JP2018512878A - 次世代シークエンシングの感度を高めるための方法 - Google Patents

Abstract

単離ＤＮＡにおける低頻度変異を検出するための方法は、単離ＤＮＡの増幅中にブロッキングプローブを試薬に加える。ブロッキングプローブは、試料に対応する野生型ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドである。ブロッキングプローブは、単離ＤＮＡの目的の領域内の疑いのある変異の部位にわたる。増幅後、増幅ＤＮＡの断片が次世代シークエンシングを用いてシークエンシングされ、及び出力が作成されて、シークエンシングされた断片を表示する。一部の実施形態では、ブロッキングプローブは、ロックド核酸（ＬＮＡ）である。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１５年４月２０日出願の米国仮特許出願第６２／１５０，１９８号明細書の優先権の利益を主張する。

本発明は、低頻度変異の次世代シークエンシングの感度を高めるための方法、特に、ＮＧＳの前に断片の一部の増幅を選択的にブロックするための方法に関する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術の導入により、研究者が生物系からの遺伝情報を取り出す方法に大きい変化が起こり、あらゆる種のゲノム、トランスクリプトーム、及びエピゲノムについての幅広い洞察に道が開かれた。この能力は、多数の重要な飛躍的進展を促進し、ヒトの疾患の研究から農業及び進化論的科学に至る分野を進展させる。

原則として、ＮＧＳ技術の背景にある概念は、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）を用いたＳａｎｇｅｒシークエンシング（ＤＮＡの小さい断片の塩基が、各断片がＤＮＡ鋳型鎖から再合成されるときに放出される信号から連続的に特定される）に類似している（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＭｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１０）１１：３１−４６を参照されたい）。ＮＧＳは、このプロセスを、１つ又は少数のＤＮＡ断片に限定されることなく、大量並列的に数百万の反応に拡大する。この進展により、ゲノム全体にわたるＤＮＡ塩基対の大きいストリングの高速シークエンシングが可能となり、最新の機器は、１回のシークエンシングの実行で数百のギガ塩基のデータを作成することができる。ＮＧＳは、従来のＳａｎｇｅｒシークエンシングでは、ＤＮＡの全てのコピーが一緒にシークエンシングされるが、ＮＧＳでは、ＤＮＡが分離されて個々にシークエンシングされる小さい断片に分割されるという点で従来のＳａｎｇｅｒシークエンシングと異なる。この差異は、低頻度変異の検出方法の感度を高めるための方法において意味を有する。

ＮＧＳの出現により、変異のシークエンシング及び試験が患者の癌の診断及び癌患者の管理において標準的な方法となった。癌組織における様々な変異のスクリーニングは、予後の予測及び治療の決定のための手段を提供する。高精度治療及び標的療法は、分子異常の検出及びこれらの分子異常を標的とする選択療法に依存する。例えば、癌患者でのＥＧＦＲ変異の検出は、この患者が抗ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に応答する可能性が極めて高いことを示唆する。他方、特定の変異の検出は、特定の療法に対する耐性を示唆し得る。例えば、癌患者でのＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異の検出は、この患者がＥＧＦＲ療法に応答しないことを示唆する。

特定の遺伝子における変異の検出は、最も一般的には、１つの遺伝子における１つ又は少なくとも少数の変異を検出するように設計された標的試験を用いて達成される。ＮＧＳは、多数の理由から相補性試験として勢いがある。第１に、標的癌療法の臨床試験は、既存の標的試験ではあまりカバーされない変異の検出に依存する。１つ又は少数の変異を試験するために新しい分子アッセイを検証及び実施する遅くて労働集約的なプロセスに依存するのではなく、ＮＧＳは、目的の１つ以上の追加の変異のカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を提供する作業を単純化する。第２に、標的試験は、誤解を与える結果を提供する可能性があり、治療的に標的可能な変異の特定に失敗する。更に、標的試験は、この標的試験が特定の変異を検出するように設計された正にその変異の検出に失敗することがある。最後に、腫瘍は、治療的に標的化可能であるが、典型的には、その腫瘍型で見られない変異を有する場合が多い。その大量並列の性質により、ＮＧＳは、予想外の遺伝子における変異を検出するのによく適している。

Ｓａｎｇｅｒシークエンシングのように、微小残存病変を測定するために一般的に使用されている他の技術は、１０パーセント〜２０パーセント未満の頻度で存在する変異を確実に検出することができない。専門家は、１０パーセント未満の頻度を示す変異が臨床的に重要であることに賛同しているが、介入を必要とする「重要な」変異を定義する適切な閾値は依然として確立されていない。ＮＧＳは、５パーセントの範囲の感度で変異を検出するための有益な手段を提供するが、分析されたＤＮＡの５パーセント未満に存在する変異の検出に対して感度が低いままである。これは、特に、末梢血血漿又は他の体液、例えば、尿若しくは気管支洗浄液を分析しようとするときに問題となる。従って、低頻度変異の検出を目的としたＮＧＳの感度を改善する方法が要望されている。

本発明の一態様では、選択的シークエンシングにより分析される試料中の変異ＤＮＡを濃縮して野生型ＤＮＡの相対比率を低下させる方法が提供される。例示的な一実施形態では、野生型と同一のロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを使用して、野生型ＤＮＡの増幅をブロックし、変異ＤＮＡを、アンプリコンベースのＮＧＳ法を用いてシークエンシングのために濃縮する。ＬＮＡプローブは、正常なＤＮＡと構造的に異なり、ＤＮＡに結合すると、その結合は非常に強く、増幅のための解離がたとえ高温でも非常に困難になり、従って増幅が防止される。

他の実施形態では、選択的シークエンシングは、ＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（低変性温度での改良された且つ完全な濃縮ＣＯ増幅）を含む技術を用いて達成することができ、このＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチド（ＲＳ−オリゴ）を用いて過剰な野生型ＤＮＡにおける変異ＤＮＡ配列を優先的に濃縮する。ＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、標準的なＳａｎｇｅｒシークエンシング分析での感度を著しく高めることが報告されている。別のアプローチは、ＱＣｌａｍｐ（商標）技術（ＤｉａＣａｒｔａから）であり、この技術は、野生型鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅を抑制し、且つ変異鋳型のみの選択的ＰＣＲ増幅を可能にする配列特異的野生型鋳型異種核酸「Ｃｌａｍｐ」（ＸＮＡ）を利用することによって体細胞変異をスクリーニングするために使用される。これにより、大幅に過剰な野生型鋳型の存在下での変異ＤＮＡの検出が可能となる。

