基因和Ret (RET)原癌基因或早幼粒细胞性白血病(PML)基因和视黄酸受体α(RARα)基因。所述至少一种探针可以是这样的探针：其在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。
在扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法的一个实施方案中，所述引物可以包含BCR-ABL基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体。所述引物可以包含(i)与ABL的外显子a2杂交的引物和(ii)与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物、和与BCR的外显子e19杂交的引物中的2种或更多种。与BCR的外显子b2杂交的引物可以扩增从包含b2a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA和从包含b3a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA。所述至少一种探针可以是这样的探针：其在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。与ABL的外显子a2杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 4、25、26和27。与BCR的外显子e1杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 1、18、19、20、21和22，与BCR的外显子b2杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2和23，和/或与BCR的外显子e19杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3和24。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、28、29、30和与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 6、31、32和与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 7、33、34、35和与其互补的序列，和/或在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 8、36和与其互补的序列。
在扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法的另一个实施方案中，所述引物可以包含EML4-ALK基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：E13A20基因融合体、E6aA20基因融合体、E6bA20基因融合体、E14A20基因融合体和E20A20基因融合体。所述引物可以包含(i)与ALK的外显子A20杂交的引物和(ii)与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物中的2种或更多种。与EML4的外显子E6a杂交的引物可以扩增从包含E6a基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E6b基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与EML4的外显子E13杂交的引物可以扩增从包含E13基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E14基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA。所述至少一种探针可以是这样的探针：其在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；或在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。在所述方法中，(a)(ii)可以进一步包括，使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物针对至少一种选自以下的其它EML4-ALK基因融合体变体：E18A20基因融合体、E15A20基因融合体、E2A20基因融合体和E17A20基因融合体。
在扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法的还另一个实施方案中，所述引物包含KIF5B-RET基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：K15R12基因融合体、K16R12基因融合体、K22R12基因融合体和K23R12基因融合体。所述引物可以包含(i)与RET的外显子R12杂交的引物和(ii)与KIF5B的外显子K15杂交的引物和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物。与KIF5B的外显子K15杂交的引物可以扩增从包含K15R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K16R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物可以扩增从包含K22R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K23R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA。所述至少一种探针可以是这样的探针：其在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；或在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。
在扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法的还另一个实施方案中，所述引物可以包含PML-RARα基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：P3R3基因融合体、P6aR3基因融合体和P6bR3基因融合体。所述引物可以包含(i)与RARα的外显子R3杂交的引物和(ii)与PML的外显子P3杂交的引物和/或与PML的外显子6a杂交的引物。与PML的外显子6a杂交的引物可以扩增从包含P6aR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA和从包含P6bR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA。所述至少一种探针可以是这样的探针：其在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；或在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。
进一步提供了引物组。所述引物组包含至少两种选自以下的引物：与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。与BCR的外显子e1杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 1、18、19、20、21和22，与BCR的外显子b2杂交的引物包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2和23，和/或与BCR的外显子e19杂交的引物包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3和24。所述引物组可以进一步包含与ABL的外显子a2杂交的引物。与ABL的外显子a2杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 4、25、26和27。
更进一步提供了探针组。所述探针组包含至少两种选自以下的探针：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、28、29、30和与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 6、31、32和与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 7、33、34、35和与其互补的序列，和/或在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 8、36和与其互补的序列。
甚至更进一步提供了试剂盒。所述试剂盒包含(i)引物组，其包含与变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子杂交的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物；和(ii)说明书，其关于检测得自mRNA样品中的所述第一基因和所述第二基因的融合体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i')得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii')使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。所述第一基因和所述第二基因可以是BCR基因和ABL原癌基因、EML4基因和ALK基因、KIF5B基因和RET原癌基因、或PML基因和RARα基因。
在一个实施方案中，所述引物组包含(a)至少两种选自以下的引物：与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物或(b)包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、18、19、20、21、22、23和24的核苷酸序列的引物，且所述说明书是关于检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用BCR-ABL基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。所述试剂盒可以包含与ABL的外显子a2杂交的引物。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中(a)所述探针在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或(b)所述探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、6、7、8、28、29、30、31、32、33、34、35、36和与其互补的序列。所述试剂盒可以进一步包含引物，所述引物包含选自SEQ ID NO: 4、25、26和27的核苷酸序列。
发明详述
本公开内容至少部分地基于用于基因融合体变体（诸如BCR-ABL基因融合体变体、EML4-ALK基因融合体变体、KIF5B-RET基因融合体变体和PML-RARα基因融合体变体）的mRNA的实时扩增、检测和/或定量的寡核苷酸引物和可检测的寡核苷酸探针。关于BCR-ABL，所述引物指导来自至少两种BCR-ABL基因融合体变体（诸如2、3或4种基因融合体变体，包括但不限于，e1a2、b2a2、b3a2和e19a2）的mRNA的反转录和扩增。所述探针以变体特异性的方式检测多种(诸如两种或更多种，例如，2、3、或4种) BCR-ABL融合基因mRNA。内源性持家基因（诸如但不限于，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、ABL和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD））的寡核苷酸引物和可检测的寡核苷酸探针能够将BCR-ABL融合基因mRNA的水平与持家基因mRNA的水平进行对比。BCR-ABL引物和探针的应用能够在单个实时聚合酶链式反应(RT-PCR)中高特异性地和灵敏性地区分和定量多个BCR-ABL融合基因mRNA。持家引物和探针的应用会提供对细胞充足、样品提取和扩增效率的控制以及BCR-ABL mRNA的定量的标准化。本公开内容能够在单个反应中检测、或检测和定量两种或更多种BCR-ABL变体，诸如三种变体、四种变体、或更多种变体，同时在不依赖于回流测试的情况下区分这样的变体。这如下实现：将多路PCR（multiplexed PCR）用于扩增从两种或更多种BCR-ABL变体（诸如三种、四种或更多种变体）转录的序列的用途与变体-特异性的杂交探针用于检测每个被靶向的BCR-ABL变体的外显子易位连接部独有的序列的用途组合。以与用现有方法实现的那些等同或更好的灵敏性、特异性和动态范围，检测/定量BCR-ABL变体。
术语
以下术语与本公开内容有关：
(a) Abelson鼠白血病(ABL)原癌基因位于1号染色体上。Entrez基因、Ensembl和HGNC细胞遗传带是1q25.2。别名包括v-abl Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物2、ABLL、ARG、Abelson相关的基因蛋白、酪氨酸-蛋白激酶ARG、EC 2.7.10.2、v-abl Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物2、Abelson酪氨酸-蛋白激酶、Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物2和EC 2.7.10。参考DNA序列包括但不限于，NC_000001.10和NT_004487.19。含有替代第一外显子的智人ABL mRNA的序列可作为登记号M14754.1 [SEQ ID NO:37]和M14753.1 [SEQ ID NO:38]得自NCBI。完整的CDS序列可作为登记号U07563.1得自NCBI。
(b)“约”表示从所述值变动大约±10%。应当理解，这样的变化总是被包括在本文中提供的任意给定值中，无论是否具体提及它。
(c)间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因位于染色体2上。Entrez基因和HGNC细胞遗传带是2p23，而Ensembl细胞遗传带是2p23.1。别名包括间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶、CD246、CD246抗原、EC 2.7.10.1、NBLST3、Ki-1、ALK酪氨酸激酶受体和突变体间变性淋巴瘤激酶。参考DNA序列包括但不限于，NC_000002.11和NT_022184.15。mRNA序列可作为登记号NM_004304.4 [SEQ ID NO:39；外显子：1-1619、1620-1739、1740-1904、1905-2106、2107-2234、2235-2366、2367-2498、2499-2599、2600-2769、2770-2864、2865-2993、2994-3156、3157-3307、3308-3439、3440-3584、3585-3767、3768-3866、3867-4019、4020-4124、4125-4311、4312-4402、4403-4467、4468-4597、4598-4695、4696-4788、4789-4890、4891-5025、5026-5116和5117-6265]得自NCBI。
(d)断裂点簇区(BCR)基因位于22号染色体上。Entrez基因和Ensembl细胞遗传带是22q11.23，而HGNC细胞遗传带是22q11。别名包括BCR1、D22S11、ALL、CML、PHL、D22S662、肾癌抗原NY-REN-26、EC 2.7.11.1、BCR/FGFR1嵌合体蛋白、断裂点簇区蛋白和FGFR1/BCR嵌合体蛋白。参考DNA序列包括但不限于，NC_000022.10、NT_011520.12、AH001427.1 (BCR DNA外显子b3；[SEQ ID NO：40]；外显子1-75)、M25948.1 (BCR DNA外显子a1；[SEQ ID NO：41]；外显子16-189)、M25946.1 (BCR DNA部分CDS；[SEQ ID NO：42])和M25947.1 (外显子b3 BCR DNA；[SEQ ID NO：43]；外显子1-75)。智人BCR转录物变体1的序列可作为登记号NM_004327.3 [SEQ ID NO:44；外显子：1-1875、1876-2057、2058-2162、2163-2348、2349-2456、2457-2517、2518-2570、2571-2711、2712-2833、2834-3002、3003-3122、3123-3198、3199-3303、3304-3378、3379-3476、3477-3608、3609-3668、3669-3778、3779-3918、3919-4053、4054-4159、4160-4322和4323-6927; 1872-1877易位断点以形成BCR-ABL]得自NCBI (国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）; www.ncbi.nlm.nih.gov)，而智人BCR转录物变体2的序列可作为登记号NM_021574.2 [SEQ ID NO:45；外显子：1-1875、1876-2057、2058-2162、2163-2348、2349-2456、2457-2517、2518-2570、2571-2711、2712-2833、2834-3002、3003-3122、3123-3198、3199-3303、3304-3378、3379-3476、3477-3536、3537-3646、3647-3786、3787-3921、3922-4027、4028-4190和4191-6795]得自NCBI。智人BCR的完整编码结构域序列(CDS)可作为登记号U07000.1得自NCBI。与BCR-ABL基因融合体有关的其它序列包括：NCBI登记号M17542.1 (外显子1和2 BCR-ABL mRNA; [SEQ ID NO:46]；外显子：1-31和32-63)、M17541.1 (外显子1和2 BCR-ABL mRNA; [SEQ ID NO:47]；外显子：1-31和32-63)、M19730.1 (编码P-185-ALL-ABL的BCR-ABL mRNA ; [SEQ ID NO:48])、AY789120.1 (BCR-ABL融合体mRNA; [SEQ ID NO:49])、EU394717.1 (BCR-ABL e8a2融合体mRNA，外显子7、8和a2; [SEQ ID NO:50]；外显子：1-52 (BCR外显子7)、53-166 (BCR外显子8)和183-238 (ABL外显子a2)；内含子: 167-182 (ABL内含子1a))、EU394718.1 (BCR-ABL e14a2融合体mRNA，外显子12-14、a2、a3、a2; [SEQ ID NO:51]；外显子：1-64 (BCR外显子12)、65-169 (BCR外显子13)、170-243 (BCR外显子14)、244-254 (ABL外显子a2补体)、255-361 (ABL外显子a2)和362-486 (ABL外显子a3))、EU394716.1 (BCR-ABL e18-int1b-a2融合体mRNA，外显子2; [SEQ ID NO:52]；外显子：1-87 (BCR e18)和128-163 (ABL a2)；内含子: 88-127 (ABL内含子1b))、EU236680.1 (BCR-ABL b3a3融合体mRNA; [SEQ ID NO:53]；基因1-250 (BCR)和基因251-297 (ABL))、X06418.1 (BCR-ABL mRNA; [SEQ ID NO:54]; 1322-1323 bcr-abl重组位点)、M13096.1 (BCR-ABL融合体mRNA，外显子2-5; [SEQ ID NO:55])、EU216062.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X5 mRNA; [SEQ ID NO:56])、EU216060.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X3 mRNA; [SEQ ID NO:57])、EU216058.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X1; [SEQ ID NO:58])、AM886138.1 (BCR-ABL融合蛋白DNA的t(9;22)(q34;q11)易位断点; [SEQ ID NO:59]；外显子：1-31 (BCR e13)和791-853 (ABL1 a3)；内含子：32-280 (BCR内含子13)和281-790 (ABL1内含子2))、DQ912590.1 (BCR-ABL融合蛋白e14a5 mRNA; [SEQ ID NO:60]; 1-185 (包括外显子12-14的BCR)和186-253 (包括外显子5的ABL))、DQ912588.1 (BCR-ABL融合蛋白e1a5; [SEQ ID NO:61]; 1-166 (包括外显子1的BCR)和167-234 (包括外显子5的ABL))、DQ898315.1 (BCR-ABL融合蛋白e14a4 mRNA; [SEQ ID NO:62]；外显子：1-70 (BCR外显子13)、71-145 (BCR外显子14)和146-216 (ABL外显子4)；145-146 BCR-ABL断点)、DQ898313.1 (BCR-ABL融合蛋白e1a4 mRNA; [SEQ ID NO:63]；外显子：1-166 (BCR外显子1)和167-237 (ABL外显子4)；166-167 BCR-ABL断点)、DQ912589.1 (BCR-ABL融合蛋白e13a5 mRNA; [SEQ ID NO:64]; 1-110 (包括外显子12和13的BCR)和111-178 (包括外显子5的ABL))、DQ898314.1 (BCR-ABL融合蛋白e13a14 mRNA; [SEQ ID NO:65]；外显子：1-70 (BCR外显子13)和71-141 (ABL外显子4)；70-71 BCR-ABL断点)、EF158045.1 (BCR-ABL p210融合蛋白mRNA; [SEQ ID NO:66])、EU154998.1 (BCR-ABL融合蛋白e8a2 mRNA; [SEQ ID NO:67]；BCR外显子7-8的194-221断点连接部，LOC653203内含子和ABL外显子a2; 195-220 LOC653203内含子)、EU216071.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体Y5 mRNA; [SEQ ID NO:68])、EU216069.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体Y3 mRNA; [SEQ ID NO:69])、EU216067.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体Y1 mRNA; [SEQ ID NO:70])、EU216065.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X8 mRNA; [SEQ ID NO:71])、EU216063.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X6 mRNA; [SEQ ID NO:72])、EU216061.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X4 mRNA; [SEQ ID NO:73])、EU216059.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X2 mRNA; [SEQ ID NO:74])、EU216072.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体Y6 mRNA; [SEQ ID NO:75])、EU216070.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体Y4 mRNA; [SEQ ID NO:76])、EU216068.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体Y2 mRNA; [SEQ ID NO:77])、EU216066.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X9 mRNA; [SEQ ID NO:78])和EU216064.1 (BCR-ABL融合蛋白异形体X7 mRNA; [SEQ ID NO:79])、AJ131466.1 (BCR-ABL e14a2融合蛋白部分mRNA; [SEQ ID NO:80]；外显子：1-117 (BCR外显子11)、118-193 (BCR外显子12)、194-298 (BCR外显子13)、299-373 (BCR外显子14)、374-547 (ABL外显子2)、548-843 (ABL外显子3)和844-997 (ABL外显子4))、AJ131467.1 (BCR-ABL e13a2融合蛋白部分mRNA; [SEQ ID NO:81]；外显子：1-117 (BCR外显子1)、118-193 (BCR外显子12)、194-298 (BCR外显子13)、299-472 (ABL外显子2)、473-768 (ABL外显子3)和769-922 (ABL外显子4))、AF113911.1 (BCR-ABL1 e1a2融合蛋白mRNA; [SEQ ID NO:82]；在成年ALL的大约25%病例中发现的Philadelphia易位的456-457融合体连接部)、AM491363.1 (BCR-ABL1 e19a2融合蛋白mRNA; [SEQ ID NO:83])、AM491361.1 (BCR-ABL1 e1a3融合蛋白mRNA; [SEQ ID NO:84])、AM491359.1 (BCR-ABL1 e13a3融合蛋白mRNA; [SEQ ID NO:85])、AM491362.1 (BCR-ABL1 e6a2融合蛋白mRNA; [SEQ ID NO:86])和AM491360.1 (BCR-ABL1 e14a3融合蛋白mRNA; [SEQ ID NO:87])。
