ES2665500T3 - Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia - Google Patents

Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia Download PDF

Info

Publication number
ES2665500T3
ES2665500T3 ES11709836.8T ES11709836T ES2665500T3 ES 2665500 T3 ES2665500 T3 ES 2665500T3 ES 11709836 T ES11709836 T ES 11709836T ES 2665500 T3 ES2665500 T3 ES 2665500T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequence
target
reaction mixture
temperature
chains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11709836.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Gerassimos Makrigiorgos
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dana Farber Cancer Institute Inc
Original Assignee
Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dana Farber Cancer Institute Inc filed Critical Dana Farber Cancer Institute Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2665500T3 publication Critical patent/ES2665500T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Un método para enriquecer una secuencia de ácido nucleico diana en una mezcla de reacción de amplificación, comprendiendo dicho método: a. proporcionar un par de cebadores capaz de reasociarse a una secuencia de referencia y también a una o más secuencias diana que son al menos 50% homólogas a dicha secuencia de referencia; b. preparar una mezcla de reacción de amplificación que incluye al menos los siguientes constituyentes: una muestra de ácido nucleico que tiene la secuencia de referencia y de la que se sospecha que tiene la una o más secuencias diana que son al menos 50% homólogas a dicha secuencia de referencia y que también son amplificables por el par de cebadores, y una cantidad en exceso de la secuencia de bloqueo de referencia con relación a la cantidad de secuencias de referencia, siendo la secuencia de bloqueo de referencia totalmente complementaria con al menos una parte de la secuencia de una de las cadenas de la secuencia de referencia entre sus sitios de cebador; c. aumentar la temperatura de la mezcla de reacción de la que se sospecha que tiene dicha secuencia diana hasta una primera temperatura de desnaturalización que está por encima de la temperatura de fusión (Tm) de la secuencia de referencia y por encima de la temperatura de fusión (Tm) de la secuencia diana, con el fin de formar las cadenas de referencia desnaturalizadas y las cadenas diana desnaturalizadas; d. reducir la temperatura de la mezcla de reacción con el fin de permitir la formación de dúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y la cadena de referencia complementaria y heterodúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y las cadenas dianas; e. aumentar la temperatura de dicha mezcla de reacción hasta una temperatura crítica (Tc) suficiente para permitir la desnaturalización preferente de dichos heterodúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y cadenas dianas en preferencia a la desnaturalización de los dúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y las cadenas de referencia; f. reducir la temperatura de la mezcla de reacción con el fin de permitir que dicho par de cebadores se reasocie a las cadenas dianas de cadena sencilla y a cualquier cadena de referencia de cadena sencilla en la mezcla de reacción; y g. extender dicho par de cebadores con el fin de enriquecer dicha secuencia diana con relación a dicha secuencia de referencia; h. repetir las etapas c hasta g durante dos o más ciclos con el fin de enriquecer dicha secuencia diana con relación a dicha secuencia de referencia.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ADN específica en un factor de 109 con respecto a otras secuencias en el ADN genómico. El método de la PCR también se describe en Saiki et al., 1985, Science 230:1350.
La PCR se realiza utilizando ADN del molde (secuencias diana y de referencia) (al menos 1 fg, más útilmente, 11000 ng) y al menos 25 pmol de cebadores oligonucleotídicos. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 μl de ADN, 25 pmol de cebador oligonucleotídico, 2,5 μl de un tampón adecuado, 0,4 μl de dNTP 1,25 μM, 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Stratagene) y agua desionizada hasta un volumen total de 25 μl. La PCR se realiza utilizando un ciclador térmico programable.
La longitud y la temperatura de cada una de las etapas de un ciclo de PCR, así como el número de ciclos, se ajustan de acuerdo con los requisitos de rigurosidad vigentes. La temperatura y el tiempo de reasociación están determinados tanto por la eficacia con la que se espera que un cebador se reasocie a un molde como por el grado de emparejamiento erróneo que debe tolerarse. La capacidad de optimizar la rigurosidad de las condiciones de reasociación del cebador está dentro del conocimiento de un experto en la técnica. Se utiliza una temperatura de reasociación de entre 30°C y 72°C. La desnaturalización inicial de las moléculas del molde normalmente se produce a entre 92°C y 99°C durante 4 minutos, seguida de 20-40 ciclos que consisten en la desnaturalización (94-99°C durante 15 segundos a 1 minuto), reasociación (temperatura determinada tal como se describe arriba, 1-2 minutos) y extensión (72°C durante 1 minuto). La etapa de extensión final se lleva a cabo generalmente durante 4 minutos a 72ºC, y puede ser seguida de una etapa indefinida (0-24 horas) a 4ºC.
La PCR utiliza una polimerasa de ácido nucleico, o enzima que cataliza la polimerización de nucleósido trifosfatos. Generalmente, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador reasociado con la secuencia diana, y procederá en la dirección 5' a lo largo del molde. ADN polimerasas conocidas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E.coli, ADN polimerasa de T7, ADN polimerasa de Thermus thermophilu (Tth), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus, ADN polimerasa de Thermococcus litoralis, ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) y ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus(Pfu). La expresión "ácido nucleico polimerasa" también abarca ARN polimerasas. Si el molde de ácido nucleico es ARN, entonces "ácido nucleico polimerasa" se refiere a una actividad de polimerización dependiente de ARN, tal como una transcriptasa inversa.