本発明の一態様では、患者からの試料における低頻度変異を検出する方法は、試料からＤＮＡを単離するステップ；ブロッキングプローブを単離ＤＮＡに加えるステップであって、このブロッキングプローブが、試料に対応する野生型ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、このブロッキングプローブが、単離ＤＮＡの目的の領域内の疑いのある変異の部位にわたるように適合されている、ステップ；単離ＤＮＡを増幅するステップ；この増幅ＤＮＡの断片を、次世代シークエンシングを用いてシークエンシングするステップ；及びこのシークエンシングされた断片に対応する出力を作成するステップを含む。一部の実施形態では、ブロッキングプローブは、ロックド核酸（ＬＮＡ）であり；他の実施形態では、ブロッキングプローブは、ブロック核酸（ＢＮＡ）、ＱＣｌａｍｐ、及びＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲから選択される。ブロッキングプローブは、１０量体〜１２量体であり得る。目的の領域がＫＲＡＳエキソン１２である実施形態では、ブロッキングプローブは、ＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡである。目的の領域がＥＧＦＲコドンＴ７９０である実施形態では、ブロッキングプローブは、ＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣである。

特定の実施形態では、ブロッキングプローブを加えるステップの前に、単離ＤＮＡが、１つ以上の目的の領域を含む断片に断片化される。他の実施形態では、単離ＤＮＡを増幅するステップの前に、単離ＤＮＡが１つ以上の濃縮プローブとハイブリダイズされてＤＮＡをタグ付け及び断片化する。試料は、全血、便、生検組織、骨髄、細針吸引液（ＦＮＡ）、及び末梢血からなる群から選択され得る。

本発明の別の態様では、単離ＤＮＡにおける低頻度変異を検出するための方法は、ブロッキングプローブを単離ＤＮＡの増幅中に試薬に加えるステップであって、このブロッキングプローブが、試料に対応する野生型ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、このブロッキングプローブが、単離ＤＮＡの目的の領域内の疑いのある変異の部位にわたるように適合されている、ステップ；増幅ＤＮＡの断片を、次世代シークエンシングを用いてシークエンシングするステップ；及びシークエンシングされた断片に対応する出力を作成するステップを含む。一部の実施形態では、ブロッキングプローブは、ロックド核酸（ＬＮＡ）であり；他の実施形態では、ブロッキングプローブは、ブロック核酸（ＢＮＡ）、ＱＣｌａｍｐ、及びＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲから選択される。ブロッキングプローブは、１０量体〜１２量体であり得る。目的の領域がＫＲＡＳエキソン１２である実施形態では、ブロッキングプローブは、ＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡである。目的の領域がＥＧＦＲコドンＴ７９０である実施形態では、ブロッキングプローブは、ＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣである。

特定の実施形態では、ブロッキングプローブを加えるステップの前に、単離ＤＮＡが、１つ以上の目的の領域を含む断片に断片化される。他の実施形態では、単離ＤＮＡを増幅する前に、単離ＤＮＡが１つ以上の濃縮プローブとハイブリダイズされてＤＮＡをタグ付け及び断片化する。試料は、全血、便、生検組織、骨髄、細針吸引液（ＦＮＡ）、及び末梢血からなる群から選択することができる。

図１Ａは、本発明の一実施形態によるアンプリコンベースのＮＧＳで変異ＤＮＡを選択するためのＬＮＡの使用を示す概略図である。 図１Ｂは、アンプリコンベースのＮＧＣの基本的なプロセスを示す概略図である。 図２Ａは、ＬＮＡブロッキングを用いて（図２Ａ）及びＬＮＡブロッキングを用いないで（図２Ｂ）同じ試料で検出されたＫＲＡＳの変異（Ｃ＞Ａ）を示すＮＧＳの結果を示す。 図２Ｂは、ＬＮＡブロッキングを用いて（図２Ａ）及びＬＮＡブロッキングを用いないで（図２Ｂ）同じ試料で検出されたＫＲＡＳの変異（Ｃ＞Ａ）を示すＮＧＳの結果を示す。 図３は、ＫＲＡＳ変異の検出でのＬＮＡを用いて得られたＮＧＳの結果とＬＮＡを用いずに得られたＮＧＳの結果とを比較する表である。 図４は、ＥＧＦＲ変異の検出でのＬＮＡを用いて得られたＮＧＳの結果とＬＮＡを用いずに得られたＮＧＳの結果とを比較する表である。 図５は、ＬＮＡを用いないで（上部パネル）及びＬＮＡを用いて（下部パネル）同じ試料で検出されたＥＧＦＲ Ｔ７９０の変異（Ｃ＞Ｔ）を示すＮＧＳの結果を示す。 図６は、本発明の一実施形態による改良された方法でのＥＧＦＲ変異の検出のためのＮＧＳシークエンシングの結果を示す表である。 図７は、ハイブリッド捕捉ＮＧＳ（ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ ＮＧＳ）用の特注設計された３１５のパネルで遺伝子を列記する表である。

以下に記載される説明及び添付の図面は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）公開データベースから入手できる情報を参照により、当業者によって容易に識別される特定の遺伝子名、アクセッション番号、及び他の識別子を明確にする。配列表を含む、全ての同定された遺伝子、断片、プローブ、アミノ酸、及びアクセッション番号に対応するＮＣＢＩデータベースに含まれる追加情報は、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明の方法は、選択的シークエンシングにより変異ＤＮＡを濃縮して、分析された試料中の野生型ＤＮＡの相対比率を低下させることによってＮＧＳ分析の感度を向上させる。例示的な実施形態では、野生型と同一のロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを使用して、野生型ＤＮＡの増幅をブロックすると共に、アンプリコンベースのＮＧＳ方法を用いてシークエンシングのために変異ＤＮＡを濃縮する。ＬＮＡは、通常のＤＮＡと構造的に異なり、ＤＮＡに結合すると、その結合が非常に強いため、たとえ高温でも増幅のための解離が非常に困難になり、従って増幅が防止される。

