ES2730675T3

ES2730675T3 - Reactivos para mejorar la precisión de la PCR

Info

Publication number: ES2730675T3
Application number: ES14743084T
Authority: ES
Inventors: John Rice; Lawrence J Wangh; Reis, Jr; Kenneth Pierce; Cristina Hartshorn; J Aquiles Sanchez; Hooser Stephen Van; Skye Fishbein
Original assignee: Brandeis University
Current assignee: Brandeis University
Priority date: 2013-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: HK1217517A1; WO2014116860A1; US11162146B2; US20140206564A1; US10301688B2; CA2898613A1; EP2948564A4; CN105164274A; US20190292610A1; US20220090216A1; CN105164274B; ZA201505826B; EP2948564A1; EP2948564B1

Abstract

Una mezcla de reacción de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que incluye, además de al menos una cadena de ácido nucleico que contiene al menos una secuencia diana, al menos un par de cebadores, una ADN polimerasa y dNTP en un tampón de reacción de la PCR, al menos un reactivo agregado que comprende almenos un par de oligonucleótidos complementarios con la capacidad de formar una concentración de 50-800 nM de un híbrido bicatenario de 6-50 pares de bases de longitud con una temperatura de fusión (Tm) de al menos 32 °C, teniendo dicho híbrido bicatenario un extremo que incluye fracciones de etiqueta unidos covalentemente, interactivos, una fracción fluorescente no plana voluminosa en una cadena y en la otra cadena, ya sea una fracción fluorescente voluminosa no plana o una fracción no voluminosa plana, en la que ninguna de las cadenas de dicho al menos un reactivo actúa como una sonda o un cebador en una cadena plantilla de la secuencia diana amplificada en la reacción.

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivos para mejorar la precisión de la PCR.

Campo

En la presente memoria se proporcionan reactivos para mejorar la precisión de la PCR.

Antecedentes

El laboratorio del solicitante ha descrito dos familias diferentes de reactivos que mejoran la especificidad del cebador cuando se agregan a una amplificación por PCR. Una familia de reactivos, descrita en la Solicitud de Patente Internacional WO 2006/044995, son los oligonucleótidos monocatenarios con forma de horquilla modificados en los extremos 3' y 5', de modo que el extremo del tallo se estabiliza con respecto a un híbrido ADN-ADN, como por adición de fracciones dabcilo, por adición de fracciones Extintor de Agujero Negro™, o por inclusión de 2' O-metil nucleótidos en el extremo del tallo. Los oligonucleótidos de tallo-bucle tienen bucles de 3-22 nucleótidos y tallos que tienen Tms calculados de 50-85 °C. Un Ejemplo de tal reactivo es dabcilo-CATTATAATGAAATTATAGTA-dabcilo (SEQ ID No. 1), donde los nucleótidos complementarios del tallo de nueve nucleótidos de longitud están subrayados. Entre las moléculas analizadas para la actividad informada en el documento WO 2006/044995 se encontraban moléculas en forma de horquilla que tienen fracciones FAM fluorescentes en los extremos 3' y 5' del tallo. Estas moléculas no fueron activas en la supresión de cebado incorrecto, incluso a 1000 nM. Se llegó a la conclusión de que "Agregar un par de fluoróforos FAM, que se cree que no interactúan entre sí de forma estabilizadora del vástago, fue desestabilizador, como lo fue la adición de un solo Dabcilo 5'". (WO 2006/044995 en la página 31, líneas 17-19).

La segunda familia de reactivos para la supresión de cebado incorrecto, descrita en la Solicitud de Patente Internacional WO 2010/105074, son pares de oligonucleótidos complementarios o parcialmente complementarios que forman un híbrido de 6-50 nucleótidos de longitud, en donde los oligonucleótidos se modifican en uno o ambos extremos por adición de fracciones policíclicas, por ejemplo, fracciones dabcilo, que no tienen porciones voluminosas que no son planas. Se probaron grupos no planas voluminosos, como la fluoresceína (FAM) y se consideró que no eran útiles como grupos modificadores en los aditivos de PCR. WO 2010/10507 en [0114]).

El documento WO 2010/105074 divulga oligonucleótidos de cadena doble modificados que tienen una longitud híbrida de 6-50 nucleótidos de longitud e incluyen 2-4 grupos modificadores, cada uno unido covalentemente a una región terminal diferente, por lo que dichos grupos modificadores son sustituyentes policíclicos que no tienen porciones voluminosas que no son planas.

Kainz et al., BioTechniques, vol. 28, no. 2, febrero de 2000, pág. 278-282 divulgan que se descubrió que fragmentos cortos de ADN bicatenario inhibían la actividad de los ADN polimerasas. Se encontró que la inhibición no era específica de la secuencia, sino que dependía exclusivamente de la temperatura de fusión de los fragmentos. No hay descripción de que tales fragmentos de ADN bicatenario deban tener ningún grupo modificador en los fragmentos de ADN bicatenario.

Sumario

La presente invención incluye procedimientos de PCR realizados en presencia de una clase completamente nueva de aditivos reactivos (en adelante "Reactivos") que exhiben al menos una manifestación de selectividad de polimerasa incrementada, como se define en las reivindicaciones. Los reactivos preferidos logran una mejora de la selectividad sin una inhibición significativa dependiente de la concentración de la actividad de 5'-Exonucleasa independiente del cebador de la enzima, o de la actividad sintética de la ADN polimerasa de la enzima, o ambas. Esta invención incluye además mezclas de reacción de PCR y kits de reactivos de PCR que incluyen uno o más de tales aditivos reactivos.

"PCR", como se usa en la presente memoria, se refiere al bien conocido procedimiento de amplificación de ácido nucleico conocido como la reacción en cadena de la polimerasa. Esta invención se aplica a procedimientos de PCR en general, que incluyen, por ejemplo, procedimientos de PCR simétricos y procedimientos de PCR no simétricos, tales como PCR asimétrica y lAt E-PCT. Se puede incluir la transcripción inversa (RT-PCR), si la diana es el ARN. Los procedimientos de PCR pueden incluir la detección de productos de amplificación, por ejemplo, mediante un colorante de unión a ADNds como SYBR Green, que emite fluorescencia cuando está en contacto con ADN bicatenario (ds) y sondas de oligonucleótidos cuya hibridación con la diana amplificada conduce a una señal detectable, por ejemplo, una señal fluorescente.

Como se usa en la presente memoria, "PCR no simétrica" significa una amplificación por PCR en donde se incluye un cebador (el cebador limitante) de un par de cebadores de PCR en la mezcla de reacción de amplificación en una cantidad límite para agotarse durante la reacción de amplificación, que continúa utilizando solo el otro cebador (el cebador de exceso), produciendo un producto de amplificación de cadena simple o "amplicón". Los procedimientos de PCR no simétricos incluyen PCR asimétrica, en donde la concentración de un cebador de un par de cebadores de PCR simétrica se reduce, generalmente por un factor de al menos cinco, y LATE-PCR. Como se usa en la presente memoria, "LATE-PCR" significa una amplificación de ADN no simétrica que emplea el proceso de PCR que utiliza un cebador de oligonucleótido (el "Cebador de exceso") en un exceso de al menos cinco veces con respecto al otro cebador (el "cebador de limitación"), que a su vez se utiliza a baja concentración, hasta 200 nM, para agotarse en ciclos de PCR aproximadamente suficientes para producir un amplicón bicatenario detectable, en donde la temperatura de fusión ajustada por concentración del cebador limitante a su secuencia totalmente complementaria es igual o superior a la temperatura de fusión ajustada en concentración del cebador de exceso al inicio de la amplificación, preferiblemente al menos tan alta y más preferiblemente 3-10 °C más alta; y en el que el ciclo térmico continúa durante múltiples ciclos después del agotamiento del cebador limitante para producir un producto de una sola cadena, a saber, el producto de extensión del cebador en exceso, a veces denominado "filamento de cebador en exceso". Los ensayos de amplificación y detección que utilizan procedimientos de PCR no simétricos pueden utilizar sondas de "baja temperatura", en donde el cebador de exceso tiene un exceso de al menos cinco veces con respecto al cebador limitante y la Tm de la sonda de detección está al menos 5 grados por debajo la Tm del cebador limitador.

Los reactivos de acuerdo con esta invención, así como los cebadores y las sondas, se describen aquí por sus temperaturas de fusión (Tm). La Tm es la temperatura a la cual el 50 % de un oligonucleótido existe en forma bicatenario, y el 50 % existe en forma de cadena simple. En esta aplicación, las Tm de los cebadores son valores ajustados por concentración calculados para secuencias de nucleótidos complementarias o no coincidentes utilizando el programa Visual OMP (DNA Software, Ann Arbor, MI) que utiliza una modificación patentada del procedimiento del "vecino más cercano" (Santa Lucia, J. (1998), PNAS (Estados Unidos) 95: 1460-1465 y Allawi, H.T. and Santa Lucia, J. (1997), Biochem. 36: 10581-10594), con concentraciones de sal normalmente establecidas en 50 mM catión monovalente y 3 mM catión divalente. Para los Reactivos y las sondas, las Tm se calculan inicialmente mediante ese procedimiento, ignorando las fracciones unidas covalentemente y las estructuras secundarias. Debido a que los Reactivos y las sondas incluyen fracciones unidas covalentemente, como fluoróforos y desactivadores, se entiende que las Tm reales pueden diferir ligeramente de los valores calculados debido a las acciones de dichas fracciones. Si una mezcla de reacción de amplificación que contiene un reactivo se somete a un análisis de fusión (o un análisis de fusionamiento), se obtiene una Tm real u "observada" del reactivo en esa mezcla de reacción. Las Tm reales de las sondas marcadas generalmente se pueden determinar empíricamente, incluidas las sondas estructuradas, tal como las sondas de sondas moleculares

Se hace referencia a la selectividad. Por "selectividad" se entiende generalmente la preferencia de una ADN polimerasa para extender los extremos 3' con ranuras durante el proceso de síntesis de ADN cuando se cumplen ciertas condiciones. De acuerdo con este entendimiento, un tipo de selectividad es la preferencia de una ADN polimerasa para extender un extremo 3' con ranura de un híbrido cuando la región 3'-terminal, que incluye particularmente el nucleótido 3' terminal, del extremo 3' con ranura es perfectamente complementario, es decir, se hibrida con desajuste. Dicho de otra manera, este tipo de selectividad es la selectividad frente a una secuencia de cebado 3'-terminal que no se ajusta perfectamente a su diana. La selectividad frente a los desajustes de la región 3'-terminal se aplica a los híbridos cebador-diana, donde significa la preferencia de una polimerasa por un híbrido cebador-diana que es perfectamente complementario en el extremo 3' del cebador sobre un híbrido cebador-diana que tiene un desajuste en, por ejemplo, el nucleótido 3'-terminal. La mejora en la discriminación contra los cebadores no coincidentes a veces se denomina una mejora en la selectividad de la polimerasa o una mejora en la especificidad del cebador. La selectividad contra los desajustes de la región 3'-terminal también se aplica más generalmente a los híbridos que tienen extremos 3' extensibles y empotrados formados por cualquiera de las dos cadenas de ADN en una mezcla de reacción de amplificación, como puede ocurrir cuando una cadena de amplicón se hibrida con (es decir, ceban) otra cadena de amplicón. La medida de selectividad del tipo anterior es la diferencia (AC^t) entre el ciclo de umbral (C^t) de la señal de amplificación del híbrido no preferido, por ejemplo, el híbrido formado por un cebador y una diana no coincidente y el C^tde señal de la amplificación del híbrido preferido, por ejemplo, el híbrido formado por un cebador y una diana emparejada. La mejora en la selectividad debida al uso de un aditivo, como los Reactivos descritos en la presente memoria, es la diferencia neta de C^t(AAC^t) obtenida al restar el AC^tsin ningún aditivo del AC^tque resulta con el aditivo. En otras palabras, el valor del ciclo de umbral, C^t, de un cebador de coincidencia perfecta con su cadena de plantilla siempre es más pequeño que el valor de la C^tde un cebador mal emparejado con la cadena de plantilla, y la inclusión de un aditivo puede aumentar la diferencia entre estos valores de C^t.

El aumento de la selectividad de la polimerasa se manifiesta en al menos una de las siguientes formas: 1) supresión de cebado incorrecta; 2 ) mayor especificidad del cebador para híbridos cebador-diana perfectamente complementarios y contra híbridos que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que no son perfectamente complementarias; 3) mayor selectividad de la polimerasa para híbridos de cebador-diana que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que son ricas en GC y contra híbridos que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que son ricas en AT; 4) supresión de la evolución del producto; 5) reducción de la dispersión entre las reacciones replicadas.

Se hace referencia a la eficacia de la polimerasa. Por "eficiencia" se entiende la tasa de actividad de la polimerasa, ya sea la cinética cuantificada de la escisión de la sonda a través de la actividad de la 5'exonucleasa independiente del cebador o la cinética cuantificada de la amplificación del producto a través de la actividad de la polimerasa. La cinética de la escisión de la sonda independiente del cebador se manifiesta como la pendiente de la curva de producción de fragmentos escindidos. El efecto de un Reactivo u otro aditivo se evidencia por un cambio, generalmente una reducción, en la pendiente. La cinética de la actividad de la polimerasa se manifiesta como el C^tde una reacción de amplificación. El efecto de un Reactivo u otro aditivo se evidencia por un cambio, generalmente un aumento, en la C^tentre la amplificación de una diana perfectamente emparejada con el Reactivo u otro aditivo y sin el Reactivo u otro aditivo. A veces se hace referencia a los efectos cinéticos negativos como "inhibición". La inhibición también se evidencia por una reducción en la producción de productos amplificados, que puede mostrarse por una reducción en la intensidad de SYBR o la señal de la sonda o por la disminución de las magnitudes de picos y valles en curvas de primera derivada.