Los procedimientos de enriquecimiento de la presente invención se realizan en un dispositivo de PCR tal como un termociclador, o más preferiblemente en condiciones de reacción en tiempo real en un dispositivo de PCR en tiempo real. Las condiciones de reacción en tiempo real utilizan, además un agente de detección de ácidos nucleicos (p. ej., colorante o sonda) con el fin de medir/detectar el producto de PCR a medida que se produce.
Muestras
Tal como se utiliza en esta memoria, "muestra" se refiere a cualquier sustancia que contenga o se presume que contenga un ácido nucleico de interés (secuencias diana y de referencia) o que es en sí mismo un ácido nucleico que contiene o se supone que contiene un ácido nucleico diana de interés. El término "muestra" incluye, por lo tanto, una muestra de ácido nucleico (ADN genómico, ADNc, ARN), célula, organismo, tejido, fluido o sustancia que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, fluido sinovial, orina, lágrimas, heces, secreciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, saliva, células de la sangre, tumores, órganos, tejido, muestras de constituyentes del cultivo celular in vitro, aislados naturales (tales como agua potable, agua de mar, materiales sólidos), muestras microbianas y objetos o especímenes que han sido "marcados" con moléculas trazadoras de ácidos nucleicos.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se pueden amplificar a partir de ADN genómico. El ADN genómico se puede aislar a partir de tejidos o células de acuerdo con el siguiente método. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se pueden aislar de la sangre mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Para facilitar la detección de una forma variante de un gen de un tejido particular, el tejido se aísla. Para aislar ADN genómico del tejido de mamíferos, el tejido se tritura y se congela en nitrógeno líquido. El tejido congelado se moltura para obtener un polvo fino con un mortero pre-enfriado rápidamente y se suspende en tampón de digestión (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 25 mM, pH 8,0, SDS al 0,5% (p/v), 0,1 mg/ml de proteinasa K) a 1,2 ml de tampón de digestión por cada 100 mg de tejido. Para aislar ADN genómico de células de cultivo de tejidos de mamíferos, las células se sedimentan por centrifugación durante 5 min a 500 x g, se resuspenden en 1-10 ml de PBS helado, se repelen durante 5 min a 500 x g y se resuspenden en 1 volumen de tampón de digestión.
Las muestras en tampón de digestión se incuban (con agitación) durante 12-18 horas a 50°C, y luego se extraen con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Si las fases no se resuelven después de una etapa de centrifugación (10 min a 1700 x g), se agrega otro volumen de tampón de digestión (sin proteinasa K) y se repite la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
etapa de centrifugación. Si un material blanco espeso es evidente en la interfaz de las dos fases, se repite la etapa de extracción orgánica. Después de la extracción, la capa acuosa superior se transfiere a un nuevo tubo al que se agregará 1/2 volumen de acetato de amonio 7,5 M y 2 volúmenes de etanol al 100%. El ácido nucleico se sedimenta por centrifugación durante 2 min a 1700 x g, se lava con etanol al 70%, se seca al aire y se resuspende en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0) a 1 mg/ml. El ARN residual se separa incubando la muestra durante 1 hora a 37°C en presencia de SDS al 0.1% y 1 μg/ml de ARNasa exenta de DNasa, y repitiendo las etapas de extracción y de precipitación con etanol. Se espera que el rendimiento de ADN genómico, de acuerdo con este método, sea de aproximadamente 2 mg de ADN/1 g de células o tejido (Ausubel et al., supra). El ADN genómico aislado de acuerdo con este método se puede utilizar de acuerdo con la invención.
El ADN diana también se puede extraer de sangre entera. Por ejemplo, se puede extraer sangre por métodos estándares en un tubo de recogida, que comprende preferentemente vidrio siliconado, sin anticoagulante para la preparación de suero o con EDTA, citrato de sodio, heparina o anticoagulantes similares, lo más preferentemente EDTA, para la preparación de plasma. El método preferido, aunque no es absolutamente necesario, es que el plasma o el suero se fraccionen a partir de sangre entera. El plasma o el suero se pueden fraccionar a partir de sangre entera mediante centrifugación, preferiblemente centrifugación suave a 300 hasta 800 x g durante 5-10 minutos, o se pueden fraccionar por otros métodos estándares. Dado que la heparina puede interferir con la PCR, el uso de sangre heparinizada puede requerir un pre-tratamiento con heparinasa. Por lo tanto, EDTA es el anticoagulante preferido para muestras de sangre. Plasma o suero sanguíneo recién recogido, o plasma congelado (almacenado) y posteriormente descongelado o suero puede utilizarse en los métodos de la invención. El plasma o suero almacenado debe mantenerse a -20°C hasta -70°C, y el plasma o suero recién recogidos se mantienen refrigerados o se mantienen en hielo hasta su uso. El ADN puede luego extraerse por métodos bien conocidos en la técnica.