(e)棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因位于2号染色体上。Entrez基因、Ensembl和HGNC细胞遗传带是2p21。别名包括C2orf2、ROPP120、ELP120、受限制地过表达的增殖相关蛋白、Ropp120、EMAP-4和EMAPL4。参考DNA序列包括但不限于，NC_000002.11和NT_022184.15。智人EML4 mRNA的序列可作为登记号BC008685.1 [SEQ ID NO:88]得自NCBI，而智人EML4转录物变体1的序列可作为登记号NM_019063.3 [SEQ ID NO:89；外显子：1-287 (EML4)、288-470、471-600、601-774、775-903、904-929、930-1053、1054-1203、1204-1273、1274-1384、1385-1480、1481-1615、1616-1751、1752-1903、1904-2029、2030-2161、2162-2229、2230-2318、2319-2416、2417-2504、2505-2603、2604-2734和2735-5549]得自NCBI，且智人EML4 mRNA转录物变体2的序列可作为登记号NM_001145076.1 [SEQ ID NO:90；外显子: 1-287、288-470、471-600、601-729、730-755、756-879、880-1029、1030-1099、1100-1210、1211-1306、1307-1441、1442-1577、1578-1729、1730-1855、1856-1987、1988-2055、2056-2144、2145-2242、2243-2330、2331-2429、2430-2560和2561-5375]得自NCBI。智人EML4-ALK融合体的完整CDS可作为登记号AB663645.1 [SEQ ID NO:91；外显子：1-1655和1714-3421；内含子：1656-1657 (内含子14 EML4)和1658-1713 (内含子19 ALK)]、JQ828841.1 (变体3+20; [SEQ ID NO:92]; 338-339 EML4-ALK断点连接部)、AB374364.1 (变体5剪接异形体a; [SEQ ID NO:93]；外显子：1-275 (外显子1-2 EML4)和276-2014 (外显子20- ALK))、AB374365.1 (变体5剪接异形体b; [SEQ ID NO:94]；外显子：1-275 (外显子1-2 EML4)和393-2131 (外显子20- ALK)；内含子: 276-392 (内含子19 ALK))、AB374363.1 (变体4; [SEQ ID NO:95]；外显子：1-1708 (外显子1-14 EML4)和1720-3409 (外显子20- ALK))、AB374362.1 (变体3剪接异形体b; [SEQ ID NO:96]；外显子：1-767 (外显子1-6b EML4)、735-767 (外显子6b EML4)和768-2506 (外显子20- ALK))、AB374361.1 (变体3剪接异形体a; [SEQ ID NO:97]；外显子：1-734 (外显子1-6a EML4)和735-2473 (外显子20- ALK))、AB274722.1 (变体1; [SEQ ID NO:98]；外显子：1-1759 (外显子1-13 EML4)和1760-3926 (外显子20- ALK))和AB275889.1 (变体2; [SEQ ID NO:99]；外显子：1-2512 (外显子1-20 EML4)和2513-4679 (外显子20- ALK))得自NCBI。
(f)“杂交”表示通过两个单链核酸之间的互补碱基配对形成双链体结构。杂交可以发生在准确互补的核酸链之间，或含有低数目的错配的互补核酸链之间。
(g)“等温扩增”表示在恒定温度（即，没有热循环）制备DNA序列的拷贝的方法。例子包括解旋酶依赖性的扩增、PAN-AC、切口酶扩增反应(NEAR)和重组酶聚合酶扩增(RPA)。
(h)驱动蛋白家族成员5B基因(KIF5B)位于10号染色体上。Entrez基因、Ensembl和HGNC细胞遗传带是10p11.22。别名包括KNS1、KNS、UKHC、常规驱动蛋白重链、普遍存在的驱动蛋白重链、KINH、驱动蛋白1、驱动蛋白重链和驱动蛋白-1重链。参考DNA序列包括但不限于，NC_000010.10和NT_008705.16。mRNA序列可作为登记号NM_004521.2 [SEQ ID NO:100] (外显子: 1-596、597-684、685-758、759-863、864-912、913-968、969-1056、1057-1181、1182-1286、1287-1432、1433-1581、1582-1775、1776-1844、1845-2051、2052-2195、2196-2384、2385-2502、2503-2564、2565-2674、2675-2776、2777-2837、2838-2909、2910-3014、3015-3231、3232-3382和3383-5889)得自NCBI。
(i)“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”表示任意长度的引物、可检测的寡核苷酸和寡聚体，且包括多脱氧核糖核苷酸、多核糖核苷酸和经修饰的/未修饰的嘌呤/嘧啶碱基的任意其它N-糖苷。例子包括单链DNA (ssDNA)、双链DNA (dsDNA)、单链RNA (ssRNA)和双链RNA (dsRNA)。这样的分子可以包含磷酸二酯键或经修饰的键，包括但不限于，磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰亚胺酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、桥连的氨基磷酸酯、桥连的亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥连的硫代磷酸酯或砜键及其组合。这样的分子可以包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或尿嘧啶、以及其它经修饰的、非标准的或衍生的碱基。可选地或另外地，这样的分子可以包含一个或多个经修饰的糖部分。
(j)“聚合酶链式反应(PCR)”是一种制备DNA序列的拷贝的方法。该方法采用热循环(即，分别对DNA加热和冷却进行变性(或解链)和复制的循环)。使用引物（其为含有与要复制的DNA序列互补的序列的短DNA片段）和热稳定的DNA聚合酶（诸如得自水生栖热菌（Thermus aquaticus）的DNA聚合酶，其被称作Taq聚合酶）来选择DNA序列和复制它(参见，例如，美国专利号4,683,195、4,800,195和4,965,188，针对它们关于这些的教导，其全部通过引用并入本文)。利用重复循环，制备的拷贝用作产生其它拷贝的模板(即，链式反应)。PCR技术包括但不限于：标准PCR等位基因-特异性的PCR、装配PCR、不对称的PCR、数字PCR、热启动PCR、序列间-特异性的PCR、反向PCR、连接介导的PCR、甲基化-特异性的PCR、微引物PCR、多路连接依赖性的可检测的寡核苷酸扩增、嵌套PCR、重叠-延伸PCR、实时PCR、反转录-PCR、固相PCR、热不对称的交错PCR和降落PCR。
(k)本文中使用的“引物”表示引发模板依赖性的核酸合成的寡核苷酸。在有核酸模板、核苷三磷酸前体、聚合酶和辅因子存在下，在合适的温度和pH条件下，通过聚合酶对核苷酸的添加可以在引物的3' 末端处延伸引物，以产生引物延伸产物。所述引物的长度可以随采用的特定条件和扩增的目的而变化。例如，为诊断目的用于扩增的引物通常具有约15至约35个核苷酸的长度。所述引物必须与期望的模板具有足够的互补性以提供期望的延伸产物的合成。换而言之，所述引物必须能够与期望的模板链以特定方式退火：所述方式足以提供处于适当的并列连接的引物的3' 羟基部分用于开始通过聚合酶的合成。所述引物不一定是期望的模板的精确补体。例如，非互补的核苷酸序列可以存在于在其它地方互补的引物的5'末端处。可选地，非互补的碱基可以散布在寡核苷酸引物内，前提是所述引物序列与期望的模板链的序列具有足够的互补性，以提供模板-引物复合物用于延伸产物的合成。例如，具有与引物互补的序列的寡核苷酸可以用作探针。
(l)“探针”表示在合适的条件下与靶核酸选择性地杂交且可以被检测到的寡核苷酸。
(m)早幼粒细胞性白血病基因(PML)位于15号染色体上。Ensembl和HGNC细胞遗传带是15q24.1，而Entrez基因细胞遗传带是15q22。别名包括MYL、RNF71、TRIM19、PP8675、早幼粒细胞性白血病蛋白、含有三联基序的蛋白19、环指蛋白71、可能的转录因子PML、蛋白PML、早幼粒细胞性白血病的诱导物和三联基序蛋白TRIM19。参考DNA序列包括但不限于，NC_000015.9和NT_010194.17。PML mRNA转录物变体5的序列可作为登记号NM_033244.3 [SEQ ID NO:101；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1538、1539-1805、1806-1858和1859-3081]得自NCBI，而PML mRNA转录物变体11、9、6和10的序列分别可作为登记号NM_033250.2 [SEQ ID NO:102；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1653、1654-1706和1707-2929]、NM_033239.2 [SEQ ID NO:103；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1538、1539-1797、1798-1850和1851-3073; 1320-1325 (易位断点以形成PML-RARA)；1794-1799 (易位断点以形成PML-RARA癌基因，在B型APL中)]、NM_002675.3 [SEQ ID NO:104；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1538、1539-1797、1798-1850和1851-2238; 1320-1325 (易位断点以形成PML-RARA癌基因，在A型APL中)]和NM_033249.2 [SEQ ID NO:105；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1653、1654-1706和1707-2094]得到。PML mRNA转录物变体2、8、7和1的序列分别可作为登记号NM_033240.2 [SEQ ID NO:106；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1538、1539-1797和1798-3714; 1320-1325 (易位断点以形成PML-RARA癌基因，在A型APL中)；1794-1799 (易位断点以形成PML-RARA，在B型APL中)]、NM_033247.2 [SEQ ID NO:107；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394和1395-1782; 1320-1325 (易位断点以形成PML-RARA癌基因，在A型APL中)]、NM_033246.2 [SEQ ID NO:108；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1447和1448-1835; 1320-1325 (易位断点以形成PML-RARA癌基因，在A型APL中)]和NM_033238.2 [SEQ ID NO:109；外显子：1-269、270-742、743-1323、1324-1394、1395-1538、1539-1797、1798-1850、1851-2001和2002-5600; 1320-1325 (易位断点以形成PML-RARA癌基因，在A型APL中)；1794-1799 (易位断点以形成PML-RARA癌基因，在B型APL中)]得到。完整CDS序列可作为登记号BC000080.2 [SEQ ID NO:110]和BC020994.2 [SEQ ID NO:111]得自NCBI。多种PML-RARα基因融合体mRNA序列可作为登记号S76405.1 [SEQ ID NO:112]、S76399.1 [SEQ ID NO:113]、S76389.1 [SEQ ID NO:114]、S76373.1 [SEQ ID NO:115]、S76371.1 [SEQ ID NO:116]、S76369.1 [SEQ ID NO:117]、S76402.1 [SEQ ID NO:118]、S76397.1 [SEQ ID NO:119]、S76375.1 [SEQ ID NO:120]、S76372.1 [SEQ ID NO:121]、S76370.1 [SEQ ID NO:122]、S76387.1 [SEQ ID NO:123]、S76395.1 [SEQ ID NO:124]、S76382.1 [SEQ ID NO:125]、S57796.1 [SEQ ID NO:126]、S76379.1 [SEQ ID NO:127]、AJ417079.1 [SEQ ID NO:128；外显子：1-109 (PML外显子6)和173-296 (RARA外显子3)；内含子: 110-172 (RARA内含子2)]、AF388194.1 [SEQ ID NO:129]和AF388193.1 [SEQ ID NO:130]得自NCBI。
(n) ret原癌基因(RET)位于10号染色体上。Entrez基因和HGNC细胞遗传带是10q11.2，而Ensembl细胞遗传带是10q11.21。别名包括CDHF12、CDHR16、PTC、RET51、HSCR1、MEN2A、MEN2B、MTC1、EC 2.7.10.1、EC 2.7.10、钙粘着蛋白家族成员12、原癌基因c-Ret、希尔施普龙病1、多发性内分泌瘤形成和甲状腺髓样癌1、RET-ELE1、钙粘着蛋白相关的家族成员16、羟基芳基-蛋白激酶、原癌基因酪氨酸-蛋白激酶受体Ret、受体酪氨酸激酶和RET转化序列。参考DNA序列包括但不限于，NC_000010.10和NT_033985.7。智人mRNA的序列可作为登记号X12949.1 [SEQ ID NO:131]得自NCBI。智人RET的完整CDS序列可作为登记号BC003072.2 [SEQ ID NO:132]和BC004257.1 [SEQ ID NO:133]得自NCBI。RET转录物变体2 mRNA的序列可作为登记号NM_020975.4 [SEQ ID NO:134；外显子：1-263、264-527、528-815、816-1057、1058-1253、1254-1453、1454-1712、1713-1838、1839-1949、1950-2069、2070-2326、2327-2474、2475-2582、2583-2797、2798-2920、2921-2991、2992-3129、3130-3229、3230-3377和3378-5617; 1949-1954 (易位断点以形成TRIM27-RET癌基因)；2324-2329 (易位断点以形成PCM1-RET、RET-CCDC6、RET-GOLGA5、RET-TRIM24和RET-TRIM33癌基因)]得自NCBI，而RET转录物变体4 mRNA的序列可作为登记号NM_020630.4 [SEQ ID NO:135；外显子1-263、264-527、528-815、1058-1253、1254-1453、1454-1712、1713-1838、1839-1949、1950-2069、2070-2326、2327-2474、2475-2582、2583-2797、2798-2920、2921-2991、2992-3129、3130-3229和3230-4159; 1949-1954 (易位断点以形成TRIM27-RET癌基因]得到。智人RET外显子13、15和2的序列分别可作为登记号AF520983.1 [SEQ ID NO:136；外显子111-218]、AF520979.1 [SEQ ID NO:137；外显子1-115]和AF520975.1 [SEQ ID NO:138；外显子1-266]得自NCBI。智人RET的外显子2-20的DNA序列可作为登记号AJ243297.1 [SEQ ID NO:139；内含子1-964、外显子965-1229、内含子1230-2847、外显子2848-3140、内含子3141-5463、外显子5464-5700、内含子5701-6882、外显子6883-7079、内含子7080-9534、外显子9535-9733、内含子9734-11708、外显子11709-11967、内含子11968-12600、外显子12601-12727、内含子12728-13354、外显子13355-13464、内含子13465-14057、外显子14058-14177、内含子14178-14973、外显子14974-15230、内含子15231-17076、外显子17077-17224、内含子17225-18865、外显子18866-18973、内含子18974-20022、外显子20023-20237、内含子20238-20569、外显子20570-20695、内含子20696-22430、外显子22431-22501、内含子22502-24171、外显子24172-24310、内含子24311-25384、外显子25385-25483、内含子25484-27074、外显子27075-27221、内含子27222-28607和外显子28608-28765]得自NCBI。
(o)视黄酸受体α基因(RARα)位于17号染色体上。Entrez基因细胞遗传带是17q21，而Ensembl细胞遗传带是17q21.2，且HGNC细胞遗传带是17q21.1。别名包括NR1B1、RAR、核受体亚家族1组B成员1、核磷蛋白-视黄酸受体α融合蛋白NPM-RAR长形式、视黄酸核受体α变体1、视黄酸核受体α变体2和视黄酸受体α多肽。参考DNA序列包括但不限于，NC_000017.10和NT_010783.15。cDNA序列可作为登记号AK312564.1 [SEQ ID NO:140]得自NCBI。RARα的完整CDS序列可作为登记号BC008727.2 [SEQ ID NO:141]和AH007261.5 [SEQ ID NO:142；外显子989-1192]得自NCBI。RARα变体转录物4和3的序列分别可作为登记号NM_001145302.2 [SEQ ID NO:143；外显子：1-228、229-768、769-929、930-1106、1107-1311、1312-1470和1471-3105]和NM_001145301.2 [SEQ ID NO:144；外显子：1-228、229-768、769-917、918-1059、1060-1220、1221-1397、1398-1602、1603-1761和1762-3396; 768-773 (易位断点以形成PLZF-RARA、RARA-PLZF和PML-RARA癌基因)]得自NCBI，而RARα变体转录物1和2的序列分别可作为登记号NM_000964.3 [SEQ ID NO:145；外显子：1-116、117-656、657-805、806-947、948-1108、1109-1285、1286-1490、1491-1649和1650-3284; 656-661 (易位断点以形成PLZF-RARA、RARA1-PLZF和PML-RARA癌基因)]和NM_001024809.3 [SEQ ID NO:146；外显子：1-849、850-998、999-1140、1141-1301、1302-1478、1479-1683、1684-1842和1843-3477]得到。外显子1、9、7和3的序列分别可作为登记号AF088888.2 [SEQ ID NO:147；外显子989-1192]、AF088895.2 [SEQ ID NO:148；外显子261-1081]、AF088893.1 [SEQ ID NO:149；外显子326-530]和AF088890.1 [SEQ ID NO:150；外显子293-441]得到。外显子2、4、8和5-6的序列分别可作为登记号AF088889.2 [SEQ ID NO:151；外显子107-646]、AF088891.2 [SEQ ID NO:152；外显子181-322]、AF088894.1 [SEQ ID NO:153；外显子156-314]和AF088892.1 [SEQ ID NO:154；外显子422-582和843-1019]得到。
(p)本文中使用的“特异性地杂交”表示给定的核酸（诸如引物或可检测的寡核苷酸）特异性地结合另一种核酸的能力。
(q)“严格的”或“序列-特异性的”杂交条件表示这样的条件：在该条件下，仅准确互补的核酸链会杂交。严格杂交（stringent hybridization）条件是本领域众所周知的。严格条件是序列依赖性的，且在不同的情况下将是不同的。通常，将严格条件选择为比特定序列在使50%的碱基对解离的确定pH和离子强度条件下的热熔点(Tm)低约5℃。
(r)“基本互补的”表示除了微小的错配区域以外互补的序列。通常，长度为约15个核苷酸的核酸中错配的总数是约3个核苷酸或更少。
(s)“靶序列”和“靶区域”表示要检测、或者检测并分析的核酸区域，且其包含本公开内容的背景下的目标融合位点，即，e1a2、b2a2、b3a2和e19a2。
(t)“变体-特异性的”表示这样的寡核苷酸，诸如寡核苷酸引物或寡核苷酸探针：其分别特异性地扩增或特异性地杂交给定的基因融合体变体的核酸序列，但是不会特异性地扩增或特异性地杂交相同基因融合体的其它变体或其它基因融合体变体。
在本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且不会在其它方面意图是限制性的。
扩增、检测和定量的方法
提供了单独地或进一步与检测或者检测并定量组合地扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法。所述融合体可以源自染色体重排，诸如易位或倒位。当以一个基因的一部分(例如，外显子)变得与另一个基因的一部分(例如，外显子)邻接的方式描述基因融合体时，例如，应当理解，所述融合体不限于特定类型的染色体重排，且可以是例如易位或倒位的结果。
提供了扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法。所述第一基因和所述第二基因可以是产生变体的任何已知的基因。例如，所述第一基因和所述第二基因可以是断裂点簇区(BCR)基因和Abelson鼠白血病(ABL)原癌基因、棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因、驱动蛋白家族成员5B (KIF5B)基因和Ret (RET)原癌基因、或早幼粒细胞性白血病(PML)基因和视黄酸受体α(RARα)基因。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，诸如通过聚合酶链式反应，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物。”第一”和“第二”的应用不要求所述第一基因是在所述第二基因的5'侧；相反，所述第一基因是普通融合配偶体，而所述第二基因是变体融合配偶体。所述方法可以进一步包括(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。通过聚合酶链式反应，可以扩增反转录的cDNA，例如，在有脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。一种或多种引物可以被可检测地标记。当可检测地标记超过一种引物时，优选地可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。所述探针可以在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。所述方法的步骤(a)可以进一步包括使用至少一个内部对照(IC)基因的引物，其中所述引物可以与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，且所述方法的步骤(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记至少一个IC基因的一种或多种引物。当可检测地标记至少一个IC基因的超过一种引物时，优选地可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
