CN102859003A - 使用参考封闭序列的全cold-pcr富集 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于富集样品中低丰度等位基因的方法、组合物和软件。具体来说是涉及在扩增反应混合物中使用过量的参考封闭序列以改进全COLD-PCR的富集效率并减少其循环时间。

Description

使用参考封闭序列的全COLD-PCR富集
发明领域
本发明涉及对核酸样品中低丰度靶序列(例如突变)的扩增和富集的改进。具体来说，本发明涉及在全COLD-PCR(在较的变性温度下共扩增)过程中使用参考封闭序列。
发明背景
在遗传分析中经常遇到的情况表明需要在存在大量过量的非变体序列(“参考序列”)下鉴定低百分比的变体DNA序列(“靶序列”)。这种情况的实例包括：(a)在存在大量过量的正常等位基因下鉴定及测序几个突变的等位基因；(b)表观遗传分析中在存在大量过量的非甲基化等位基因下鉴定几个甲基化的等位基因(或反之亦然)；(c)在线粒体DNA中检测低水平的异质性；(d)在病毒感染中检测耐药性类物种和(e)在存在大量过量的野生型等位基因下鉴定癌症患者血液中的肿瘤循环DNA(其中该人疑似患有癌症，以跟踪癌症治疗的成功或检测复发)。
本申请的发明人之前已描述用于富集样品PCR反应混合物中的低丰度等位基因的浓度的COLD-PCR方法；见由Gerassimos Makrigiorgos转让给本发明受让人的题为“靶序列的富集”的公开PCT专利申请(其国际申请号为PCT/US2008/009248，现在为美国编号12/671295)。所描述的COLD-PCR富集方法基于修改的核酸扩增方案，其在临界变性温度“Tc”下孵育反应混合物。之前的专利申请公开了两种形式的COLD-PCR，即全COLD-PCR和快速COLD-PCR。
在全COLD-PCR中，使所述反应混合物处于第一变性温度(例如94℃)，与传统PCR类似地选择足够高于参考(例如野生型)序列和靶(例如突变体)序列的解链温度的变性温度。然后缓慢地冷却所述混合物以便于通过杂交形成参考-靶异源双链体。通常以受控的方式在超过8分钟的时间稳定地从94℃至70℃降低温度以确保正确的杂交。或者，迅速地降低温度至70℃并保持在该温度下8分钟以确保正确的杂交。一旦冷却，所述反应混合物不仅含有参考-靶异源双链体，也含有参考-参考同源双链体(和更少程度的靶-靶同源双链)。当所述靶序列和参考序列交叉杂交时，沿短的(例如<200bp)双链DNA序列的任何地方的一或多种单核苷酸错配或插入或缺失的微小的序列差异会产生该序列的解链温度(Tm)的小的但可预测的变化(Lipsky，R.H.等人(2001)Clin Chem,47,635-644；Liew，M.等人(2004)Clin Chem,50,1156-1164)。取决于确切的序列上下文和错配的位置，0.1-20℃的解链温度的变化都是可考虑的。上述所提及的专利申请中所描述的全COLD-PCR，前提是在双链参考序列和杂交参考-靶异源双链体之间的解链温度上的差异。在冷却下来形成参考-靶异源双链体后，在临界变性温度(Tc)下孵育所述反应混合物，临界变性温度选择为低于双链参考序列的解链温度并高于参考-靶异源双链体的较低的解链温度，从而交叉杂交的异源靶-参考异源双链体的变性优先于参考-参考同源双链。
临界变性温度(Tc)是在低于该温度下所述参考核酸序列的PCR效率急剧下降的温度(但不足以促进参考-靶异源双链体的变性)。例如，如果设定PCR变性温度在87℃，167bp的p53基因序列扩增良好，在86.5℃扩增一般而如果PCR变性设置在86℃或以下时检测不到产物。因此，在本实施例中。在临界变性温度(Tc)下的中间孵育后，所述引物退火至来自变性异源双链体的变性的靶和参考链并由聚合酶延伸，从而相对于参考序列富集靶序列的浓度。全COLD-PCR优点之一是靶序列和参考序列使用同一引物对。
上述提及的专利申请中所描述的快速COLD-PCR，前提是双链参考序列(例如野生型序列)和双链靶序列(例如突变体序列)的解链温度之间有差异。具体来说，所述靶序列的解链温度必须低于所述参考序列的解链温度。快速COLD-PCR中的临界变性温度(Tc)是在低于该温度下所述双链参考核酸序列的PCR效率急剧下降，但不足以促进双链靶序列的变性的温度。在所述快速COLD-PCR富集循环期间，所述反应混合物不经历在全COLD-PCR循环的第一步骤中的高于所述参考序列的解链温度(例如94℃)的变性。相反，在临界变性温度(例如Tc=83.5℃)孵育所述反应混合物，选择该温度(a)低于双链参考序列的解链温度并高于双链靶序列的较低的解链温度，或(b)低于参考序列和靶序列的Tm，但仍然造成参考序列和靶序列变性程度的差异。在临界变性温度(Tc)下孵育后，所述引物退火至变性的靶链并由聚合酶延伸，从而相对于参考序列富集靶序列的浓度。同一引物对也都用于靶序列和参考序列。
已发现与通过快速COLD-PCR的富集相比，通过全COLD-PCR的富集相对地效率差并且耗时。然而，快速COLD-PCR的使用限于所述双链靶序列的解链温度适合地低于所述双链参考序列的解链温度的应用中。例如，如果所述突变体序列的解链温度是等于或高于野生型序列的解链温度，在已进行快速COLD-PCR的有低丰度突变体序列的样品的测序数据中不会检测到突变。因此，有需求改进所述全COLD-PCR循环的效力和速率。
认为全COLD-PCR的相对的效率差主要是由于异源双链体的缺乏，特别是在全COLD-PCR早期循环期间形成的异源双链体的缺乏。即使优化在杂交步骤期间的缓慢冷却(例如，从94℃至70℃稳定地冷却8分钟)，非常低浓度的靶(例如突变体)链(尤其在早期循环期间的)减少形成异源双链体的能力。增加杂交冷却的时间是不期望的，并且在任何情况下未发现对改进富集特别有效。全COLD-PCR可能比快速COLD-PCR相对低效率的另一原因是在全COLD-PCR的后期循环期间的扩增子具有重新形成其同源双链体而不是形成异源双链体的倾向。