El método de la presente invención se puede utilizar para detectar si se ha producido metilación en una secuencia diana. El método de detección de la metilación comprende un enfoque químico o enzimático para el tratamiento del ADN sensible a la metilación. Los tratamientos químicos incluyen la incubación de ADN con bisulfito de sodio, que convierte selectivamente las citosinas no metiladas en uracilos. El ADN se desnaturaliza primero por calor y luego se trata con bisulfito 5M, pH 5-7. El pre-tratamiento del ADN genómico para separar los uracilos pre-existentes se utiliza antes del tratamiento con bisulfito. Este pre-tratamiento consiste en el tratamiento con uracilo glicosilasa en presencia de hidroxilamina 5 mM, pH 7.
Debido a que las citosinas metiladas de la secuencia diana se convierten en uracilos, formarán ahora emparejamientos erróneos cuando forman un dúplex con la secuencia de bloqueo de referencia en la etapa de enfriamiento de la hibridación de la PCR por COLD completa (en presencia de secuencia de bloqueo de referencia).
PCR por COLD completa en Ausencia de Secuencia de Bloqueo de Referencia (Técnica Anterior)
La Fig. 1 ilustra el procedimiento de la técnica anterior, conocido como PCR por COLD completa, para enriquecer una secuencia diana en una muestra de ácido nucleico que contiene una secuencia diana y de referencia tal como se explica en la Solicitud de EE.UU. Nº de serie 12/671.295, titulada "Enrichment of a target Sequence” arriba incorporada. La Fig. 1 es una reproducción de la Fig. 1 en la solicitud de patente arriba incorporada.
Las secuencias diana y de referencia se pueden obtener a partir de una diversidad de fuentes que incluyen ADN genómico, ADNc, ADN vírico, ADN de mamífero, ADN fetal o ADN bacteriano. Mientras que la secuencia de referencia es generalmente el alelo de tipo salvaje y la secuencia diana es el alelo mutante, lo inverso también puede ser cierto. El alelo mutante puede incluir una o más deleciones, inserciones o alteraciones de nucleótidos. En algunas realizaciones, el alelo mutante es una mutación somática. En otras realizaciones, la secuencia diana es ADN metilado, mientras que la secuencia de referencia es ADN no metilado.
El método incluye someter la mezcla de reacción de amplificación a una primera temperatura de desnaturalización (Fig. 1A, Etapa 1) que está por encima de la temperatura de fusión "Tm" de una secuencia de referencia. La Tm de un ácido nucleico puede determinarse mediante experimentación o estimarse mediante cálculo. El experto en la materia conoce muy bien numerosos métodos bien conocidos para determinar la Tm de un ácido nucleico, algunos de los cuales se describen en esta memoria. La primera temperatura de desnaturalización se selecciona generalmente, ya que generalmente se seleccionaría la temperatura de desnaturalización de una reacción de PCR y debería ser lo suficientemente alta como para permitir la desnaturalización completa de las secuencias diana y de referencia (p. ej., 94°C). En una realización, la primera temperatura de desnaturalización es de aproximadamente 1°C a 30°C por encima de la Tm de la secuencia de referencia, más preferiblemente la Tm de la secuencia de referencia es de aproximadamente 5°C a 20°C por encima de la Tm de la secuencia de referencia.
imagen7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
70°C. Además de los heterodúplex 16 de la secuencia de bloqueo de referencia 14 y la cadena complementaria de referencia 10A y los heterodúplex 18 de la secuencia de bloqueo de referencia 14 y la cadena diana complementaria 12A, la mezcla de reacción contiene también las cadenas negativas desnaturalizadas 10B y 12B de las secuencias de referencia y diana, respectivamente.
En la etapa 3 de la Fig. 2, La mezcla de reacción se somete luego a la temperatura crítica "Tc", p. ej., 84,5°C, que se elige para permitir la desnaturalización preferencial de los heterodúplex 18 de la cadena diana 12A y la secuencia de bloqueo de referencia 14. La temperatura crítica (Tc) se selecciona de manera que los dúplex 16 de las cadenas de bloqueo de referencia 14 y las cadenas de referencia complementarias 10A permanezcan sustancialmente sin desnaturalizar cuando la mezcla de reacción se incuba a "Tc". La temperatura de fusión para el dúplex 18 de la secuencia de bloqueo de referencia 14 y la cadena diana 10B siempre será menor que la temperatura de fusión del dúplex 16 de la secuencia de bloqueo de referencia 14 y la cadena de referencia complementaria 10A porque la secuencia de bloqueo de referencia 14 es totalmente complementaria con al menos una parte de la cadena de referencia 10A, y habrá al menos un emparejamiento erróneo con la cadena diana 12A.