还提供了扩增得自人的mRNA样品中的断裂点簇区(BCR)基因和Abelson鼠白血病(ABL)原癌基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含BCR-ABL基因融合体变体集合的引物(诸如2、3或4种引物)，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体。所述方法可以进一步包括(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应，可以扩增反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。所述引物可以包含与ABL的外显子a2杂交的引物。所述引物可以包含与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物。与BCR的外显子b2杂交的引物可以扩增从包含b2a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA和从包含b3a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA。一种或多种引物可以被可检测地标记。如果可检测地标记超过一种引物，优选地可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针可以是这样的探针：其在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。所述方法的步骤(a)可以进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物可以与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，且所述方法的步骤(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。一种或多种引物可以被可检测地标记。如果可检测地标记超过一种引物，优选地可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。与ABL的外显子a2杂交的引物可以包含SEQ ID NO: 4、25、26或27的核苷酸序列，诸如SEQ ID NO: 4。与BCR的外显子e1杂交的引物可以包含SEQ ID NO: 1、18、19、20、21或22的核苷酸序列，诸如SEQ ID NO: 1。与BCR的外显子b2杂交的引物可以包含SEQ ID NO: 2或23的核苷酸序列，诸如SEQ ID NO: 2。与BCR的外显子e19杂交的引物可以包含SEQ ID NO: 3或24的核苷酸序列，诸如SEQ ID NO: 3。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 5、28、29、30或与其互补的序列，诸如SEQ ID NO: 5。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 6、31、32或与其互补的序列，诸如SEQ ID NO: 6。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 7、33、34、35或与其互补的序列，诸如SEQ ID NO: 7。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 8、36或与其互补的序列，诸如SEQ ID NO: 8。
还提供了扩增得自人的mRNA样品中的棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含EML4-ALK基因融合体变体集合的引物(诸如2、3、4或5种引物)，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：E13A20基因融合体、E6aA20基因融合体、E6bA20基因融合体、E14A20基因融合体和E20A20基因融合体。所述方法可以进一步包括(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应，可以扩增反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。所述引物可以包含与ALK的外显子A20杂交的引物。所述引物可以包含与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物中的2种或更多种。与EML4的外显子E6a杂交的引物可以扩增从包含E6a基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E6b基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA。与EML4的外显子E13杂交的引物可以扩增从包含E13基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E14基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA。一种或多种引物可以被可检测地标记。如果可检测地标记超过一种引物，优选地可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。所述至少一种探针可以是这样的探针：其在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；或在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。所述方法的步骤(a)可以进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，且所述方法的步骤(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记一种或多种IC引物。优选地，可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。所述方法的步骤(a)(ii)可以进一步包括使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物针对至少一种选自以下的其它EML4-ALK基因融合体变体：E18A20基因融合体、E15A20基因融合体、E2A20基因融合体和E17A20基因融合体。
还提供了扩增得自人的mRNA样品中的驱动蛋白家族成员5B (KIF5B)基因和Ret (RET)原癌基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含KIF5B-RET基因融合体变体集合的引物(诸如2、3或4种引物)，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：K15R12基因融合体、K16R12基因融合体、K22R12基因融合体和K23R12基因融合体。所述方法可以进一步包括(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应，可以扩增反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。所述引物可以包含与RET的外显子R12杂交的引物。所述引物可以包含与KIF5B的外显子K15杂交的引物和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物。与KIF5B的外显子K15杂交的引物可以扩增从包含K15R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K16R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA。与KIF5B的外显子K22杂交的引物可以扩增从包含K22R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K23R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA。一种或多种引物可以被可检测地标记。优选地，可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针可以是这样的探针：其在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；或在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。所述方法的步骤(a)可以进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记一种或多种IC引物。优选地，可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测所述至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
还提供了扩增得自人的mRNA样品中的早幼粒细胞性白血病(PML)基因和视黄酸受体α(RARα)基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含PML-RARα基因融合体变体集合的引物(诸如2或3种引物)，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：P3R3基因融合体、P6aR3基因融合体和P6bR3基因融合体。所述方法可以进一步包括(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应，可以扩增反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。所述引物可以包含与RARα的外显子R3杂交的引物。所述引物可以包含与PML的外显子P3杂交的引物和/或与PML的外显子6a杂交的引物。与PML的外显子6a杂交的引物可以扩增从包含P6aR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA和从包含P6bR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA。一种或多种引物可以被可检测地标记。优选地，可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针可以是这样的探针：其在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；或在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。所述方法的步骤(a)可以进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记一种或多种IC引物。优选地，可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
还提供了检测得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，扩增所述反转录的cDNA，和(b)检测扩增的cDNA，和任选地，同时地或依次地定量所述扩增的cDNA。”第一”和“第二”的应用不要求所述第一基因是在所述第二基因的5'侧；相反，所述第一基因是普通融合配偶体，而所述第二基因是变体融合配偶体。一种或多种引物可以被可检测地标记，在该情况下，优选地可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针可以是这样的探针：其在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。所述方法的步骤(a)可以进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物可以与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，且所述方法的步骤(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记一种或多种IC引物，在该情况下，优选地可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
还提供了检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物（即，正向引物和反向引物）扩增所述反转录的cDNA，所述引物实现BCR-ABL基因融合体变体集合的反转录和扩增，所述集合包含至少两种基因融合体变体，诸如2、3或4种基因融合体变体，所述基因融合体变体选自e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，随后，如果得自e1a2、b2a2、b3a2或e19a2 BCR-ABL基因融合体变体的mRNA存在于所述mRNA样品中，将所述mRNA反转录成cDNA (参见(a)(i))并扩增所述反转录的cDNA(参见(a) (ii))，和(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。所述引物可以包含与ABL的外显子a2杂交的引物，诸如反向引物。与ABL的外显子a2杂交的引物可以从两种或更多种BCR-ABL基因融合体变体的mRNA反转录cDNA。所述引物可以包含与BCR的外显子e1、BCR的外显子b2和BCR的外显子e19杂交的引物，诸如正向引物。与BCR的外显子b2杂交的引物（诸如正向引物）可以扩增从包含b2a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA和从包含b3a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA。一种或多种引物可以被可检测地标记，诸如不同地可检测地标记，在该情况下，优选地，和甚至理想地，可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。
作为可检测地标记一种或多种引物的替代或另外地，步骤(b)可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针可以是这样的探针：其在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。步骤(b)可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与不同的BCR-ABL基因融合体变体cDNA杂交，且每种探针与扩增的cDNA的杂交优选地、甚至理想地是可辨别的。
步骤(a)可以进一步包括，使用引物，即，正向引物和反向引物，其实现得自至少一个IC基因的mRNA至cDNA的反转录(参见(a)(i))和反转录的IC cDNA的扩增(参见(a)(ii))，在该情况下，步骤(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。所述IC引物可以与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交。可以可检测地标记一种或多种IC引物，诸如针对每种IC cDNA不同地可检测地标记，在该情况下，优选地，甚至理想地，可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。因而，检测扩增的IC cDNA可以包括检测标记的IC引物。作为通过检测标记的IC引物来检测扩增的IC cDNA的替代或另外地，检测扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针（诸如在IC基因的两个外显子的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含一个外显子的3'末端和邻接外显子的5'末端）和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针和/或至少一种IC引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针和/或IC引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交优选地、甚至理想地是可辨别的。可以将得自两个或更多个IC基因（诸如两个IC基因、三个IC基因、四个IC基因或超过四个IC基因）的信号平均化，且可以使用平均信号来定量根据本文描述的方法扩增和检测的一种或多种基因融合体。
与ABL的外显子a2杂交的引物（诸如反向引物）可以包含SEQ ID NO: 4、25、26或27的核苷酸序列。引物（尤其是反向引物）的一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 4。
与BCR的外显子e1杂交的引物（诸如正向引物）可以包含SEQ ID NO: 1、18、19、20、21或22的核苷酸序列。一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1。
与BCR的外显子b2杂交的引物（诸如正向引物）可以包含SEQ ID NO: 2或23的核苷酸序列。一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 2。
与BCR的外显子e19杂交的引物（诸如正向引物）可以包含SEQ ID NO: 3或24的核苷酸序列。一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3。
在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 5、28、29、30或与其互补的序列。SEQ ID NO: 5或与其互补的序列是优选的。
在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 6、31、32或与其互补的序列。SEQ ID NO: 6或与其互补的序列是优选的。
在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 7、33、34、35或与其互补的序列。SEQ ID NO: 7或与其互补的序列是优选的。
在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含SEQ ID NO: 8、36或与其互补的序列。SEQ ID NO: 8或与其互补的序列是优选的。
还提供了检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物（即，正向引物和反向引物）扩增所述反转录的cDNA，所述引物实现至少一种BCR-ABL基因融合体变体的反转录和扩增，所述BCR-ABL基因融合体变体包含e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体或e19a2基因融合体，其中所述引物包含含有SEQ ID NO: 1、2、3、18、19、20、21、22、23或24的核苷酸序列的引物，诸如正向引物，随后，如果得自至少一种BCR-ABL基因融合体变体的mRNA存在于所述mRNA样品中且使用实现至少一种BCR-ABL基因融合体变体的反转录和扩增的正向引物和反向引物，那么将所述mRNA反转录成cDNA (参见(a)(i))并扩增所述反转录的cDNA(参见(a)(ii))，和(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。一种或多种引物可以被可检测地标记，诸如不同地可检测地标记，在该情况下，优选地，甚至理想地，可以区分一种或多种标记的引物的检测。作为可检测地标记一种或多种引物的替代或另外地，步骤(b)可以包括：使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述探针与所述扩增的cDNA的杂交。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与不同的BCR-ABL基因融合体变体cDNA杂交，且每种探针与所述扩增的BCR-ABL基因融合体变体cDNA的杂交优选地、甚至理想地是可辨别的。
步骤(a)可以进一步包括，使用引物，即，正向引物和反向引物，其实现得自至少一个IC基因的mRNA至cDNA的反转录和反转录的IC cDNA的扩增，在该情况下，步骤(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。所述IC引物任选地与至少一个IC基因的不同外显子杂交。可以可检测地标记一种或多种IC引物，诸如针对每种IC cDNA不同地可检测地标记，在该情况下，可以优选地、甚至理想地区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。因而，检测扩增的IC cDNA可以包括检测标记的IC引物。BCR-ABL基因融合体变体的反转录和扩增的条件理想地适合于至少一个IC基因的反转录和扩增。作为通过检测标记的IC引物来检测扩增的IC cDNA的替代或另外地，检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少一种探针和/或至少一种引物接触，其中每种探针/引物对每种扩增的IC cDNA是特异性的，且每种探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交优选地、甚至理想地是可辨别的。
所述引物可以包含含有SEQ ID NO: 1、18、19、20、21或22的核苷酸序列的引物，诸如正向引物。一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或与其互补的序列。
所述引物可以包含含有SEQ ID NO: 2或23的核苷酸序列的引物，诸如正向引物。一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 2。
所述引物可以包含含有SEQ ID NO: 3或24的核苷酸序列的引物，诸如正向引物。一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3。
所述引物（诸如反向引物）可以包含选自SEQ ID NO: 4、25、26或27的核苷酸序列。SEQ ID NO: 4是优选的，特别对于反向引物而言。
至少一种探针可以包含这样的探针：其包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、28、29、30、31、32、33、34、35、36的核苷酸序列或与其互补的序列。优选地，至少一种探针包含：包含SEQ ID NO: 5、28、29、30的核苷酸序列或与其互补的序列的探针，包含SEQ ID NO: 6、31、32的核苷酸序列或与其互补的序列的探针，包含SEQ ID NO: 7、33、34、35的核苷酸序列或与其互补的序列的探针，和/或包含SEQ ID NO: 8、36的核苷酸序列或与其互补的序列的探针。更优选地，至少一种探针包含：包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列或与其互补的序列的探针，包含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列或与其互补的序列的探针，包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列或与其互补的序列的探针，和/或包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列或与其互补的序列的探针。
当所述方法包括检测得自两种或更多种BCR-ABL基因融合体变体的mRNA时，所述方法可以包括(i)得到从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)一起或单独地扩增所述BCR-ABL基因融合体变体的反转录的cDNA。使用任意合适的方法，可以检测、或检测并定量BCR-ABL融合体变体的存在。当一起扩增（就得到的cDNA而言）和一起反转录并扩增（就mRNA而言）BCR-ABL基因融合体变体时，彼此可以区分的探针的应用例如能够确定每种BCR-ABL基因融合体变体的存在/缺失/量。
还提供了检测得自人的mRNA样品中的棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用EML4-ALK基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：E13A20基因融合体、E6aA20基因融合体、E6bA20基因融合体、E14A20基因融合体和E20A20基因融合体，和(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。所述引物包含与ALK的外显子A20杂交的引物。所述引物可以包含与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物。与EML4的外显子E6a杂交的引物可以扩增从包含E6a基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E6b基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与EML4的外显子E13杂交的引物可以扩增从包含E13基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E14基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA。可检测地标记一种或多种引物。可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针是这样的探针：其在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E14的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；或在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。在所述方法中，(a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物任选地与至少一个IC基因的不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记一种或多种IC引物。可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。在所述方法中，(a)(ii)可以进一步包括，使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物针对至少一种选自以下的其它EML4-ALK基因融合体变体：E18A20基因融合体、E15A20基因融合体、E2A20基因融合体和E17A20基因融合体。