本发明的一个目的是提高在全COLD-PCR的早期循环中的异源双链体形成的效率。本发明的另一目的是降低全COLD-PCR的总循环时间。
发明概述
本发明是用于富集样品中的低丰度等位基因的方法，并特别涉及在所述反应混合物中使用过量的参考封闭序列以提高全COLD-PCR的效率并缩短循环时间。
本发明涉及在以上提及的Gerassimos Makrigiorgos的受让给本发明受让人的题为“靶序列的富集”专利申请(国际申请号为PCT/US2008/009248，现在为美国编号12/671295)中结合图1和2所描述的COLD-PCR方法的修改，该申请在此通过引用并入本文。更具体地，根据本发明，每个修改的全COLD-PCR方案在所述反应混合物进行热循环之前向所述反应混合物中过量地添加设计的参考封闭序列(例如单链寡核苷酸)。
所述修改的全COLD-PCR方法涉及制备含有核酸样品的扩增反应混合物。所述核酸样品会具有参考序列(例如野生型序列)并也会疑似含有一或多种靶序列(例如一或多种突变体序列)。如所提及的，本发明的目的是富集所述靶序列的浓度，从而在大多数情况下，当所述靶序列如果存在并且是低丰度时会使用该方法。根据本发明的靶序列与所述参考序列具有至少50％同源性，不过该方法特别地适合于富集含有大约1-10个碱基序列变化的突变体等位基因。使用与用于所述参考序列的同样的引物通过PCR扩增所述靶序列。如所提及的，本发明涉及在所述反应混合物中存在过量浓度水平的参考封闭序列。所述参考封闭序列是与所述参考序列的一条链在其引物位点之间的至少一部分互补或部分地与引物位点重叠的核酸序列。添加至所述反应混合物中的参考封闭序列期望地是单链的(但也可以是双链，鉴于最初的变性步骤会获得变性的单链参考封闭序列)。
根据全COLD-PCR方案，使所述反应混合物处于第一变性温度，例如95℃，该温度高于所述参考序列和所述靶序列的解链温度(Tm)，获得所述参考序列和所述靶序列的变性的链。冷却所述反应混合物例如至约70℃以促进杂交。由于在存在过量参考封闭序列下进行冷却，所述参考封闭序列优选地与所述参考序列的互补链杂交，并与所述靶序列的互补链杂交。例如，假设在所述方法开始时过量地添加单链参考封闭序列，该方法中在这一点的反应混合物会含有参考封闭序列与互补参考(例如野生型)链的异源双链体和参考封闭序列与靶(例如突变体)链的异源双链体。在这一点的反应混合物也含有所述参考序列和靶序列的变性的负链。在修改的全COLD-PCR循环中存在的所形成的异源双链体是根本上不同于以上引用的专利申请中所描述的全COLD-PCR方案中所形成的参考-靶异源双链体。提供过量的参考封闭序列促进比现有的全COLD-PCR方案(例如，大约8分钟)更快的杂交(例如，大约30秒)。在本发明的一个优选实施方案中，所述冷却杂交步骤在持续时间上小于一分钟。
然后使所述反应混合物处于临界温度(例如，Tc=84.5℃)，该温度足以允许所述靶链的变性优先于所述参考封闭序列。选择临界温度(Tc)以使在Tc孵育时所述参考封闭链与互补参照链的双链体在反应混合物基本上保持未变性，而所述参照封闭链与靶链的双链体基本上变性。术语“基本上”是指至少60％、和优选地至少90％、或更优选地至少98％为给定的变性或未变性形式。所述参考封闭序列与靶链的双链体的解链温度会始终低于所述参考封闭序列与互补参考链的双链体的解链温度，因为前者含有错配而后者不含有错配。
在优先变性后，降低所述反应混合物的温度以允许所述引物对退火至反应混合物中的游离的靶链和参考链。再次假设在所述方法开始时过量地添加单链参考封闭序列，该循环中在这一点上理论上有两条游离的靶序列链(与最初的变性步骤相比)而只有一条游离的参考链。另一参考链与所述参考封闭序列杂交，从而不可用于扩增。然后延伸退火的引物，从而导致靶序列的指数扩增而参考链只线性扩增。因此，在所述COLD-PCR循环期间样品中的所述靶序列相对于所述参考序列逐渐富集。
可以重复所述方法10个至30个或更多循环。已发现该方法显著增加靶扩增子的富集并减少全COLD-PCR的循环时间。它也能够富集纯合突变，其在现有的全COLD-PCR方案中不会形成异源双链。
所述参考封闭序列的长度可以等于或小于或大于所述靶或参考序列的长度。在优选的实施方案中，所述参考封闭序列在序列的每侧比靶序列和参考序列小几个碱基以使所述引物不会明显地结合所述参考序列。因此，通过扩增所述靶序列的引物不能延伸所述参考封闭序列。为此，任选地可以封闭所述参考封闭序列的3'OH端的DNA聚合酶延伸。此外，任选地，可以用部分重叠所述引物结合位点的核酸序列设计参考封闭序列的5'-末端，以使得可以阻止Taq DNA聚合酶的5'至3'核酸外切(即杂交参考封闭序列的降解)。
如所提及的，所述参考序列是单链的或双链的。在优选实施方案中，所述参考封闭序列是单链核酸。然而，所述参考封闭序列可以采取其它形式，例如单链DNA、RNA、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)或另一修饰的核苷酸之间的嵌合体。可以选择PNA或LNA在嵌合序列的位置以匹配突变可能的位置，以使最大化在那些位置上的潜在错配的作用。所述参考封闭序列也可以是单链PNA或单链DNA。
通过参考附图和下面的详细描述，本发明的其它实施方案和优点对本领域技术人员来说显而易见的。
附图简述