Con referencia a la etapa 4 de la Fig. 2, después de la desnaturalización preferencial, la temperatura de la mezcla de reacción se reduce, p. ej., a 60ºC, para permitir que el par de cebadores 20A, 20B se reasocie con las cadenas diana libres 12A, 12B y la cadena de referencia libre 10B en la mezcla de reacción. El número de referencia 20A se refiere al cebador directo y el número de referencia 20B se refiere al cebador inverso. Tal como se describió previamente, la secuencia diana 12 es amplificable a través del mismo par de cebadores 20A, 20B que los utilizados para la secuencia de referencia 10. La etapa 5 de la Fig. 2 ilustra dos cadenas libres 12A, 12B de la secuencia diana en comparación con la etapa de desnaturalización inicial y sólo una cadena de referencia libre 10B. La otra cadena de referencia 10A se hibrida con la secuencia de bloqueo de referencia 14 y, por lo tanto, no está disponible para la amplificación. La temperatura de la mezcla de reacción se eleva luego, p. ej., a 72ºC, para extender los cebadores reasociados 20A, 20B, enriqueciendo así la concentración de la secuencia diana 12 en la mezcla de reacción con respecto a la secuencia de referencia 10. Es probable que el método se repita cinco a treinta ciclos.
El método ilustrado en la Fig. 2 puede y debería ser optimizado para protocolos individuales. Dichos protocolos pueden incorporarse en el software, si se desea, para hacer funcionar diversos equipos de PCR y de PCR en tiempo real.
Consideraciones de Diseño para la Secuencia de Bloqueo de Referencia Preferida
Tal como se mencionó, la secuencia de bloqueo de referencia puede adoptar muchas formas, aunque la forma preferida es ADN de cadena sencilla no extensible. Más específicamente, la secuencia de bloqueo de referencia preferida tiene las siguientes características:
(a)
comprende ADN de cadena sencilla de hasta 200 pb de longitud;
(b)
tiene una longitud que es varias bases más pequeña que la secuencia diana (p. ej., 8-12 bases en cada uno de los lados de la secuencia), de modo que los cebadores no se unen de manera apreciable a la secuencia de referencia cuando se reasocian a la secuencia de bloqueo de referencia; y tampoco se unen de manera apreciable a la secuencia de bloqueo de referencia propiamente dicha; y
(c)
contiene un extremo 3' que está bloqueado para la extensión de ADN-polimerasa.
Una secuencia de bloqueo de referencia de este tipo se puede sintetizar en uno de los diversos métodos. En primer lugar, la secuencia de bloqueo de referencia puede prepararse por síntesis directa utilizando métodos de síntesis de oligonucleótidos convencionales que permiten la modificación del extremo 3' de la secuencia. El extremo 3' puede contener un grupo fosfato, un grupo amino, un di-desoxi-nucleótido o cualquier otro resto que bloquee la extensión de la polimerasa 5' a 3'. Alternativamente, la secuencia de bloqueo de referencia puede prepararse mediante síntesis de polimerasa durante una reacción de PCR que genera ADN de cadena sencilla como el producto final. En este caso, el ADN de cadena sencilla generado corresponde a la secuencia exacta necesaria para la secuencia de bloqueo de referencia. Los métodos para sintetizar ADN de cadena sencilla a través de la síntesis de polimerasa son varios y bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, sería adecuada PCR asimétrica o PCR LATE. Alternativamente, se puede sintetizar una secuencia de bloqueo de referencia de ADN de cadena sencilla uniendo un producto de PCR de doble cadena sobre un soporte sólido. Esto se logra realizando una reacción de PCR estándar, utilizando un par de cebadores, uno de los cuales está biotinilado. Después de la PCR, el producto de la PCR se incuba con un soporte sólido recubierto con estreptavidina (p. ej., perlas magnéticas) y se deja que se una a las perlas. Posteriormente, la temperatura se eleva a 95°C durante 2-3 minutos para desnaturalizar el ADN y liberar a la solución la cadena de ADN no biotinilada del producto de la PCR inmovilizado. Las perlas magnéticas con la
imagen8
TABLA 1
Oligo
Secuencia (5 'a 3') Fuente
Secuencia de bloqueo de referencia 1 (RBS60)
Ex8-167F
GCTTCTCTTTTCCTATCCTG (SEQ ID NO: 1) Li et (2008) al.
Ex8-167R
CTTACCTCGCTTAGTGCT (SEQ ID NO: 2) Li et (2008) al.
87d
TGGTAATCTACTGGGACG (SEQ ID NO: 3) Li et (2008) al.
87i
CGGAGATTCTCTTCCTCT (SEQ ID NO: 4) Li et (2008) al.
30T-p53-87F
60refseq-dir
GGACGGAACAGCTTT (SEQ ID NO: 6)
60refseq-inv
CTGGCCGCGTGTCTC (SEQ ID NO: 7)
RBS60
Secuencia de Bloqueo de Referencia 2 (RBS90)
Ex8-167F
GCTTCTCTTTTCCTATCCTG (SEQ ID NO: 9) Li et (2008) al.