还提供了检测得自人的mRNA样品中的驱动蛋白家族成员5B (KIF5B)基因和Ret (RET)原癌基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用KIF5B-RET基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：K15R12基因融合体、K16R12基因融合体、K22R12基因融合体和K23R12基因融合体，和(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。所述引物包含与RET的外显子R12杂交的引物。所述引物可以包含与KIF5B的外显子K15杂交的引物和与KIF5B的外显子K22杂交的引物。与KIF5B的外显子K15杂交的引物可以扩增从包含K15R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K16R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物可以扩增从包含K22R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K23R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA。可检测地标记一种或多种引物。可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针可以是这样的探针：其在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；或在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。在所述方法中，(a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物任选地与至少一个IC基因的不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记一种或多种IC引物。可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA包括使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
还提供了检测得自人的mRNA样品中的早幼粒细胞性白血病(PML)基因和视黄酸受体α(RARα)基因的融合体变体的mRNA的方法。所述方法包括(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用PML-RARα基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含P3R3基因融合体、P6aR3基因融合体和P6bR3基因融合体中的至少两种，和(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。所述引物包含与RARα的外显子R3杂交的引物。所述引物可以包含与PML的外显子P3杂交的引物和与PML的外显子6a杂交的引物。与PML的外显子6a杂交的引物可以扩增从包含P6aR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA和从包含P6bR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA。可检测地标记一种或多种引物。可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。检测所述扩增的cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。至少一种探针是这样的探针：其在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；或在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。检测所述扩增的cDNA可以包括：使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。在所述方法中，(a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物任选地与至少一个IC基因的不同外显子杂交，和(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。可以可检测地标记一种或多种IC引物。可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。检测所述扩增的IC cDNA可以包括：使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
考虑到以上内容和本文中的“实施例”，以上方法可以用于分析其它基因融合体变体。参见，例如，在COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer; cancer.sanger.ac.uk/cosmic/fusion)中报告的接近9,000种融合体，已经观察或推断出它们的断点(存在的mRNA的部分以HGVS (Human Genome Variation Society)形式阐述在COSMIC上)。
例如，据报道APSCR1 (软组织腺泡状肉瘤染色体区域, 候选物1；基因ID ENSG00000169696；转录物ID ENST00000306739)与TFE3 (结合IGHM增强子3的转录因子; NCBI (国家生物技术信息中心)登录号NM_006521.3 (cDNA)；[SEQ ID NO:155]；外显子：1-354、355-468、469-772、773-1018、1019-1123、1124-1241、1242-1298、1299-1374、1375-1522和1523-3393)形成基因融合体。已经如下推断断点：1_1030 ASPSCR1和1031_1841 TFE3、1_1030 ASPSCR1和1019_3431 TFE3、和1_1030 ASPSCR1和1124_3431 TFE3 (NM_006521.3)；[SEQ ID NO:155]。
据报道ALK (间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶; NCBI登录号NM_004304.4; [SEQ ID NO:39])与C2orf44 (2号染色体开放读码框44；转录物ID ENST00000295148)、CARS (半胱氨酰基-tRNA合成酶；转录物ID ENST00000278224)、NPM1 (核磷蛋白(核仁磷蛋白B23，核仁间质蛋白)；NCBI登录号NM_002520.6; [SEQ ID NO:156]；外显子：1-303、304-383、384-503、504-597、598-704、705-769、770-827、828-914、915-1016、1017-1091和1092-1449)、RANBP2 (RAN结合蛋白2; NCBI登录号NM_006267.4; [SEQ ID NO:157]；外显子：1-198、199-266、267-378、379-531、532-762、763-908、909-1101、1102-1189、1190-1399、1400-1581、1582-1757、1758-1881、1882-2043、2044-2181、2182-2328、2329-2508、2509-2592、2593-2728、2729-2823、2824-7975、7976-8146、8147-8239、8240-8418、8419-8623、8624-8725、8726-8886、8887-9160、9161-9495和9496-11711)和TPM3 (原肌球蛋白3; NCBI登录号NM_153649.3; [SEQ ID NO:158]；外显子：1-262、263-396、397-514、515-585、586-661、662-724、725-794和795-3212)形成基因融合体。当ALK与C2orf44融合时，推断的断点是1_3817+654 C2orf44和4080-117_6222 ALK，而当ALK与CARS融合时，推断的断点是1_1893+1117 CARS和4080-229_6222 ALK，当ALK与NPM1融合时，推断的断点是1_448 NPM1和4080_6222 ALK，当ALK与RANBP2融合时，推断的断点是1_2728 RANBP2和4080_6222 ALK，且当ALK与TPM3融合时，推断的断点是1_794 TPM3和4080_6222 ALK。在这点上，我们指出，据报道TPM3也与NTRK1 (神经营养性的酪氨酸激酶, 受体, 1型；转录物ID ENST00000392302)形成基因融合体，其推断的断点是1_794 TPM3和1269_2609 NTRK1。
除了TPM3以外，据报道NTRK1 (神经营养性的酪氨酸激酶, 受体, 1型；转录物ID ENST00000392302)也与TPR (转录物ID ENST00000367578)形成基因融合体。推断的断点是1_3073 TPR和1262_2609 NTRK1。
据报道SS18 (滑膜肉瘤易位, 18号染色体；转录物ID ENST00000269138)与SSX1 (滑膜肉瘤，X断点1; NCBI登录号NM_005635.3; [SEQ ID NO:159]；外显子：1-116、117-205、206-320、321-416、417-466、467-602、603-707和708-1298；易位断点以形成SSXT-SSX1融合蛋白: 320-325和464-469)和SSX2 (滑膜肉瘤，X断点2; NCBI登录号NM_003147.5; [SEQ ID NO:160]；外显子：1-116、117-205、206-320、321-416、417-466、467-602、603-748、749-853和854-1476)形成基因融合体。当SS18与SSX1融合时，推断的断点是1_1308 SS18和422_1271 SSX1、和1_1308 SS18和422-1104_1271 SSX1。当SS18与SSX2融合时，推断的断点是1_1308 SS18和439_1466 SSX2。
据报道COL1A1 (胶原, 1型, α1；转录物ID ENST00000225964)与PDGFB (血小板-衍生的生长因子β多肽; NCBI登录号NM_002608.2; [SEQ ID NO:161]；外显子：1-1052、1053-1149、1150-1239、1240-1445、1446-1590、1591-1743和1744-3377)形成基因融合体。已经如下推断断点：1_768 COL1A1和1086_3373 PDGFB、1_1182 COL1A1和1086_3373 PDGFB、1_1740 COL1A1和1086_3373 PDGFB、1_1893 COL1A1和1086_3373 PDGFB、1_2739 COL1A1和1086_3373 PDGFB、1_2955 COL1A1和1086_3373 PDGFB、1_3171 COL1A1和1086_3373 PDGFB、1_3333 COL1A1和1086_3373 PDGFB、和1_3549 COL1A1和1086_3373 PDGFB。
据报道FUS (在肉瘤中融合的; NCBI登录号NM_004960.2)与CREB3L2 (cAMP应答元件结合蛋白3-样2; NCBI登录号NM_194071.3; [SEQ ID NO:162]；外显子：1-498、499-715、716-891、892-979、980-1164、1165-1311、1312-1370、1371-1439、1440-1539、1540-1666、1667-1883和1884-7456)、DDIT3 (DNA损伤诱导的转录物3; NCBI登录号NM_004083.5; [SEQ ID NO:163]；外显子：1-100、101-148和149-318)和ERG (v-ets成红细胞增多病病毒#26癌基因同系物(禽类)；NCBI登录号NM_004449.4; [SEQ ID NO:164]；外显子：1-123、124-225、226-311、312-529、530-681、682-885、886-996、967-1035、1036-1092、1093-1140和1141-5037)形成基因融合体。已经推断的断点如在表Ia和Ib中所示。
表Ia
通过共有的5'基因片段推断的FUS基因融合体变体的断点
表1b
通过共有的3'基因片段推断的FUS基因融合体变体的断点
据报道EWSR1 (尤因肉瘤断点区域1; NCBI登录号NM_005243.2; [SEQ ID NO:165]；外显子：1-322、323-359、360-411、412-535、536-722、723-890、891-1102、1103-1283、1284-1321、1322-1354、1355-1473、1474-1603、1604-1726、1727-1889、1890-1987和1988-2240)与CREB1 (cAMP应答元件结合蛋白1；转录物ID ENST00000236996)、FLI1 (弗兰德白血病病毒整合1; NCBI登录号NM_002017.2; [SEQ ID NO:166]；外显子：8-190、191-402、403-557、558-761、762-827、828-893、894-953、954-1001和1002-2945)、ERG (v-ets成红细胞增多病病毒E26癌基因同系物(禽类)；NCBI登录号NM_004449.4; [SEQ ID NO:164])、WT1 (肾母细胞瘤1; NCBI登录号NM_024426.3; [SEQ ID NO:167]；外显子：1-842、843-965、966-1068、1069-1146、1147-1197、1198-1294、1295-1445、1446-1535和1536-1628)、FEV (ETS癌基因家族; NCBI登录号NM_017521.2; [SEQ ID NO:168]；外显子：1-634、635-709和710-1879)和NR4A3 (核受体亚家族4、组A成员3; NCBI登录号NM_006981.2; [SEQ ID NO:169]；外显子：1-553、554-727、728-1680、1681-1810、1811-1983、1984-2183、2184-2362和2363-5634)形成基因融合体。在这点上，我们应当指出，据报道NR4A3也与TAF15 (RNA聚合酶II、TATA框结合蛋白(TBP)-相关的因子；转录物编号ENST00000311979)形成基因融合体。已经推断的断点如在表Ic (对于每篇参考文献，其包括TAF15:NR4A3)和Id中所示。
表Ic
通过共有的5'基因片段推断的EWSR1基因融合体变体的断点
表Id
通过共有的3'基因片段推断的EWSR1基因融合体变体的断点
据报道KIAA1549 (转录物ID ENST00000242365)与BRAF (v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1; NCBI登录号NM_004333.4; [SEQ ID NO:170]；外显子：1-199、200-301、302-565、566-669、670-772、773-921、922-1041、1042-1201、1202-1238、1239-1375、1376-1493、1494-1578、1579-1755、1756-1802、1803-1921、1922-2053、2054-2188和2189-2947)形成基因融合体。推断的断点显示在表Ie中。
表Ie
通过共有的5'基因片段推断的KIAA1549基因融合体变体的断点
据报道TMPRSS2 (跨膜蛋白酶、丝氨酸2; NCBI登录号NM_005656.3; [SEQ ID NO:171]；外显子：1-78、79-149、150-372、373-459、460-579、580-706、707-817、818-861、862-1033、1034-1209、1210-1305、1306-1448、1449-1601和1602-3204)与ERG (v-ets成红细胞增多病病毒E26癌基因同系物(禽类)；NCBI登录号NM_004449.4; [SEQ ID NO:164])形成基因融合体。推断的断点显示在表If中。
表If
通过共有的5'基因片段推断的TMPRSS2基因融合体变体的断点
任何合适的组织或体液样品可以用作核酸（即，mRNA）的样品的来源。由于BCR-ABL基因融合体变体通常存在于具有慢性髓性白血病(CML)的人和某些具有急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的人中，通常，所述来源是血液(或其细胞组分，诸如白血细胞)。由于PML-RARα基因融合体变体通常存在于具有急性早幼粒细胞性白血病(APL)的人中，通常所述来源也是血液(或其细胞组分，诸如白血细胞)。对于BCR-ABL和PML-RARα试验而言，骨髓也可以用作样品核酸（即，mRNA）的来源，但是，鉴于对骨髓取样是一个非常侵袭性的程序，血液及其组分一般是优选的。在将BCR-ABL和/或PML-RARα基因融合体确定为其它疾病、障碍或病症的诊断/预后的情况下，其它样品可能用作核酸（即，mRNA）的样品的来源。这样的样品的例子包括但不限于，肿瘤活组织检查、触摸制备物和细针抽吸。可以将生物样品保存，诸如通过加入螯合剂，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐，诸如二钠盐或钙二钠盐。可以将蛋白水解酶（诸如蛋白水解酶K）加入样品中以消化不希望的蛋白。
由于EML4-ALK和KIF5B-RET融合体变体通常存在于具有实体瘤(例如，对于EML4-ALK而言，肺癌、乳腺癌和结直肠癌；和对于KIF5B-RET而言，肺癌)的人中，通常核酸（即，mRNA）的来源是切除的癌症肿瘤、活组织检查的肿瘤和/或细针抽吸物。可以将生物样品保存，诸如通过福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)。
如本领域已知的，可以将样品制备用于使用任意合适的方法的测定。理想地，所述方法提取和浓缩核酸，特别是mRNA。所述方法也理想地制备可用于反转录和扩增的核酸（即，mRNA），并从所述提取物除去反转录和扩增的潜在抑制剂。
使用例如得自Qiagen Inc. (Valencia, CA)的RNeasy RNA分离试剂盒，可以从外周血分离RNA。例如使用得自Qiagen (Valencia, CA)的RNeasy FFPE分离试剂盒，可以从FFPE样本分离RNA。也可以使用任意其它RNA提取和纯化技术，包括从化学提取至自动化的磁珠核酸捕获系统的液体-液体和固相技术。可以将RNA分离和反转录，并可以将得到的cDNA扩增(例如，如在例如美国专利号5,310,652、5,322,770、5,561,058、5,641,864和5,693,517中描述的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR))。
一旦已经得到核酸且如果必要的话经过反转录(例如，mRNA至cDNA)，就可以使它与引物接触，如果特定基因融合体变体存在于样品中，所述引物会导致特定基因融合体变体的特异性扩增。“特异性扩增”是指，所述引物扩增目标特定基因融合体变体，且不扩增其它基因融合体变体。参见，例如，PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, 编, Freeman Press, NY (1992)); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis等人, 编, Academic Press, San Diego, CA (1990)); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1994-1999，包括直到2004年4月的补充更新)；和Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 第3版, 2001)。多种其它基于扩增的方法或基于延伸的方法描述在国际专利申请公开号WO 93/22456和美国专利号4,851,331、5,137,806、5,595,890和5,639,611中，针对它们关于这些的教导，它们都特别地通过引用并入本文。尽管可以使用方法诸如连接酶链式反应、链置换测定和各种基于转录的扩增方法(参见，例如，Abramson和Myers, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47 (1993)的综述)，但是PCR是优选的。
可以在单个扩增反应中同时使用两种或更多种基因融合体变体的引物。通过不同的标记或尺寸(例如，使用凝胶电泳)，可以区分扩增产物。
可以用标记可检测地标记引物，所述标记可以通过例如光谱、光化学、生化、免疫化学或化学方式检测到(参见，例如，Sambrook等人)。有用的标记包括染料，诸如荧光染料，放射性标记，诸如32P，电子致密试剂，酶，诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶，生物素，或可得到其抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。
可以类似地标记探针，诸如用荧光素。在这点上，如果将引物用染料标记和将可检测的寡核苷酸用荧光素标记并设计成结合新生链（而不是染料），可以发生跨DNA螺旋的荧光共振能量转移(FRET)。
任何合适的序列可以用作IC。IC基因的例子阐述在本文的“实施例”中，即，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、ABL和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)。
核酸扩增试剂（诸如用于相同孔中的RT-PCR）包括具有聚合酶活性的酶(例如，rTth)、一种或多种酶辅因子(例如，MnCl2)和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP；例如，dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。在本文中例证了核酸扩增试剂的优选浓度。
促进扩增的条件是促进引物的退火和核酸序列的延伸的那些条件。退火依赖于多种参数，诸如温度、离子强度、正在扩增的序列的长度、互补性、和正在扩增的序列的G:C含量。例如，降低温度会促进互补核酸序列的退火。高G:C含量和较长的长度会稳定化双链体形成。通常，约30 bp或更小且具有高G:C含量的引物和可检测的寡核苷酸较好地工作。在本文中例证了优选的扩增条件、引物和可检测的寡核苷酸。
通过使反应混合物热循环约10次至约100次，诸如约20次至约75次，诸如约25次至约50次，可以将扩增重复任意合适的次数。
一旦扩增反应结束，就可以使用任意合适的方法检测扩增产物的存在。这样的方法包括但不限于，本领域已知的那些，诸如用或不用荧光染料(取决于是否用染料-标记的引物扩增产物)的凝胶电泳、使用嵌入染料的解链特性(参见，例如，PCR Technology,Principles, and Applications for DNA Amplification, Erlich, 编, W. H. Freeman and Co., New York, 1992, 第7章)、和使用内部探针的杂交。也可以使用的方法的其它例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、电化学发光、反向斑点印迹、高压液相色谱法(HPLC) (参见，例如，Lazar, Genome Res. 4: S1-S14 (1994))和单链PCR产物的单链构象多态性分析(参见，例如，Orita等人, PNAS USA 86: 2766-2770 (1989))。
通过监测反应混合物中双链DNA (dsDNA)的总量的增加(参见，例如，美国专利号5,994,056和欧洲专利公开号487,218和512,334)，可以检测扩增的核酸。使用结合DNA的染料，诸如SYBR Green。染料在结合dsDNA时会发荧光，且使用荧光的增加来确定dsDNA的增加。
基于双脱氧测序的方法和寡核苷酸-长度产物的焦磷酸测序TM也可以用于检测扩增的核酸。Kobayashi 等人(Mol. Cell. Probes 9: 175-182 (1995))描述了另一种测序方法。
当使用PCR时，可以使用条件，诸如在本文实施例中举例说明的那些。当使用标准PCR时，在扩增完成后，诸如在扩增过程中使用标记的引物以后，通过在扩增以后使用标记的引物作为探针，或通过使用在序列上不同于引物的探针，在扩增以与扩增的靶序列杂交以后，可以进行检测。随后可以通过其它方式分离和检测标记的扩增产物。
可选地，可以在实时PCR测定中组合扩增和检测。当使用实时PCR时，所述混合物可以进一步包含核酸检测试剂，诸如插入任何双链DNA的非特异性的荧光染料，例如，或序列-特异性的DNA探针，其仅在所述探针与它的互补DNA靶标杂交以后允许检测，由此实现同时扩增和检测。当探针在扩增过程中存在于混合物中时，所述探针应当在促进扩增的条件下是稳定的，应当不会干扰扩增，应当在扩增条件下结合它的靶序列，和仅在结合它的靶序列以后发射信号。在这点上特别适当的探针的例子包括分子信标探针、TAQMAN®探针和线性探针，诸如Abravaya等人(美国专利申请公开号2005/0227257)描述的那些。所述探针可以形成分子信标的环区域，其为单独的或进一步与茎区域的部分组合。所述探针也可以用作线性探针，其具有在一端的荧光团(例如，FAM)和在另一端的高效猝灭剂，诸如Black Hole Quencher (BHQ®; BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA)。
扩增产物的检测指示，含有一种或多种特定基因融合体变体(取决于是否同时检测两种或更多种基因融合体变体)的细胞存在于样品中，而扩增产物的检测的缺乏指示，含有特定基因融合体变体的细胞不存在于样品中。在这点上，如果同时扩增两种或更多种特定基因融合体变体(或一种或更多种特定基因融合体变体和一种内部对照(IC)基因)，可以用独特的可检测标记物标记每种特定基因融合体变体的引物，由此使两种或更多种特定基因融合体变体(或一种或更多种特定基因融合体变体和一种IC基因)的检测可被区分开。基因融合体变体和IC产物的相对水平可以指示含有基因融合体变体的样品中的细胞的比例。
如果需要的话，所述方法可以进一步包括最初的通用扩增步骤。例如，可以使样品与简并引物接触，并在特异性扩增一种或多种基因融合体变体（单独地或进一步与IC序列组合地）之前扩增。