Los Reactivos, así como los cebadores y las sondas, útiles en procedimientos, mezclas de reacción y kits de esta invención son oligonucleótidos en sentido amplio, lo que significa que pueden ser ADN, ARN, mezclas de ADN y ARN, y pueden incluir nucleótidos no naturales (por ejemplo, 2'O-metil ribonucleótidos y nucleótidos unidos), enlaces internucleótidos no naturales (por ejemplo, enlaces de fosforotioato) y miméticos de ADN (por ejemplo, PNA). Tanto los cebadores como las sondas funcionan en parte al hibridar con una secuencia de interés en una mezcla de reacción. En los ejemplos a continuación, se utilizan cebadores, sondas y Reactivos que son ADN, que se prefieren.

Un Reactivo en mezclas de reacción de PCR, procedimientos y kits de acuerdo con algunas realizaciones de esta invención comprende dos oligonucleótidos complementarios que forman un híbrido bicatenario. En ciertas realizaciones, el Reactivo tiene una o más de las siguientes características:

Longitud: las dos cadenas de oligonucleótidos forman un híbrido que tiene al menos seis nucleótidos de longitud, preferiblemente 6-50 nucleótidos de longitud.

Tm: el Reactivo tiene una Tm calculada de al menos 32 °C. Un Reactivo más preferido tiene una Tm calculada no más de 5 °C por debajo de la temperatura de extensión del cebador de la reacción de PCR, lo que generalmente significa una Tm calculada de al menos 55 °C en una PCR de 2 pasos que tiene una etapa de recocido y extensión combinada de 60 grados, o al menos 67 °C en una PCR de 3 pasos que incluye un paso de extensión de 72 °C. Un Reactivo preferido puede tener una Tm calculada que es más alta que la temperatura de extensión del cebador de la reacción de PCR, lo que generalmente significa una Tm por encima de 60 °C en una PCR de 2 pasos, o superior a 72 °C en una PCR de 3 pasos, o en algunos casos, por encima de 75 °C o incluso por encima de 78 °C. En ciertas realizaciones preferidas, un Reactivo preferido tiene una Tm calculada que es más alta que la Tm de sonda más alta.

Estructura híbrida: en la reacción de PCR, el Reactivo actúa para mejorar la selectividad de la polimerasa cuando es bicatenario. Ninguna de las cadenas del Reactivo actúa como una sonda en una cadena de plantilla amplificada en la reacción porque ninguna de las cadenas es complementaria de ninguna cadena de plantilla amplificada en la reacción. Ninguna de las cadenas actúa como un cebador en una línea de plantilla amplificada en la reacción, porque la polimerasa no puede extender el extremo 3' del Reactivo o porque no está disponible el extremo 3' del Reactivo para contactar una plantilla amplificada o porque ninguna de las cadenas es complementaria a cualquier filamento de la plantilla amplificado en la reacción.

Etiquetado: un extremo del híbrido incluye etiquetas interactivas, es decir, etiquetas que interactúan para detener o modificar la fluorescencia del Reactivo cuando es bicatenario. Un nucleótido en un extremo del híbrido en la forma bicatenario del Reactivo, preferiblemente un nucleótido dentro de los tres nucleótidos del extremo híbrido, más preferiblemente un nucleótido terminal e incluso más preferiblemente un nucleótido 5'-terminal, tiene una fracción voluminosa unida covalentemente, fluorescente no plana, preferiblemente un fluoróforo; mientras que un nucleótido en la cadena complementaria, preferiblemente un nucleótido dentro de tres nucleótidos del extremo híbrido, más preferiblemente un nucleótido terminal, e incluso más preferiblemente un nucleótido 3' terminal, tiene otra fracción voluminosa, no plana, unida covalentemente, por ejemplo un fluoróforo, o una fracción de extintor plana no voluminosa unida covalentemente, preferiblemente una fracción no fluorescente que absorbe energía luminosa pero libera energía en forma de calor (un extintor no fluorescente o, para abreviar, un "extintor"). Dichas etiquetas unidas covalentemente en los extremos 5' y 3' de la forma bicatenario del Reactivo se colocan de manera que estas etiquetas interactúen. La interacción es preferiblemente por contacto (que proporciona, por ejemplo, la extinción del contacto), y dicho contacto se mejora al hacer que los extremos de la etiqueta tengan extremos romos en el híbrido bicatenario preferido. Cuando se usan dos fracciones fluorescentes que interactúan, preferiblemente son colores distinguibles.

Concentraciones relativas de cadenas: en realizaciones preferidas que incluyen un fluoróforo se agrega a una concentración que es igual o mayor que, preferiblemente 1,5-10 veces y un extintor, la cadena marcada con extintor mayor que, incluso más preferiblemente 2-5 veces mayor que, la concentración de la cadena complementaria.

En un procedimiento, mezcla de reacción o kit de acuerdo con esta invención, un solo Reactivo puede ser el único componente que mejora la selectividad. Como alternativa, se pueden incluir dos Reactivos, preferiblemente uno de los cuales tiene una Tm al menos 5 °C más alta que la Tm del otro. Dos Reactivos pueden comprender cuatro cadenas o, al compartir una cadena común, solo tres cadenas. Como segunda alternativa, también se puede incluir un reactivo bicatenario multidabcilado con un reactivo, en el que el Reactivo dabcilado tiene una longitud de 6-50 nucleótidos híbridos, no es extensible por la polimerasa y tiene tres o cuatro fracciones dabcilo terminales. El Reactivo y el reactivo dabcilado pueden comprender cuatro cadenas o, si comparten una cadena común, solo tres cadenas. Como otra alternativa más, se puede incluir una polimerasa de inicio en caliente o una enzima de inicio en caliente con cualquiera de los anteriores como un componente adicional que mejora la selectividad.

En los procedimientos de acuerdo con esta invención, se agrega un Reactivo a la mezcla de reacción de PCR inicial a una concentración suficiente para aumentar la selectividad de la polimerasa sin aumentar el número de ciclos térmicos necesarios para que el producto correcto alcance su C^ten más de 10 ciclos, preferiblemente en ningún caso. Más de 5 ciclos, más preferiblemente por 3 ciclos o menos. Un Reactivo se agrega típicamente a una mezcla de reacción de PCR en una concentración en el intervalo de 25-800 nM, preferiblemente en el intervalo de 50-800 nM, más preferiblemente en el intervalo de 50-300 nM, e incluso más preferiblemente en el intervalo de 50-200 nM. En ciertos procedimientos de esta invención, más de un Reactivo ("Reactivo(s)" significa generalmente uno o más Reactivos) se puede agregar a una sola reacción, en cuyo caso los intervalos de concentración citados anteriormente son las concentraciones totales de dichos Reactivos agregados.

Los procedimientos de esta invención incluyen reacciones de amplificación por PCR, que incluyen reacciones de RT-PCR, para producir uno o más productos amplificados, en donde la mezcla de reacción de amplificación contiene un Reactivo para mejorar la selectividad de la polimerasa. Los procedimientos preferidos incluyen además la detección de fluorescencia de productos amplificados. Para la detección de productos bicatenario, la mezcla de reacción puede contener un colorante de ADN, por ejemplo, el colorante SYBR Green, que emite fluorescencia en presencia de ADN bicatenario, que es un colorante de ADN bicatenario. El fluoróforo de un Reactivo puede emitir en la longitud de onda de emisión del colorante, ya que la fluoresceína emite en la longitud de onda de emisión del colorante SYBR Green. Alternativamente, un fluoróforo de un Reactivo puede emitir en la longitud de onda de emisión del colorante cuando las cadenas del Reactivo están separadas y puede apagar la fluorescencia en la longitud de onda del colorante SYBR Green cuando las cadenas del Reactivo son bicatenario. En ese caso, la detección de un producto bicatenario de señalización de emisión de colorante (amplicón) también detectará no solo la emisión de SYBR no enmascarada, si la hubiera, que emana del reactivo bicatenario de reactivos sino también la emisión de fluoróforos del Reactivo, incluidos los Reactivos sin emisión de fluoróforos a temperaturas a las que el Reactivo(s) es al menos parcialmente monocatenario. Se apreciará que a medida que aumenta la temperatura de la mezcla de reacción, la emisión de colorante disminuirá debido a la fusión de la cadena del amplicón, pero la emisión de fluoróforo aumentará debido a la fusión de la cadena del Reactivo(s). Si las temperaturas de fusión (Tm) de un amplicón y un Reactivo son detectables de manera detectable, la primera derivada de una curva de fusión incluirá picos y/o valles separados indicativos de sus estados dependientes de la temperatura como moléculas bicatenario (unión de colorante) y moléculas de unión (no ligantes). Alternativamente, un Reactivo(s) puede marcarse con un fluoróforo que no emite a la longitud de onda de emisión del colorante ADNds, por ejemplo, la combinación del colorante SYBR Green y un fluoróforo Cal Red. En ese caso, la detección en el canal SYBR (o Fluoresceína) detectará la emisión del colorante unido a la forma bicatenario del amplicón, y detectará la extinción de SYBR de la forma bicatenario del Reactivo(s). Además, la detección de la hibridación dependiente de la temperatura y la separación de las cadenas de Reactivo(s) será posible en el canal Cal Red, por ejemplo.

Los Reactivos también se pueden usar en combinación con una o más sondas marcadas con fluorescencia que emiten una señal detectable cuando se hibridan con sus dianas. Mientras que el colorante del ADNds señala que se ha producido algún producto bicatenario, que incluye, por ejemplo, dímeros de cebador, las sondas de hibridación específicas de la diana señalan la producción de un producto en particular, a saber, el producto deseado. El Reactivo o los Reactivos en una reacción pueden estar marcados con el mismo fluoróforo o fluoróforos que una o más sondas, o el Reactivo(s) puede incluir un fluoróforo o fluoróforo espectralmente distinto. Nuevamente, si las Tm del Reactivo(s) y los amplicones son diferentes, la primera derivada de una curva de fusión incluirá picos y valles separados indicativos de sus estados dependientes de la temperatura como moléculas bicatenarias y moléculas monocatenarias.

Los Reactivos de acuerdo con esta invención generan una señal fluorescente en condiciones particulares a una temperatura conocida, mejor vista como un valle de fusión (o recocido) (es decir, un pico negativo) en una primera curva de fluorescencia derivada, en lo sucesivo referida como una "marca de temperatura". Por esa razón, un Reactivo puede servir como un estándar interno de temperatura en cada reacción. La marca de temperatura revela variaciones y diferencias entre las reacciones. Tal marca de temperatura tiene tres valores independientes: 1) la profundidad de su "valle" es característica de la cantidad de reactivo agregado a la reacción; 2 ) la temperatura a la cual su "valle" alcanza su valor más bajo es la Tm empírica observada del reactivo; 3) el ancho del valle a "media profundidad" es una medida del proceso dependiente de la temperatura de formación de doble cadena/cadena sencilla y fusión del reactivo.

Se espera que cada una de las propiedades de marca de temperatura anteriores sea una propiedad constante del (de los) Reactivo(s) correspondiente(s) en reacciones de replicación idénticas. Este es el caso porque el Reactivo(s) no se amplifica o se degrada durante el curso de la reacción. Por lo tanto, una diferencia en una o más propiedades de la marca de temperatura en reacciones repetidas proporciona evidencia de no uniformidad entre las repeticiones. Estas propiedades de las marcas de temperatura también se pueden usar para corregir matemáticamente las no uniformidades entre las reacciones repetidas, así como para cuantificar los productos amplificados en una reacción en relación con las marcas de temperatura del reactivo(s) no amplificado(s).

Como apreciará un experto en la técnica, también es posible utilizar en una reacción de amplificación por PCR dos Reactivos diferentes que tienen secuencias de oligonucleótidos que no hibridan en cruz para sus cadenas dobles que tienen Tm significativamente diferentes, por ejemplo, el Reactivo2 con una Tm de 71 °C y Reactivo3 con una Tm de ~50 °C. Dichos reactivos sin hibridación cruzada se pueden etiquetar en el mismo color o en colores diferentes. Es preferible etiquetar ambos Reactivos en el mismo color, por ejemplo, FAM, de modo que en ausencia de cualquier otro híbrido sonda/diana, ambos se detecten en el mismo canal de color y aparezcan en la misma curva. En estas circunstancias, una curva de fusión en un amplio intervalo de temperatura tiene dos valles cuando se expresa como primeras derivadas y la distancia entre los puntos más bajos en estos dos valles, en este Ejemplo, es de 21 °C (71 50). La construcción de dos marcas de temperatura muy diferentes es ventajosa, ya que la distancia entre las dos marcas se conoce de antemano y se puede utilizar para garantizar que cada reacción abarca el mismo intervalo de temperaturas.