Ex8-167R
CTTACCTCGCTTAGTGCT (SEQ ID NO: 10) Li et (2008) al.
p53-ex8-115F
TTGCTTCTCTTTTCCTAT (SEQ ID NO: 11)
p53-ex8-115R
RBS90
imagen9
Resultados: Resultados representativos se representan en las Figs. 4 a 7 para la RBS60 y la Fig. 8 para RBS90. En las Figs. 4 a 7 se compara la PCR por COLD completa, modificada (en presencia de RBS60) con la PCR por COLD 5 completa (sin RBS60), la PCR por COLD rápida y la PCR convencional.
La Fig. 4 ilustra que el enriquecimiento a través de PCR por COLD completa modificada (RBS 25nM) es robusta (un incremento de 3% a 37%) para una circunstancia en la que la mutación aumenta la temperatura de fusión. La mutación no es detectable cuando se utiliza la PCR por COLD rápida y la PCR convencional en la Fig. 4. De manera similar, la Fig. 5 ilustra que el enriquecimiento a través de la PCR por COLD completa modificada (RBS 25 nM) es 10 robusta (un incremento de 3% a 47%) para una circunstancia en la cual la mutación no afecta a la temperatura de fusión. Nuevamente, la mutación no es detectable cuando se utiliza la PCR por COLD rápida y la PCR convencional en la Fig. 5. La Fig. 6 también ilustra que el enriquecimiento a través de PCR por COLD completa modificada (RBS 25 nM) es robusta (un incremento de 3% a 45%) para una circunstancia en la que la mutación reduce la temperatura de fusión. En la Fig. 6 el enriquecimiento a través de PCR por COLD rápida también es robusta (es decir, debido a la
15 temperatura de fusión reducida). De nuevo, en la Fig. 6 la mutación no es detectable cuando se utiliza PCR convencional. La Fig. 7 ilustra los resultados para una deleción por reducción de la temperatura. El enriquecimiento a través de la PCR por COLD completa modificada (RBS 25nM) es robusta (un incremento de 3% a 45%), así como el enriquecimiento a través de la PCR por COLD rápida. De nuevo, la mutación no es detectable cuando se utiliza PCR convencional.
20 La Fig. 8 muestra datos de secuenciación de Sanger para el enriquecimiento de alelos mutantes HCC1008 de muestras procesadas utilizando RBS90, e ilustra que el enriquecimiento con PCR por COLD completa modificada en presencia de la secuencia de bloqueo de referencia de 90 pb es robusta (un incremento de 3% a 38%). Comparando los resultados en la Fig. 5, que muestra datos de secuenciación de Sanger para el enriquecimiento de alelos mutantes HCC1008 de muestras procesadas utilizando RBS60, a los resultados en la Fig. 8 confirma que el método
25 de la presente invención es robusto con secuencias de bloqueo de referencia de diferentes longitudes. En todos los casos y para todas las mutaciones estudiadas hasta el momento, la PCR por COLD completa modificada (en presencia de RBS) parece tener el mejor comportamiento, ya que enriquece todos los tipos de mutaciones (la Tm
imagen10

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES11709836.8T 2010-03-08 2011-03-08 Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia Active ES2665500T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31164210P 2010-03-08 2010-03-08
US311642P 2010-03-08
PCT/US2011/027473 WO2011112534A1 (en) 2010-03-08 2011-03-08 Full cold-pcr enrichment with reference blocking sequence

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2665500T3 true ES2665500T3 (es) 2018-04-26

Family

ID=43983637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11709836.8T Active ES2665500T3 (es) 2010-03-08 2011-03-08 Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia

Country Status (10)

Country Link
US (3) US8623603B2 (es)
EP (1) EP2545189B1 (es)
JP (1) JP5795341B2 (es)
KR (2) KR101550489B1 (es)
CN (1) CN102859003B (es)
AU (1) AU2011224534B2 (es)
CA (1) CA2792433C (es)
DK (1) DK2545189T3 (es)
ES (1) ES2665500T3 (es)
WO (1) WO2011112534A1 (es)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2665500T3 (es) 2010-03-08 2018-04-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia
AU2011319755B2 (en) 2010-10-27 2017-02-23 President And Fellows Of Harvard College Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
AU2012223438A1 (en) 2011-02-28 2013-09-26 Transgenomic, Inc Kit and method for sequencing a target DNA in a mixed population
US11130992B2 (en) 2011-03-31 2021-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions to enable multiplex COLD-PCR
US9796748B2 (en) 2011-05-02 2017-10-24 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequestration of dynamic nucleic acid circuits
WO2013009736A2 (en) 2011-07-10 2013-01-17 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for self-assembly of polymers with complementary macroscopic and microscopic scale units
CN103131756B (zh) * 2011-11-24 2014-08-27 百奥迈科生物技术有限公司 一种小核酸的检测方法及其应用
JP5846496B2 (ja) * 2012-04-19 2016-01-20 国立大学法人 鹿児島大学 ＬＮＡクランプ技術による植物内生菌のＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子の選択的ＰＣＲ増幅法
US9133490B2 (en) 2012-05-16 2015-09-15 Transgenomic, Inc. Step-up method for COLD-PCR enrichment
US9279146B2 (en) 2012-12-21 2016-03-08 Roche Molecular Systems, Inc. Compounds and methods for the enrichment of mutated nucleic acid from a mixture