如果需要的话，可以将核酸样品或探针固定化在固体支持物上。利用固体支持物的测定形式的例子包括斑点印迹形式和反向斑点印迹形式(参见，例如，美国专利号5,310,893、5,451,512、5,468,613和5,604,099，针对它们关于这些的教导，它们都特别地通过引用并入本文)。
扩增后，可能需要将扩增产物与模板和多余的引物分离以确定是否发生特异性扩增。使用标准方法(参见，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning, Fritsch和Maniatis, 编, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY (1989))，通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳可以实现分离。可选地，可以使用色谱法实现分离。色谱法的类型的例子包括吸附、分配、离子交换和分子筛，且色谱技术的类型的例子包括柱、纸、薄层和气相色谱法(参见，例如，Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 第2版, Wm. Freeman & Co., New York, NY (1982))。
通过显色证实扩增。例如，用溴化乙锭染色的凝胶可以使用紫外线显色。用放射性同位素标记的扩增产物可以通过将x-射线胶片暴露和显色来显色，而用荧光测量标记物标记的扩增产物可以通过使扩增产物遭受刺激波谱来显色。扩增显色的一种优选方法是使用与扩增产物杂交的经标记的探针。
可以使用手工柱，诸如可得自Qiagen的手工柱。自动化样品制备系统（诸如设计成使用磁性微粒方法纯化核酸的自动化样品制备系统）的应用可以是优选的。自动化样品制备系统的一个例子是m2000sp，其可得自Abbott Laboratories, Abbott Park, IL。可选地，可以使用m24sp自动化样品制备系统(Abbott)来制备样品，或手工地制备样品，例如，通过使用基于柱的RNA提取试剂盒，诸如Paxgene，其可得自PreAnalytix/Qiagen。
一种无关的核酸序列可以用作内部对照(IC)以证实该方法已经对于每种样品正确地进行。与基因融合体序列一起检测IC。也可以使用IC标准化给定的基因融合体序列的定量，例如，通过将IC信号与基因融合体信号进行对比。
可以如本领域已知地进行扩增/检测，诸如通过使用m2000rt仪器(Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL)。在有脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)和镁存在下用DNA聚合酶扩增靶核酸。扩增试剂含有一种或多种基因融合体变体的特定扩增引物集合和优选的IC基因。在PCR扩增过程中，使用高温来分离双链DNA的链。当将反应物冷却至可以发生DNA退火的温度时，分析物-特异性的、单链DNA寡核苷酸引物会结合分析物DNA。通过DNA聚合酶延伸引物，由此制备分析物DNA的短靶标段的精确拷贝。在每轮热循环中，扩增产物会在高温解离成单链，从而随着温度降低而允许引物退火和延伸。通过在高温和低温之间的重复循环，实现靶标的指数扩增。基因融合体变体和（如果靶向的话）IC基因的扩增在同一反应中同时进行。
为了评价治疗选择的目的，可以使用所述方法确定基因融合体变体状态。例如，据报道，已经证实伊马替尼（imatinib）（其由Novartis在美国作为Gleevec销售，在其它国家作为Glivec销售）会改善具有CML (BCR-ABL相互易位或“费城染色体”)的人的存活。伊马替尼还被用于治疗具有胃肠道间质瘤(GIST)和其它恶性肿瘤的人。已经被用于治疗具有CML的人的另一种药物是尼洛替尼（nilotinib）。其它激酶抑制剂包括波舒替尼（bosutinib ）和达沙替尼（bosutinib ）。HHT也已经被用于治疗。
还可以使用所述方法预测被诊断出癌症（诸如白血病）的患者的结果，以评估转移的风险，诸如在具有早期阶段疾病(I/II期)的患者中，和监测具有晚期转移性癌症(III/IV期)的患者。由于癌症的转移扩散经常血源性地发生，所述方法也可以用于测定外周血以评估复发。
引物和探针
还提供了引物组。所述引物组包含至少两种选自以下的引物：与BCR的外显子e1杂交的引物，诸如正向引物；与BCR的外显子b2杂交的引物，诸如正向引物；和与BCR的外显子e19杂交的引物，诸如正向引物。每种引物可以被可检测地标记，和/或所述引物组可以与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。与BCR的外显子e1杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 1、18、19、20、21和22。与BCR的外显子b2杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2和23。与BCR的外显子e19杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3和24。所述引物组可以进一步包含与ABL的外显子a2杂交的引物，诸如反向引物。与ABL的外显子a2杂交的引物可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 4、25、26和27。引物，尤其是反向引物的一种优选的核苷酸序列是SEQ ID NO: 4。
还提供了另一个引物组。所述引物组包含至少两种选自以下的引物：与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物、与EML4的外显子E6b杂交的引物、与EML4的外显子E14杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组可以与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；和在EML4-AKL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。所述引物组可以进一步包含与ALK的外显子A20杂交的引物。
还提供了另一个引物组。所述引物组包含至少两种选自以下的引物：与KIF5B的外显子K15杂交的引物、与KIF5B的外显子K16杂交的引物、与KIF5B的外显子K22杂交的引物和与KIF5B的外显子K23杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组可以与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；和在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。所述引物组可以进一步包含与RET的外显子R12杂交的引物。
提供了另一个引物组。所述引物组包含至少两种选自以下的引物：与PML的外显子P3杂交的引物、与PML的外显子6a杂交的引物和与PML的外显子6b杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组可以与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；和在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。所述引物组可以进一步包含与RARα的外显子R3杂交的引物。
进一步提供了探针组。所述探针组包含：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、28、29、30和与其互补的序列。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 6、31、32和与其互补的序列。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 7、33、34、35和与其互补的序列。在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针可以包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 8、36和与其互补的序列。
提供了另一个探针组。所述探针组包含至少两种选自以下的探针：在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；和在EML4-AKL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。
提供了另一个探针组。所述探针组包含至少两种选自以下的探针：在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；和在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。
提供了另一个探针组。所述探针组包含至少两种选自以下的探针：在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；和在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。
通过任意合适的方法，经常是采用商购可得的试剂和仪器(参见，例如，Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA)、DuPont (Wilmington, DE)和Milligen (Bedford, MA))的化学合成(例如，固相合成)，可以制备寡核苷酸。可选地，它们可以购自商业来源。合成寡核苷酸的方法是本领域众所周知(参见，例如，Narang等人, Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979); Brown等人, Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979); Beaucage等人, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)；和美国专利号4,458,066)。
以封闭试管、同质形式进行所述方法的能力会是污染的风险最小化(参见，例如，Kreuzer等人, Ann. Hematol. 82: 284-289 (2003))。通过常规地用于使样品与一对PCR引物接触的任何方式，可以使样品与引物接触。例如，可以在微孔板中或在适合于小体积混合物的微量瓶中接触样品和引物。
还提供了诊断性的实时PCR (rtPCR)方法，其使用前述引物和探针在分开的反应或合并的反应中扩增和检测BCR-ABL基因融合体变体。
还可以使用与本文描述的引物和探针具有至少约80%同一性的引物和探针。关于引物，优选地，甚至理想地，最后十个碱基与本文描述的引物具有至少约75%同一性。如果需要的话，可以将一种或两种引物(即，正向引物和反向引物)标签或标记。标记的引物的应用会产生标记的扩增产物。例如，使用被设计成检测荧光的任意合适的设备，诸如ABI 310 Genetic Analyzer和Genescan 3.1.2软件(Applied Biosystems)，可以检测荧光地标记的扩增产物。
如果需要的话，可以修饰上述的引物，使得它们不再充当DNA合成的引物，且可以被标记并用作可检测的寡核苷酸。所述探针可以用在不同的测定形式中。例如，所述探针可以用在5'-核酸酶测定中(参见，例如，美国专利号5,210,015、5,487,972和5,804,375；和Holland等人, PNAS USA 88: 7276-7280 (1988)，针对它们关于这些的教导，它们都明确地通过引用并入)。
尽管已经在本文中在它们用在基于核酸的扩增方法（诸如PCR，尤其是实时PCR）中的背景下描述了引物和探针，但是这样的引物和探针可以用作其它基于核酸的方法中的探针，所述其它基于核酸的方法是诸如杂交技术(例如，基于膜的杂交技术(DNA印迹和RNA印迹)、改进的核酸杂交技术(参见，例如，Pandian等人, 美国专利号5,627,030)和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)-样技术)，它们用于检测相同的、类似的和互补的多核苷酸序列。
根据本领域已知的方法，可检测地标记探针，所述探针是单链的、线性的DNA寡核苷酸。可选地，如果需要的话，可以类似地标记引物。可以使用任意合适的标记，诸如荧光团、发光团、化学发光团、光发光团（photoluminophore）或放射性同位素。例如，可以将荧光部分共价地连接至探针的一端，且可以将淬灭部分共价地连接至另一端。合适的荧光团的例子包括但不限于：FAM (例如，6'-FAM)、荧光素及其衍生物、罗丹明、香豆素及其衍生物、TET、HEX、JOE、TAMA、TAMRA、NTB、ROX、VIC、NED、4,7-二氯-荧光素、4,7-二氯-罗丹明、DABCYL、DABSYL、孔雀石绿、LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、萤光黄、德克萨斯红®、四甲基罗丹明、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料(例如，Cy3和Cy5)及其衍生物。FAM是一种优选的标记。猝灭剂的例子包括DABCYL、DABSYL、DABMI、四甲基罗丹明、TAMRA、MGB、BHQ®和BHQplus。MGB可以是一种优选的猝灭剂。如上面指出的，在每轮实时PCR扩增过程中，可检测地标记的探针与扩增的BCR-ABL基因融合体变体DNA (即，靶序列)（如果存在的话）退火。在没有靶序列存在下，每个探针呈现这样的构象：其使猝灭剂与激发的荧光团足够近，以在它可以发射荧光之前吸收它的能量。在有靶序列存在下，每种探针与靶标中的它的互补序列结合，且荧光团和猝灭剂保持分开，从而允许荧光发射和检测。优选地，和甚至理想地，将BCR-ABL基因融合体变体探针和IC-特异性的探针不同地标记，使得靶DNA和IC DNA可以区分。
试剂盒
还提供了试剂盒。一种试剂盒包含：
(i)引物组，其包含与变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子杂交的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自mRNA样品中的所述第一基因和所述第二基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i')得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii')使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测扩增的cDNA，和任选地，同时地或依次地定量所述扩增的cDNA。所述第一基因和所述第二基因可以是产生融合体的任何基因。例如，所述第一基因和所述第二基因可以是BCR基因和ABL原癌基因、EML4基因和ALK基因、KIF5B基因和RET原癌基因、或PML基因和RARα基因。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。所述方法的步骤(ii) (a)可以进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，且步骤(ii) (b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
另一种试剂盒包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物，诸如正向引物：与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用BCR-ABL基因融合体变体集合的引物（即，正向引物和反向引物）扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。所述试剂盒可以包含与ABL的外显子a2杂交的引物，诸如反向引物。所述引物实现BCR-ABL基因融合体变体mRNA的反转录和扩增或BCR-ABL基因融合体变体cDNA的扩增。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。步骤(ii) (a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，即，正向引物和反向引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，且步骤(ii) (b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。所述引物实现IC mRNA的反转录和扩增或IC cDNA的扩增。
还另一种试剂盒包含：
(i)引物组，其包含含有选自SEQ ID NO: 1、2、3、18、19、20、21、22、23和24的核苷酸序列的引物，诸如正向引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用至少一种BCR-ABL基因融合体变体的引物（即，正向引物和反向引物）扩增所述反转录的cDNA，所述BCR-ABL基因融合体变体选自：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测扩增的cDNA，和任选地同时地或依次地定量所述扩增的cDNA。所述试剂盒可以进一步包含含有选自SEQ ID NO: 4、25、26和27的核苷酸序列的引物，诸如反向引物。对于引物、尤其是反向引物而言，SEQ ID NO: 4是优选的。所述引物实现BCR-ABL基因融合体变体mRNA的反转录和扩增或BCR-ABL基因融合体变体cDNA的扩增。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针选自SEQ ID NO: 5、6、7、8、28、29、30、31、32、33、34、35、36和与其互补的序列。步骤(ii) (a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，即，正向引物和反向引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和步骤(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。所述引物实现IC mRNA的反转录和扩增或IC cDNA的扩增。
还提供了另一种试剂盒。所述试剂盒包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物、与EML4的外显子E6b杂交的引物、与EML4的外显子E14杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的EML4基因和ALK基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用EML4-ALK基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：E13A20基因融合体、E6aA20基因融合体、E6bA20基因融合体、E14A20基因融合体和E20A20基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测扩增的cDNA，和任选地同时地或依次地定量所述扩增的cDNA。所述试剂盒可以包含与ALK的外显子A20杂交的引物。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；或在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。在所述试剂盒中，(ii)(a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物任选地与至少一个IC基因的不同外显子杂交，和(b)可以进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
提供了另一种试剂盒。所述试剂盒包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与KIF5B的外显子K15杂交的引物、与KIF5B的外显子K16杂交的引物、与KIF5B的外显子K22杂交的引物和与KIF5B的外显子K23杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的KIF5B基因和RET基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用KIF5B-RET基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：K15R12基因融合体、K16R12基因融合体、K22R12基因融合体和K23R12基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测扩增的cDNA，和任选地同时地或依次地定量所述扩增的cDNA。所述试剂盒可以包含与RET的外显子R12杂交的引物。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；或在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。在所述试剂盒中，(ii) (a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物任选地与至少一个IC基因的不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
提供了另一种试剂盒。所述试剂盒包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与PML的外显子P3杂交的引物、与PML的外显子6a杂交的引物和与PML的外显子6b杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的PML基因和RARα基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用PML-RARα基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：P3R3基因融合体、P6aR3基因融合体和P6bR3基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测扩增的cDNA，和任选地同时地或依次地定量所述扩增的cDNA。所述试剂盒可以包含与RARα的外显子R3杂交的引物。所述试剂盒可以进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每种基因融合体的探针，其中所述探针在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；或在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。在所述试剂盒中，(ii) (a)可以进一步包括，使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物可以与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
试剂盒可以含有容器或样品小瓶，其用于储存组织或体液的样品。引物（诸如一对引物，特别是正向引物和反向引物）可以以有效地允许一种或多种基因融合体变体的检测的量存在于组合物中。使用本文所述的或本领域已知的用于检测样品中的特定核酸分子的任何方法，完成基因融合体变体的检测。试剂盒还可以包含缓冲液、核苷酸碱基和要在杂交和/或扩增反应中使用的其它组合物。
所述试剂盒可以进一步包含dNTP。优选地，将dNTP与参比染料一起供给在缓冲溶液中。
可以以不同的构型包装引物、探针和dNTP。优选地，引物、探针和dNTP是在单个容器中。所述容器优选地还含有防腐剂，诸如叠氮化钠和/或ProClin®950。
所述试剂盒可以进一步包含RNA聚合酶、或逆转录酶和DNA聚合酶的混合物。可以使用任意合适的RNA聚合酶。一种优选的RNA聚合酶的一个例子是rTth。还可以使用任意合适的逆转录酶。一种优选的逆转录酶的一个例子是SuperScript®III (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)。同样地，可以使用任意合适的DNA聚合酶。一种优选的DNA聚合酶的一个例子是AmpliTaq Gold®(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)。可以在缓冲溶液中供给聚合酶和/或转录酶，所述缓冲溶液任选地含有且优选地确实含有稳定剂。
所述试剂盒可以进一步包含在缓冲溶液中的活化试剂，诸如氯化锰。缓冲溶液优选地包括防腐剂，诸如叠氮化钠和/或ProClin®950。
试剂盒可以任选地进一步包含IC。所述IC是一种无关的人核酸序列，其证实所述过程对于每种样品已经正确地进行。所述IC也可以用于定量BCR-ABL基因融合体变体的相对表达。任意合适的序列可以用作IC。在本文的“实施例”中阐述了IC基因的例子，即，GUSB、ABL和G6PD。不同地标记BCR-ABL基因融合体变体特异性的探针和IC特异性的探针，使得BCR-ABL DNA和IC DNA可以区分。
所述试剂盒任选地进一步包含是非人核酸序列的加工对照。所述加工对照可以添加至所述方法中，以进一步确保所述测定已经正确地进行。
实施例
下述实施例用于举例说明本公开内容。所述实施例无意以任何方式限制要求保护的发明的范围。
实施例1
本实施例描述了BCR-ABL扩增引物的设计。
扩增包括使用正向引物和反向引物，其位于融合的BCR和ABL基因区段之间的易位断点的相对侧上。因而，每种得到的BCR-ABL扩增子含有变体-特异性的连接部序列。制备了一种反向引物(RP)和三种正向引物(FP)。反向引物a2RP与ABL的外显子a2内的特定序列退火，所述特定序列是变体e1a2、b2a2、b3a2和e19a2共有的。反向引物a2RP指导来自多种变体的RNA的反转录。正向引物e1FP、b2FP和e19FP分别与BCR的外显子e1、b2和e19内的特定序列退火。引物对e1FP和a2RP会扩增从变体e1a2 RNA反转录的cDNA靶序列。引物对b2FP和a2RP会扩增从变体b2a2和b3a2 RNA反转录的cDNA靶序列。引物对e19FP和a2RP会扩增从变体e19a2 RNA反转录的cDNA靶序列。可以在单个反应中使用一对引物扩增一个特定变体(或当使用引物b2FP和a2RP时，多个特定变体)。可选地，可以在单个反应中使用两个或更多个引物对来在多路反应中扩增两种或更多种变体。引物的序列显示在表II中。