图1展示用于选择性富集靶序列的现有技术的全COLD-PCR实施方案，其在题为“靶序列的富集”的现有专利申请(国际申请号PCT/US2008/009248，现在美国编号为12/671295)有所描述，其通过引用并入本文。
图2展示本发明的原理，其通过在所述扩增反应混合物中存在过量的参考封闭序列来改进全COLD-PCR。
图3是用于实现本发明的一个实施方案的60bp的参考封闭序列的示意图。使用下划线的引物初步地扩增87bp的扩增子。为每条链设计互补参考封闭序列并含有3'不可延伸的磷酸基团。
图4显示富集的PFSK-1突变体等位基因的Sanger测序数据，其分别来自使用常规PCR、在反应混合物中不使用参考封闭序列的全COLD-PCR、在反应混合物中有过量参考封闭序列的全COLD-PCR和快速COLD-PCR处理的样品。
图5显示富集的HCC1008突变体等位基因的Sanger测序数据，其分别来自使用常规PCR、在反应混合物中不使用参考封闭序列的全COLD-PCR、在反应混合物中有过量参考封闭序列(RS)(60bp)的全COLD-PCR和快速COLD-PCR处理的样品。
图6显示富集的HCC2218突变体等位基因的Sanger测序数据，其分别来自使用常规PCR、在反应混合物中不使用参考封闭序列的全COLD-PCR、在反应混合物中有过量参考封闭序列(RS)的全COLD-PCR和快速COLD-PCR处理的样品。
图7显示富集的TL92突变体等位基因(缺失1bp G)的Sanger测序数据，其分别来自使用常规PCR、在反应混合物中不使用参考封闭序列的全COLD-PCR、在反应混合物中有过量参考封闭序列(RS)的全COLD-PCR和快速COLD-PCR处理的样品。
图8显示来自通过使用90bp参考封闭序列(RS)的全COLD-PCR处理的样品的富集的HCC1008突变体等位基因的Sanger测序数据。
发明详述
定义
如本文中所用，术语“富集靶序列”是指增加样品中靶序列的量和增加样品中靶序列相对于对应的参考序列的比例。例如，在样品中靶序列对参考序列的比例最初是5％对95％，可以在扩增反应优选地扩增所述靶序列以产生70％靶序列对30％参考序列的比例。因此，所述靶序列相对于参考序列有14倍的富集。
如本文中所用的，术语“靶序列”是指在核酸样品中比相应的参考序列更不普遍的核酸。所述靶序列构成样品中的参考序列+靶序列的总量的小于50％。所述靶序列可以是突变体等位基因。例如，样品(例如，血液样品)可能含有大量的正常细胞和很少的癌性细胞。正常细胞含有非突变或野生型等位基因，而少数癌性细胞中含有体细胞突变。在这种情况下，该突变体是靶序列而野生型序列是参考序列。
如本文中所用的，“靶链”是指靶序列的单核酸链。
所述靶序列必须与相应的参考序列具有至少50％同源性，但必须与参考序列具有至少一个核苷酸差异。使用与用于所述参考序列的同样的引物通过PCR扩增所述靶序列。
如本文中所用的，术语“参考序列”是指在核酸样品中比相应的靶序列更普遍的核酸。所述参考序列构成样品中的总参考序列+靶序列的高于50％。优选地，所述参考序列的表达在RNA和/或DNA水平是所述靶序列的10X、15X、20X、25X、30X、35X、40X、45X、50X、60X、70X、80X、90X、100X、150X、200X或更多。如本文中所用的，“参考链”是指参考序列的单核酸链。
如本文中所用的，术语“野生型”是指在群体中特定基因的最常见的多核苷酸序列或等位基因。通常地，从正常细胞获得野生型等位基因。
如本文中所用的，术语“突变体”是指在核酸序列中的核苷酸的改变(即单个或多个核苷酸的取代、缺失或插入)。带有突变的核酸具有序列上不同于来自相应的野生型多核苷酸的序列的核酸序列(突变体等位基因)。本发明广泛地涉及体细胞突变和多态性。本发明的方法特别用于选择性地富集含有大约1-10个核苷酸序列变化的突变体等位基因，不过即使有更高数目的序列变化也适用。突变体等位基因通常会从患病的组织或细胞获得并与疾病状态相关。
如本文中所用的，术语“解链温度”或“Tm”是指在该温度下多核苷酸与其互补序列解离的温度。通常地，Tm可以定义为该温度下双链核酸分子中的一半Watson-Crick碱基对断裂或解离(即“熔解”)而另一半Watson-Crick碱基对的双链构象保持完整的温度。换句话说，Tm定义为这样的温度，在该温度下两个互补序列的50％的核苷酸是退火的(双链)而50％的核苷酸是变性的(单链)。因此，Tm定义为从双链向单链核酸分子(或相反地，从单链向双链核酸分子)转变的中点。
可以通过若干方法估计Tm，例如通过最邻近计算，如Wetmur1991(Wetmur,J.G.1991.DNA probes:applications of the principles of nucleicacid hybridization.Crit Rev Biochem Mol Biol 26:227-259,)和商业程序，其包括OligoTM Primer Design和在互联网上可获得的程序。可选地，可以通过实际试验确定Tm。例如，可以在熔解曲线测定中使用双链DNA结合或嵌入性染料，如溴化乙锭或SYBR-green(Molecular Probes)以确定核酸的实际的Tm。用于确定核酸Tm的其他方法在本领域中是众所周知的。这些方法的一些在通过引用并入本文的本发明人之前题为“靶序列的富集”的专利申请(国际申请号PCT/US2008/009248，现在美国序列号12/671295)中列出。