US10301688B2 (en) 2013-01-23 2019-05-28 Brandeis University Reagents for improving PCR accuracy
US10913977B2 (en) * 2013-07-24 2021-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions to enable enrichment of minor DNA alleles by limiting denaturation time in PCR or simply enable enrichment of minor DNA alleles by limiting the denaturation time in PCR
BR112016007062A2 (pt) 2013-10-03 2017-09-12 Janssen Biotech Inc variantes de protoxina-ii e métodos de uso
US20160115556A1 (en) * 2013-10-19 2016-04-28 Trovagene, Inc. Detecting mutations in disease over time
JP2016536013A (ja) * 2013-10-19 2016-11-24 トローバジーン インコーポレイテッド 疾患における変異の経時的な検出
US20160273022A1 (en) 2013-10-20 2016-09-22 Trovagene, Inc. Synthesis and enrichment of nucleic acid sequences
CA2922261A1 (en) * 2013-10-20 2015-05-21 Trovagene, Inc. Synthesis and enrichment of nucleic acid sequences
US9873908B2 (en) 2013-11-27 2018-01-23 Roche Molecular Systems, Inc. Methods for the enrichment of mutated nucleic acid from a mixture
CN103602748A (zh) * 2013-11-28 2014-02-26 瑞希基因科技（北京）股份有限公司 一种结合荧光定量pcr技术的焦磷酸测序方法
EP4219744A3 (en) * 2014-01-27 2023-08-30 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
WO2015196154A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Richardson Katherine System, method, data module and kit for detecting variant nucleotide sequences
TW201708249A (zh) * 2015-04-02 2017-03-01 健生生物科技公司 原毒素－ｉｉ變體及使用方法
US10329605B2 (en) 2015-04-20 2019-06-25 Neogenomics Laboratories, Inc. Method to increase sensitivity of detection of low-occurrence mutations
ES2917175T3 (es) 2015-06-24 2022-07-07 Dana Farber Cancer Inst Inc Degradación selectiva de ADN de tipo salvaje y enriquecimiento de alelos mutantes usando nucleasa
CN105063208B (zh) * 2015-08-10 2018-03-06 北京吉因加科技有限公司 一种血浆中游离的目标dna低频突变富集测序方法
WO2017070339A1 (en) * 2015-10-20 2017-04-27 Richardson Katherine Microfluidic device for enrichment of nucleic acid sequence alterations
CN107338240B (zh) * 2015-11-25 2020-11-24 葛猛 对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法和试剂盒
CN105821120B (zh) * 2016-02-03 2019-04-30 广州医科大学附属肿瘤医院 一种基于巢式复合cold-pcr的t790m突变检测方法
CA3046953A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for molecular barcoding of dna molecules prior to mutation enrichment and/or mutation detection
EP3872187B1 (en) 2017-04-23 2022-09-21 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
FI3842545T3 (fi) 2017-04-23 2023-01-31 Koostumuksia ja menetelmiä näytteiden tunnistuksen parantamiseksi indeksoiduissa nukleiinihappokirjastoissa
US10975430B2 (en) * 2017-04-23 2021-04-13 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
CA3059839C (en) 2017-04-23 2023-01-03 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
WO2019023243A1 (en) 2017-07-24 2019-01-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING AND AMPLIFYING DNA TARGETS IN A SINGLE REACTION MIXTURE
CN107858401A (zh) * 2017-10-31 2018-03-30 重庆邮电大学 一种低丰度基因突变的富集方法
WO2020156545A1 (en) 2019-02-02 2020-08-06 Beijing Bytedance Network Technology Co., Ltd. Prediction using intra-buffer samples for intra block copy in video coding
JP7405861B2 (ja) 2019-03-01 2023-12-26 北京字節跳動網絡技術有限公司 映像符号化におけるイントラブロックコピーのための方向に基づく予測
WO2020177661A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Beijing Bytedance Network Technology Co., Ltd. Order-based updating for intra block copy in video coding
JP7284284B2 (ja) 2019-03-04 2023-05-30 北京字節跳動網絡技術有限公司 映像符号化におけるイントラブロックコピーの実装形態の態様
KR102635519B1 (ko) 2019-07-10 2024-02-07 베이징 바이트댄스 네트워크 테크놀로지 컴퍼니, 리미티드 비디오 코딩에서 인트라 블록 카피를 위한 샘플 식별
CA3145319A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Multi-site enrichment of deletions in dna microsatellites

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5310652A (en) 1986-08-22 1994-05-10 Hoffman-La Roche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerase-high temperature reverse transcription
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
GB2228086A (en) 1988-11-25 1990-08-15 Ici Plc Characterisation of genomic DNA
KR920700360A (ko) 1989-03-22 1992-02-19 하리크 프리드리히 미끄럼 베어링
US5075217A (en) 1989-04-21 1991-12-24 Marshfield Clinic Length polymorphisms in (dC-dA)n ·(dG-dT)n sequences
AU5645690A (en) 1989-05-05 1990-11-29 Lifecodes Corporation Method for genetic analysis of a nucleic acid sample
US5256775A (en) * 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5045450A (en) 1989-07-13 1991-09-03 Massachusetts Institute Of Technology Determination of a mutational spectrum
DE3938907C2 (de) 1989-11-24 1999-11-04 Dade Behring Marburg Gmbh Mittel zum Lagern und Suspendieren von Zellen, insbesondere Erythrozyten
AU635105B2 (en) 1990-01-26 1993-03-11 Abbott Laboratories Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions
US5427930A (en) 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
EP0516753A4 (en) 1990-02-26 1994-05-18 Us Health A method for the fluorescent detection of a dna sequence in real time
WO1991014003A2 (en) 1990-03-09 1991-09-19 Ig Laboratories, Inc. Characterization and analysis of polymorphic vntr loci
ATE153707T1 (de) 1990-05-07 1997-06-15 Daikin Ind Ltd Diagnostische anwendungen der bildung von doppelten d-loops.