表II
BCR-ABL引物
可以使用替代引物。替代引物的例子显示在表III中。
表III
替代性的BCR-ABL引物
引物e1FP_alt1、e1FP_alt2、e1FP_alt3、e1FP_alt4和e1FP_alt5与e1FP类似地起作用。引物b2FP_alt1与b2FP类似地起作用。引物e19FP_alt1与e19FP类似地起作用。引物a2RP-alt1、a2RP_alt2和a2RP_alt3与a2RP类似地起作用。引物a2RP_alt2和a2RP_alt3在ABL外显子a2和a3的连接部处与特定序列退火。由于这些序列在基因组DNA中被内含子隔开，a2RP_alt2和a2RP_alt3特异性地靶向RNA。引物a2RP_alt1衍生自ABL的外显子a2，而a2RP_alt2和a2RP_alt3中的仅大写字母核苷酸衍生自ABL的外显子a2，且a2RP_alt2和a2RP_alt3中的小写字母核苷酸衍生自ABL的外显子a3。
实施例2
本实施例描述了BCR-ABL探针的设计。
将四种短寡核苷酸探针设计成以高亲和力与得自每个被靶向的BCR-ABL变体(即，e1a2、b2a2、b3a2和e19a2)的连接部-特异性的序列特异性地杂交。每种探针所跨的BCR-ABL外显子连接部在基因组DNA中被内含子序列隔开。因此，所述探针仅与衍生自BCR-ABL RNA/cDNA的扩增子杂交。探针的特异性会实现变体的区分。所述探针可以个别地用于检测单种BCR-ABL变体。可选地，两种或更多种探针可以一起用于在单个反应中检测多种BCR-ABL变体。为了被靶向的BCR-ABL变体的合并检测，可以相同地标记探针。可选地，为了在单个反应中对两种或更多种BCR-ABL变体的示差检测，可以不同地标记探针。探针的序列显示在表IV中。
表IV
BCR-ABL探针
探针命名 序列5'-3' SEQ ID NO
e1a2探针 染料ACGCAGAAGCCCT猝灭剂 5
b2a2探针 染料AAGGAAGAAGCCC猝灭剂 6
b3a2探针 染料AGTTCAAAAGCCC猝灭剂 7
e19a2探针 染料ACGTCAAAGCCCTT猝灭剂 8
用斜体表示从每种翻译变体的BCR侧衍生出的探针序列。每种探针包含得自它的有关扩增子的有义链的序列。尽管表IV显示了在探针的5'末端处的染料和在探针的3'末端处的猝灭剂，所述猝灭剂可以是在探针的5'末端处，且所述染料可以是在探针的3'末端处。在表IV中阐述的SEQ ID NO是参考在没有染料和猝灭剂存在下的核苷酸序列。
e1a2探针由在BCR的外显子e1的3'末端处的最后6个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前7个核苷酸组成。因此，e1a2探针会识别从BCR-ABL变体e1a2 mRNA扩增的连接部-特异性的序列。
b2a2探针由在BCR的外显子b2的3'末端处的最后7个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前6个核苷酸组成。因此，b2a2探针会识别从BCR-ABL变体b2a2 mRNA扩增的连接部-特异性的序列。
b3a2探针由在BCR的外显子b3的3'末端处的最后7个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前6个核苷酸组成。因此，b3a2探针会识别从BCR-ABL变体b3a2 mRNA扩增的连接部-特异性的序列。
e19a2探针由在BCR的外显子e19的3'末端处的最后6个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前8个核苷酸组成。因此，e19a2探针会识别从BCR-ABL变体e19a2a2 RNA扩增的连接部-特异性的序列。
可以使用替代探针。替代探针的例子显示在表V中。
表V
替代性的BCR-ABL探针
探针命名 序列5'-3' SEQ ID NO
e1a2探针_alt1 染料AAGGGCTTCTGCGTC猝灭剂 28
e1a2探针_alt2 染料GACGCAGAAGCCC猝灭剂 29
e1a2探针_alt3 染料GACGCAGAAGCCCT猝灭剂 30
b2a2探针_alt1 染料AAGGGCTTCTTCC猝灭剂 31
b2a2探针_alt2 染料AGGGCTTCTTCCTT猝灭剂 32
b3a2探针_alt1 染料AGAGTTCAAAAGCC猝灭剂 33
b3a2探针_alt2 染料AAGGGCTTTTGAACTC猝灭剂 34
b3a2探针_alt3 染料AAGGGCTTTTGAACTC猝灭剂 35
e19a2探针_alt1 染料AAGGGCTTTGACGTC猝灭剂 36
用斜体表示从每种翻译变体的BCR侧衍生出的探针序列。探针e1a2探针_alt2、e1a2探针_alt3和b3a2探针_alt1中的每一种包含得自它的有关扩增子的有义链的序列。所有其它的替代探针包含与它的有关扩增子的有义链互补的序列。尽管表V显示了在探针的5'末端处的染料和在探针的3'末端处的猝灭剂，所述猝灭剂可以是在探针的5'末端处，且所述染料可以是在探针的3'末端处。在表V中阐述的SEQ ID NO是参考在没有染料和猝灭剂存在下的核苷酸序列。
例如，替代性的e1a2探针（在表V中命名为alt2）由在BCR的外显子e1的3'末端处的最后7个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前6个核苷酸组成。因此，e1a2探针会识别从BCR-ABL变体e1a2 mRNA扩增的连接部-特异性的序列。
替代性的b2a2探针（在表V中命名为alt2）由在BCR的外显子b2的3'末端处的最后7个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前7个核苷酸组成。因此，b2a2探针会识别从BCR-ABL变体b2a2 mRNA扩增的连接部-特异性的序列。
替代性的b3a2探针（在表V中命名为alt1）由在BCR的外显子b3的3'末端处的最后9个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前5个核苷酸组成。因此，b3a2探针会识别从BCR-ABL变体b3a2 mRNA扩增的连接部-特异性的序列。
替代性的e19a2探针（在表V中命名为alt1）由在BCR的外显子e19的3'末端处的最后7个核苷酸和在ABL的外显子a2的5'末端处的前8个核苷酸组成。因此，e19a2探针会识别从BCR-ABL变体e19a2a2 RNA扩增的连接部-特异性的序列。
实施例3
本实施例描述了内部对照(IC)扩增引物和探针的设计。
设计了两种寡核苷酸引物（即，正向引物和反向引物）用于扩增用作内部对照的三个内源基因中的每一个。将所述引物设计成扩增充分表征的持家基因β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、ABL和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)。
GUSB的正向引物(GUSBFP)与位于GUSB的外显子8中的序列退火。GUSB的反向引物(GUSBRP)与位于GUSB的外显子10中的序列退火，且与GUSBFP组合指导反转录的GUSB cDNA的扩增。得到的扩增子跨得自GUSB的外显子8、9和10的序列。
为GUSB扩增子的杂交和检测，设计了寡核苷酸探针。将所述探针设计成与GUSB的外显子9中的序列杂交。
ABL的正向引物(ABLFP)与位于ABL的外显子3中的序列退火。ABL的反向引物(ABLRP)与位于ABL的外显子4中的序列退火，且与ABLFP组合指导反转录的ABL cDNA的扩增。得到的扩增子跨得自ABL的外显子3和4的序列。
为ABL扩增子的杂交和检测，设计了寡核苷酸探针。将所述探针设计成与ABL的外显子3 (在ABLFP的3'侧)中的序列杂交。
G6PD的正向引物(G6PDFP)与位于G6PD的外显子2中的序列退火。G6PD的反向引物(G6PDRP)与位于外显子4中的序列退火，且与G6PDFP组合指导反转录的G6PD cDNA的扩增。得到的扩增子跨得自G6PD的外显子2、3和4的序列。
为G6PD cDNA扩增子的杂交和检测，设计了寡核苷酸探针。将所述探针设计成与G6PD外显子2和3的连接部处的序列杂交。
IC引物和探针的序列显示在表VI中。可以将IC引物和探针包括在BCR-ABL引物和探针混合物中，用于同时扩增和检测BCR-ABL变体RNA和IC RNA。但是，在这样的构型中，差别地标记BCR-ABL探针和IC探针。
表VI
IC引物和探针
尽管表VI显示了在探针的5'末端处的染料和在探针的3'末端处的猝灭剂，所述猝灭剂可以是在探针的5'末端处，且所述染料可以是在探针的3'末端处。在表VI中阐述的SEQ ID NO是参考在没有染料和猝灭剂存在下的核苷酸序列。
实施例4
本实施例描述了一种示例性的PCR反应。
混合核酸扩增必需的引物和探针和其它组分，诸如dNTP混合物、缓冲液、聚合酶和二价离子。将可能含有BCR-ABL转录物的纯化的RNA加入混合物中。使混合物处于BCR-ABL mRNA和IC mRNA的反转录的特定条件。然后扩增反转录的cDNA。可以催化RNA的反转录和DNA的扩增的聚合酶的应用，使反转录和扩增能由仪器以单次运行的封闭试管形式进行，所述仪器可以并行地进行热循环和信号检测。检测扩增的BCR-ABL和IC。任选地，通过与IC mRNA的水平进行对比(即，相对定量)，确定存在于纯化的RNA样品中的BCR-ABL mRNA的水平。差别地可检测的标记的应用，能够检测和区分得自两种或更多种BCR-ABL变体的RNA，且取决于使用的IC的数目，检测和区分得自一种或多种IC的RNA。一种示例性的PCR试剂混合物显示在表VII中。在一种示例性的PCR反应中，将25µl纯化的RNA与25µl PCR试剂混合物混合。PCR循环条件显示在表VIII中。
表VII
PCR试剂混合物
组分 反应浓度 测量单位
e1FP 0.2 µM
b2FP 0.1 µM
e19FP 0.1 µM
a2RP 0.6 µM
GUSBFP 0.1 µM
GUSBRP 0.3 µM
e1a2探针 0.4 µM
b2a2探针 0.4 µM
b3a2探针 0.4 µM
e19a2探针 0.2 µM
GUSB探针 0.2 µM
PCR缓冲液 1.0 X
dNTP 0.325 mM
ROX参比染料 0.015 µM
适体 0.2 µM
rTth聚合酶 10 单位
MnCl2 3 mM
dTNPs = 脱氧核糖核苷酸三磷酸。
表VIII
PCR循环条件
循环 参数 描述
1 58℃/30 分钟 反转录
4 92℃/30秒, 60℃/30秒 DNA扩增(低严格性)
56 92℃/30秒, 62℃/30秒, 58℃/40秒 DNA扩增(DNA扩增和荧光读出)
实施例5
本实施例描述了与EML4-ALK基因融合体变体的检测有关的方法。
使用与上述的那些类似的方法，可以实现得自RNA样品的EML4-ALK融合体变体的扩增、检测、定量和区分。
该方法的PCR扩增原理利用包含一种反向引物和多种正向引物的寡核苷酸混合物。所述反向引物(命名为A20RP)与ALK外显子20内的特定序列区域退火，所述特定序列区域是靶向的EML4-ALK融合体变体共有的。命名为E6aFP、E6bFP、E13FP、E14FP和E20FP的正向引物分别与EML4外显子6a、外显子6b、外显子13、外显子14和外显子20的特定序列区域退火。每种引物在所述方法的功能性中的效用总结如下：
● 反向引物A20RP指导从多种EML4-ALK融合体变体反转录RNA。
● 正向引物E6aFP和反向引物A20RP的组合扩增从EML4-ALK E6aA20反转录的cDNA靶序列。
● 正向引物E6bFP和反向引物A20RP的组合扩增从EML4-ALK E6bA20反转录的cDNA靶序列。应当指出，由于EML外显子6a和6b的邻近，如果需要的话，与ALK反向引物A20RP组合的单个EML正向引物(例如，E6aFP)可以用于扩增E6aA20和E6bA20融合体变体。
● 正向引物E13FP和反向引物A20RP的组合扩增从EML4-ALK E13A20反转录的cDNA靶序列。
● 正向引物E14FP和反向引物A20RP的组合扩增从EML4-ALK E14A20反转录的cDNA靶序列。应当指出，由于EML外显子13和14的邻近，如果需要的话，与ALK反向引物A20RP组合的单个EML正向引物(例如，E13FP)可以用于扩增E13A20和E14A20融合体变体。
● 正向引物E20FP和反向引物A20RP的组合扩增从EML4-ALK E20A20反转录的cDNA靶序列。
● 应当指出，如果需要扩增另外的(罕见的) EML4-ALK融合体变体(例如，E18A20、E15A20、E2A20和/或E17A20)，可以修改该方法以包含得自其它EML4区域的正向引物。在这点上，我们指出，对于EML4-ALK而言，COSMIC具有推断的下述断点：1_1725 EML4（转录物ID: ENST00000318522）和4080_6222 ALK（NCBI登录号NM_004304; [SEQ ID NO:39]），1_903+220 EML4和4080_6222 ALK，和1_2478 EML4和4080_6222 ALK。
这些引物集合可以个别地用于在分开的PCR反应中扩增特定变体，或在多路构型中用于在一个PCR反应中扩增多种变体。
上面讨论的扩增原理利用位于融合的EML4和ALK基因区段之间的倒位断点的相对侧上的正向引物和反向引物。因而，每种得到的EML4-ALK扩增子含有变体-特异性的连接部序列。检测原理使用多种寡核苷酸探针(命名为E6aA20探针、E6bA20探针、E13A20探针、E14A20探针和E20A20探针)，所述探针被设计成在靶向的EML4-ALK变体的外显子融合体连接部处以高亲和力与序列特异性地杂交。每种探针在所述方法的功能性中的效用总结如下：
● E6aA20探针由在EML4外显子6a和ALK外显子20的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从EML4-ALK E6aA20扩增的序列。
● E6bA20探针由在EML4外显子6b和ALK外显子20的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从EML4-ALK E6bA20扩增的序列。
● E13A20探针由在EML4外显子13和ALK外显子20的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从EML4-ALK E13A20扩增的序列。
● E14A20探针由在EML4外显子14和ALK外显子20的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从EML4-ALK E14A20扩增的序列。
● E20A20探针由在EML4外显子20和ALK外显子20的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从EML4-ALK E20A20扩增的序列。
● EML4-ALK外显子连接部在基因组DNA中被内含子序列隔开。因此，跨外显子连接部的探针仅与衍生自EML4-ALK RNA/cDNA的扩增子杂交(且不与基因组DNA杂交)。
● 应当指出，如果需要的话，可以修改该方法以包含得自其它EML4-ALK外显子融合体连接部的探针以实现另外的、罕见的EML4-ALK融合体变体(例如，E18A20、E15A20、E2A20和/或E17A20)的检测。
● 应当指出，还可以使用一个探针(或多个探针)实现扩增的序列的检测，所述探针没有跨EML4-ALK融合体连接部。例如，在ALK外显子20内的探针靶向序列(在反向引物A20RP的5'侧和在外显子融合体连接部的3'侧)可以用于使用上述引物集合扩增的所有靶向的EML4-ALK融合体变体的共同检测。可选地，在扩增的靶向的EML4外显子的区域(在适用的EML4正向引物的3'侧和在外显子融合体连接部的5'侧)内的探针还可以用于检测融合体变体。
探针可以个别地用于检测单种EML4-ALK变体，或作为混合物用于在单个反应中检测多种变体。另外，可以将探针用共同染料标记用于靶向的EML4-ALK变体的合并检测，或用不同的染料标记，所述不同的染料能够在单个反应中差别地检测多种EML4-ALK变体。
如前述BCR-ABL方法一样，该ELM4-ALK方法还可以利用另外的引物/探针集合检测由内源性持家基因（诸如GUSB、ABL或G6PD）表达的细胞RNA。得自内源性持家基因的RNA水平可以用于将ELM4-ALK转录物定量方法相对于细胞充足、样品提取和扩增效率中的变化标准化。得自该持家基因的RNA水平也可以充当样品有效性对照。
实施例6
本实施例描述了与KIF5B-RET基因融合体变体的检测有关的方法。
使用与上述的那些类似的方法，可以实现得自RNA样品的KIF5B-RET融合体变体的扩增、检测、定量和区分。
该方法的PCR扩增原理利用包含一种反向引物和多种正向引物的寡核苷酸混合物。所述反向引物(命名为RET12RP)与RET外显子12内的特定序列区域退火，所述特定序列区域是靶向的KIF5B-RET融合体变体共有的。命名为K15FP、K16FP、K22FP和K23FP的正向引物分别与KIF5B外显子15、外显子16、外显子22和外显子23的特定序列区域退火。每种引物在所述方法的功能性中的效用总结如下：
● 反向引物RET12RP指导从多种KIF5B-RET融合体变体反转录RNA。
● 正向引物K15FP和反向引物RET12RP的组合扩增从KIF5B-RET融合体变体K15R12反转录的cDNA靶序列。
● 正向引物K16FP和反向引物RET12RP的组合扩增从KIF5B-RET融合体变体K16R12反转录的cDNA靶序列。应当指出，由于KIF5B外显子15和16的邻近，如果需要的话，与RET反向引物RET12RP组合的单个KIF5B正向引物(例如，K15FP)可以用于扩增K15R12和K16R12融合体变体。
● 正向引物K22FP和反向引物RET12RP的组合扩增从KIF5B-RET融合体变体K22R12反转录的cDNA靶序列。
● 正向引物K23FP和反向引物RET12RP的组合扩增从KIF5B-RET K23R12反转录的cDNA靶序列。应当指出，由于KIF5B外显子22和23的邻近，如果需要的话，与RET反向引物RET12RP组合的单个KIF5B正向引物(例如，K22FP)可以用于扩增K22R12和K23R12融合体变体。
● 如果需要扩增另外的KIF5B-RET融合体变体，可以修改该方法以包含得自其它KIF5B区域的正向引物。在这点上，我们指出，对于KIF5B-RET，COSMIC具有推断的下述断点：1_2183 KIF5B (转录物ID: ENST00000302418)和2327_5629 RET (NCBI登录号NM_020975.4 [SEQ ID NO:134])和1_2372+476 KIF5B和2327-436_5629 RET。
这些引物集合可以个别地用于在分开的PCR反应中扩增特定变体，或在多路构型中用于在一个PCR反应中扩增多种变体。
上面讨论的扩增原理利用位于融合的KIF5B和RET基因区段之间的倒位断点的相对侧上的正向引物和反向引物。因而，每种得到的KIF5B-RET扩增子将含有变体-特异性的连接部序列。该方法的检测原理使用多种寡核苷酸探针(命名为K15R12探针、K16R12探针、K22R12探针和K23R12探针)，所述探针被设计成在靶向的KIF5B-RET变体的外显子融合体连接部处以高亲和力与序列特异性地杂交。每种探针在该方法的功能性中的效用总结如下：
● K15R12探针由在KIF5B外显子15和RET外显子12的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从KIF5B-RET融合体变体K15R12扩增的序列。
● K16R12探针由在KIF5B外显子16和RET外显子12的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从KIF5B-RET融合体变体K16R12扩增的序列。
● K22R12探针由在KIF5B外显子22和RET外显子12的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从KIF5B-RET融合体变体K22R12扩增的序列。
● K23R12探针由在KIF5B外显子23和RET外显子12的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从KIF5B-RET融合体变体K23R12扩增的序列。
● KIF5B-RET外显子融合体连接部在基因组DNA中被内含子序列隔开。因此，跨这些连接部的探针仅与衍生自KIF5B-RET RNA/cDNA的扩增子杂交(且不与衍生自基因组DNA的的扩增子杂交)。
● 应当指出，如果需要的话，可以修改该方法以包含得自其它KIF5B-RET外显子融合体连接部的探针以实现另外的KIF5B-RET融合体变体的检测。
● 应当指出，还可以使用一个探针(或多个探针)实现扩增的序列的检测，所述探针没有跨KIF5B-RET融合体连接部。例如，在RET外显子12内的探针靶向序列(在反向引物RET12RP的5'侧和在外显子融合体连接部的3'侧)可以用于使用上述引物集合扩增的所有靶向的KIF5B-RET融合体变体的共同检测。可选地，在扩增的靶向的KIF5B外显子的区域(在适用的KIF5B正向引物的3'侧和在外显子融合体连接部的5'侧)内的探针还可以用于检测融合体变体。
探针可以个别地用于检测单一KIF5B-RET变体，或作为混合物用于在单个反应中检测多种变体。另外，可以将探针用共同染料标记用于靶向的KIF5B-RET融合体变体的合并检测，或用不同的染料标记，所述不同的染料能够在单个反应中差别地检测多种KIF5B-RET融合体变体。
如前述BCR-ABL和ELM4-ALK方法一样，该KIF5B-RET方法还可以利用另外的引物/探针集合检测由内源性持家基因（诸如GUSB、ABL或G6PD）表达的细胞RNA。得自内源性持家基因的RNA水平可以用于将KIF5B-RET转录物定量方法相对于细胞充足、样品提取和扩增效率中的变化标准化。得自该持家基因的RNA水平也可以充当样品有效性对照。
实施例7
本实施例描述了与PML-RARα基因融合体变体的检测有关的方法。
使用与上述的那些类似的方法，可以实现得自RNA样品的PML-RARα易位变体的扩增、检测、定量和区分。
该方法的PCR扩增原理利用包含一种反向引物和多种正向引物的寡核苷酸混合物。所述反向引物(命名为R3RP)与RARα外显子3内的特定序列区域退火，所述特定序列区域是靶向的PML-RARα易位变体共有的。命名为P3FP、P6aFP和P6bFP的正向引物分别与PML外显子3的特定序列区域、PML外显子6的5' 区域或PML外显子6的3' 区域退火。每种引物在该方法的功能性中的效用总结如下：
● 反向引物R3RP指导从多种PML-RARα易位变体反转录RNA。
● 正向引物P3FP和反向引物R3RP的组合扩增从PML-RARαS形式(其中PML外显子3与RARα外显子3融合的易位变体)反转录的cDNA靶序列。
● 正向引物P6aFP和反向引物R3RP的组合扩增从PML-RARαV形式(其中PML外显子6的5' 区域与RARα外显子3融合的易位变体)反转录的cDNA靶序列。
● 正向引物P6bFP和反向引物R3RP的组合扩增从PML-RARαL形式(其中PML外显子6的5' 区域与RARα外显子3融合的易位变体)反转录的cDNA靶序列。应当指出，由于得自PML-RARαV形式和PML-RARαL形式的外显子融合体连接部的邻近，如果需要的话，与RARα反向引物R3RP组合的单个PML正向引物(例如，P6aFP)可以用于扩增两者的外显子融合体连接部。
● 应当指出，如果需要扩增另外的(罕见的) PML-RARα融合体变体，可以修改该方法以包含得自其它PML区域的正向引物。
这些引物集合可以个别地用于在分开的PCR反应中扩增特定变体，或在多路构型中用于在一个PCR反应中扩增多种变体。
上面讨论的扩增原理利用位于融合的PML和RARα基因区段之间的易位断点的相对侧上的正向引物和反向引物。因而，每种得到的PML-RARα扩增子含有变体-特异性的连接部序列。该方法的检测原理使用3种寡核苷酸探针(命名为S探针、V探针和L探针)，所述探针被设计成在靶向的PML-RARα变体(S形式、V形式或L形式)处以高亲和力与序列特异性地杂交。每种探针在该方法的功能性中的效用总结如下：
● S探针由在PML外显子3和RARα外显子3的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从PML-RARα形式S RNA扩增的序列。
● V探针由在PML外显子6的5' 区域和RARα外显子3的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从PML-RARα形式V RNA扩增的序列。
● L探针由在PML外显子6的3' 区域和RARα外显子3的连接部处的核苷酸序列组成。因此，该探针会识别从PML-RARα形式L RNA扩增的序列。
● PML-RARα外显子连接部在基因组DNA中被内含子序列隔开。因此，跨外显子连接部的探针仅与衍生自PML-RARαRNA/cDNA的扩增子杂交(且不与基因组DNA杂交)。
● 应当指出，如果需要的话，可以修改该方法以包含得自其它PML-RARα外显子融合体连接部的探针以实现另外的、罕见的EML4-ALK融合体变体的检测。
● 应当指出，还可以使用一个探针(或多个探针)实现扩增的序列的检测，所述探针没有跨PML-RARα融合体连接部。例如，在RARα外显子3内的探针靶向序列(在反向引物R3RP的5'侧和在外显子融合体连接部的3'侧)可以用于使用上述引物集合扩增的所有靶向的PML-RARα融合体变体的共同检测。可选地，在扩增的靶向的PML外显子的区域(在适用的PML正向引物的3'侧和在外显子融合体连接部的5'侧)内的探针还可以用于检测融合体变体。
探针可以个别地用于检测单种PML-RARα变体，或作为混合物用于在单个反应中检测多种变体。另外，可以将探针用共同染料标记用于靶向的PML-RARα变体的合并检测，或用不同的染料标记，所述不同的染料能够在单个反应中差别地检测多种PML-RARα变体。