ロック核酸（ＬＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの強度及び特異性を高めるために使用することができる核酸アナログである。ＬＮＡ塩基を、あらゆるＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドに組み込んで、局所へリックスに高次構造変化を誘導することができる。この変更された状態は、ＬＮＡ塩基に、相補配列に対するより強い結合強度、大きいミスマッチの識別、及び改善された二重鎖形成を提供する。これらの特徴は、ＬＮＡがオリゴヌクレオチドに組み込まれたときの増幅の成功率を高めると共に、二重鎖の融点も上昇させ、これにより、プローブ及びプライマーを短縮することができ、より高い特異性を与える。現在までのＬＮＡの適用例としては、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ、リアルタイムＰＣＲプローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロアレイプローブ、並びにＰＣＲプライマーが挙げられる。

ＬＮＡヌクレオチドのリアルタイムＰＣＲプローブ及びプライマーへの組み込みは、Ｃ_ｔ値を著しく低下させ、これに対応して増幅効率が上昇する。標準的なＰＣＲでは、ＬＮＡ修飾は、増幅の特異性を高め、これによりシークエンシングの読み精度が向上し、必要な鋳型の量を少なくとも１０分の１に減らすことができる。多数の適用例では、これらの少量を検出する能力、たとえ標的配列の僅か１つ又は２つのコピーであっても検出する能力は極めて望ましいであろう。

本明細書で使用される用語「遺伝子」は、適切な調節配列に機能的に連結されたときにｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コード領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列の前及び後の調節領域、並びに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。

本明細書で使用される用語「核酸」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はこれらのアナログの単位を含む任意の分子、好ましくは、高分子を指す。核酸は、一本鎖又は二本鎖の何れかであり得る。一本鎖核酸は、変性された二本鎖ＤＮＡの一方の核酸鎖であり得る。或いは、一本鎖は、何れの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であり得る。一態様では、鋳型核酸はＤＮＡである。別の態様では、鋳型はＲＮＡである。適切な核酸分子は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の適切な核酸分子は、ｍＲＮＡを含むＲＮＡである。核酸分子の「一部分」は、この分子によって構成されるヌクレオチドの連続したセットを指す。一部分は、分子によって構成されるヌクレオチドの全て又はサブセットのみを含み得る。一部分は、二本鎖又は一本鎖であり得る。

核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、様々な他の成分、例えば、タンパク質、脂質、及び他の（例えば、非標的又は非鋳型）核酸を含む生物学的試料から単離することができる。核酸分子は、任意の物質（例えば、細胞内物質（生きている又は死んでいる）、細胞外物質、ウイルス物質、環境試料（例えば、メタゲノム試料）、合成物質（例えば、ＰＣＲ又は他の増幅技術によって提供されるようなアンプリコン））、動物、植物、細菌、古細菌、真菌、又はその他の生物から得ることができる。本技術に使用される生物学的試料は、ウイルス粒子又はその調製物を含む。一部の実施形態では、核酸は、（例えば、シークエンシング用のアンプリコンライブラリー又は断片ライブラリーを作成するために）増幅反応で鋳型として使用される試料から単離される。一部の実施形態では、核酸は、断片のライブラリーの作成に使用される試料から単離される。

核酸分子は、生物から直接、又は生物から得られる生物学的試料から、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便、毛髪、汗、涙、皮膚、及び組織から得ることができる。例示的な試料としては、限定されるものではないが、全血、リンパ液、血清、血漿、口腔細胞、汗、涙、唾液、痰、毛髪、皮膚、生検、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、精液、膣排泄物、漿液、滑液、心膜液、腹水、胸膜液、漏出液、滲出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞試料、及びぬぐい液、吸引液（例えば、骨髄、細針など）、洗浄液（例えば、口腔、鼻咽頭、気管支、気管支肺胞、眼、直腸、腸、膣、表皮など）、及び／又は他の標本が挙げられる。

法医学標本、アーカイブ標本、保存標本、及び／又は長期間保存された標本、例えば、新鮮凍結、メタノール／酢酸固定、又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本及び試料を含む、あらゆる組織又は体液標本を、この技術に使用される核酸源として使用することができる。核酸鋳型分子は、培養細胞、例えば、初代培養細胞又は細胞株から単離することもできる。鋳型核酸が得られる細胞又は組織をウイルス又は他の細胞内病原体に感染させることができる。試料はまた、生物学的標本、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルス、又はゲノムＤＮＡから抽出された全ＲＮＡであり得る。試料はまた、非細胞起源からの単離ＤＮＡ、例えば、冷凍器で保存されていた増幅／単離ＤＮＡであり得る。

核酸分子は、例えば、生物学的試料からの抽出により、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（例えば、ｐｐ．２８０−２８１を参照されたい）に記載されているような様々な技術によって得ることができる。

様々な実施形態では、核酸は増幅される。当技術分野で公知のあらゆる増幅方法を使用することができる。使用できる増幅技術の例としては、限定されるものではないが、ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ホットスタートＰＣＲ、ネストＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕポロニーＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ（ｐｉｃｏｔｉｔｅｒ ＰＣＲ）、及びエマルジョンＰＣＲが挙げられる。他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自己持続性配列複製、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライミングＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、及び核酸ベースの配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。本明細書で使用できる他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号明細書；同第５，４９４，８１０号明細書；同第４，９８８，６１７号明細書；及び同第６，５８２，９３８号明細書に記載されている増幅方法が挙げられる。

本明細書で使用される用語「単離された」又は「部分的に精製された」は、核酸の場合、その天然の供給源で見られる核酸と共に存在し、且つ／又は細胞によって発現されるときに核酸と共に存在し得る少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸又はポリペプチド）から分離された核酸を指す。化学的に合成された核酸又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳で合成された核酸は、「単離された」と見なされる。

用語「単一ヌクレオチド多型」又は「ＳＮＰ」は、ゲノムＤＮＡ又は腫瘍関連ＤＮＡにおける単一点変異を指す。用語「変異」及び「点変異」は、ＳＮＰを含み、且つ／又はＳＮＰを指すことを意味する。