US5846710A (en) 1990-11-02 1998-12-08 St. Louis University Method for the detection of genetic diseases and gene sequence variations by single nucleotide primer extension
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
GB2293238A (en) 1994-09-13 1996-03-20 Inceltec Ltd Primers for replication and/or amplification reactions
US5629178A (en) * 1994-10-28 1997-05-13 Genetics & Ivf Institute Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA)
US5565340A (en) 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
US5631147A (en) 1995-09-21 1997-05-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids in cells by thermophilic strand displacement amplification
WO1997019193A2 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US5612473A (en) 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US6010878A (en) 1996-05-20 2000-01-04 Smithkline Beecham Corporation Interleukin-1 β converting enzyme like apoptotic protease-6
US6599704B2 (en) 1997-03-04 2003-07-29 Christoph Wagener Method for detecting mutated alleles
US5849497A (en) * 1997-04-03 1998-12-15 The Research Foundation Of State University Of New York Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker
JP3785517B2 (ja) 1997-06-05 2006-06-14 東ソー株式会社 核酸融解温度測定法
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US6174680B1 (en) 1998-12-30 2001-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for identifying mismatch repair glycosylase reactive sites, compounds and uses thereof
FR2779154B1 (fr) 1998-05-27 2002-07-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre
US6994962B1 (en) 1998-12-09 2006-02-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods of identifying point mutations in a genome
US6850846B2 (en) 2000-01-11 2005-02-01 Affymetrix, Inc. Computer software for genotyping analysis using pattern recognition
DE10012540B4 (de) 2000-03-15 2004-09-23 Vermicon Ag Oligonukleotide und Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen durch Polymerase-Kettenreaktion
CA2421078A1 (en) 2000-08-30 2002-03-07 Haplogen, Llc Method for determining alleles
EP1253205A1 (en) 2001-04-24 2002-10-30 LION Bioscience AG Method of blocking amplification of selected sequences
US6762049B2 (en) 2001-07-05 2004-07-13 Institute Of Microelectronics Miniaturized multi-chamber thermal cycler for independent thermal multiplexing
DE10158516A1 (de) 2001-11-29 2003-06-12 Focusgenomics Gmbh Verfahren zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen in Nukleinsäuren
AUPS076902A0 (en) 2002-02-26 2002-03-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel selective polymerase chain reaction
AUPS076802A0 (en) 2002-02-26 2002-03-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Selective nucleic acid amplification
AU2003231121B2 (en) 2002-04-26 2008-08-07 University Of Utah Research Foundation Characterization of single stranded nucleic acids by melting analysis using a double strand specific nucleic acid dye
US20040022764A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Hanan Polansky Inhibition of microcompetition with a foreign polynucleotide as treatment of chronic disease
WO2004055193A1 (fr) 2002-12-18 2004-07-01 Dingbang Xu Procede pcr et application par temperature de thermo-denaturation basse transnormale
WO2004058990A2 (en) * 2002-12-20 2004-07-15 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with stenosis, methods of detection and uses thereof
GB0406863D0 (en) 2004-03-26 2004-04-28 Qiagen As Nucleic acid sequencing
WO2006093082A1 (ja) 2005-03-01 2006-09-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. サブトラクション・ポリヌクレオチドの取得方法
US7456281B2 (en) * 2005-04-20 2008-11-25 Idaho Technology, Inc. Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US8076082B2 (en) 2005-10-14 2011-12-13 Cleveland State University Methods for identifying multiple DNA alteration markers in a large background of wild-type DNA
US20070154892A1 (en) 2005-12-30 2007-07-05 Simon Wain-Hobson Differential amplification of mutant nucleic acids by PCR in a mixure of nucleic acids
US7544473B2 (en) 2006-01-23 2009-06-09 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US20100009355A1 (en) * 2006-03-14 2010-01-14 Kolodney Michael S Selective amplification of minority mutations using primer blocking high-affinity oligonucleotides
AU2007231546B2 (en) 2006-03-28 2012-04-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Amplification of DNA fragments
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