Después de cualquier número de ciclos térmicos deseados, se puede construir una relación de intensidades fluorescentes: señal de muestra/señal de marca de temperatura. Dado que la señal de temperatura es la misma en reacciones repetidas, el cálculo de la relación anterior proporciona una medida cuantitativa de la cantidad de producto acumulado después del número elegido de ciclos térmicos. Y, si un conjunto estándar de valores de relación se construye primero utilizando números conocidos de copias de destino al inicio de la amplificación, la relación observada de la muestra experimental se puede usar para establecer el número de copia de destino en la muestra original.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A muestra la estructura cristalina de la Taq Polimerasa sin nada acoplado a ella.

La figura 1B muestra un modelo informático de esa estructura en el que tanto el sitio poli como el sitio 5'exo son llenados con dabcilo.

Las figuras 2A-2C son gráficas de fluorescencia de Fam frente al número de ciclo resultante del ensayo de temperatura de oscilación independiente del cebador del Ejemplo 2, sin reactivo agregado, reactivo conocido y Reactivo de acuerdo con esta invención, respectivamente.

Las figuras 3A-3O son gráficas de la fluorescencia de SYBR Green versus el número de ciclo resultante del ensayo de especificidad del cebador del Ejemplo 3 sin usar aditivo de reactivo o diferentes concentraciones de ReactivoA, ReactivoC, Reactivo o Reactivo1'.

La Figura 4 es un gráfico de la fluorescencia de SYBR Green versus el número de ciclo resultante del ensayo del Ejemplo 4 usando Reactivo1 y Reactivo2.

Las figuras 5A-B son curvas de fusión de Reactivo1 y Reactivo2 a diferentes concentraciones.

Las figuras 6A-F son perfiles de fusión, derivados de fluorescencia frente a temperatura, obtenidos en el ensayo múltiple del Ejemplo 6 con diferentes concentraciones de Reactivo!

La Figura 7A presenta gráficas de fluorescencia de SYBR Green versus número de ciclo para cada una de las dos dianas y una cantidad de Reactivo1 o Reactivo2 en el ensayo del Ejemplo 7; más las curvas de fusión de la sonda de fluorescencia de ese ensayo.

La Figura 7B presenta curvas derivadas de las curvas de fluorescencia de SYBR Green de la Figura 7A.

La Figura 7C presenta curvas derivadas de la fluorescencia del Reactivo1 y del Reactivo2 en el ensayo del Ejemplo 7.

La Figura 8A es un gráfico de la fluorescencia SYBR Green en tiempo real de muestras sin reactivo y muestras con Reactivo2 en el ensayo del Ejemplo 8.

Las figuras 8B y 8C son curvas derivadas de la fluorescencia SYBR Green de la Figura 8A para muestras con Reactivo2 y sin reactivo, respectivamente.

La Figura 9 es una tabla que presenta la demora en el ciclo de umbral que resulta de la inclusión de una concentración dada de Reactivo1 en el ensayo del Ejemplo 9 para una serie de dianas que no coinciden en gran medida con el cebador limitante utilizado para la amplificación.

La Figura 10 presenta perfiles de fusión de múltiples sondas de ACTIVACIÓN/DESACTIVACIÓN en el ensayo multiplex del Ejemplo 10 con la adición de un aditivo de la técnica anterior o Reactivo!

Las figuras 11A-B presentan curvas de fusión de un ensayo por triplicado del Ejemplo 11 sin aditivo, con un anticuerpo de inicio en caliente y con un anticuerpo de inicio en caliente más Reactivo1 en el color de las sondas de ACTIVACIÓN/DESACTIVa C iÓN y en el color del Reactivo1, respectivamente.

La Figura 12A presenta curvas de fusión del Reactivo1 en varios puntos durante la reacción de amplificación del Ejemplo 12.

La Figura 12B presenta curvas de fusión post-amplificación de la sonda y del Reactivo1 en el ensayo del Ejemplo 12.

La Figura 13A presenta curvas de fusión del Reactivol en 24 repeticiones sometidas a sesenta ciclos de PCR.

Las Figuras 13B-D presentan curvas de fusión de un ensayo multiplex descrito en el Ejemplo 13 para muestras normales y mutantes en colores de sondas para diferentes dianas, a saber, FAM, Cal Orange y Cal Red, respectivamente.

La Figura 13E presenta curvas de fusión en Cal Orange que muestran un cambio en la temperatura de fusión del Reactivo1 entre dos muestras mutantes, una de las cuales no amplificó.

La Figura 13F presenta curvas de fusión para el Reactivo1 en el ensayo descrito en el Ejemplo 11 para muestras con Reactivo1 y para muestras con anticuerpo de arranque en caliente más Reactivol

Las Figuras 14A-F presentan curvas de fusión del ensayo descrito en el Ejemplo 14 para muestras con cantidades variables de ADN de plantilla y Taq Polimerasa regular o Taq Polimerasa del anticuerpo más sin reactivo, un aditivo dabcilado, bicatenario, o el aditivo bicatenario dabcilado y Reactivol

Las Figuras 15A-C presenta la curva en tiempo real de la fluorescencia de la sonda del ensayo descrito en el Ejemplo 15 para muestras que contienen Taq Polimerasa de inicio en caliente y sin reactivo o Reactivo2, para muestras que contienen Taq Polimerasa de inicio en caliente con anticuerpo y para muestras que contienen Taq regular polimerasa y Reactivo2, respectivamente.

La Figura 16 presenta curvas de fusión en mezclas de reacción de PCR del Reactivo4 o de una combinación de Reactivo3 y Reactivo4.

Las Figuras 17A-C presentan curvas de fusión de Reactivos que pueden obtenerse a partir de tres muestras repetidas, cada una equipada con una curva Gaussiana.

La Figura 17D muestra firmas de fluorescencia que pueden obtenerse de una muestra antes y después del ajuste.

La Figura 17E muestra firmas de fluorescencia que pueden obtenerse de una muestra después del ajuste, presentadas como fluorescencia normalizada y como una segunda curva derivada.

La Figura 18 es un gráfico que muestra las estructuras químicas de diversas fracciones de enfriamiento.

La Figura 19 es un gráfico que muestra las estructuras químicas de diversos fluoróforos.

La Figura 20A muestra firmas fluorescentes de réplicas en la primera fusión antes del comienzo de una reacción de amplificación con la línea (201), son réplicas que no contienen polimerasa, mientras que la línea (202) son las réplicas que contienen polimerasa.

La Figura 20B muestra firmas fluorescentes de réplicas de la segunda fusión después de una reacción de amplificación, una vez que la polimerasa tiene la oportunidad de extender la cadena acortada marcada con fluoróforo.

La Figura 21A muestra el promedio de firmas fluorescentes Quasar670 de réplicas para cada cepa y sin control de plantilla para la primera fusión antes del inicio de una reacción de amplificación.

La Figura 21B muestra el promedio de las firmas fluorescentes Quasar 670 de las repeticiones de la segunda fusión después de que se completan 60 ciclos térmicos.

La Figura 21C muestra el perfil de fusión para las dianas embB e inhA utilizando las firmas fluorescentes Cal Red 610 promedio para cada cepa y sin control de plantilla.

Descripción detallada

El ADN es una doble hélice con la mano derecha que consta de dos cadenas de oligonucleótidos que se ejecutan en direcciones opuestas, antiparalelas, es decir, de 3' a 5' y de 5' a 3'. Cuando el ADN se replica, las dos cadenas se desenrollan temporalmente por la ADN topoisomerasa y la ADN helicasa, que forman parte del complejo de ADN polimerasa tipo III. Las cadenas simples resultantes sirven como plantillas para la síntesis de nuevas cadenas complementarias de pares de bases. Los precursores de nucleótidos incorporados en las nuevas cadenas de ADN durante el proceso de replicación siempre se incorporan en la dirección 3' a 5' porque el proceso de replicación se activa durante la adición de cada nuevo nucleósido por escisión de los pirofosfatos 5' de los precursores de trifosfato. Como consecuencia de estos hechos, una nueva cadena, la cadena principal, crece continuamente en la horquilla de replicación a través de la acción de la ADN polimerasa III, mientras que la otra cadena, la cadena retrasada, se sintetiza de manera discontinua. La síntesis discontinua comienza con la síntesis de un cebador de ARN por la enzima Primasa. El cebador de ARN luego se extiende con desoxinucleótidos por la acción de la Polimerasa III. Los ADN polimerasas tipo III son enzimas diméricas. Una vez que el fragmento de Okazaki resultante se apoya en el extremo 5' del cebador de ARN adyacente, dicho cebador se digiere por la acción de la ADN polimerasa de Tipo I que también actúa para extender el extremo 3' del fragmento corriente arriba. La brecha resultante entre los fragmentos de ADN de la cadena retrasada se cierra por la acción del ADN ligasa.

La Taq Polimerasa y otros ADN polimerasas estables térmicamente utilizadas en la amplificación por PCR son las polimerasas tipo I. Tienen una actividad de Exonucleasa de 5' a 3' además de la actividad de polimerasa sintética de ADN de 3' a 5'. Los estudios cristalográficos de rayos X de la Taq Polimerasa muestran que esta enzima es una molécula monomérica compuesta por tres dominios no idénticos, que se muestran en general en la Figura 1A. El dominio de la polimerasa de la enzima se describe como que tiene la forma de una palma de la mano derecha 101 con los dedos 102 y un pulgar 103. La parte bicatenario de una plantilla de ADN replicante se encuentra en la palma, colocando así el extremo 3' del extremo cadena cebadora en el sitio catalítico de dominio polimerasa 104. La unión de la molécula de ADN hace que los dedos y el sitio catalítico se muevan más cerca del extremo 3' donde se agrega un nuevo nucleótido. El filamento 5' extendido de la plantilla se desliza entre los dedos y el pulgar (en el plano de la página en la Figura 1A). El sitio catalítico 105 del dominio de 5'exonucleasa está ubicado en el lado posterior del dominio como se ve en la Figura 1A.

La enzima exhibe actividad de 5'exonucleasa dependiente del cebador e independiente del cebador, pero, debido a que la enzima solo se une al ADN bicatenario, la existencia de estas dos actividades de 5'exonucleasa sugiere que puede cortar un extremo 5' monocatenario mientras se aproxima a este una estructura desde cualquier dirección. Se cree que el dominio de 5'exonucleasa de la enzima se extiende por debajo de la palma del dominio de la polimerasa como se muestra en la Figura 1A, o para girar hacia arriba con el fin de llevar el sitio activo de la 5'exonucleasa en la parte superior de la palma en las proximidades del sitio catalítico de la polimerasa.

Como se resumió anteriormente, la Solicitud de Patente Internacional WO2010/105074 describe una clase de oligonucleótidos modificados químicamente que tienen 1-4 fracciones planas no voluminosas (preferiblemente fracciones dabcilo, véase la Figura 18) en uno a cuatro nucleótidos terminales que pueden inhibir la actividad polimerasa de la enzima cuando se agrega a una reacción de amplificación por PCR a una alta concentración. Sin embargo, cuando se agrega el mismo reactivo a una concentración más baja, inhibe la actividad de la 5'exonucleasa y también aumenta la selectividad de la polimerasa. El aumento de la selectividad de la polimerasa se manifiesta en al menos una de las siguientes formas: 1 ) supresión de cebado incorrecta; 2 ) mayor especificidad del cebador para híbridos cebador-diana perfectamente complementarios y contra híbridos que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que no son perfectamente complementarias; 3) mayor selectividad de la polimerasa para híbridos de cebadordiana que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que son ricas en GC y contra híbridos que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que son ricas en AT; 4) supresión de la evolución del producto; 5) Reducción de la dispersión entre las reacciones replicadas. Por lo tanto, es plausible que el reactivo agregado se una preferentemente al sitio de 5'exonucleasa de la enzima y por lo tanto altera la selectividad de la polimerasa por un cambio alostérico en la forma del sitio de la polimerasa. Además, es plausible que el mismo reactivo se una al sitio de polimerasa de la enzima, pero solo a una concentración más alta.

La línea de razonamiento anterior ahora está respaldada por el cálculo fisicoquímico de la probabilidad de que las fracciones dabcilo en los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido puedan unirse a uno o ambos del sitio catalítico de 5'exonucleasa y el sitio catalítico de polimerasa de la Taq Polimerasa. El Ejemplo 1 describe los programas de ordenador utilizados para hacer estos cálculos. El resultado de tal prueba se llama "puntuación de g LiDE". Cuanto más negativo sea la puntuación de GLIDE, mayor será la probabilidad de que la fracción química bajo investigación se una al sitio de unión propuesto en la proteína. Los resultados en el Ejemplo 1 generaron las siguientes puntuaciones de GLIDE para el sitio de la polimerasa: interacción 5'dabcilo = puntuación de GLIDE -4,84, interacción 3'dabcilo = -8,08; y para el sitio de 5'exonucleasa: interacción 5'dabcilo = puntaje de GLIDE -5,33, interacción 3'dabcilo = puntaje de GLiDE -10,03. Estos resultados indican que la interacción del sitio de la 5'exonucleasa con el 3'dabcilo es particularmente probable, y el examen de un modelo de relleno de espacio del oligonucleótido modificado con la superficie de la proteína confirma un buen ajuste en este sitio. La evidencia de interacción de los grupos dabcilo con el sitio de la polimerasa no fue tan buena como para el sitio de la Exonucleasa, ya que los grupos dabcilo ingresaron a la palma a través del orificio entre los dedos y el pulgar. En conjunto, la evidencia anterior sugiere un modelo en el que el sitio de 5'exonucleasa de un monómero Taq se une preferentemente a un oligonucleótido dabcilado, y un segundo oligonucleótido dabcilado se une al sitio de la polimerasa en una concentración más alta. Este modelo asume que la unión del oligonucleótido en el sitio de la 5'exonucleasa alostéricamente altera la forma del sitio de la polimerasa, haciéndolo más selectivo.