本明細書で使用される「遺伝子変化に関連した疾患」は、健康な野生型対象と比較して対象の遺伝物質の変化、例えば、欠失、挿入、ＳＮＰ、遺伝子再構成によって少なくとも部分的に引き起こされるあらゆる疾患を指す。疾患は、変化が、疾患を発症する対象のリスクを増大させるか、対象の疾患（感染症又は感染成分での疾患を含む）への罹患し易さを高めるか、疾患関連分子の産生をもたらすか、又は細胞を罹患させるか若しくは異常にする（例えば、癌細胞における細胞周期の調節の喪失）場合に対象の遺伝物質の変化によって少なくとも部分的に引き起こされ得る。疾患は、複数の遺伝子の変化、例えば、癌に関連し得る。

本明細書で使用される用語「相補的」は、水素結合塩基対を形成するヌクレオチドの能力を指す。一部の実施形態では、相補的は、２つの所与のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列が互いにアニーリングするときに、ＤＮＡではＡとＴとが対合し、ＧとＣとが対合し、ＲＮＡではＧとＣとが対合し、ＡとＵとが対合するような水ヌクレオチド塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＵ間の水素結合塩基対形成の優先を指す。

標的核酸に特異的なプライマーに関連して使用される場合の本明細書で使用される「特異的」は、プライマーが標的核酸にアニーリングしてその増幅を媒介するが、試料中に存在する非標的配列にアニーリングせず、その増幅も媒介しないアニーリング温度が存在するようなプライマーと標的との間の相補性のレベルを指す。

本明細書で使用される「増幅された産物」、「増幅産物」、又は「アンプリコン」は、特定の標的核酸鋳型鎖及び／又はその相補配列（これは、ヌクレオチド配列では、鋳型核酸配列及び／又はその相補配列に対応する）の一部のコピーである増幅反応から生じるオリゴヌクレオチドを指す。増幅産物は、プライマーに特異的であり、且つ標的核酸及び／又はその相補体の一部である配列に隣接する配列を更に含み得る。

アンプリコンパネルは、例えば、疾患、疾患の進行、発育障害、体質性疾患、代謝経路、薬理ゲノムの特徴付け、形質、生物（例えば、種の識別のための）、生物群、地理的位置、器官、組織、試料、環境（例えば、メタゲノム及び／又はリボソームＲＮＡのための）、遺伝子、染色体などに関連したアンプリコンの集合である。例えば、癌パネルは、特定の癌表現型との関連が確立された特定の遺伝子又は遺伝子の変異を含む。いくつかのアンプリコンパネルは、特定の「癌ホットスポット」、即ち、癌の進行及び治療耐性に相関する既知の変異を含むゲノムの領域に関する。

アンプリコンパネルの作成は、多くの場合、パネルのアンプリコンの配列を得るための下流の次世代シークエンシングに関連する。増幅を使用してゲノムを標的とし、ＮＧＳのための選択された目的の領域（ＲＯＩ）を提供する。この標的の濃縮は、シークエンシング労力をゲノムの特定の領域に集中させる。

本明細書で使用される「ブロッキングオリゴヌクレオチド」（また「ブロッキングプローブ」）は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、又はロックド核酸の１つであり得る一本鎖核酸配列である。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、自然発生でも非自然発生でもよく、一般に、１０〜４０のヌクレオチド、より好ましくは１０〜１２のヌクレオチドを含む。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、相補的標的領域（ＲＯＩ）内の結合相互作用（例えば、溶融温度（Ｔ_ｍ））を変更するように構成されている。

細胞生物学及び分子生物学における一般的な用語の定義は、“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２００６（ＩＳＢＮ ０−９１１９１０−１９−０）；Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）で確認することができる。分子生物学における一般的な用語の定義はまた、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｘ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００９（ＩＳＢＮ−１０：０７６３７６６３２１）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓでも確認することができる。

特段の記載がない限り、本発明は、例えば、参照によりそれらの全内容が全て本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２００１）；ａｎｄ Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９５）に記載されている標準的な方法で行われた。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）方法は、大量並列の高スループット戦略の一般的な特徴を共有する。ＮＧＳ方法は、鋳型の増幅を必要とする方法と必要としない方法とに大きく分けることができる。増幅を必要とする方法としては、４５４技術プラットフォームとしてＲｏｃｈｅによって商品化されたパイロシークエンシング（例えば、ＧＳ ２０及びＧＳ ＦＬＸ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって商品化されたＳｏｌｅｘａプラットフォーム、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商品化されたＳｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームが挙げられる。単一分子シークエンシングとしても知られる非増幅アプローチは、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって商品化されたＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォーム、並びにＶｉｓｉＧｅｎ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによってそれぞれ商品化された新たなプラットフォームによって例証されている。

図１Ａは、アンプリコンベースのＮＧＳ用に変異ＤＮＡを選択するためのＬＮＡを用いるプロセスを図式的に例示する。図１Ｂは、変異ＤＮＡの感度を高めるためにＷＴブロッキングを用いるハイブリッド捕捉ベースのＮＧＳのプロセスを示すブロック図である。

他の実施形態では、本発明による選択的シークエンシングは、ＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（低変性温度での改良された且つ完全な濃縮ＣＯ増幅）を含む技術を用いて達成することができ、このＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチド（ＲＳ−オリゴ）を用いて過剰な野生型ＤＮＡにおける変異ＤＮＡ配列を優先的に濃縮する。ＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、標準定なＳａｎｇｅｒシークエンシング分析での感度を著しく高めることが報告されている。別のアプローチは、ＱＣｌａｍｐ（商標）技術（ＤｉａＣａｒｔａから）であり、この技術は、野生型鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅を抑制し、且つ変異鋳型のみの選択的ＰＣＲ増幅を可能にする配列特異的野生型鋳型異種核酸「Ｃｌａｍｐ」（ＸＮＡ）を利用することによって体細胞変異をスクリーニングするために使用される。これにより、大幅に過剰な野生型鋳型の存在下での変異ＤＮＡの検出が可能となる。