EP2395113A1 (en) 2007-06-29 2011-12-14 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
US8455190B2 (en) 2007-08-01 2013-06-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Enrichment of a target sequence
US8071338B2 (en) 2007-08-08 2011-12-06 Roche Molecular Systems, Inc. Suppression of amplification using an oligonucleotide and a polymerase significantly lacking 5′-3′ nuclease activity
WO2010065626A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Globeimmune, Inc. Genotyping tools, methods and kits
US8206929B2 (en) * 2009-01-07 2012-06-26 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants
EP2456887B1 (en) 2009-07-21 2015-11-25 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for quantitative detection of nucleic acid sequences over an extended dynamic range
ES2665500T3 (es) 2010-03-08 2018-04-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia
AU2012223438A1 (en) 2011-02-28 2013-09-26 Transgenomic, Inc Kit and method for sequencing a target DNA in a mixed population
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
US11130992B2 (en) 2011-03-31 2021-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions to enable multiplex COLD-PCR
EP2710144B1 (en) 2011-05-19 2020-10-07 Agena Bioscience, Inc. Processes for multiplex nucleic acid identification
US9238836B2 (en) 2012-03-30 2016-01-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for sequencing modified nucleic acids
US9133490B2 (en) 2012-05-16 2015-09-15 Transgenomic, Inc. Step-up method for COLD-PCR enrichment
EP2975124B1 (en) 2013-03-14 2019-03-06 Takara Bio Inc. Method for using heat-resistant mismatch endonuclease
EP3578667B1 (en) 2013-04-17 2023-10-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for characterizing dna sequence composition in a genome
US10913977B2 (en) 2013-07-24 2021-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions to enable enrichment of minor DNA alleles by limiting denaturation time in PCR or simply enable enrichment of minor DNA alleles by limiting the denaturation time in PCR
US9873908B2 (en) 2013-11-27 2018-01-23 Roche Molecular Systems, Inc. Methods for the enrichment of mutated nucleic acid from a mixture
CA3046953A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for molecular barcoding of dna molecules prior to mutation enrichment and/or mutation detection

Also Published As

Publication number Publication date
EP2545189B1 (en) 2018-01-10
JP2013521776A (ja) 2013-06-13
US11174510B2 (en) 2021-11-16
US8623603B2 (en) 2014-01-07
KR101550489B1 (ko) 2015-09-07
CA2792433C (en) 2016-10-11
DK2545189T3 (en) 2018-04-23
US20140106362A1 (en) 2014-04-17
US20110217714A1 (en) 2011-09-08
US9957556B2 (en) 2018-05-01
WO2011112534A1 (en) 2011-09-15
CA2792433A1 (en) 2011-09-15
AU2011224534A1 (en) 2012-09-27
EP2545189A1 (en) 2013-01-16
KR20120139780A (ko) 2012-12-27
US20180282798A1 (en) 2018-10-04
CN102859003A (zh) 2013-01-02
AU2011224534B2 (en) 2014-10-09
JP5795341B2 (ja) 2015-10-14
KR20150067398A (ko) 2015-06-17
CN102859003B (zh) 2014-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2665500T3 (es) Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia
CN101815789B (zh) 靶序列的富集
WO2016101258A1 (zh) 一种检测与人体异常状态相关的差异甲基化CpG岛的方法
ES2769795T3 (es) Sistema y método de detección de RNAs alterados por cáncer de pulmón en sangre periférica
JP2008508901A (ja) 核酸の単離および増幅方法
JP5431351B2 (ja) バイサルファイト修飾された核酸を増幅およびコピーするための酵素
JP6417032B2 (ja) オリゴヌクレオチドフラグメント、ならびにこれを用いる標的核酸配列の変異体の選択的増幅の方法および用途
US20130309724A1 (en) Step-up method for cold-pcr enrichment
WO2010108325A1 (zh) 一种用于核酸扩增的环形引物及其应用
ES2360113T3 (es) Amplificación universal de rna fragmentado.
JP2015522292A (ja) 協働的プライマー、プローブ、およびそれらの用途
Sirakov Nucleic acid isolation and downstream applications
JP2013523178A (ja) Ｋｒａｓプライマーおよびプローブ
KR102126031B1 (ko) 유전적 변이를 함유하는 핵산 검출 방법
ES2966013T3 (es) Diseño específico de alelo de cebadores cooperativos para genotipado de variantes de ácido nucleico mejorado
US11104941B2 (en) 5′ adapter comprising an internal 5′-5′ linkage
KR101860547B1 (ko) 세포-유리형 dna의 암 질환의 진단 용도
Kovalenko et al. Promoters of genes MTHFR from patients with hyperhomocysteinemia and PTEN from patients with malignant and benign endometrial and ovarian tumors
WO2006019155A1 (ja) 遺伝子多型のタイピング方法
WO2023060138A2 (en) Methods for producing circular deoxyribonucleic acids
CN113215163A (zh) 一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用
US20160201105A1 (en) Step-up method for cold-pcr enrichment