A la luz de la evidencia discutida anteriormente, fue sorprendente descubrir una clase completamente nueva de reactivos, en lo sucesivo denominados "Reactivos" (Reactivo1, Reactivo2, etc.). Cuando se agregan a una reacción de PCR, los Reactivos de acuerdo con esta invención exhiben al menos una manifestación de selectividad incrementada de la polimerasa, como se definió anteriormente, sin una inhibición significativa dependiente de la concentración de la actividad 5'exonucleasa independiente del cebador de la enzima, o una dependencia significativa dependiente de la concentración Inhibición de la actividad de la polimerasa. Igualmente, sorprendente, estos reactivos están compuestos por dos oligonucleótidos complementarios, al menos uno de los cuales, contrariamente a la enseñanza de la Solicitud de Patente Internacional WO 2010/105074, tiene una fracción que es o incluye una porción no plana voluminosa. Dicha fracción es preferiblemente un fluoróforo, en un nucleótido terminal, preferiblemente un nucleótido 5', y en el que el nucleótido 3' terminal de la cadena complementaria se modifica con otra fracción voluminosa, o preferiblemente una fracción plana sin una porción voluminosa, para, por ejemplo, dabcilo o un Extintor de Agujero Negro o extintor de agujero negro, ambos de los cuales se muestran en la Figura 18 y que se denominan "extintores" porque, en lugar de emitir energía absorbida como luz, emiten energía absorbida como calor. La Figura 19 muestra las estructuras de los fluoróforos voluminosos utilizados en combinación con los Reactivos de la presente memoria, pero como apreciará un experto en la técnica, estos fluoróforos particulares son solo algunos de los muchos fluoróforos conocidos y fracciones no fluorescentes similares que se unen fácilmente a una cadena de oligonucleótidos.

En realizaciones preferidas que utilizan un extintor, la cadena que lleva la fracción del extintor se agrega a una concentración suficiente para reducir la intensidad de fluorescencia de la cadena marcada con fluorescencia hasta un nivel aceptable mediante extinción mediante hibridación. Normalmente, esa concentración al menos aproximadamente es igual a la concentración de la cadena marcada con fluorescencia. En realizaciones preferidas, la cadena marcada con interruptor se agrega a una concentración que es igual o mayor que, preferiblemente, 1,5-10 veces mayor que, lo más preferiblemente 2-5 veces mayor que, la concentración de la cadena complementaria. Esto garantiza que todas las cadenas marcadas con una fracción fluorescente unida covalentemente se hibridarán con una cadena marcada con extintor a medida que la temperatura disminuye gradualmente y, como consecuencia, la fluorescencia se extinguirá a su nivel más bajo posible.

Se emplean cinco realizaciones diferentes de reactivo según esta invención (Reactivo1, Reactivo1', Reactivo2, Reactivo3 y Reactivo4) en los ejemplos descritos a continuación. Sus secuencias de oligonucleótidos y su marcación se resumen en la Tabla 1. En la Tabla 1, "F" denota una fracción fluorescente unida, preferiblemente un fluoróforo (véase Figura 19); "Q" denota una fracción de desactivador, preferiblemente un desactivador no fluorescente, y más preferiblemente un desactivador de agujero negro (véase la Figura 18); "D" denota el inactivador no fluorescente dabcilo (véase figura 18); y "C3" denota un enlazador de tres carbonos.

Tabla 1

Nombre Secuencia/Etiquetado

Reactivo1 5' F-CAGCTGCACTGGGAAGGGTGCAGTCTGACC-C33'

3' Q- GTCGACGTGACCCTTCCCACGTCAGACTGG 5' (SEQ ID No. 2)

Reactivo1' 5' F-CAGCTGCACTGGGAAGGGTGCAGTCTGACC-C33'

3' F-GTCGACGTGACCCTTCCCACGTCAGACTGG 5' (SEQ ID No. 3) Reactivo2 5' F-GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA-C33'

3' Q- CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT 5' (SEQ ID No. 4)

Reactivo3 5' F-GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA-D 3'

3' Q- CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT-D 5' (SEQ ID No. 5)

Reactivo4 5' F-GAAATAAAATAAAAATAAAATA-D 3'

3' Q-CTTTATTTTATTTTTATTTTAT-D 3' (SEQ ID No. 6)

ReactivoA 5' CAGCTGCACTGGGAAGGGTGCAGTCTGACC-C33'

3' C3-GTCGACGTGACCCTTCCCACGTCAGACTGG 5' (SEQ ID No. 7)

ReactivoB 5' GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA-C33'

3' C3-CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT 5' (SEQ ID No. 8)

ReactivoC 5' D-CAGCTGCACTGGGAAGGGTGCAGTCTGACC-C33'

3' D-GTCGACGTGACCCTTCCCACGTCAGACTGG 5' (SEQ ID No. 9)

ReactivoD 5' D-GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA-C33'

3' D-CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT 5' (SEQ ID No. 10)

El Reactivo1 está compuesto por dos cadenas perfectamente complementarias, cada una de 30 nucleótidos de longitud, más fracciones unidos covalentemente: una fracción fluorescente 5'-terminal en una cadena y un interruptor 3'-terminal en la otra cadena, con una temperatura de fusión resultante de aproximadamente 79 °C. El Reactivo1' está compuesto por las mismas dos cadenas de oligonucleótidos que el Reactivo1, pero el inactivador 3'-terminal se reemplaza por una fracción fluorescente. El Reactivo 2 es un oligonucleótido bicatenario de 22 pares de bases de longitud más fracciones unidas covalentemente, de nuevo una fracción fluorescente en el extremo 5' en una cadena y un extintor en el terminal en la otra cadena, con una Tm resultante de aproximadamente 71 °C. El Reactivo3 es un oligonucleótido bicatenario de 22 pares de bases de longitud más fracciones covalentemente unidas: una fracción 5' terminal fluorescente y un 3' terminal dabcilo en una cadena y un 3'terminal extintor y un 5' terminal dabcilo en la otra cadena, con una Tm resultante de aproximadamente 70 °C. El Reactivo4 es un oligonucleótido bicatenario de 22 pares de bases de longitud más fracciones unidas covalentemente como en el Reactivo3, con una Tm de aproximadamente 50 °C. La Tabla 1 también presenta la estructura del ReactivoA, que comprende solo las dos cadenas de oligonucleótidos del Reactivo1 con tres átomos de carbono (C3) en ambos extremos 3'. La Tabla 1 también presenta la estructura del ReactivoB, que comprende solo las dos cadenas de oligonucleótidos del Reactivo2 cubiertas con átomos de carbono (C3) en ambos extremos 3'. Además, la Tabla 1 resume el ReactivoC, que comprende las dos cadenas de oligonucleótidos del Reactivo1, uno de los cuales está cubierto con átomos de carbono (C3) en su extremo 3' también está marcado con una fracción dabcilo en su extremo 5', y el otro que está marcado con una fracción dabcilo en su extremo 3'. Por lo tanto, el ReactivoC bicatenario tiene dos grupos dabcilo en un extremo. La Tabla 1 también muestra el ReactivoD, que comprende las dos cadenas de oligonucleótidos del Reactivo2, una de las cuales está cubierta con átomos de carbono (C3) en su extremo 3' y también está marcada con una fracción dabcilo en su extremo 5', y la otra de los cuales está marcado con una fracción dabcilo en su extremo 3'. Como apreciará alguien versado en la técnica, las secuencias de nucleótidos y las longitudes de los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 1 pueden alterarse fácilmente para lograr cualquier longitud y temperatura de fusión deseada o requerida para el Reactivo para su uso en una reacción de amplificación de PCR particular.

Aunque las longitudes y las secuencias de las cadenas complementarias utilizadas para el Reactivo1 y el Reactivo2 (Tabla 1) son claramente diferentes, las estructuras de estos Reactivos son similares en la medida en que están formadas por desoxinucleótidos naturales, tienen cadenas completamente complementarias y tienen un extintor de agujeros negros en un extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5' de la cadena complementaria, cuyo extremo 3' está cubierto con una cadena de 3 carbonos.

Como puede apreciar un experto en la técnica, las formulaciones del Reactivo se pueden alterar de muchas maneras, y cada uno de los cambios se puede probar fácilmente para determinar su capacidad para mejorar la selectividad de la polimerasa utilizando los ensayos descritos anteriormente. Una lista parcial de posibles cambios estructurales que pueden usarse para alterar la estructura del reactivo incluye:

1. El uso de dos fluoróforos en lugar de un extintor y un fluoróforo, como se describe para el Reactivo1' en el Ejemplo 3, Figura 3. Las variantes de este diseño muestran menos mejora de la selectividad de la polimerasa, pero generan un marcador de temperatura en la misma Tm en dos colores diferentes.

2. Las marcas de temperatura en la misma Tm en más de un color y con una selectividad robusta de la polimerasa también se pueden lograr mezclando un exceso de una cadena marcada con un extintor, con una cadena complementaria marcada con más de un fluoróforo.

3. Las marcas de temperatura en diferentes Tm y etiquetadas en uno o más colores y reteniendo la robusta selectividad de la polimerasa se pueden lograr mezclando un exceso de una cadena marcada con un extintor, con dos cadenas complementarias diferentes, una de las cuales es más corta que otro y etiquetado con el mismo o un fluoróforo diferente (ref. Aditivo EP042 en el Ejemplo 10).

4. Usar una o ambas cadenas de oligonucleótidos que comprenden ribonucleósidos en lugar de desoxirribonucleósidos, o usar LNA o PNA o bases no naturales, etc.

5. Utilizando una amplia variedad de inactivadores unidos covalentemente, fluoróforos y otras propiedades, siempre que los oligonucleótidos bicatenarios resultantes muestren las propiedades de los reactivos descritos en la presente memoria.

6. Es posible combinar las propiedades de los Reactivos con las del ReactivoC o ReactivoD que se muestran en la Tabla 1. En este caso, un extremo del oligonucleótido bicatenario está marcado con un fluoróforo y un extintor, mientras que el otro extremo del oligonucleótido está marcado con una fracción 3'dabcilo y una fracción 5'dabcilo. Como se explica más adelante, los Reactivos de este diseño generan una marca de temperatura y también inhiben la actividad de la 5'exonucleasa y, a una mayor concentración, la actividad de la polimerasa. La Tabla 1 proporciona dos ejemplos de dichos Reactivos, Reactivo3 y Reactivo4.

7. Es posible preparar conjuntos de reactivos múltiples que comparten al menos una cadena de oligonucleótidos, por ejemplo: a) un primer oligonucleótido largo marcado con un residuo de extintor en un extremo; b) un segundo oligonucleótido igualmente largo que es totalmente complementario a dicho primer oligonucleótido y tiene un fluoróforo opuesto al inactivador anterior; un tercer oligonucleótido que es más corto que dicho segundo oligonucleótido, que se ha truncado en su extremo 3' (o 5') no marcado; un cuarto, quinto, etc. nucleótidos que son progresivamente más cortos que el anterior, cada uno de ellos truncado de manera gradual desde el extremo 3' (o 5') sin etiquetar. Los oligonucleótidos de un inventario de lo anterior se pueden usar para construir conjuntos de reactivos que tienen regiones bicatenario progresivamente más cortas que están todas marcadas con la misma combinación de extintor y fluoróforo. Los Reactivos de tal conjunto tendrán marcas de temperatura cada vez más bajas, ya que se incluyen oligonucleótidos más cortos.

8. Conjuntos de Reactivos compuestos por dos Reactivos diferentes que tienen Tm mediblemente diferentes y secuencias de hibridación no cruzadas claramente diferentes, en donde la etiqueta fluorescente de dichos Reactivos puede estar en el mismo color o en colores diferentes. Los conjuntos de Reactivos de este diseño generarán dos marcas de temperatura distintivas diferentes, reflejando las dos Tm diferentes de los pares de cadenas complementarias. Las curvas de fusión que están marcadas de esta manera se pueden usar para construir una "regla" estandarizada para comparar y estandarizar empíricamente el número de grados entre las marcas de temperatura.

9. Otro tipo de variante del reactivo utiliza una cadena de oligonucleótidos larga (por ejemplo, 30 nucleótidos de longitud) con un fluoróforo 3' o, preferiblemente, un extintor y una cadena de oligonucleótidos corta (por ejemplo, 15 nucleótidos de longitud) que es complementaria de la cadena 3' final de la cadena larga y se modifica en su extremo 5' con un fluoróforo, pero no se limita en su extremo 3'. La cadena larga se utiliza en exceso de la cadena corta para garantizar la hibridación de todas las moléculas de la cadena corta. El híbrido formado por las dos cadenas tendrá una primera Tm, relativamente baja. Si tal variante se incluye en una mezcla de reacción de amplificación por PCR, la polimerasa extenderá el extremo 3' de la cadena más corta hasta el extremo 5' de la cadena más larga. Como resultado, la Tm del Reactivo aumentará significativamente. Las variantes diseñadas de esta manera proporcionan una manera conveniente de probar que la polimerasa activa está presente en la reacción. Esto es importante para el control de calidad de los Reactivos que se almacenan durante mucho tiempo antes de ser utilizados. Este procedimiento de construcción in situ del Reactivo final se usa solo en ensayos en los que la cadena marcada con fluorescencia, tanto en su estructura corta original como en su estructura posteriormente extendida, no ceba ninguna secuencia diana en la mezcla de reacción.