以下の実施例は、特定の変異検出のための本発明の方法の試験を説明する。

実施例１：ＫＲＡＳ変異の検出におけるＮＧＳの感度を高める
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及び１３の変異が大腸癌（ＣＲＣ）の症例の約３０％で見られ、再発及び死亡率のリスクの上昇に関連している。様々な前臨床試験及び臨床試験により、ＣＲＣの変異を活性化するＫＲＡＳの存在がＥＧＦＲモノクローナル抗体（ＥＧＦＲ ｍＡｂ）、例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔａｘ）及びパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）に対する耐性に相関することが明らかにされた。従って、米国食品医薬局（ＦＤＡ）は、コドン１２又は１３にＫＲＡＳ変異を含む腫瘍を有する患者にＥＧＦＲ ｍＡｂを与えないように勧告した。これには、処置前にＫＲＡＳ変異状態を評価する必要があるが、現在、医師は、これらの変異を高感度、高スループット、及び単純な方法で検出することができない。

Ｓａｎｇｅｒシークエンシングは、ＫＲＡＳ変異を検出するためのゴールドスタンダードであるが、極めて非効率であり、比較的低い感度を有する。医療現場での要望の増加に応えて、様々なＫＲＡＳ変異検出アッセイが開発され、文献に記載されており、及び様々な供給者が市販の試験キットを提供している（例えば、Ｃａｖａｌｌｉｎｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．：“ＫＲＡＳ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｋｉｔｓ ｏｎ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ”，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３０：５２５１−５２５６．２０１０；Ｍａｌａｐｅｌｌｅ Ｕ，ｅｔ ａｌ．：“ＫＲＡＳ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ，ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ”，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．６７：１−９．２０１４を参照されたい）。リアルタイムＰＣＲベースの方法は、最もコスト効率が良く、他の方法よりも短い作業時間で済む。

ＮＧＳ技術を用いると、１回の試験の実施で複数の遺伝子における複数の変異を同時にスクリーニングすることが可能である。ＣＲＣホルマリン固定パラフィン包埋標本におけるＫＲＡＳ変異を含む標的癌遺伝子変異のＮＧＳによる検出は、（Ｓａｎｇｅｒシークエンシングと比較して）９６．１％の精度及び（リアルタイムＰＣＲ法と比較して）９９．６％の精度であることが報告されている。残念なことに、ＮＧＳは、低頻度（５％未満）変異の検出ではその感度が限定される。

ＫＲＡＳ変異のＮＧＳの検出の感度を高めるための本発明のアプローチを評価するために、ＤＮＡをＦＦＰＥ若しくはＥＤＴＡ全血／便試料から抽出した。正常な試料及び癌試料を使用する。癌は、形態評価、ＦＩＳＨ試験、フローサイトメトリー、細胞遺伝学的分析、及び免疫組織化学を含む標準的な診断法を用いて確認した。限定されるものではないが、生検組織、骨髄、細針吸引液（ＦＮＡ）、及び末梢血を含む他のＤＮＡの供給源を使用できることに留意されたい。

高感度試験を、特定の変異を有する３０を超えるＤＮＡ試料に対して、及び陰性対照として一切の変異を有していない４つのサンプルに対して行った。

ＤＮＡの抽出：本発明者らは、製造者の取扱説明書に従って手動抽出及び自動抽出（ＱＩＡｃｕｂｅ）の両方において、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてＤＮＡを抽出した。次いで、抽出したＤＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）機器を用いて定量し、約５０〜１００ｎｇ／μＬに水で調製した。

既知の技術を用いて標的シークエンシングを行い、試料から得られたＤＮＡの遺伝子のサブセット又は領域を単離してシークエンシングする。標的シークエンシングパネルは、事前に選択された内容を含むものを購入してもよく、又は製造者の取扱説明書に従って多数の市販の標的シークエンシングライブラリープレップキットの何れかを用いる当技術分野で公知の方法で特注設計してもよい。

アンプリコンベースのＮＧＳの方法：
図１Ｂを参照すると、アンプリコンベースのＮＧＳ １００では、一対のオリゴ（プローブ１、プローブ２）が各アンプリコン用に設計されている。ステップ１２０で、これらのオリゴの非断片化ゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションを９６ウェルプレートで行い、続いてステップ１２２で、伸長及びライゲーションにより、ユニバーサルプライマー配列が隣接した目的の領域からなるＤＮＡ鋳型を形成する。次いで、ステップ１２４で、キットと共に供給されるインデックスプライマーを用いてＤＮＡ鋳型をＰＣＲ増幅し、１つの管にプールした。ステップ１２６で、最終アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ又はＮｅｘｔＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍでシークエンシングする。この配列データを、利用可能なバイオインフォマティクスソフトウェアを用いて分析し、ユーザーインターフェイス１２８によって出力する。

図１Ａは、増幅中にＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが付加される、本発明に従ったアンプリコンベースのＮＧＳ １０２の変更された方法を図式的に例示する。ＬＮＡオリゴは、ＰＣＲのプライマーアニーリングステップ中に鋳型鎖にアニーリングし、伸長中に変異鋳型ＤＮＡから融解するが、ＷＴ ＤＮＡから融解しないように設計されている。ＬＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおける１つのヌクレオチドのミスマッチがその融解温度（Ｔ_ｍ）を大幅に低下させるため、変異鋳型ＤＮＡのみが自由にその伸長を完了する。従って、ＷＴ ＤＮＡは線形に増幅されるが、変異ＤＮＡは指数関数的に増幅される。

本発明者らは、癌における変異を検出するための標準的な遺伝子パネルを用いて、変異部位を覆うＬＮＡプローブを付加することによってＫＲＡＳ変異の検出感度を高める能力を実証する。標的特異的癌パネル（ＴＳＡＣＰ）は、高度に多重化された１回の試験管反応で２１２のアンプリコンを有する４８の癌遺伝子を含む。ＴＳＡ−Ｍｙｅｌｏｉｄパネルは、高度に多重化された１回の試験管反応で５８１のアンプリコンを含む５４の遺伝子を有する。この高度に標的化されたアプローチは、遺伝子変異体を高速且つ効率的に発見、評価、及びスクリーニングするための広範な適用を可能にする。１回の実施で最大９６の試料で、１つの試料当たり数百のアンプリコンを組み合わせる能力により、ＴＳＡＣＰ又はＴＳＡ−Ｍｙｅｌｏｉｄパネルは、前例のないレベルの試料の多重化を提供すると共に、優れた特異性及び均一性を提供する。ＴＳＣＡＰ遺伝子の一覧を示す表１及びＴＳＡ−Ｍｙｅｌｏｉｄ遺伝子の一覧を示す表２を参照されたい。