如前述BCR-ABL、ELM4-ALK和KIF5B-RET方法一样，该PML-RARα方法还可以利用另外的引物/探针集合检测由内源性持家基因（诸如GUSB、ABL或G6PD）表达的细胞RNA。得自内源性持家基因的RNA水平可以用于将PML-RARα转录物定量方法相对于细胞充足、样品提取和扩增效率中的变化标准化。得自该持家基因的RNA水平也可以充当样品有效性对照。
因而，考虑到以上内容，本公开内容提供了以下：
A. 一种扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)通过聚合酶链式反应使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，
由此扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA。
B. A的方法，其进一步包括：
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA，
由此检测得自mRNA样品中的所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的mRNA。
C. A的方法，其中在有脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应扩增所述反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。
D. A或B的方法，其中可检测地标记一种或多种引物。
E. D的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。
F. B的方法，其中检测扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。
G. F的方法，其中至少一种探针是在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。
H. F或G的方法，其中检测扩增的cDNA包括使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。
I. B的方法，其中(a)进一步包括使用至少一个内部对照(IC)基因的引物，其中所述IC引物可以与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
J. I的方法，其中可检测地标记一种或多种IC引物。
K. J的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。
L. I的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测所述至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。
M. L的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
N. 一种扩增得自人的mRNA样品中的断裂点簇区(BCR)基因和Abelson鼠白血病(ABL)原癌基因的融合体变体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含BCR-ABL基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，由此扩增得自人的mRNA样品中的BCR-ABL基因融合体变体的mRNA。
O. N的方法，其进一步包括:
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA，
由此检测得自人的mRNA样品中的BCR-ABL基因融合体变体的mRNA。
P. N的方法，其中在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应扩增所述反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。
Q. N或O的方法，其中所述引物包含与ABL的外显子a2杂交的引物。
R. N、O或Q的方法，其中所述引物包含与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物。
S. R的方法，其中所述与BCR的外显子b2杂交的引物会扩增从包含b2a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA和从包含b3a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA。
T. N或O的方法，其中可检测地标记一种或多种引物。
U. T的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。
V. O的方法，其中检测扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。
W. V的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
X. V或W的方法，其中检测扩增的cDNA包括使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。
Y. O的方法，其中(a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物可以与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
Z. Y的方法，其中可检测地标记一种或多种IC引物。
AA. Z的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。
AB. Y的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测所述至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。
AC. AB的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
AD. Q的方法，其中所述与ABL的外显子a2杂交的引物包含SEQ ID NO: 4、25、26或27的核苷酸序列。
AE. Q的方法，其中所述与ABL的外显子a2杂交的引物包含SEQ ID NO: 4的核苷酸序列。
AF. R的方法，其中所述与BCR的外显子e1杂交的引物包含SEQ ID NO: 1、18、19、20、21或22的核苷酸序列，与BCR的外显子b2杂交的引物包含SEQ ID NO: 2或23的核苷酸序列，和/或与BCR的外显子e19杂交的引物包含SEQ ID NO: 3或24的核苷酸序列。
AG. R的方法，其中所述与BCR的外显子e1杂交的引物包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列，与BCR的外显子b2杂交的引物包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列，和/或与BCR的外显子e19杂交的引物包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列。
AH. V的方法，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 5、28、29、30或与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 6、31、32或与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 7、33、34、35或与其互补的序列，和/或在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 8、36或与其互补的序列。
AI. V的方法，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 5或与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 6或与其互补的序列，在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 7或与其互补的序列，和/或在BCR-ABL基因融合体的连接部（所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端）处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含SEQ ID NO: 8或与其互补的序列。
AJ. 一种扩增得自人的mRNA样品中的棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的融合体变体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含EML4-ALK基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：E13A20基因融合体、E6aA20基因融合体、E6bA20基因融合体、E14A20基因融合体和E20A20基因融合体，
由此扩增得自人的mRNA样品中的EML4-ALK基因融合体变体的mRNA。
AK. AJ的方法，其进一步包括:
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA，
由此检测得自人的mRNA样品中的EML4-ALK基因融合体变体的mRNA。
AL. AJ的方法，其中在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应扩增所述反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。
AM. AJ或AK的方法，其中所述引物包含与ALK的外显子A20杂交的引物。
AN. AJ、AK或AM的方法，其中所述引物包含与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物中的2种或更多种。
AO. AN的方法，其中所述与EML4的外显子E6a杂交的引物会扩增从包含E6a基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E6b基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与EML4的外显子E13杂交的引物会扩增从包含E13基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E14基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA。
AP. AJ或AK的方法，其中可检测地标记一种或多种引物。
AQ. AP的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。
AR. AK的方法，其中检测扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。
AS. AR的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；或在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。
AT. AR或AS的方法，其中检测扩增的cDNA包括使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。
AU. AK的方法，其中(a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
AV. AU的方法，其中可检测地标记一种或多种IC引物。
AW. AV的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。
AX. AV的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。
AY. AX的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
AZ. AJ-AY的方法，其中(a)(ii)进一步包括使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物针对至少一种选自以下的其它EML4-ALK基因融合体变体：E18A20基因融合体、E15A20基因融合体、E2A20基因融合体和E17A20基因融合体。
BA. 一种扩增得自人的mRNA样品中的驱动蛋白家族成员5B (KIF5B)基因和Ret (RET)原癌基因的融合体变体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含KIF5B-RET基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：K15R12基因融合体、K16R12基因融合体、K22R12基因融合体和K23R12基因融合体，
由此扩增得自人的mRNA样品中的KIF5B-RET基因融合体变体的mRNA。
BB. BA的方法，其进一步包括:
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA，
由此检测得自人的mRNA样品中的KIF5B-RET基因融合体变体的mRNA。
BC. BA的方法，其中在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应扩增所述反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。
BD. BA或BB的方法，其中所述引物包含与RET的外显子R12杂交的引物。
BE. BA, BB或BD的方法，其中所述引物包含与KIF5B的外显子K15杂交的引物和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物。
BF. BE的方法，其中所述与KIF5B的外显子K15杂交的引物会扩增从包含K15R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K16R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物会扩增从包含K22R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K23R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA。
BG. BA或BB的方法，其中可检测地标记一种或多种引物。
BH. BG的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。
BI. BB的方法，其中检测扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。
BJ. BI的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；或在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。
BK. BI或BJ的方法，其中检测扩增的cDNA包括使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。
BL. BB的方法，其中(a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
BM. BL的方法，其中可检测地标记一种或多种IC引物。
BN. BM的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。
BO. BL的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测所述至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。
BP. BO的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
BQ. 一种扩增得自人的mRNA样品中的早幼粒细胞性白血病(PML)基因和视黄酸受体α(RARα)基因的融合体变体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含PML-RARα基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：P3R3基因融合体、P6aR3基因融合体和P6bR3基因融合体，
由此扩增得自人的mRNA样品中的PML-RARα基因融合体变体的mRNA。
BR. BQ的方法，其进一步包括:
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA，
由此检测得自人的mRNA样品中的PML-RARα基因融合体变体的mRNA。
BS. BQ的方法，其中在有dNTP、缓冲液、聚合酶和二价离子的混合物存在下，通过聚合酶链式反应扩增所述反转录的cDNA，同时在约58℃至约62℃的温度保持约30秒至约40秒和约92℃的温度保持约30秒之间循环。
BT. BQ或BR的方法，其中所述引物包含与RARα的外显子R3杂交的引物。
BU. BQ、BR或BT的方法，其中所述引物包含与PML的外显子P3杂交的引物和/或与PML的外显子6a杂交的引物。
BV. BU的方法，其中所述与PML的外显子6a杂交的引物会扩增从包含P6aR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA和从包含P6bR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA。
BW. BQ或BR的方法，其中可检测地标记一种或多种引物。
BX. BW的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。
BY. BR的方法，其中检测扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。
BZ. BY的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；或在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。
CA. BY或BZ的方法，其中检测扩增的cDNA包括使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。
CB. BR的方法，其中(a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
CC. CB的方法，其中可检测地标记一种或多种IC引物。
CD. CC的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。
CE. CB的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测所述至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。
CF. CE的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
CG. 引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
CH. CG的引物组，其中所述与BCR的外显子e1杂交的引物包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 1、18、19、20、21和22。
CI. CG的引物组，其中所述与BCR的外显子b2杂交的引物包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2和23。
CJ. CG的引物组，其中所述与BCR的外显子e19杂交的引物包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3和24。
CK. CG的引物组，其进一步包含与ABL的外显子a2杂交的引物。
CL. CK的引物组，其中所述与ABL的外显子a2杂交的引物包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 4、25、26和27。
CM. 引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物、与EML4的外显子E6b杂交的引物、与EML4的外显子E14杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；和在EML4-AKL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。
CN. CM的引物组，其进一步包含与ALK的外显子A20杂交的引物。
CO. 引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与KIF5B的外显子K15杂交的引物、与KIF5B的外显子K16杂交的引物、与KIF5B的外显子K22杂交的引物和与KIF5B的外显子K23杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；和在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。
CP. CO的引物组，其进一步包含与RET的外显子R12杂交的引物。
CQ. 引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与PML的外显子P3杂交的引物、与PML的外显子6a杂交的引物和与PML的外显子6b杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；和在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。
CR. CQ的引物组，其进一步包含与RARα的外显子R3杂交的引物。
CS. 探针组，其包含至少两种选自以下的探针：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
CT. CS的探针组，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、28、29、30和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
CU. CS的探针组，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 6、31、32和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
CV. CS的探针组，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 7、33、34、35和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
CW. CS的探针组，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 8、36和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
CX. 探针组，其包含至少两种选自以下的探针：在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；和在EML4-AKL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。
CY. 探针组，其包含至少两种选自以下的探针：在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；和在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。
CZ. 探针组，其包含至少两种选自以下的探针：在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；和在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。
DA. 试剂盒，其包含：
(i)引物组，其包含与变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子杂交的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自mRNA样品中的所述第一基因和所述第二基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i')得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii')使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
DB. DA的试剂盒，其进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。
DC. DA的试剂盒，其中(ii) (a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
DD. 试剂盒，其包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用BCR-ABL基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
DE. DD的试剂盒，其包含与ABL的外显子a2杂交的引物。
DF. DD的试剂盒，其进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