10. Otra variante más del Reactivo utiliza dos cadenas largas (por ejemplo, 30 nucleótidos de longitud) que son completamente complementarias y una cadena está presente en una concentración más alta que la otra, en donde la cadena más abundante está marcada en su extremo 3' con un extintor, preferiblemente un extintor de agujeros negros, y en el que la cadena menos abundante está marcada en su extremo 5' con una fracción voluminosa que puede formar un contacto cercano con la fracción extintora, pero en el que dicha fracción voluminosa no presenta fluorescencia en la longitud de onda detectada por el dispositivo que se utiliza para la amplificación y análisis. Los Reactivos de este diseño separan así la función de marcado Tm del Reactivo de la mejora de la selectividad de la polimerasa. Los Reactivos de este diseño son útiles para diseñar reacciones, ensayos o pruebas que han aumentado la selectividad de la polimerasa, sin revelar la presencia del reactivo.

La funcionalidad de un Reactivo de acuerdo con esta invención se ve afectada por el procedimiento de PCR en el que se emplea, en particular las temperaturas utilizadas para los ciclos térmicos. Por lo tanto, un diseñador tendrá en cuenta el procedimiento previsto. En los casos en que haya margen de maniobra en los detalles del procedimiento, el diseñador considerará alternativas. Como alternativa al cambio de la Tm o la concentración de un Reactivo para lograr un funcionamiento deseado del Reactivo, a veces se puede cambiar el perfil de los ciclos térmicos. Por Ejemplo, se considera un Reactivo con una Tm de 68 °C cuando se agrega a una mezcla de reacción a una concentración de 50 nM, y un perfil de ciclos térmicos que incluye un paso de extensión a 72 °C. El reactivo solo será parcialmente bicatenario a la temperatura de extensión, por lo que su concentración efectiva durante la etapa de extensión será inferior a 50 nM. Si se desea una concentración efectiva de 50 nM, se puede hacer cualquiera de las tres cosas: a) cambiar la estructura del Reactivo para aumentar su Tm a un nivel tal que sea bicatenario a 72 °C; b) aumentar la concentración de Reactivo de modo que, cuando sea parcialmente monocatenario a 72 °C, su concentración efectiva a 72 °C sea 50 nM; o c) se reduce la temperatura de extensión de la PCR en varios grados para que el Reactivo tenga doble cadena (o casi) a la temperatura de extensión más baja. Se considera también un Reactivo que tiene una Tm de 50 °C a una concentración de 50 nM, y un perfil de ciclo térmico que incluye una temperatura de recocido del cebador de 50 °C. El Reactivo será parcialmente (mitad, por definición) bicatenario a 50 °C. Si se desea que el Reactivo actúe solo como un aditivo de arranque en caliente que evite el cebado incorrecto durante la preparación de la muestra a baja temperatura, pero no durante el ciclo de temperatura, se podría cambiarla estructura del Reactivo para disminuir su Tm o, alternativamente, se podría elevar la temperatura de recocido del cebador a un nivel en el que el Reactivo sea de una sola cadena (o casi).

El Ejemplo 2 muestra la cinética cuantificada de la escisión de la sonda a través de la actividad de la 5'exonucleasa independiente del cebador en una serie de pruebas que comprenden hacer oscilar la temperatura de una mezcla de reacción para inducir la escisión de una sonda, comparando mezclas de reacción que no tienen Reactivo agregado o concentraciones crecientes de Reactivo1, o las cantidades equivalentes de ReactivoAo ReactivoC. Los resultados se presentan en las Figuras 2A-2C, que son gráficos de fluorescencia (debido a la escisión de la sonda) versus ciclos de oscilación de temperatura. Los resultados muestran que: 1) la sonda no se escinde en ausencia de una diana (curva 201); 2) la sonda se escinde al máximo cuando está presente solo con su diana (curva 202); 3) la escisión de la sonda solo se inhibe ligeramente mediante la adición de concentraciones crecientes (50 (curva 203), 100 (curva 204), 150 (curva 205) nM) del ReactivoA; 4) la escisión de la sonda se inhibe severamente mediante la adición de 50 nM o más de ReactivoC (curvas 206, 207, 208); 5) la escisión de la sonda no se inhibe mucho más mediante la adición de 50 (curva 209), 100 (curva 210) o 150 (curva 211) nM del Reactivo1 que mediante la adición de las mismas concentraciones de ReactivoA. Por Ejemplo, la pendiente sin aditivo reactivo es de aproximadamente 35 grados, alcanzando aproximadamente 3800 unidades de fluorescencia después de 45 ciclos; la pendiente con 50 nM de ReactivoA es de aproximadamente 25 grados, alcanzando aproximadamente 3300 unidades de fluorescencia después de 45 ciclos; la pendiente con 50 nM de Reactivo1 es de aproximadamente 20 grados, alcanzando aproximadamente 3100 unidades de fluorescencia después de 45 ciclos; pero la pendiente con 50 nM de ReactivoC es solo de unos 10 grados, alcanzando solo unas 2100 unidades de fluorescencia después de 45 ciclos. Este resultado inesperado distingue claramente al Reactivo1 del ReactivoC, e indica que, a diferencia del ReactivoC, el Reactivo1 no se une al dominio de 5'exonucleasa en la enzima.

Tanto la LATE-PCR como la amplificación de la PCR simétrica generan amplicones de ADN bicatenario cuya cinética de acumulación se puede observar leyendo en tiempo real luego de la tinción con SYBR Green, un colorante fluorescente intercalante. Los datos en las Figuras 3A-3O, resultantes de las reacciones LATE-PCR descritas en el Ejemplo 3, son gráficos de fluorescencia sin procesar de ADN bicatenario teñido con SYBR Green. Puede verse desde las Figuras 3A-C que las reacciones que reciben concentraciones crecientes de ReactivoA tienen altos niveles de fondo de tinción con SYBR Green incluso antes de la amplificación, debido a que el ADN del ReactivoA se une a SYBR Green y presenta fluorescencia. En contraste, las reacciones que reciben el Reactivo1 marcado con Cal Orange (Figuras 3G-I) o Quasar (Figuras 3J-L) tienen niveles mucho más bajos de fluorescencia de fondo. El nivel más bajo de fluorescencia de fondo se debe al fluoróforo unido covalentemente más el desactivador de agujero negro enlazado covalentemente del Reactivo1, los cuales absorben parte de la energía del colorante SYBR Green intercalado. El nivel más bajo de fluorescencia de fondo es deseable, ya que aumenta la señal sobre el fondo resultante de la amplificación del producto de ADN bicatenario.

Los datos en el Ejemplo 3 también muestran que ambas versiones del Reactivo1 aumentan la especificidad del cebador en contraste con la concentración equivalente del ReactivoA, el oligonucleótido bicatenario no marcado. Este aumento en la especificidad del cebador es evidente como la separación entre las curvas de fluorescencia en tiempo real de la amplificación de dos dianas equimolares, una que se adapta perfectamente a su cebador (curvas de números impares) frente a otra que no coincide con el mismo cebador debido a un solo cambio de nucleótido en la base complementaria al extremo 3' del cebador (curvas de número par). Este ensayo mide la especificidad del cebador cada vez que se usa la plantilla inicial para iniciar la amplificación. Los amplicones hechos de ambas cadenas diana son idénticos, porque el cebador se incorpora a todas las copias; tienen la misma secuencia, que coincide perfectamente con el cebador. Los resultados (Figuras 3G, 3J) muestran claramente que solo 50 nM de Reactivo1, etiquetado con Cal Orange o Quasar, es suficiente para lograr un aumento significativo en la especificidad del cebador, A ACj , con una disminución muy pequeña en la eficiencia de amplificación, medida por la demora (ACj ) en el C^tde la diana combinada en comparación con el control sin reactivo (Figura 3, círculo 301). En contraste, 50 nM del ReactivoC marcado con dos fracciones dabcilo (Figura 3D, círculo 309) causa un aumento de aproximadamente 20 ciclos, y en concentraciones más altas inhibe efectivamente la amplificación de las dianas emparejadas y desajustadas (Figuras 3E-F). Este resultado también apunta a la naturaleza única de estos reactivos como clase de moléculas.

Las figuras 3M-O muestra los resultados de la reacción del Ejemplo 3 utilizando una variante de Reactivol, a saber, Reactivol' (véase Tabla 1). Esta variante no tiene Extintor de Agujero Negro, pero tiene dos fluoróforos voluminosos en los extremos complementarios del oligonucleótido bicatenario, un 3'Cal Orange 560 y un 5'Quasar 670. La comparación de los resultados en las Figuras 3M-O con las Figuras 3G-I y J-L muestran que los niveles de fondo de la fluorescencia de SYBR en las Figuras 3M-O son ligeramente más altos que los de las Figuras 3G-I y J-L, de acuerdo con el hecho de que los dos fluoróforos unidos covalentemente absorben menos energía del SYBR que un fluoróforo unido covalentemente y un interruptor de agujero negro unido covalentemente. Los resultados también muestran que Reactivol' causó un aumento mucho menor en la selectividad de la polimerasa (A AC^t) que cualquiera de las versiones de Reactivol. Además, el Reactivol' no causó una disminución mayor en la eficiencia de amplificación que el ReactivoA (Figuras 3A-C). Esta diferencia se debe probablemente al hecho de que el Reactivol' se modifica con dos fluoróforos voluminosos en lugar de un fluoróforo y un interruptor de agujero negro en el Reactivol. Se sabe que los Extintores de Agujero Negro y los fluoróforos interactúan mediante la extinción por contacto (Johansson MK. Choosing reporter-extintor pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol Biol. 2006; 335: 17-29).

Con referencia a la Tabla 1, el Reactivol está compuesto por un oligonucleótido bicatenario que tiene una longitud de 30 pares de bases. Tiene una Tm de 79 °C. El Reactivo2 está compuesto por un oligonucleótido bicatenario que tiene una longitud de 22 pares de bases. Tiene una Tm de 71 °C. El Ejemplo 4 compara las capacidades del Reactivo1 y el Reactivo2 para aumentar la selectividad de la polimerasa al amplificar el par diana/cebador perfectamente emparejado y el par diana/cebador mal emparejado ya descrito en el Ejemplo 3. La extensión del cebador en este Ejemplo se llevó a cabo a 72 °C. Los resultados demuestran que Reactivo2, como Reactivo1, aumenta la selectividad de la polimerasa para la diana/cebador emparejado sobre la diana/cebador mal emparejado (A AC^t), pero el alcance de la mejora no fue tan grande como el observado para la concentración equivalente de Reactivo!

Además, en el ensayo del Ejemplo 4, el Reactivo2 fue menos efectivo que el Reactivo1 para mejorar otra manifestación de la selectividad de la polimerasa: la supresión de la evolución del producto que tiene lugar como resultado de interacciones no intencionadas entre el extremo 3' de un amplicón monocatenario generado durante la fase lineal de la amplificación LATE-PCR y alguna otra molécula monocatenaria en la reacción. Hay muchas maneras de observar la evolución del producto. La evolución del producto en el Ejemplo 4 se muestra en la Figura 4, donde se ve como un aumento en el ADN bicatenario teñido con SYBR Green después de que la reacción ha alcanzado la fase de meseta cuando se supone que la acumulación de ADN bicatenario se detiene. Los resultados muestran que Reactivo2 no suprimió la evolución del producto tan eficazmente como Reactivo! La explicación probable de esta diferencia es que solo aproximadamente el 45 % de las moléculas del Reactivo2 son bicatenario a la temperatura de extensión de 72 °C, en comparación con aproximadamente el 95 % de las moléculas del Reactivo!

El Ejemplo 5 ilustra otra propiedad más de Reactivo1 y Reactivo2. Mientras que los oligonucleótidos de estos dos Reactivos tenían secuencias diferentes, ambos tienen una cadena marcada con un Extintor de Agujeros Negro en 3' y una cadena complementaria marcada con un fluoróforo en 5', Cal Orange con una emisión máxima de 560 nm. En cada caso, la señal fluorescente de la cadena marcada con fluoróforo fue alta a 90 °C y se mantuvo en un nivel alto hasta que la temperatura de la reacción se redujo a aproximadamente 5 °C por encima de la Tm del oligonucleótido bicatenario del Reactivo. A temperaturas por debajo de este nivel, las cadenas complementarias se hibridan entre sí. La señal fluorescente disminuye dramáticamente, debido a que la cadena marcada con extintor, que está presente en exceso de la cadena marcada con fluoróforo, asegura que todas las cadenas marcadas con fluoróforo se vuelvan bicatenario, lo que a su vez hace que el fluoróforo se acerque más al extintor. Cuando se ve en términos de intensidad de señal, se observa una hibridación de las cadenas a medida que disminuye la señal sigmoidal de la señal máxima a la señal mínima a la temperatura (no se muestra). Cuando se ve como la primera derivada de la intensidad de la señal, como en las Figuras 5A-B, la hibridación de las cadenas se observa como un valle negativo en curvas que tienen una pendiente de cero a temperaturas por encima del recocido de la cadena y una pendiente de cero a temperaturas por debajo de la terminación del recocido de la cadena. La temperatura en el punto más bajo de cada valle negativo es la Tm medida del Reactivo en la mezcla de reacción, a la cual el 50 % de las cadenas marcadas con fluoróforo son bicatenario. De acuerdo con sus Tm ajustadas en la concentración calculada, la Tm empírica del Reactivo1 es aproximadamente 79 °C (Figura 5A) y la Tm empírica del Reactivo2 es aproximadamente 71 °C (Figura 5B). Las Tm empíricas son las Tm funcionales de los reactivos en sus concentraciones indicadas en la mezcla de reacción. Pero, los resultados muestran que las Tm de ambos Reactivos aumentan unos pocos grados a medida que aumenta la concentración de la cadena marcada con fluorescencia (intervalo de prueba 50 nM-150 nM). Este aumento dependiente de la concentración en Tm es consistente con el hecho de que la Tm calculada usando la fórmula del vecino más cercano incluye una corrección para la concentración (c) de los oligonucleótidos de hibridación. El Ejemplo 5 confirma visualmente la conclusión alcanzada en el Ejemplo 4 de que solo aproximadamente el 45 % de las moléculas marcadas con fluoróforo Reactivo2 son bicatenario a 72 °C, mientras que aproximadamente el 95 % de las moléculas de Reactivo1 son bicatenario a esta temperatura.