当業者に容易に明らかになるように、より大きい又はより小さい遺伝子パネルを使用することができる。

ハイブリッド捕捉ＮＧＳの方法
本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｔｕｄｉｏで設計された特注パネルを使用した。本発明者らは、投入鋳型として３１５の癌関連遺伝子を使用した。遺伝子の一覧は、図７のように提供される。

エキソンを使用するＴＥＲＣ遺伝子以外の残りの全ての遺伝子は、ＣＤＳのみを使用している。プローブの選択では「Ｄｅｎｓｅ」を選択する。設計の概要は次の通りである：
累積標的サイズ：９０７，３９５ｂｐ
最終プローブ：１０３６７；
ギャップ：０；
カバレッジ：１００％
このアッセイは、標準的なＮＧＳ Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔワークフローを使用した。ＤＮＡを、Ｑｉａｃｕｂｅ機器を用いてＥＤＴＡ ＷＢ、ＢＭ、又はＦＦＰＥから抽出し、Ｑｕｂｉｔ ＤＮＡ ＢＲアッセイキットを用いて定量した。次世代の濃縮ベースの試料調製により、５０ｎｇの投入ゲノムＤＮＡからアダプター−タグライブラリーを作成する。次世代のＤＮＡのタグメンテ―ション（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、機械的せん断を必要とすることなくＤＮＡを同時に断片化及びタグ付けする。統合された試料のバーコードにより、最大１２のアダプター結合試料のライブラリーの１つのハイブリダイゼーションベースのプルダウン反応（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）にプールすることができる。次いで、プールされたライブラリーを一本鎖ＤＮＡに変性し、標的領域に相補的なビオチン標識プローブを高速捕捉ハイブリダイゼーションに使用する。ストレプトアビジンビーズを加え、このストレプトアビジンビーズが、目的の標的領域にハイブリダイズするビオチン化プローブに結合する。ストレプトアビジンビーズの磁気プルダウンにより、ビオチン化プローブにハイブリダイズする標的領域を濃縮する。次いで、濃縮ＤＮＡ断片をビーズから溶出させ、２回目の高速捕捉が完了し、濃縮特異性が高まる。

ＭｉＳｅｑでシークエンシングされたＮＤＳＴの特注プールを、ＭｉＳｅｑレポーター（ＭＳＲ）を用いて分析する。ＭＳＲからの濃縮ワークフローにより、ＢＷＡアルゴリズムを用いてｂａｍファイル形式で整合配列の読み（ａｌｉｇｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ）を作成し、ＧＡＴＫ ｉｎｄｅｌ再整列ツールを用いてｉｎｄｅｌ再整列を行う。変異体呼び出しが、管理ファイルで指定された標的領域で行われる。ＧＡＴＫ変異体呼び出し元が、指定された標的領域の全ての部位にわたる遺伝子型、アノテーション、及び他の情報を含むｖｃｆファイルを作成する。

ゲノム及びギャップ内でのカバレッジ深度を含むカバレッジファイルも作成する。濃縮の要約の統計データは、標的内及び標的外の読み／塩基、標的領域における平均カバレッジ、１倍、１０倍、２０倍、及び５０倍のカバレッジで存在する読み率（％）、カバレッジの均一性を含み、これらは全て各試料濃縮シークエンシングレポートに列記されている。

高感度ＮＧＳ試験：
上記の標準的なＮＧＳ法を高感度（ＨＳ）アッセイに変更するために、本発明者らは、野生型ＤＮＡに対応するＬＮＡ又はＢＮＡ（ブロック核酸）を加えて増幅を防止して、変異ＤＮＡを選択的にシークエンシングする。原則として、これは、野生型の増幅を防止するあらゆる核酸を用いて行うことができ、これは、アンプリコンベースのＮＧＳでは必要なステップであり、その必要性の程度は低いがハイブリッド捕捉ＮＧＳでも必要である。オリゴＬＮＡは、通常、目的の変異が位置するホットスポットに対応する野生型ＤＮＡと同一の配列を有する約１０量体〜１２量体で見られる。複数の遺伝子座をカバーする野生型と同一の複数のオリゴヌクレオチドを同時に使用することができる。本発明者らは、投入ＤＮＡの量によって１試料当たり４μＭ〜４０ｎＭを使用する。ＬＮＡオリゴは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長及び３’エキソヌクレアーゼによる変性の両方を阻害するために３’ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴを特徴付けるように設計されている。ＢＮＡオリゴは、同じ理由から３’リン酸を有するように設計されている。全ての方法において、ＬＮＡ又はＢＮＡは、アンプリコンベースのＮＧＳでは、図１Ａに示されているように増幅ステップの前に試料に加えられる。

ＫＲＡＳ変異の検出では、本発明者らは、コドン１２にわたるプローブ（ＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡ）を、増幅前にこのアッセイに使用される試薬に加えた。図２Ａは、ＬＮＡブロッキングを用いて検出されたＫＲＡＳ変異を目視確認するＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの代表的な画像であり、９８％の変異率を実証し、これは、図２Ｂに示されている６％の変異率と比較することができる。図３に示されている表は、ＬＮＡを用いて得られた結果とＬＮＡを用いずに得られた結果との比較を提供し、変異ＤＮＡのパーセンテージにおける有意差（１６倍の濃縮）を実証している。

実施例２：ＥＧＦＲ変異の検出におけるＮＧＳの感度を高める
癌における変異を検出するための上記のような同様の遺伝子パネルを使用して、本発明者らは、変異部位をカバーするＬＮＡプローブを加えることによってＥＧＦＲ Ｔ７９０変異を検出する感度を高めることができることを実証する。この場合、本発明者らは、増幅時、Ｔ７９０コドンをカバーするプローブ（ＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣ）をこのアッセイに使用される試薬に加えた。図４の表は、ＬＮＡを用いて得られた結果とＬＮＡを用いずに得られた結果との比較を提供し、同様に、変異ＤＮＡのパーセンテージにおける有意差を示す。ＬＮＡを用いないと、Ｔ７９０での変異率は１９％であり、確定的ではない結果が生じる、即ち「非選択」である。増幅前に上記のようにＬＮＡオリゴを加えた後、変異率、従って感度が図５に示されているように９４％への５倍の上昇を示し、大幅に向上した、即ち「選択」であった。