如本文中所用的，“参考封闭序列”是设计的单链或双链核酸序列，例如寡核苷酸，优选地具有小于所述靶序列的长度。在优选的实施方案中，所述参考封闭序列在序列的每侧比参考序列小几个碱基以使所述引物不会明显地结合所述参考序列。任选地，阻断所述参考封闭序列的3'OH末端的DNA聚合酶延伸，修饰5-末端以阻止Taq DNA聚合酶的5'至'3核酸外切。所述参考封闭序列也可以采取其他形式，其在所述反应混合物处于临界温度“Tc”时仍退火至参考序列，例如单链DNA、RNA、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)或另一修饰核苷酸之间的嵌合体。
与本发明中相关联的，术语“临界温度”或“Tc”是指优先地变性靶链和所述参考封闭序列的双链体的选定的温度。选择所述临界温度(Tc)以使在Tc孵育时由所述参考封闭链与互补参照链组成的双链体在反应混合物基本上保持未变性，而由所述参照封闭链与靶链组成的双链体基本上变性。术语“基本上”是指至少60％、和优选地至少90％、或更优选地至少98％为给定的变性或未变性形式。在以下提供的实施例中，所选择的用于中间孵育步骤的临界温度“Tc”是84.5℃，而第一变性温度为95℃。
如本文中所用的，“引物对”是指退火至靶序列和参考序列的相反链以在PCR反应期间形成扩增产物的两种引物。所述靶序列和参考序列应该是至少25个碱基以利于引物附着。设计引物对，使其具有低于所述反应的Tc的Tm。
如本文中所用的，“同源性”是指两个聚合物分子(例如两个多核苷酸或两个多肽之间的亚单元序列的相似性。适合于确定序列相同性百分比和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有所描述。进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地可获得的。
一般性核酸扩增
在一个实施方案中，在本发明方法中使用的核酸样品包含具有靶序列和参考序列的基因组DNA。在另一实施方案中，本发明方法的核酸样品包含之前在核酸扩增反应中扩增的靶序列和参考序列。技术人员会理解有许多方法可用于扩增核酸。可能最流行的方法是聚合酶链式反应(PCR，例如见，U.S.Pat.Nos.4,683,195和4,683,202，以及Saiki等人，Science230:1350-1354(1985)和Gyllensten等人，PNAS(USA)85:7652-7656(1985))。所述PCR方法的优选的变化是不对称PCR(例如见Mao等人，Biotechniques27(4):674-678(1999)；Lehbein等人，Electrophoresis 19(8-9):1381-1384(1998)；Lazaro等人，ol.Cell.Probes 6(5):357-359(1992)；和美国专利号6197499)。其他扩增方法包括但不限于，链置换扩增(SDA)(见Walker等人，Nucleic Acids Res.20(7):1691-1696(1992)，以及美国专利号5744311、5648211和5631147)、滚动循环扩增(RCA)(见PCT出版物WO97/19193)、基于核酸序列的扩增(NASBA)(见Compton，Nature 350:91-92(1991)，以及美国专利号5409818和5554527)、转录物介导的扩增(TMA)(见Kwoh等人，PNAS(USA)86:1173-1177(1989)，以及美国专利号5399491)、自持序列复制(3SR)(见Guatelli等人，PNAS(USA)87:1874-1879(1990))和连接酶链式反应(LCA)(见美国专利5427930和5792607号)。
在其最简单的形式中，PCR是用于酶促合成特定DNA序列的体外方法，其使用杂交至靶DNA的相反链并位于感兴趣区域的两侧的两种寡核苷酸引物。包括模板变性、引物退火和通过DNA聚合酶的退火引物延伸的重复系列的反应步骤导致特定片段的指数积累，所述片段的末端由所述引物的5'末端限定。有报道PCR能够以相对于基因组DNA中其他序列的109的因子产生特定DNA序列的选择性富集。所述PCR方法在Saiki等人，1985,Science 230:1350中也有所描述。
使用模板DNA(靶序列和参考序列)(至少1fg；更有用地，1-1000ng)和至少25pmol的寡核苷酸引物进行PCR。典型的反应混合物包括：2μl的DNA，25pmol的寡核苷酸引物，2.5μl的适合的缓冲液，0.4μl的1.25μM的dNTP，2.5单位的Taq DNA聚合酶(Stratagene)和去离子水至25μl的总体积。使用可编程的热循环仪进行PCR。
根据实际的严格性要求调整PCR循环的每个步骤的长度和温度以及循环的数目。通过引物预期退火至模板的效率和所要容忍的错配程度确定退火温度和时间。优化引物退火条件的严格性的能力在本领域的中等技术人员的知识范围内。使用30°C-72°C的退火温度。模板分子的最初的变性正常地在92°C-99°C下进行4分钟，随后为由变性(94-99°C下15秒-1分钟)、退火(如上所讨论确定的温度下1-2分钟)和延伸(72°C下1分钟)组成的20-40个循环。通常在72°C下进行最后的延伸步骤4分钟并可以随后为4°C下的无限期步骤(0-24小时)。
PCR采用核酸聚合酶或催化三磷酸核苷聚合的酶。通常地，所述酶会在退火至所述靶序列的引物的3'-末端上启动合成，并会沿所述模板在5'-方向继续进行。已知的DNA聚合酶包括，例如大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、极端嗜热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶，水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶和激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶。术语“核酸聚合酶”也包括RNA聚合酶。如果核酸模板是RNA，那么“核酸聚合酶”涉及RNA依赖的聚合活性，例如逆转录酶。