La funcionalidad del Reactivo para mejorar la selectividad de la polimerasa depende en parte de las temperaturas de fusión de los productos de amplificación de PCR (amplicones), la temperatura de fusión del propio reactivo y las temperaturas particulares utilizadas para pasos particulares en el ciclo térmico de la PCR. Por Ejemplo, si la temperatura de extensión de la reacción se lleva a cabo a 72 °C, un Reactivo que tenga una temperatura de fusión de 79 °C será aproximadamente 95 % bicatenario a 72 °C. En contraste, una cantidad equivalente de un Reactivo que tenga una temperatura de fusión de 71 °C solo será aproximadamente 45 % bicatenario a 72 °C. Dado que la Taq polimerasa y las enzimas relacionadas solo se unen a moléculas bicatenario en el sitio de la polimerasa, la "concentración efectiva" del Reactivo que tenga la temperatura de fusión más baja será menor a 72 °C que la concentración efectiva del Reactivo con la temperatura de fusión alta. La concentración efectiva del Reactivo durante el recocido y la extensión del cebador también disminuirá si las Tm de los cebadores para sus respectivas cadenas de plantilla son más altas que la temperatura de fusión del Reactivo.

El Ejemplo 6 ilustra un caso de este tipo. Allí, la amplificación fue una PCR de dos pasos con un paso de recocidoextensión combinada a 75 °C. Los cebadores limitantes utilizados en este Ejemplo tuvieron una Tm inicial ajustada en concentración de aproximadamente 80 °C, mientras que los cebadores en exceso tuvieron una Tm inicial ajustada en concentración de aproximadamente 78 °C. El Reactivo1 tiene una Tm de aproximadamente 79 °C, como se indicó anteriormente. Debido a que las Tm de los cebadores son tan altas en relación con la Tm del Reactivo1, los cebadores comienzan a hibridarse y se extienden en sus filamentos de la plantilla antes de que el Reactivo1 sea completamente efectivo, ya que la temperatura de reacción se reduce de 95 °C a 75 °C durante cada ciclo térmico. El Reactivo 1 es aproximadamente un 80 % bicatenario a 75 °C, la temperatura usó la extensión del cebador en este experimento. Por lo tanto, la "concentración efectiva" del Reactivo1 cuando debe funcionar durante el recocido del cebador por PCR y la extensión del cebador en el Ejemplo 6 es más baja que su concentración establecida.

Se podría argumentar que bajo estas circunstancias no se acumula ningún beneficio al agregar el Reactivo en el Ejemplo 6, pero este no es el caso por las siguientes razones: 1) el Reactivo aún se puede usar como marca de temperatura (véase más abajo) para establecer la extensión de la reproducibilidad entre las reacciones replicadas, y como la base para corregir matemáticamente las diferencias entre las reacciones replicadas (véase más abajo); 2 ) la amplitud de la señal del Reactivo en su Tm todavía sirve como base para la comparación cuantitativa interna de cualquier señal generada a partir de cualquier producto de amplificación; 3) el Reactivo aún tiene una concentración y una capacidad completamente efectivas para aumentar la selectividad de la polimerasa a todas las temperaturas por debajo de la temperatura a la que todas las moléculas son bicatenario (es decir, por debajo de aproximadamente 72 °C en el caso del Reactivo1). Esto es útil porque hace posible, por ejemplo, bajar la temperatura de la reacción en cualquier ciclo para medir la hibridación de la sonda a una diana y luego, si se desea, reanudar la amplificación. A este respecto, el aumento de la concentración del Reactivo1 de 50 nM (Figura 6A) a 100 nM (Figura 6B produjo una dispersión reducida entre las firmas de fluorescencia para el gen rpoB a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 75 °C, como se muestra por las curvas de los círculos 604-606 en comparación con las curvas de los círculos 601-603. Esto se logró sin una inhibición significativa de la actividad de la polimerasa, como lo muestran las alturas de pico/valle relativas a aproximadamente 68 y 56 °C. Además, el aumento de la concentración de Reactivo1 de 50 nM (Figura 6D) a 100 nM (La Figura 6E produjo una dispersión reducida entre las firmas de fluorescencia para los genes katG y gyrA a temperaturas de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 75 °C, como lo muestran las curvas de los círculos 616-618 en comparación con las curvas de los círculos 613 a 615. Esto también se logró sin una inhibición significativa de la actividad de la polimerasa, como lo muestran las alturas de pico/valle relativas a aproximadamente 66 (katG) y 55 °C (gyrA). La concentración de Reactivo1 a 200 nM aumentó la inhibición de la actividad de la polimerasa (compare las alturas de pico/valle en la Figura 6C a los de la Figura 6B, y compare las alturas pico/valle en la Figura 6F a los de la Figura 6E) sin reducción adicional en la dispersión, por lo quejuzgamos que la concentración de 100 nM es la mejor de las tres concentraciones probadas.

En el Ejemplo 6, las Figuras 6A -6C, las curvas de los círculos 603, 606, 609 ilustran el uso de un Reactivo como marcador de temperatura. El Reactivo1 tiene el mismo fluoróforo que las sondas activadas, pero tiene una Tm por encima del intervalo de temperatura de los picos y valles en la firma de fluorescencia para el gen rpoB. Por lo tanto, la fusión del reactivo no afecta a las firmas de fluorescencia. Los marcadores de temperatura y su uso se explican más detalladamente a continuación en relación con los Ejemplos 16 y 17.

La funcionalidad de la Taq Polimerasa y otras polimerasas térmicamente estables también dependerá de las propiedades dependientes de la temperatura de la enzima en sí misma. Por lo tanto, dos enzimas diferentes que tienen propiedades diferentes se verán afectadas de manera diferente por el mismo reactivo a la misma temperatura. En general, la "concentración efectiva" de un Reactivo en particular será mayor cuando se use una enzima con una tolerancia térmica más baja, debido a que generalmente se usan temperaturas de ciclo más bajas con dichas enzimas. El Ejemplo 7 describe el uso tanto del Reactivo1 como del Reactivo2, un ensayo en el que se usó Tfi (exo-)polimerasa para la amplificación en lugar de la Taq Polimerasa. La Tfi (exo-)polimerasa de una polimerasa termorresistente de Thermus filiformis que tiene un dominio de polimerasa y un dominio de 5'exonucleasa, pero se ha diseñado genéticamente para que no tenga actividad de 5'exonucleasa. Las reacciones que usan Tfi (exo-) se usan mejor con temperaturas de extensión de 68-72 °C, porque la actividad de la polimerasa se inactiva a 75 °C. Con La a Dn Taq Polimerasa, a menudo se utilizan temperaturas de extensión más altas, por ejemplo, 75-81 °C.

Los resultados del Ejemplo 7 muestran que la adición de concentraciones crecientes de Reactivo2 (100 nM a 150 nM a 200 nM) causa una disminución modesta en la eficiencia de amplificación pero un aumento muy significativo en la selectividad de la polimerasa. La adición de 100 nM de Reactivo1 logra un aumento similar en la selectividad de la polimerasa, pero una disminución ligeramente mayor en la eficiencia de la amplificación. Las mejoras en la selectividad de la polimerasa debido a los Reactivos se observan de dos maneras en el Ejemplo 7. Primero, la adición del Reactivo aumenta la especificidad del cebador cada vez que se usa la plantilla inicial para iniciar la amplificación, porque ambas cadenas diana se vuelven idénticas después de que el cebador se incorpora en cualquiera de las plantillas iniciales. Por este motivo, el cebador se ajusta perfectamente a todas las copias posteriores de la línea de la plantilla. En el Ejemplo 7, la diana no coincidente no es complementaria al cebador en dos ubicaciones, el nucleótido opuesto al extremo 3' del cebador y los nucleótidos opuestos a la posición 9 del extremo 3' del cebador. La falta de coincidencia en el extremo 3' del cebador domina la especificidad del cebador. En segundo lugar, la adición del Reactivo suprime la evolución del producto que, de lo contrario, se produce hacia el final de las reacciones cuando se acumula la concentración de las cadenas del producto. La evolución del producto en LATE-PCR es evidente utilizando al menos tres métricas diferentes: 1) como un aumento inesperado en la fluorescencia de SYBR Green después de que la acumulación de ADN bicatenario haya comenzado a estabilizarse al final de la fase exponencial de la amplificación de LATE-PCR; 2) como un aumento en la temperatura de fusión del producto de ADN bicatenario presente al final de la fase lineal de la amplificación LATE-PCR, visualizado utilizando la tinción SYBR Green; y 3) como una disminución en la cantidad de producto de ADN monocatenario presente al final de la fase lineal de amplificación LATE-PCR, como se visualiza por hibridación a una sonda específica de secuencia. La evolución del producto en LATE-PCR también aumenta la dispersión entre las reacciones repetidas durante la fase lineal de amplificación. Como se muestra en la Figura 7A, panel 1, la evolución del producto en el Ejemplo 7 se observa en tres de las cuatro réplicas del par diana/cebador amplificado en ausencia de cualquier Reactivo. La evolución del producto se suprime en todas las réplicas de ambas dianas amplificadas en presencia de 100-Reactivo2200 nM o 100 nM Reactivo! La evolución del producto también se suprime con Reactivo1 50 nM (resultados no mostrados).

Es evidente a partir de la discusión anterior que la optimización de la selectividad de la polimerasa requiere una mayor especificidad del cebador al comienzo de la amplificación y la supresión de la evolución del producto hacia el final de la amplificación. Una característica de los Reactivos es que una sola molécula puede realizar ambas tareas. Un distintivo de una reacción optimizada es un alto nivel de reproducibilidad, es decir, baja dispersión entre las reacciones replicadas. Los datos en el Ejemplo 7 muestran que tanto el Reactivo2 200 nM como el Reactivo1 100 nM exhiben una dispersión significativamente reducida entre las repeticiones durante la fase exponencial de LATE-RCR según lo juzgado por los gráficos SYBR Green de ADN bicatenario acumulativo (Figura 7A, paneles 4 y 5). Estas mismas dos muestras también muestran muy poca dispersión en el nivel de moléculas de ADN monocatenario producidas durante la fase lineal de la amplificación LATE-PCR, según se analiza mediante análisis de curva de fusión usando una sonda fluorescente (Figura 7A, paneles 9 y 10). La sonda fluorescente también muestra que no hay moléculas de la diana Mal emparejado presentes en casi todas las muestras que reciben Reactivo2200 nM o 100 nM Reactivo! Las réplicas con 100 nM Reactivo1 son incluso más precisas que aquellas con Reactivo2200 nM.

La dispersión mínima entre las réplicas es una medida de la selectividad de la polimerasa e implica que todas las moléculas en una población actúan de la misma manera. Si bien no desea limitarse a ninguna teoría, es probable que, en el caso que se describe aquí, "actuar de la misma manera" signifique que todas las moléculas de polimerasa se unen al Reactivo a una temperatura más alta de la que se unen y extiendan cualquier emparejamiento erróneo 3' terminal. Debido a que la Tm de un cebador mal emparejado es siempre menor que la Tm del mismo cebador a su diana perfectamente complementaria, y la Tm del extremo 3' de una cadena del producto a alguna otra secuencia dentro de otra cadena también suele ser menor que la Tm de los cebadores utilizados para la amplificación (si este no fuera el caso, la evolución del producto no sería un evento raro), se deduce que la dispersión mínima entre las repeticiones se puede lograr mejor asegurando que la concentración del reactivo bicatenario sea suficiente para unir a todas las moléculas de polimerasa en la reacción a una temperatura justo por debajo de la Tm del cebador limitante. En el Ejemplo 7, esta condición se cumple al agregar 100 nM Reactivo! Debido a que el Reactivo1 tiene una Tm de 79 °C, es de aproximadamente el 95 % bicatenario a 72 °C, la Tm del cebador limitante a su diana perfectamente coincidente. Se requiere un poco más de 200 nM de Reactivo2 porque su Tm es de aproximadamente 71 °C, lo que significa que solo aproximadamente el 45 % de las moléculas son bicatenario a 72 °C.