実施例３：ＥＧＦＲ変異の検出におけるＮＧＳの感度を高める
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、最も頻度の高いヒトの悪性腫瘍の１つであり、全肺癌の約８０％を占める。ＮＳＣＬＣは、それらが有する活性化変異（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）に基づいて遺伝子サブセットに分けることができ、これらのサブセットのそれぞれは、特定の阻害剤での治療による恩恵を受ける可能性が高い患者コホートに対応し得る。

チロシンキナーゼドメインをコードするエキソン内のホットスポットに影響を与える、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）における活性化変異は、ＮＳＣＬＣ患者の１０〜４０％で確認することができ、殆どが腺癌である。変異患者の約５０％がエキソン１９にインフレーム欠失（コドン７４６〜７５０付近）を有し、３５〜４５％がエキソン２１におけるアルギニンによるロイシン８５８の置換を示す。残りの変異は、エキソン２０における挿入（５％）、及びエキソン１８〜２１にわたる珍しい置換、例えば、Ｌ８６１Ｑである。これらの特定の変異は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）エルロチニブ及びゲフィチニブに対する高い感度に関連し、エキソン２０におけるＥＧＦＲ Ｔ７９０ Ｍ変異が、エルロチニブ及びゲフィチニブ耐性を獲得した症例の５０％で観察され、新規薬剤耐性を有する患者の３８％でも検出された。

本発明者らはまた、既に検査されて、既知のＥＧＦＲ変異を有する肺癌に対して陽性である患者からの追加の９つの無作為試料を、ＬＮＡブロッキングアプローチを用いて分析した。エキソン１８、１９、２０、又は２１におけるＥＧＦＲ変異の試験の結果が図６に示されている。９人の患者のうちの１人（症例番号ＭＯＬ１５−００１５７２）は、低いパーセンテージであるが、ＮＧＳによって既に決定されたようにＴ７９０変異を有するとして既に印が付けられている。予想通り、Ｔ７９０変異を有するこの１人の患者は、ＬＮＡブロッキングを利用した後に同じ変異を示したが、著しく高いパーセンテージであった。加えて、９人の患者のうちのもう１人（症例番号ＭＯＬ１５−００１８７７）は、本発明の技術のＬＮＡブロッキングによって提供される高い感度を用いないと以前は検出されなかったＴ７９０の変異を示した。

既に公開されたデータは、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングが変異の分析に使用されたときに、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングの増幅中の野生型ＤＮＡブロッキングがＳａｎｇｅｒシークエンシングの感度を高めることができ、比較的低いレベルの変異の検出が可能となることを示唆した。これは、ＢＲＡＦ Ｖ６００変異、ＫＲＡＳ変異、ＰＩＫ３ＣＡ変異、及びＥＧＦＲ Ｌ８５８変異（以下に記載される参照文献１〜５）で報告された。これらの技術は、一般に、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の代替として見なされる。ＮＧＳで使用されるアプローチと、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングで使用される異なるアプローチ、即ち、ＮＧＳでのＤＮＡ断片の単離及び個々のシークエンシングと、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングでの全ての分子の同時シークエンシングとにより、ＮＧＳでブロッキングプローブを利用するという動機が先行技術では存在しない。

本発明者は、上記の実験が、ＮＧＳシークエンシングのための変異の濃縮に初めてＬＮＡが使用されたことを示すと考えている。本発明のアプローチは、ＮＧＳの感度の著しい改善を実証している。これは、本明細書ではＫＲＡＳ変異及びＥＧＦＲ Ｔ７９０変異に適用されるが、同じアプローチを他のタイプの変異、及びＮＧＳで一緒に試験される複数の遺伝子における複数の変異にも使用することができる。加えて、本明細書に記載の実施例は、野生型ＤＮＡの増幅のブロッキングの機構としてＬＮＡプローブを利用しているが、ＢＮＡ、ＱＣｌａｍｐを含む他のブロッキング材料を使用することができ、及びＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲを使用することができる。