DG. DD的试剂盒，其中(ii) (a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
DH. 试剂盒，其包含：
(i)引物组，其包含含有选自SEQ ID NO: 1、2、3、18、19、20、21、22、23和24的核苷酸序列的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物针对至少一种选自以下的BCR-ABL基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，其中所述引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
DI. DH的试剂盒，其进一步包含含有选自SEQ ID NO: 4、25、26和27的核苷酸序列的引物。
DJ. DH的试剂盒，其进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、6、7、8、28、29、30、31、32、33、34、35、36和与其互补的序列。
DK. DH的试剂盒，其中(ii) (a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
DL. 试剂盒，其包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物、与EML4的外显子E6b杂交的引物、与EML4的外显子E14杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的EML4基因和ALK基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用EML4-ALK基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：E13A20基因融合体、E6aA20基因融合体、E6bA20基因融合体、E14A20基因融合体和E20A20基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
DM. DL的试剂盒，其包含与ALK的外显子A20杂交的引物。
DN. DL的试剂盒，其进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；或在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。
DO. DL的试剂盒，其中(ii) (a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
DP. 试剂盒，其包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与KIF5B的外显子K15杂交的引物、与KIF5B的外显子K16杂交的引物、与KIF5B的外显子K22杂交的引物和与KIF5B的外显子K23杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的KIF5B基因和RET基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用KIF5B-RET基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：K15R12基因融合体、K16R12基因融合体、K22R12基因融合体和K23R12基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
DQ. DP的试剂盒，其包含与RET的外显子R12杂交的引物。
DR. DP的试剂盒，其进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；或在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。
DS. DP的试剂盒，其中(ii) (a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
DT. 试剂盒，其包含：
(i)引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与PML的外显子P3杂交的引物、与PML的外显子6a杂交的引物和与PML的外显子6b杂交的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自人的mRNA样品中的PML基因和RARα基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用PML-RARα基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：P3R3基因融合体、P6aR3基因融合体和P6bR3基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
DU. DT的试剂盒，其包含与RARα的外显子R3杂交的引物。
DV. DT的试剂盒，其进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针：在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；或在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。
DW. DT的试剂盒，其中(ii) (a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
DX。检测得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用在易位后与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，扩增所述反转录的cDNA，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA，
由此检测得自mRNA样品中的所述第一基因和所述第二基因之间的融合体变体的mRNA。
DY. DX的方法，其中可检测地标记一种或多种引物。
DZ. DY的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的引物的检测。
EA. DX的方法，其中检测扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。
EB. EA的方法，其中至少一种探针是在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。
EC. EA或EB的方法，其中检测扩增的cDNA包括使所述扩增的cDNA与至少两种探针接触，其中每种探针与所述扩增的cDNA的杂交是可辨别的。
ED. DX的方法，其中(a)进一步包括使用至少一个IC基因的引物，其中所述IC引物与所述至少一个IC基因的相同或不同外显子杂交，和(b)进一步包括检测所述扩增的IC cDNA。
EE. ED的方法，其中可检测地标记一种或多种IC引物。
EF. EE的方法，其中可以区分一种或多种可检测地标记的IC引物的检测。
EG. EF的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的IC cDNA与至少一种IC探针和/或至少一种IC引物接触，和检测所述至少一种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交。
EH. EG的方法，其中检测所述扩增的IC cDNA包括使所述扩增的IC cDNA与至少两种IC探针/引物接触，其中每种IC探针/引物对不同的IC cDNA是特异性的，且每种IC探针/引物与所述扩增的IC cDNA的杂交是可辨别的。
在本说明书中提及的所有专利、专利申请公开、期刊论文、教科书和其它出版物都指示本公开内容所属领域的技术人员的技能水平。所有这样的出版物通过引用并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物通过引用并入的相同程度。
在没有本文中未明确公开的任何要素或限制存在下，可以适当地实践本文示例性地描述的发明。因而，例如，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一个在本文中的每个实例可以用其它两个术语中的任一个替换。同样地，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。因而，例如，对“所述方法”的提及包括所述类型的一种或多种方法和/或步骤，所述类型在本文中描述和/或本领域普通技术人员在阅读本公开内容后会明白。
已经采用的术语和表达用作描述术语，且不用作限制术语。在这点上，当某些术语在“术语”下进行阐述和在“具体实施方式”中在别处以其它方式进行定义、描述、解释或讨论时，所有这样的定义、描述、解释和讨论意图归于这样的术语。在这样的术语和表达的应用中也无意排除显示和描述的特征或其部分的任何等同物。此外，当在“具体实施方式”中使用副标题例如“术语”时，这样的应用仅仅是为了易于提及，且无意将在一个部分中做出的任何公开内容仅限制为该部分；相反，在一个副标题下做出的任何公开内容意图构成在各个和每个其它副标题下的公开内容。
应当认识到，在要求保护的发明的范围内，多种修改是可能的。因而，应当理解，尽管已经在优选实施方案和任选特征的上下文中特别地公开了本发明，但是本领域技术人员可以求助于本文中公开的概念的修改和变化。这样的修改和变化视作在所附权利要求限定的发明范围内。

Claims (36)

1.一种扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物，和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，
其中一种或多种引物可以被可检测地标记，
由此扩增得自mRNA样品中的第一基因和第二基因之间的融合体的变体的mRNA。
2.权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA，
由此检测得自mRNA样品中的所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的mRNA。
3.权利要求2所述的方法，其中检测所述扩增的cDNA包括：在杂交条件下使所述扩增的cDNA与至少一种探针接触，和检测所述至少一种探针与所述扩增的cDNA的杂交。
4.权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述第一基因和所述第二基因是断裂点簇区(BCR)基因和Abelson鼠白血病(ABL)原癌基因、棘皮动物微管相关蛋白-样4 (EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因、驱动蛋白家族成员5B (KIF5B)基因和Ret (RET)原癌基因、或早幼粒细胞性白血病(PML)基因和视黄酸受体α(RARα)基因。
5.权利要求3所述的方法，其中至少一种探针是在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。
6.权利要求4所述的方法，其中所述引物包含BCR-ABL基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体。
7.权利要求6所述的方法，其中所述引物包含(i)与ABL的外显子a2杂交的引物和(ii)与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物中的至少两种。
8.权利要求7所述的方法，其中所述与BCR的外显子b2杂交的引物会扩增从包含b2a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA和从包含b3a2基因融合体的BCR-ABL基因融合体变体反转录的cDNA。
9.权利要求6所述的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
10.权利要求7所述的方法，其中所述与ABL的外显子a2杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 4、25、26和27的核苷酸序列，所述与BCR的外显子e1杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 1、18、19、20、21和22的核苷酸序列，与BCR的外显子b2杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 2和23的核苷酸序列，和/或与BCR的外显子e19杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 3和24的核苷酸序列。
11.权利要求9所述的方法，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、28、29、30和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 6、31、32和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 7、33、34、35和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和/或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 8、36和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
12.权利要求4所述的方法，其中所述引物包含EML4-ALK基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少2种选自以下的基因融合体变体：E13A20基因融合体、E6aA20基因融合体、E6bA20基因融合体、E14A20基因融合体和E20A20基因融合体。
13.权利要求12所述的方法，其中所述引物包含(i)与ALK的外显子A20杂交的引物和(ii)与EML4的外显子E13杂交的引物、与EML4的外显子E6a杂交的引物和与EML4的外显子E20杂交的引物中的2种或更多种。
14.权利要求13所述的方法，其中所述与EML4的外显子E6a杂交的引物会扩增从包含E6a基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E6b基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与EML4的外显子E13杂交的引物会扩增从包含E13基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA和从包含E14基因融合体的EML4-ALK基因融合体变体反转录的cDNA。
15.权利要求12所述的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E13的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6a的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E6b的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端；在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E14的3’末端和ALK的外显子A20的5'末端；或在EML4-ALK基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含EML4的外显子E20的3'末端和ALK的外显子A20的5'末端。
16.权利要求12所述的方法，其中(a)(ii)进一步包括使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物针对至少一种选自以下的其它EML4-ALK基因融合体变体：E18A20基因融合体、E15A20基因融合体、E2A20基因融合体和E17A20基因融合体。
17.权利要求4所述的方法，其中所述引物包含KIF5B-RET基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：K15R12基因融合体、K16R12基因融合体、K22R12基因融合体和K23R12基因融合体。
18.权利要求17所述的方法，其中所述引物包含(i)与RET的外显子R12杂交的引物和(ii)与KIF5B的外显子K15杂交的引物和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物。
19.权利要求18所述的方法，其中所述与KIF5B的外显子K15杂交的引物会扩增从包含K15R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K16R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA，和/或与KIF5B的外显子K22杂交的引物会扩增从包含K22R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA和从包含K23R12基因融合体的KIF5B-RET基因融合体变体反转录的cDNA。
20.权利要求17所述的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K15的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K16的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K22的3'末端和RET的外显子R12的5'末端；或在KIF5B-RET基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含KIF5B的外显子K23的3'末端和RET的外显子R12的5'末端。
21.权利要求4所述的方法，其中所述引物包含PML-RARα基因融合体变体集合的引物，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：P3R3基因融合体、P6aR3基因融合体和P6bR3基因融合体。
22.权利要求21所述的方法，其中所述引物包含(i)与RARα的外显子R3杂交的引物和(ii)与PML的外显子P3杂交的引物和/或与PML的外显子6a杂交的引物。
23.权利要求22所述的方法，其中所述与PML的外显子6a杂交的引物会扩增从包含P6aR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA和从包含P6bR3基因融合体的PML-RARα基因融合体变体反转录的cDNA。
24.权利要求21所述的方法，其中至少一种探针是这样的探针：其在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P3的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6a的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端；或在PML-RARα基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含PML的外显子P6b的3'末端和RARα的外显子R3的5'末端。
25.引物组，其包含至少两种选自以下的引物：与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物，其中所述引物可以被可检测地标记，和/或其中所述引物组与至少一种可检测地标记的探针组合，所述探针选自：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
26.权利要求25所述的引物组，其中所述与BCR的外显子e1杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 1、18、19、20、21和22的核苷酸序列，与BCR的外显子b2杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 2和23的核苷酸序列，和/或与BCR的外显子e19杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 3和24的核苷酸序列。
27.权利要求25所述的引物组，所述引物组进一步包含与ABL的外显子a2杂交的引物。
28.权利要求27所述的引物组，其中所述与ABL的外显子a2杂交的引物包含选自SEQ ID NO: 4、25、26和27的核苷酸序列。
29.探针组，其包含至少两种选自以下的探针：在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
30.权利要求29的探针组，其中所述在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针，包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、28、29、30和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 6、31、32和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 7、33、34、35和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；和/或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交的探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 8、36和与其互补的序列，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端。
31.试剂盒，其包含：
(i)引物组，其包含与变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子杂交的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物；和
(ii)说明书，其关于检测得自mRNA样品中的所述第一基因和所述第二基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i')得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii')使用引物扩增所述反转录的cDNA，所述引物包含变得与第二基因的变体外显子邻接的第一基因的外显子的引物、和所述第二基因的2个或更多个变体外显子中的每一个的引物，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
32.权利要求31所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中所述探针在所述第一基因和所述第二基因之间的融合体的变体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含所述第一基因的外显子的3'末端和所述第二基因的外显子的5'末端。
33.权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述第一基因和所述第二基因是BCR基因和ABL原癌基因、EML4基因和ALK基因、KIF5B基因和RET原癌基因、或PML基因和RARα基因。
34.权利要求33所述的试剂盒，其中所述引物组包含(a)至少两种选自以下的引物：与BCR的外显子e1杂交的引物、与BCR的外显子b2杂交的引物和与BCR的外显子e19杂交的引物或(b)包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、18、19、20、21、22、23和24的核苷酸序列的引物，且其中所述说明书是关于检测得自人的mRNA样品中的BCR基因和ABL原癌基因的融合体的mRNA的方法，所述方法包括：
(a) (i)得到已经从所述mRNA样品反转录的cDNA，或将所述mRNA样品反转录成cDNA，和(ii)使用BCR-ABL基因融合体变体集合的引物扩增所述反转录的cDNA，所述集合包含至少两种选自以下的基因融合体变体：e1a2基因融合体、b2a2基因融合体、b3a2基因融合体和e19a2基因融合体，其中一种或多种引物可以被可检测地标记，和
(b)检测所述扩增的cDNA，或者检测并定量所述扩增的cDNA。
35.权利要求34所述的试剂盒，其中所述引物组进一步包含(a)与ABL的外显子a2杂交的引物或(b)包含选自SEQ ID NO: 4、25、26和27的核苷酸序列的引物。
36.权利要求34所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含使用可检测地标记的引物不可检测出的每个基因融合体变体的探针，其中(a)所述探针在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e1的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b2的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子b3的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或在BCR-ABL基因融合体的连接部处或附近与核苷酸序列杂交，所述连接部包含BCR的外显子e19的3'末端和ABL的外显子a2的5'末端；或(b)所述探针包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 5、6、7、8、28、29、30、31、32、33、34、35、36和与其互补的序列。
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