La dispersión entre réplicas también es un fenómeno bien conocido en las amplificaciones de PCR simétricas a medida que se aproximan a la fase de meseta de la reacción [R.G. Rutledge, Nucl. Acids Res. (2004) 32 (22): e178. doi: 10,1093/nar/gnh177]. El Ejemplo 8 y la Figura 8A ilustran la dispersión entre las reacciones replicadas en una amplificación por PCR simétrica utilizando un par de cebadores utilizados para amplificar una parte del gen que causa la enfermedad de Tay Sachs [J.E. Rice et al. (2002) Prenatal Diagn. 22: 1130-1134] en ausencia de cualquier Reactivo agregado (Figura 8A, curvas del círculo 801), varias muestras en un conjunto de 12 se situaron en niveles mucho más altos o más bajos que la mayoría de las muestras. En contraste, la adición de 100 nM de Reactivo2 (Figura 8A, curvas del círculo 802) redujo significativamente el nivel de dispersión entre todas las repeticiones. El Reactivo2 tenía 22 nucleótidos de longitud, con una Tm de 68 °C. Ambos conjuntos de reacciones se analizaron en tiempo real utilizando SYBR Green, que tiñe el ADN bicatenario. Se agregaron aproximadamente 5 copias de ADN genómico humano a cada reacción, y las señales de SYBR Green aparecieron después de un promedio de 33-35 ciclos térmicos. La meseta se alcanzó después de 40 o 45 ciclos, dependiendo de si se agregó Reactivo2. Todas las muestras incubadas sin el Reactivo2 se amplificaron y se estabilizaron antes de las incubadas con el Reactivo2, lo que concuerda con la posibilidad de que las reacciones que no contienen el Reactivo2 estuvieran integradas tanto por el amplicón bicatenario deseado como por el ADN bicatenario adicional no específico. El análisis de la curva de fusión de todas las muestras se realizó después de 60 ciclos. Estos resultados, Figura 8B y la Figura 8C, confirmó que las muestras incubadas con Reactivo2 eran muy similares y estaban libres en ADN bicatenario no específico. En contraste, todas las muestras amplificadas sin Reactivo2 tenían algún nivel de ADN bicatenario no específico de mayor fusión. Las réplicas amplificadas en ausencia de Reactivo2 solo divergen unas de otras a medida que se acercan a los niveles de meseta. Esto demuestra que la divergencia es un fenómeno dependiente de la concentración, en otras palabras, depende de niveles relativamente altos de cadenas de productos acumulados. No se observa divergencia entre las réplicas en las muestras que contienen Reactivo2, aunque las concentraciones de ADN bicatenario en estas muestras son más altas que las que divergen en ausencia de Reactivo2. Se concluye de estos resultados que el Reactivo2 aumenta la selectividad de la polimerasa en la PCR simétrica y, por lo tanto, evita la extensión de los extremos 3' no coincidentes de las cadenas de productos que interactúan con otras cadenas de productos, es decir, la evolución del producto. Este resultado es consistente con los mostrados anteriormente para la amplificación LATE-PCR. Se nota que la evolución del producto es más fácil de observar en LATE-PCR, porque hace que los amplicones de una sola cadena se conviertan en una doble cadena. En contraste, en la PCR simétrica, los amplicones bicatenario simplemente se convierten en moléculas bicatenarias más grandes.

El Ejemplo 9 demuestra que la capacidad de un Reactivo para aumentar la especificidad del cebador depende de la magnitud de la falta de coincidencia entre el cebador y una diana. El alcance de la falta de coincidencia varía con el número, la identidad y la ubicación de los desajustes de nucleótidos entre el cebador limitante y varias dianas. La extensión de la falta de coincidencia se determina utilizando la Tm ajustada por concentración calculada de un cebador a una diana, según la fórmula del vecino más cercano. Rutinariamente se utilizan Visual OMP (software de ADN) para estimar Tm en las concentraciones de oligonucleótidos y concentraciones de sal de la reacción. La Tm de los oligonucleótidos marcados con fluorescencia se puede estimar de manera similar, pero preferiblemente se determina empíricamente. Se usó Taq polimerasa en el Ejemplo 9, se añadió el Reactivo1 a 50 nM, el recocido del cebador se ajustó a 70 °C y la extensión del cebador se ajustó a 75 °C. Se utilizaron el mismo cebador limitante y el mismo cebador en exceso para todas las reacciones de amplificación LATE-PCR. Las diferencias de secuencia entre estas dianas se ubicaron en el complemento del primer limitante. Los nucleótidos en las diversas dianas que no coinciden en comparación con el cebador limitante están subrayados en la Figura 9. En reacciones de este tipo en las que se utiliza el mismo cebador limitador para amplificar las dianas que tienen diferentes secuencias, el cebador limitador puede combinarse con una de las dianas del conjunto, o puede ser un cebador de consenso que se corresponda de manera imperfecta con todas las dianas. En cualquier caso, cada diana tiene su propio conjunto de bases emparejadas o desajustadas dentro de su secuencia que es el complemento del cebador limitante, y cada diana emparejada de manera imperfecta se amplifica con menos eficiencia que usando un cebador limitante perfectamente complementario a su secuencia propia. Los resultados de la detección en tiempo real con el colorante SYBR Green, valores de CT, se presentan en la Figura 9. Los valores de Ct muestran que la adición de Reactivo1 50 nM aumenta la especificidad inicial del cebador en todos los casos. (En ciclos de amplificación posteriores, todas las dianas se amplifican con la misma eficiencia.) Suponiendo que la concentración de dianas es igual, cada diana muestra su propio retraso característico en la amplificación, que depende del número, la ubicación y los tipos de desajustes de pares de bases con el mismo cebador limitante. Estas químicas combinadas se pueden usar para la identificación de variantes de dianas relacionadas.

Otra manifestación de la mayor selectividad de la polimerasa lograda con la adición del Reactivo es el aumento de la multiplexación, es decir, la amplificación balanceada de múltiples productos utilizando múltiples pares de cebadores en la misma reacción. El Ejemplo 10 presenta dos conjuntos de datos de una reacción triple para tres dianas en el genoma de las mitocondrias humanas. Se generó un conjunto de datos en una reacción triple que contiene una versión de tres cadenas del reactivo dabcilado descrito en la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 2010/104074. El segundo conjunto de datos se generó en una reacción triple que contiene 50 nM de Reactivo! La presencia de la versión Cal Orange de Reactivo1 se observó como un valle profundo a 79 °C en el canal de Cal Orange. (No se observa tal valle en las reacciones que reciben el reactivo administrado porque este reactivo no tiene fluorescencia). Cada una de las dianas del gen se observa como una "firma fluorescente" (véase J.E. Rice et al., Fluorescent signatures for variable DNAsequences, Nucleic Acids Research Advance Access, 2012,1-10 doi: 10,1093/nar/gks731) generado por la unión de un conjunto específico de dianas de sondas Lights-On/Lights-Off etiquetadas con Quasar 670 para la diana HV2, Cal Red 590 para la diana CO2, o Cal Orange 560 para la diana ND1. Las firmas fluorescentes para las seis reacciones triples se presentan en la Figura 10, paneles 1-6. La mejora de la multiplexación debida a Reactivo1 se observa como un aumento significativo en las amplitudes de los picos y valles de cada una de las tres firmas fluorescentes en los paneles 2 , 4 y 6. El canal de Cal Orange (panel 6), en particular, muestra un aumento significativo en la firma fluorescente para la diana del gen ND1, porque muy poca de esta diana del gen se genera en ausencia de Reactivo1 o el reactivo dabcilado (no mostrado). El reactivo administrado solo supera parcialmente este problema (panel 5). Sin embargo, la mejora en la selectividad de la polimerasa debido al Reactivo1 no se limita al producto del gen ND1 y, debido a que el Reactivo mejora la selectividad de la polimerasa en general, también se observa para las otras dos dianas del gen (paneles 2 y 4). Esta mejora general en la amplificación de la diana se debe a una disminución en el cebado incorrecto entre los cebadores. Como resultado, los cebadores generan niveles más altos de los amplicones específicos de genes bicatenario y de cadena simple.

La Figura 10, el panel 6, ilustra una curva de firma fluorescente que incluye un valle a aproximadamente 79 °C, la fusión del Reactivo1 a una temperatura superior a la firma de las sondas. La Tm del reactivo se puede utilizar para normalizar las curvas de firma entre las muestras.

El Ejemplo 11 también ilustra la multiplexación mejorada debido a la adición de los 50 nM de Reactivo! En este caso, la reacción fue una amplificación de un solo tubo de transcripción inversa/LATE-PCR (RT-LATE-PCR) que contiene tres pares de cebadores y sondas. Dos dianas de ARN diferentes y un ARN de control se multiplexaron en la reacción presentada en el Ejemplo 11. El control se derivó de una secuencia en el fago bacteriano MS2. El amplicón de ADN monocatenario resultante generó un pico a 50 °C (Figura 11B) cuando se probó con una sonda de Cal Orange.

La diana que fue objeto del ensayo se derivó del gen de la neuraminidasa del virus de la influenza humana. El producto monocatenario amplificado generado en el RT-LATE-PCR se probó con tres sondas compuestas por un par de Lights On/Lights-Off que generó un pico de Cal Red 610 con un máximo a 55 °C y otra sonda Lights-On, la sonda 09N1-Os, que generó un segundo pico, también en Cal Red, con un máximo de aproximadamente 42 °C (Figura 11A). Cuando se examinaron en una reacción de monoplex, las alturas relativas de los dos picos fueron constantes, con el pico de 55 °C algo más alto que el pico de 42 °C, pero cuando se examinaron en un múltiplex, la altura relativa del pico de 42 °C disminuyó progresivamente a medida que más y se agregaron más cebadores diferentes, hasta el punto de desaparecer cuando estaban presentes siete pares de cebadores. Debido a que el pico a 55 °C siempre estuvo presente en la reacción múltiplex, el amplicón debe haberse sintetizado. Se concluyó que, en la reacción multiplexada en ausencia de cualquier mejora de selectividad de polimerasa, también deben generarse productos no específicos que interfieran con la hibridación de la sonda Cal Red de Tm baja.

Dado que la mezcla de reacción contiene una enzima transcriptasa reversa y una Taq Polimerasa, se agregó un anticuerpo de inicio en caliente a la mezcla de reacción para establecer si el bloqueo de la actividad de la Taq Polimerasa durante la etapa de transcripción inversa antes de la amplificación suprimió el cebado incorrecto y, por lo tanto, aumentó la señal de Tm baja. La adición de anticuerpo (Figura 11A, curvas 111) no aumentó la fuerza relativa de la señal de Tm baja. Pero, la adición de Reactivo1 50 nM más el anticuerpo (Figura 11A, curvas 112) aumentó la altura del pico de Tm baja en relación con la altura del pico de Tm alta. Este resultado proporciona evidencia adicional de la mejora de la multiplexación lograda por el reactivo. En este caso, la mejora en la selectividad de la polimerasa se observó en el canal de Cal Red, mientras que, como se esperaba, el Reactivo1 agregado se observó como un pico negativo agudo en el canal de Cal Orange con su característica Tm de 79 °C.

Como apreciará un experto en la técnica, la discusión anterior asume que todas las reacciones replicadas son homogéneas, de tubo cerrado y perfectamente reproducibles. Detección homogénea significa que no requiere la separación de cebadores o sondas marcadas con fluorescencia unidas (hibridadas con la diana) de cebadores o sondas no unidos. Tubo cerrado significa, entre otras cosas, que el recipiente de reacción no experimenta evaporación en el transcurso de la amplificación por PCR, ya que la evaporación aumentará las concentraciones de iones no volátiles. Perfectamente reproducible significa, entre otras cosas, que todas las reacciones replicadas tienen la misma composición de iones monovalentes y divalentes, así como los mismos niveles de otras moléculas pequeñas en la mezcla maestra de reacción. Idealmente, las condiciones de reacción reproducibles significan, entre otras cosas, que las mismas condiciones de calentamiento y enfriamiento existen en todas las posiciones en un dispositivo de múltiples pocillos.

En realidad, algunas reacciones se llevan a cabo en dispositivos con múltiples cámaras, incluidos dispositivos para microfluidos que permiten cambios en las composiciones químicas durante el curso de una reacción. Algunos recipientes de reacción de tubos cerrados tienen fugas o permiten que se produzca la evaporación. Muchas reacciones se preparan intencionalmente o no, utilizando diferentes concentraciones de sales, tampones y otros componentes químicos de vez en cuando. Y, en realidad, no todas las posiciones en un dispositivo de embarcaciones múltiples son idénticas, incluso en dispositivos que giran. Todas las variaciones anteriores alteran las funciones enzimáticas y, por lo tanto, alteran la cinética de una reacción.

Los Reactivos de acuerdo con esta invención generan una señal fluorescente a una temperatura conocida, mejor vista como un valle de fusión (o recocido) (pico negativo) en una curva de fluorescencia de primera derivada, en lo sucesivo denominada "marca de temperatura". Por esa razón, un Reactivo puede servir como un estándar interno de temperatura en cada reacción. La marca de temperatura revela variaciones y diferencias entre las reacciones. Tal marca de temperatura tiene tres valores independientes: 1 ) la profundidad de su "valle" es característica de la cantidad de Reactivo agregado a la reacción; 2) la temperatura a la cual su "valle" alcanza su valor más bajo es la Tm empírica del Reactivo; 3) el ancho del valle a "media profundidad" es una medida del proceso dependiente de la temperatura de formación de doble cadena/cadena sencilla y fusión del Reactivo.