在PCR装置中，例如热循环仪，或更优选地在实时反应条件下在实时PCR装置中进行本发明的富集程序。实时反应条件还利用核酸检测试剂(例如染料或探针)以在PCR产物产生时测量/检测该PCR产物。
样品
如本文中所用的“样品”是指含有或推定含有感兴趣的核酸(靶序列和参考序列)的任何物质，或其本身是含有或推定含有感兴趣的靶核酸的核酸。因此，术语“样品”包括核酸(基因组DNA、cDNA、RNA)、细胞、生物体、组织、流体或物质样品，包括但不限于，例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、关节液、尿、眼泪、粪便、皮肤的外部分泌物、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、唾液、血液细胞、肿瘤、器官、组织、体外细胞培养物成分样品、天然分离物(例如饮用水、海水、固体材料)、微生物标本，和已用核酸示踪分子“标记”的对象或标本。
可以从基因组DNA扩增本发明的核酸序列。根据以下的方法可以从组织或细胞分离基因组DNA。可选地，可以通过本领域所熟知的方法从血液分离本发明的核酸序列。
为了便于从特定组织中检测基因的变体形式，分离所述组织。为了从哺乳动物组织分离基因组DNA，切碎所述组织并在液氮中冷冻。用预冷的研钵和杵将冷冻组织磨成细粉，并在消化缓冲液(100mM NaCl、10mMTris-HCl、pH 8.0、25mM EDTA、pH 8.0、0.5％(w/v)SDS、0.1mg/ml蛋白酶K)中以每100mg组织1.2ml消化缓冲液来悬浮。为了从哺乳动物组织培养细胞中分离基因组DNA，通过在500×g离心5分钟沉淀细胞，在1-10ml冰冷的PBS重悬细胞，在500×g离心5分钟重沉淀细胞并在1体积的消化缓冲液中重悬细胞。
将消化缓冲液中的样品在50°C下孵育(振荡)12-18小时，然后用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇提取。如果在离心步骤(1700×g下10分钟)后所述相不清晰，再添加一体积的消化缓冲液(无蛋白酶K)并重复离心步骤。如果在两相的界面处厚的白色物质是明显的，重复所述有机提取步骤。提取之后，转移上部的水层至新的管中，向其加入1/2体积的7.5M醋酸铵和2体积的100％乙醇。所述核酸通过在1700×g下离心2分钟来沉淀，用70％乙醇洗涤，空气干燥并以1mg/ml重悬在TE缓冲液中(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，pH 8.0)。通过在0.1％SDS和1μg/ml无DNase的RNase存在的情况下在37°C孵育1小时和重复提取和乙醇沉淀步骤来去除残余RNA。根据该方法的基因组DNA的产量预计为大约2mg DNA/1g细胞或组织(Ausubel等人，同上)。根据本发明可以使用根据该方法分离的基因组DNA。
也可以从全血中提取所述靶DNA。例如，通过标准方法可以抽取血液至收集管中，优选地包含硅化玻璃，或者没有用于制备血清的抗凝血剂，或者有用于制备血浆的EDTA、柠檬酸钠、肝素或类似的抗凝血剂，最优选地EDTA。虽然不是绝对需要的，所述优选的方法是从全血中分离血浆或血清。通过离心可以从全血中分离血浆或血清，优选地在300×g-800×g下温和离心5-10分钟，或通过其他标准方法分离。由于肝素可能干扰PCR，使用肝素化的血液可能需要用肝素酶预处理。因此，EDTA是优选的用于血液标本的抗凝血剂。在本发明的方法中可以使用新鲜收集的血浆或血清或冷冻的(储存的)并随后解冻的血浆或血清。储存的血浆或血清应该保存在-20℃至-70℃，而新鲜收集的血浆或血清保持冷藏或保持在冰上直至使用。然后可以通过本领域所熟知的方法提取所述的DNA。
本发明的方法可以用于检测在靶序列中是否发生甲基化。所述甲基化检测方法包含用于DNA甲基化敏感处理的化学或酶方法。化学处理包括用选择性转变非甲基化胞嘧啶为尿嘧啶的亚硫酸氢钠孵育DNA。首先热变性所述DNA，然后用5M亚硫酸氢盐(pH 5-7)处理。在亚硫酸氢盐处理前预处理基因组DNA以去除事先存在的尿嘧啶。该预处理由包括在5mM的羟胺(pH 7)存在下的尿嘧啶糖基化酶处理。
因为所述靶序列的甲基化胞嘧啶被转变为尿嘧啶，当在全COLD-PCR(存在参考封闭序列)的杂交冷却步骤中用所述参考封闭序列双链化时，它们现在会形成错配。
没有参考封闭序列的全COLD-PCR(现有技术)
图1展示用于在含有靶序列和参考序列的核酸样品中富集靶序列的称为全COLD-PCR的现有技术流程，如在以上并入的题为“靶序列的富集”的美国申请序列号12/671295所解释。图1是以上并入的专利申请中的图1的再现。
从多种来源可以获得所述靶序列和参考序列，其包括基因组DNA、cDNA、病毒DNA、哺乳动物DNA、胎儿DNA或细菌DNA。尽管参考序列通常是野生型等位基因而靶序列是突变体等位基因，也可以是相反。所述突变体等位基因可以包括任意一或多个核苷酸的缺失、插入或改变。在某些实施方案中，所述突变体等位基因是体细胞突变。在其它实施方案中，所述靶序列是甲基化的DNA而参考序列是未甲基化的DNA。
该方法包括使所述扩增反应混合物处于第一变性温度(图1A，步骤1)，该温度高于参考序列的解链温度“Tm”。可以通过实验确定或通过计算估计核酸的Tm值。技术人员熟知许多用于确定核酸的Tm的方法，其中一些在本文中有所描述。通常地如通常选择PCR反应的变性温度一样选择第一变性温度，其应该足够高以允许所述靶序列和参考序列的全部变性(例如，94℃)。在一个实施方案中，第一变性温度高于所述参考序列的Tm大约1℃-30℃，更优选地所述参考序列的Tm高于参考序列的Tm大约5℃-20℃。