参照文献（参照により本明細書に組み入れられる）：
１．Ｋｏｍａｔｓｕ Ｈ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｔ，Ｉｎｕｉ Ａ，Ｓｏｇｏ Ｔ，Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｔ，Ｉｍｕｒａ Ｍ，Ｔａｔｅｎｏ Ａ．，“Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｕｓｅ ｏｆ ｓａｌｉｖａ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＤＮＡ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｕｓｉｎｇ ＬＮＡ ｐｒｏｂｅ−ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ”，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１３ Ｄｅｃ；１９（６）：１０８７−９２．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０１５６−０１３−０６３０−９．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊｕｎ １７．
２．Ａｎｇ Ｄ，Ｏ’Ｇａｒａ Ｒ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ａ，Ｂｅａｄｌｉｎｇ Ｃ，Ｗａｒｒｉｃｋ Ａ，Ｔｒｏｘｅｌｌ ＭＬ，Ｃｏｒｌｅｓｓ ＣＬ．，“Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−−ＰＣＲ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”，Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２０１３ Ｍａｙ；１５（３）：３１２−８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｏｌｄｘ．２０１２．１２．００５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｍａｒ ２７．
３．Ｄｏｎｏ Ｍ，Ｍａｓｓｕｃｃｏ Ｃ，Ｃｈｉａｒａ Ｓ，Ｓｏｎａｇｌｉｏ Ｃ，Ｍｏｒａ Ｍ，Ｔｒｕｉｎｉ Ａ，Ｃｅｒｒｕｔｉ Ｇ，Ｚｏｐｐｏｌｉ Ｇ，Ｂａｌｌｅｓｔｒｅｒｏ Ａ，Ｔｒｕｉｎｉ Ｍ，Ｆｅｒｒａｒｉｎｉ Ｍ，Ｚｕｐｏ Ｓ．，“Ｌｏｗ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ”，Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｆｅｂ ８；１８：１５１９−２６．ｄｏｉ：１０．２１１９／ｍｏｌｍｅｄ．２０１２．００１７５．
４．Ｓｋｒｏｎｓｋｉ Ｍ，Ｃｈｏｒｏｓｔｏｗｓｋａ−Ｗｙｎｉｍｋｏ Ｊ，Ｓｚｃｚｅｐｕｌｓｋａ Ｅ，Ｓｚｐｅｃｈｃｉｎｓｋｉ Ａ，Ｒｕｄｚｉｎｓｋｉ Ｐ，Ｏｒｌｏｗｓｋｉ Ｔ，Ｌａｎｇｆｏｒｔ Ｒ．，“Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＥＧＦＲ ｇｅｎｅ ｃｏｄｏｎ Ｌ８５８ ｂｙ ＰＮＡ−ＬＮＡ ＰＣＲ ｃｌａｍｐ ｉｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ”，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２０１３；７５６：３２１−３１．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−９４−００７−４５４９−０＿３９．
５．Ｍｏｒａｎｄｉ Ｌ，ｄｅ Ｂｉａｓｅ Ｄ，Ｖｉｓａｎｉ Ｍ，Ｃｅｓａｒｉ Ｖ，Ｄｅ Ｍａｇｌｉｏ Ｇ，Ｐｉｚｚｏｌｉｔｔｏ Ｓ，Ｐｅｓｓｉｏｎ Ａ，Ｔａｌｌｉｎｉ Ｇ．，“Ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＡＳＬＮＡｑＰＣＲ）：ａｎ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙ ＫＲＡＳ ａｎｄ ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（４）：ｅ３６０８４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３６０８４．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ａｐｒ ３０．

Claims (18)

1. 患者からの試料における低頻度変異を検出する方法において、
   前記試料からＤＮＡを単離するステップ；
   ブロッキングプローブを前記単離ＤＮＡに加えるステップであって、前記ブロッキングプローブが、前記試料に対応する野生型ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、前記ブロッキングプローブが、前記単離ＤＮＡの目的の領域内の疑いのある変異の部位にわたるように適合されている、ステップ；
   前記単離ＤＮＡを増幅するステップ；
   前記増幅ＤＮＡの断片を、次世代シークエンシングを用いてシークエンシングするステップ；及び
   前記シークエンシングされた断片に対応する出力を作成するステップ
   を含むことを特徴とする、方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記ブロッキングプローブがロックド核酸（ＬＮＡ）であることを特徴とする、方法。
3. 請求項１に記載の方法において、前記ブロッキングプローブが、ブロック核酸（ＢＮＡ）、ＱＣｌａｍｐ、及びＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲから選択されることを特徴とする、方法。
4. 請求項３に記載の方法において、前記ブロッキングプローブが１０量体〜１２量体であることを特徴とする、方法。
5. 請求項１に記載の方法において、前記目的の領域がＫＲＡＳエキソン１２であり、及び前記ブロッキングプローブがＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡであることを特徴とする、方法。
6. 請求項１に記載の方法において、前記目的の領域がＥＧＦＲコドンＴ７９０であり、及び前記ブロッキングプローブがＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣであることを特徴とする、方法。
7. 請求項１に記載の方法において、ブロッキングプローブを加えるステップの前に、前記単離ＤＮＡを、１つ以上の目的の領域を含む断片に断片化するステップを更に含むことを特徴とする、方法。
8. 請求項１に記載の方法において、前記単離ＤＮＡを増幅するステップの前に、前記単離ＤＮＡを１つ以上の濃縮プローブにハイブリダイズさせて前記ＤＮＡをタグ付け及び断片化するステップを更に含むことを特徴とする、方法。
9. 請求項１に記載の方法において、前記試料が、全血、便、生検組織、骨髄、細針吸引液（ＦＮＡ）、及び末梢血からなる群から選択されることを特徴とする、方法。
10. 単離ＤＮＡにおける低頻度変異を検出するための方法において、
    ブロッキングプローブを前記単離ＤＮＡの増幅中に試薬に加えるステップであって、前記ブロッキングプローブが、前記試料に対応する野生型ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、前記ブロッキングプローブが、前記単離ＤＮＡの目的の領域内の疑いのある変異の部位にわたるように適合されている、ステップ；
    前記増幅ＤＮＡの断片を、次世代シークエンシングを用いてシークエンシングするステップ；及び
    前記シークエンシングされた断片に対応する出力を作成するステップ
    を含むことを特徴とする、方法。
11. 請求項１０に記載の方法において、前記ブロッキングプローブがロックド核酸（ＬＮＡ）であることを特徴とする、方法。
12. 請求項１０に記載の方法において、前記ブロッキングプローブが、ブロック核酸（ＢＮＡ）、ＱＣｌａｍｐ、及びＩＣＥ ＣＯＬＤ−ＰＣＲから選択されることを特徴とする、方法。
13. 請求項１２に記載の方法において、前記ブロッキングプローブが１０量体〜１２量体であることを特徴とする、方法。
14. 請求項１０に記載の方法において、前記目的の領域がＫＲＡＳエキソン１２であり、及び前記ブロッキングプローブがＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡであることを特徴とする、方法。
15. 請求項１０に記載の方法において、前記目的の領域がＥＧＦＲコドンＴ７９０であり、及び前記ブロッキングプローブがＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣであることを特徴とする、方法。
16. 請求項１０に記載の方法において、ブロッキングプローブを加えるステップの前に、前記単離ＤＮＡを、１つ以上の目的の領域を含む断片に断片化するステップを更に含むことを特徴とする、方法。
17. 請求項１に記載の方法において、前記単離ＤＮＡを増幅するステップの前に、前記単離ＤＮＡを１つ以上の濃縮プローブにハイブリダイズさせて前記ＤＮＡをタグ付け及び断片化するステップを更に含むことを特徴とする、方法。
18. 請求項１０に記載の方法において、前記試料が、全血、便、生検組織、骨髄、細針吸引液（ＦＮＡ）、及び末梢血からなる群から選択されることを特徴とする、方法。

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