之后，降低所述扩增反应混合物的温度以使得靶序列和参考序列可以杂交(图1A，步骤2)。该退火步骤导致靶-靶双链体、参考-参考双链体和靶-参考序列双链体的形成，但应该优化该步骤以形成靶-参考双链体。本方法中使用的PCR引物被设计为具有防止其在该中间温度下结合至所述靶序列和参考序列的解链温度。如以上所提及的，已发现需要靶-参考杂交和降温所需的相对大量的时间(图1A，步骤2)至少在某些应用中限制全COLD-PCR的有效性。
然后通过提高所述反应混合物的温度至Tc(图1A，步骤3)来优先变性靶-参考杂交双链体。图1中的Tc或临界温度选择为低于所述参考序列的Tm但高于靶-参考双链体的Tm。正如前面提到的，当所述靶序列和参考序列交叉杂交时，沿双链DNA序列的任何地方的一或多个单核苷酸错配的微小的序列差异会产生该序列的解链温度(Tm)的小的但可预测的变化(Lipsky，R.H.等人(2001)Clin Chem,47,635-644；Liew，M.等人(2004)Clin Chem,50,1156-1164)。取决于确切的序列上下文和错配的位置，在0.1-20℃范围内的解链温度的变化是可能的。通常施用Tc(图1A，步骤3)大约1秒至5分钟，更优选地5秒至30秒。如果需要，可以在步骤3和2之间反复多个循环。
在所述靶-参考杂交双链体优先变性后，降低所述反应混合物的温度以允许一或多种引物退火至所述靶序列(图1A，步骤4)。然后由核酸聚合酶延伸所述退火的引物(图1A，步骤5)，从而富集在所述样品中含有的核酸群体中的靶序列。
通常重复该方法的步骤多个循环以得到足够的靶序列和参考序列的扩增。在一个实施方案中，重复该方法的步骤5-40个循环和更优选地10-30个循环。由本领域的普通技术人员可以确定循环的最佳数量。优选地，在PCR装置中进行本方法，更优选地在实时检测PCR装置中在实时反应条件下进行，所述实时检测PCR装置例如SMARTCYCLER实时PCR装置(Cepheid，Sunnyvale，CA)和Mx3005P实时PCR装置(Stratagene，La Jolla，CA)。在本实施方案中，所述反应混合物可以包括用于定量和/或监测所述反应的扩增产物的核酸检测试剂(例如，核酸检测染料如SYBR Green染料或LC-Green染料或有效地偶联到荧光染料的探针)的反应。一旦所述靶序列的富集完成，可以进一步处理所述样品，例如进行测序反应。通过各种方法可以进一步处理所富集的等位基因，其包括：MALDI-TOF、HR熔解、双脱氧测序、单分子测序、焦磷酸测序、第二代高通量测序、SSCP、数字PCR和定量PCR(见图1B)。这些处理技术的更详细的描述以及诊断测定包括在上面所提到的题为“靶序列的富集”的美国申请序列号12/671295，其通过引用并入本文。
在反应混合物中包含过量的参考封闭序列的全COLD-PCR循环
图2表示根据本发明的修改的全COLD-PCR法的靶序列的富集。开始(图2，步骤1)，核酸样品中含有双链的参考序列10(例如野生型序列)和含有双链的靶序列12(例如突变体序列)。所述扩增反应混合物含有所述样品、其他PCR成分和过量浓度水平(例如25nM)的根据本发明的参考封闭序列14。在图2中，所表示的参考封闭序列14是与所述参考序列10的一条链10A的引物位点之间互补的单链核酸序列。
图2的步骤1中使反应混合物处于第一变性温度，例如95℃下30秒，其产生参考序列的变性链10A、10B和靶序列的变性链12A、12B。然后冷却所述反应混合物例如70℃下30秒以促进杂交，这是从现有技术中的正常的8分钟冷却的显著减少。由于在过量参考封闭序列14的存在下进行所述冷却，所述参考封闭序列14优选地与所述参考序列的互补链10A杂交并与所述靶序列的互补链12A杂交。图2中的步骤2展示所述反应混合物在杂交冷却至70℃后的状态。除了所述参考封闭序列14与互补参考链10A的异源双链体16和所述参考封闭序列14与互补靶链12A的异源双链体18，所述反应混合物也含有参考序列和靶序列分别的变性的负链10B和12B。
图2的步骤3中，然后将所述反应混合物进行至临界温度“Tc”，例如84.5℃，选择该温度以允许靶链12A与参考封闭序列14的异源双链体18的优先变性。选择所述临界温度(Tc)以致在“Tc”下孵育所述反应混合物时所述参考封闭链14与互补参考链10A的双链体16基本上保持不变性。所述参考封闭序列14与靶链10B的双链体18的解链温度会始终小于所述参考封闭序列14和互补参考链10A的双链体16的解链温度，因为所述参考封闭序列14完全互补于所述参考链10A的至少一部分，并与所述靶链12A会有至少一个错配。
参照图2的步骤4，在优先变性后，降低所述反应混合物的温度，例如60℃，以允许所述引物对20A、20B退火至所述反应混合物中的游离靶链12A、12B和游离的参考链10B。附图标记20A是指所述正向引物而附图标记20B是指所述反向引物。如之前所述，通过与用于所述参考序列10相同的引物对20A、20B可以扩增所述靶序列12。图2的步骤5展示与最初的变性步骤比较的所述靶序列的两条游离链12A、12B和仅一条游离的参考链10B。另一条参考链10A与所述参考封闭序列14杂交，从而不可进行扩增。然后升高所述反应混合物的温度，例如72℃，以延伸所退火的引物20A、20B，从而相对于参考序列10富集反应混合物中的靶序列12的浓度。可以重复所述方法5至30个循环。
在图2中所示的方法可以并应该针对个别方案来优化。如果需要的话，可以在用于操作各种PCR和实时PCR设备的软件中体现这样的方案。
针对优选的参考封闭序列的设计考虑
如所提及的，所述参考封闭序列可以采取许多形式，但优选的形式是单链的不可延伸的DNA。更具体地，优选的参考封闭序列具有以下特点：
(a)包含长度高达200bp的单链DNA；
(b)具有比所述靶序列小几个碱基(例如在所述序列每侧的8-12个碱基)的长度，以致在退火至参考封闭序列时所述引物没有明显地结合所述参考序列；并且也没有明显地结合所述参考封闭序列自身；和
(c)含有阻止DNA聚合酶延伸的3'-末端。
以几种方法之一可以合成这样的参考封闭序列。首先，通过使用标准寡核苷酸合成方法的直接合成可以制备所述参考封闭序列，其允许修饰所述序列的3'-末端。所述3'-末端可以含有磷酸基、氨基、双脱氧核苷酸或阻止5'至3'聚合酶延伸的任何其他部分。可选地，通过产生单链DNA作为最终产品的PCR反应中的聚合酶合成可以制备所述参考封闭序列。在这种情况下，所产生的单链DNA对应于所述参考封闭序列所必需的确切序列。通过聚合酶合成的合成单链DNA的方法有几种并为本领域的技术人员所熟知。例如，不对称PCR或LATE PCR会是适合的。可选地，通过在固体支持物上结合双链PCR产物可以合成单链DNA的参考封闭序列。这通过使用引物对进行标准PCR反应实现，所述引物对其中之一是生物素化的。PCR后，将所述PCR产物与链霉亲和素包被的固体支持物(例如磁珠)孵育并使得其可以结合至所述珠。接着，升高温度至95℃2-3分钟以变性DNA并从固定化的PCR产物中释放非生物素化的DNA链至溶液中。然后去除有互补DNA链的磁珠而所述单链产物保留在所述溶液中用作所述参考封闭序列。
在使用所述单链参考封闭序列之前，优选地封闭3'-末端的聚合酶延伸。以本领域的技术人员所熟知的几种方法可以完成。例如，可以采用使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的反应，在溶液中存在双脱氧核苷酸(ddNTP)下，添加单个ddNTP至所述单链参考封闭序列的末端。ddNTP用于阻止聚合酶延伸。可选地，可以使用于所述参考封闭序列的3'-末端互补的寡核苷酸模板来提供瞬时的双链结构。然后，可以使用聚合酶在所述参考封闭序列的与所述杂交寡核苷酸相对的3'-末端插入单个ddNTP。
在以双链形式合成参考封闭序列的另一方法中，使用含有含有酶限制性位点的引物进行常规PCR来扩增野生型版本的感兴趣的序列。PCR扩增后，使用限制性酶消化所述PCR产物的两个末端并产生突出。然后在双脱氧核苷酸的存在下将这些突出进行聚合酶延伸，从而阻止两侧的3'-末端的进一步延伸。然后所述双链的3'-末端封闭的CR产物可以用作双链参考封闭序列。
寡核苷酸合成生成的参考封闭序列的具体实例
合成两种参考封闭序列：对应于p53基因外显子8区段的60bp(RBS60)和90bp(RBS90)参考封闭序列。表1含有合成的RBS60和RBS90参考封闭序列的列出的序列。由Integrated DNA Technologies有限公司合成所述RBS60和RBS90序列，其具有3'-封闭磷酸基团。使用在相同的外显子8片段中有突变的细胞系测试该方法(见，列于表1中)。
图3是示意图，展示与修改的全COLD-PCR富集相关联的RBS60参考封闭序列的使用。使用下划线的引物初步地扩增87bp的扩增子。针对图3中的参考链设计互补参考封闭序列(RBS60)。从图3中明显地看出，RBS60阻止所述引物结合并含有3'磷酸基以阻止延伸。
RBS60的方案：
最初使用常规PCR和引物ex8-167F与ex8-167R(表1)扩增来自p53外显子8的167bp的序列。所使用的基因组DNA是野生型DNA或野生型DNA中混合进3％突变体DNA的混合物。所使用的含有特定突变的突变体细胞系在表1中列出。
然后将PCR产物稀释500倍。然后，进行在25nM的参考封闭序列RBS60和200nM引物87f和87r存在下的全COLD-PCR反应，所述引物87f和87r扩增嵌套在167bp片段内的区域。使用PhusionTM聚合酶(NewEngland Biolabs)进行扩增。全COLD-PCR程序为：5个循环的常规PCR(95℃30sec；60℃30sec；72℃1min)；然后25个循环的全COLD-PCR(95℃30sec；70℃30sec；然后在Tc=84.5°C 3sec，然后在60℃30sec；72℃1min)X 25。可选地，通过采用与存在RBS60的全COLD-PCR完全相同的程序进行全COLD-PCR(没有RBS60)，但从所述反应混合物中省略RBS60。在RBS60存在下的全COLD-PCR(和全COLD-PCR(无RBS60)，和快速COLD-PCR，和常规PCR)之后使用较长的引物30T-p53-87F测序产物。
RBSS90的方案：
如对RBS60所详述的对RBS90应用相同的步骤，但不同的是用于嵌套全COLD-PCR的引物套为p53-ex8-115F和p53-ex8-115R而针对RBS90所用的Tc为Tc=84.4°C。
表1:
Figure BDA00002292139700171
Figure BDA00002292139700181
结果:
代表性结果如图所示，图4至图7表示RBS60而图8表示RBS90。在图4至7中，修饰的全COLD-PCR(存在RBS60的情况下)与全COLD-PCR(无RBS60)、快速COLD-PCR和常规PCR比较。
图4说明，在突变增加解链温度的情况下，通过修饰的全COLD-PCR(25nM RBS)的富集是稳健的(3％增加至37％)。在图4中，当使用快速COLD-PCR和常规PCR时不能检测到所述突变。图5类似地说明，在突变不影响解链温度的情况，通过修饰的全COLD-PCR(25nM RBS)的富集是稳健的(3％增加至47％)。在图5中，当使用快速COLD-PCR和常规PCR时也不能检测到所述突变。图6也说明，在突变减少解链温度的情况下，通过修饰的全COLD-PCR(25nM RBS)的富集对突变减少解链温度的情况是稳健的(3％增加至45％)。在图6中，通过快速COLD-PCR的富集也是稳健的(即由于降低的解链温度)。在图6中，当使用常规PCR时不能检测到所述突变。图7表示针对温度降低缺失的结果。通过修改的全COLD-PCR(25nm RBS)的富集是与过快速COLD-PCR的富集同样稳健的(从3％上升至45％)。当使用常规PCR时也不能检测到所述突变。
图8显示来自使用RBS90处理的样品的HCC1008突变等位基因富集的Sanger测序数据，并展示在90bp参考封闭序列存在下的修改的全COLD-PCR的富集是稳健的(从3％上升至38％)。图5中的结果(显示来自使用RBS60处理样品的富集的HCC1008突变等位基因的Sanger测序数据)与图8中的结果比较确认用不同长度的参考封闭序列的本发明的方法是稳健的。在所有情况并对至今所研究的所有突变，修改的全COLD-PCR(存在RBS)似乎具有最好的表现，其在短的反应时间中，富集所有类型的突变(Tm增加、保持或减少的突变)，并具有比全COLD-PCR(没有RBS)更好的富集。
Figure IDA00002292140500011
Figure IDA00002292140500021
Figure IDA00002292140500031
Figure IDA00002292140500041

Claims (24)

1.在扩增反应混合物中富集靶核酸序列的方法，所述方法包括：
a)制备扩增反应混合物，其包括至少以下成分：
具有参考序列并疑似具有一或多种靶序列的核酸样品，所述靶序列与所述参考序列具有至少50％同源性并可由与扩增所述参考序列所使用的引物对相同的引物对扩增，和
过量的参考封闭核酸序列，其与所述参考序列的一条链在其引物位点之间的至少部分序列完全互补；
b)使疑似具有所述靶序列的反应混合物处于第一变性温度，该温度高于所述参考序列的解链温度(Tm)以形成变性的参考链和变性的靶链；
c)降低所述反应混合物的温度以允许形成所述参考封闭序列与互补参考链的异源双链体以及所述参考封闭序列与靶链的异源双链体；
d)使所述反应混合物处于临界温度(Tc)，所述临界温度足以允许所述参考封闭序列与靶链的异源双链体优先变性，但不足以使所述参考封闭序列和互补参考链的异源双链体变性；
e)降低所述反应混合物的温度以允许所述引物对退火至所述反应混合物中游离的靶链以及任何游离的参考链；和
f)延伸所述引物对以相对于所述参考序列富集所述靶序列。
2.权利要求1的方法，其中封闭所述参考封闭序列的3'端以抑制延伸。
3.权利要求1的方法，其中所述参考封闭序列链的5'端包含阻止TaqDNA聚合酶的5'至3'核酸外切作用的核苷酸。
4.权利要求1的方法，其中在步骤a)中提供的参考封闭序列是单链的核酸参考封闭序列。
5.权利要求1的方法，其中在步骤a)中提供的参考封闭序列是双链核酸参考封闭序列，其在步骤b)中当所述反应混合物处于第一变性温度时变性以形成单链参考封闭序列。
6.权利要求1的方法，其中所述参考封闭序列是单链DNA、RNA、肽核酸或锁核酸之一。
7.权利要求1的方法，其中所述参考封闭序列是单链DNA、RNA、肽核酸或锁核酸或另一修饰的核苷酸之间的嵌合体。
8.权利要求7的方法，其中选择所述肽核酸或锁核酸在嵌合序列上的位置以匹配疑似存在突变的位置，从而使所述参考封闭序列与靶链的异源双链体变性所需温度和所述参考封闭序列与互补参考链的异源双链体变性所需温度之间的差异最大化。
9.权利要求1的方法，其中所述参考封闭序列与所述参考序列的一条链在其引物结合位点之间完全互补，或在一端与所述引物结合位点重叠。
10.权利要求1的方法，其中所述参考封闭序列等于或短于所述参考序列。
11.权利要求1的方法，其中冷却步骤c)少于一分钟。
12.权利要求1的方法，其中所述参考封闭序列以基本上等于25nM的量存在于所述反应混合物中。
13.权利要求1的方法，其中所述双链靶序列的解链温度高于或等于所述双链参考序列的解链温度。
14.权利要求1的方法，其中首先通过对所述反应混合物进行PCR扩增所述参考序列和靶序列，然后对所述反应混合物的至少一部分进行权利要求1的富集方法。
15.权利要求1的方法，其中所述靶序列包含纯合的突变。
16.权利要求1的方法，其中所述靶序列与所述参考序列的甲基化不同，并在对所述反应混合物实施权利要求1的方法前用亚硫酸氢钠处理所述反应混合物。
17.权利要求1的方法，其中所述参考序列和靶序列包含至少25个碱基对。
18.权利要求1的方法，其中重复所述方法两或更多个循环。
19.权利要求1的方法，其还包括使用一或多种方法分析所述具有富集的靶序列的反应混合物的步骤，所述方法选自：MALDI-TOF、HR熔解、双脱氧测序、单分子测序、焦磷酸测序、第二代高通量测序、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、数字PCR和定量PCR。
20.权利要求1的方法，其中所述Tc应用1秒至60秒。
21.权利要求1的方法，其中所述反应混合物含有核酸检测染料。
22.权利要求14的方法，其中所述方法在实时PCR装置中进行。
23.权利要求1的方法，其使用标记探针在实时反应条件下进行。
24.包含用于进行权利要求1的方法的程序指令的计算机可读介质。
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