Se espera que cada una de las propiedades de marca de temperatura anteriores sea una propiedad constante del(de los) Reactivo(s) correspondiente(s) en reacciones de replicación idénticas. Este es el caso porque el Reactivo(s) no se amplifica o se degrada durante el curso de la reacción. Por lo tanto, las diferencias en una o más propiedades de la marca de temperatura en reacciones repetidas proporcionan evidencia de no uniformidad entre las repeticiones. Estas propiedades de las marcas de temperatura también se pueden usar para corregir matemáticamente las no uniformidades entre las reacciones repetidas, así como para cuantificar los productos amplificados en una reacción en relación con las marcas de temperatura del Reactivo(s) no amplificado(s).

Como apreciará un experto en la técnica, también es posible utilizar en una reacción de amplificación por PCR dos reactivos diferentes que tienen secuencias de oligonucleótidos que no hibridan en cruz para sus cadenas dobles que tienen Tm significativamente diferentes, por ejemplo, el Reactivo2 con un Tm de 71 °C y Reactivo3 con una Tm de ~50 °C. Dichos Reactivos sin hibridación cruzada se pueden etiquetar en el mismo color o en colores diferentes. Se prefiere etiquetar ambos Reactivos en el mismo color, por ejemplo, FAM, de modo que en ausencia de cualquier otro híbrido sonda/diana del mismo color. En estas circunstancias, una curva de fusión en un amplio intervalo de temperatura tiene dos valles cuando se expresa como primeras derivadas y la distancia entre los puntos más bajos en estos dos valles, en este Ejemplo, es de 21 °C (71-50). La construcción de dos marcas de temperatura muy diferentes es ventajosa, ya que la distancia entre las dos marcas se conoce de antemano y se puede utilizar para garantizar que cada reacción abarca el mismo intervalo de temperaturas.

La Tm del Reactivo es una propiedad del Reactivo, y es generalmente conocida. La Tm observada del Reactivo en una muestra experimental puede compararse con su Tm en otras muestras y la Tm esperada del Reactivo. Las diferencias entre las Tm de muestras en un conjunto proporcionan evidencia de la variación de muestra a muestra en el sistema. Una diferencia constante entre las Tm de todas las muestras en un conjunto y la Tm esperada del Reactivo indica que la composición de la mezcla de reacción ha causado un cambio general en las condiciones de hibridación del sistema.

Sin embargo, a veces se observa que los ensayos de replicación realizados al mismo tiempo, o en diferentes momentos de una manera tan idéntica como sea posible, no son idénticos. Este es el caso incluso cuando un lote grande de una mezcla maestra particular se prepara, se divide en alícuotas y se prueba como réplicas. La preparación de diferentes lotes de la misma mezcla maestra también puede ser no idéntica, y las mezclas maestras que tienen fórmulas diferentes inevitablemente muestran diferencias. En particular, las concentraciones de cationes monovalentes y divalentes, así como ciertas moléculas polares, son frecuentemente diferentes en diferentes mezclas maestras. Las diferencias entre réplicas también surgen debido a errores de la máquina y del tubo. Por Ejemplo, no todos los pocillos en una placa o rotor pueden calentarse y enfriarse de manera idéntica y no todos los tubos en un conjunto pueden estar herméticamente sellados. La evaporación parcial de una muestra durante ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento aumenta las concentraciones de todos los productos químicos no volátiles en una reacción de "tubo cerrado". Además, la inclusión de una proteína en una mezcla de reacción, como un anticuerpo de inicio en caliente, a menudo trae consigo cantidades desconocidas de iones y otras sustancias químicas patentadas.

Los datos presentados en el Ejemplo 12 ilustran que la marca de temperatura de un reactivo se puede medir repetidamente durante el curso de una reacción de amplificación, por ejemplo, al principio, la parte media y el final. Los resultados muestran que la marca de temperatura es altamente reproducible, siendo la misma después de 0, 30 y 60 ciclos térmicos.

El Ejemplo 13 proporciona un conjunto no exhaustivo de causas para las variaciones entre las repeticiones que se ha observado usando la marca de temperatura de al menos un Reactivo. En la mayoría de los casos, las variaciones entre réplicas se observan como cambios en la marca de temperatura a una temperatura más alta o más baja en una cantidad superior a 0,5 °C. Estos cambios están de acuerdo con las diferencias en la fuerza iónica de la mezcla de reacción. En general, las fuerzas iónicas más altas estabilizan las cadenas hibridadas y, por lo tanto, aumentan la Tm de la marca de temperatura. Como se discutió anteriormente en relación con el Ejemplo 5 y las Figuras 5A-B, 2-3 diferencias en las concentraciones de un Reactivo alteran la marca de temperatura de ese Reactivo de acuerdo con la fórmula del vecino más cercano para calcular los valores de Tm antes del inicio de una reacción, pero los cambios de esta naturaleza generalmente son intencionales. En contraste, las ligeras diferencias no intencionadas en las cantidades de un Reactivo de composición conocida para replicar reacciones causan ligeras variaciones en la amplitud de la señal a una temperatura fija.

Las polimerasas de inicio rápido, composiciones en las que se modifica una polimerasa regular mediante, por ejemplo, anticuerpos, grupos alquilantes o trinucleótidos modificados, se utilizan junto con todas las formas de PCR. Una modificación de arranque en caliente bloquea o inhibe la actividad de la polimerasa antes de la primera etapa de fusión del primer ciclo térmico. De este modo, evitan un cebado incorrecto en un momento en que se prepara la mezcla de reacción y los cebadores están presentes con la polimerasa a una temperatura muy por debajo de sus Tm. Todos los tipos de reactivos de arranque en caliente se inactivan intencionalmente de manera irreversible durante el primero, o los primeros (en el caso de algunos trinucleótidos modificados) de las etapas de fusión de la cadena del ciclo térmico de la PCR. Debido a que el Reactivo mejora la selectividad de la polimerasa y la especificidad del cebador como se describió anteriormente, el Reactivo se puede usar como sustituto de los reactivos convencionales de arranque en caliente. En esta capacidad, el Reactivo (o combinación de Reactivos) no se inactiva intencionalmente irreversible después del inicio de la amplificación. Más bien, es activo o inactivo de una manera dependiente de la temperatura correspondiente a la medida en que es bicatenario. Además, cuando se usa en esta capacidad, un Reactivo (o una combinación de Reactivos) no inhibe la actividad de la polimerasa de la misma manera que un reactivo de arranque en caliente tradicional. Más bien, el Reactivo (o combinación de Reactivos) inhibe la actividad de la 5'exonucleasa y, por lo tanto, restringe severamente la actividad de la polimerasa a la extensión de interacciones de cebador/diana perfectamente emparejadas, garantizando así que la síntesis de productos no específicos no se inicie antes de la primera etapa de fusión del primer ciclo térmico.

El uso de un solo reactivo como sustituto del arranque en caliente puede reforzarse mediante la adición de 100-500 nM de un oligonucleótido bicatenario que se administra en tres a cuatro de sus nucleótidos terminales como se describió anteriormente en la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 2010/105074. Ambas secuencias de cadenas complementarias de dicha molécula multidabcilada están diseñadas para no hibridar en cruz con ninguno de los cebadores o reactivos en la reacción. La temperatura de fusión de dicho reactivo multidabcilado se establece lo suficientemente baja, preferiblemente al menos 30 °C, pero por debajo de las Tm del cebador y más preferiblemente por debajo de la temperatura de recocido, para garantizar que no inhiba la unión y extensión del cebador para pares el cebador/diana correctamente emparejado. El Ejemplo 14 ilustra un caso en el que el Reactivo1 se ha usado en combinación con 500 nM de un oligonucleótido bicatenario que tiene una longitud de 22 nucleótidos, está modificado por 4 grupos dabcilo terminales y tiene una Tm de 67 °C, que está por debajo de los cebadores Tm y 8 °C por debajo de la temperatura de recocido/extensión. La reacción de amplificación contenía 10, 100 o 1,000 genomas de M. tuberculosis de ADN, junto con 20000 copias de ADN genómico humano para aumentar la posibilidad de cebado incorrecto si varios aditivos no podían prevenir el cebado incorrecto. Se utilizó un par de cebadores para la diana del gen rpoB en M. tuberculosis para la amplificación, junto con dos pares de sondas Lights-On/Lights-Off.

Los resultados en el Ejemplo 14, Figuras 14A-C son los productos de reacciones repetidas en las que se usó una unidad de Taq polimerasa por 25 pl sin un anticuerpo de inicio en caliente. En contraste, las Figuras 14D-F tenían un anticuerpo de inicio en caliente agregado. La Figura 14A en comparación con la Figura 14D tiene más variabilidad entre las reacciones replicadas (véase región de las flechas 1 y 1', 2 y 2') analizadas después de 35 ciclos de amplificación. Esta variabilidad se debe a errores de cebado incorrecto antes del inicio de la amplificación en ausencia del anticuerpo. Las figuras 14B y E contenían 500 nM del oligonucleótido de 22 pb modificado con 4 grupos dabcilo pero sin Reactivo! Las comparaciones de las Figuras 14B y A, y las Figuras 14e y D ilustran que la presencia del oligonucleótido modificado alteró el patrón de fluorescencia del híbrido sonda/diana (particularmente en la región de las flechas 2 y 2'). Esto muestra que el oligonucleótido modificado funciona para evitar un cebado incorrecto antes y durante la amplificación. Las Figuras 14C y F contenían 500 nM del oligonucleótido de 22 pb modificado con grupos 4 dabcilo, más 75 nM de Reactivo! Las comparaciones de las Figuras 14B y C, y las Figuras14E y F ilustran que el Reactivo1 reduce aún más la dispersión entre las reacciones replicadas. Además, la comparación de las Figuras 14F y C ilustran que el anticuerpo de inicio en caliente no mejora significativamente la similitud de las reacciones replicadas en cada uno de los tres niveles diana 10, 100 y 1000 copias de ADN genómico de M. tuberculosis. En conjunto, estos resultados demuestran que un Reactivo combinado con un oligonucleótido bicatenario con múltiples dabcilos y una Tm por debajo de la de los cebadores exhiben tanto una selectividad del cebador mejorada como una actividad similar al comienzo en caliente.

El Ejemplo 14 ilustra además el beneficio de combinar 500 nM del oligonucleótido de 22 pb modificado con 4 grupos dabcilo con 75 nM Reactivo1 después de 35 ciclos térmicos. La comparación de las Figuras 14C y B y las Figuras 14F y E ilustra que los dos reactivos trabajan juntos para mejorar aún más la precisión de la amplificación. Además, la marca de temperatura a aproximadamente 80 grados generada por Reactivo1, Figuras 14C y F, se pueden usar para normalizar las señales fluorescentes en todos los demás puntos.

El Ejemplo 15 ilustra que el Reactivo2 usado en combinación con un anticuerpo de inicio en caliente mejora la reproducibilidad de las reacciones replicadas en comparación con el anticuerpo solo. El Ejemplo 15 también ilustra que el Reactivo2 usado solo es tan bueno como el anticuerpo utilizado solo para lograr la supresión de arranque en caliente de un cebado incorrecto.

El Ejemplo 16 ilustra el uso de dos Reactivos que tienen diferentes Tm. Ambos Reactivos se marcaron en el mismo color fluorescente y la reacción se llevó a cabo por triplicado. El resultado se genera al trazar la primera derivada de la fluorescencia en función de la temperatura y muestra dos marcas de temperatura en el mismo color fluorescente. La Tm empírica de la marca de temperatura más baja es aproximadamente 52 °C y la marca de temperatura más alta es alrededor de 66 °C. Como apreciará una persona versada en la técnica, el número de grados C entre estas dos marcas podría aumentarse (o disminuirse) alterando la composición del par de bases de los Reactivos correspondientes. Por Ejemplo, la marca de temperatura más baja podría permanecer a 52 °C y la marca de temperatura más alta podría moverse a 79 °C usando Reactivo! Como apreciará una persona versada en la técnica, se podrían añadir una o más señales fluorescentes adicionales a este gráfico de dos marcas. Por Ejemplo, una diana amplificable podría ser sondeada en el mismo color, y el híbrido sonda/diana podría diseñarse para generar un primer pico de derivada positivo entre las marcas de temperatura de los dos reactivos no amplificables. En este caso, la amplitud de dicho pico de la diana amplificada en relación con la profundidad sin cambios de los valles de los dos reactivos no amplificados aumentaría en proporción a la cantidad del producto amplificado. En el caso de un ensayo LATE-PCR, esta señal aumentaría en función de la cantidad del amplicón monocatenario generado. Dicha señal podría incluirse en una reacción como un control interno amplificable, en comparación con los controles internos no amplificables proporcionados por uno o más Reactivos.

La actividad similar a un arranque en caliente también se puede lograr usando dos Reactivos, en cuyo caso también se generan dos marcas de temperatura diferentes en todo el intervalo de temperatura. Por Ejemplo, para reacciones de 25 |jl que contienen 1,25 unidades de Taq polimerasa, una primera combinación puede comprender Reactivo3 (Tabla 1) mezclado con Reactivo4 (Tabla 1) para proporcionar una primera marca de temperatura a aproximadamente 67 °C y una segunda marca de temperatura a aproximadamente 52 °C, dependiendo de la concentración de cada Reactivo en el intervalo de 50-300 nM. Se prefiere que tanto el Reactivo3 como el Reactivo4 estén marcados con el mismo fluoróforo, por ejemplo, FAM, como se ilustra en el Ejemplo 16. Se puede usar una combinación de Reactivo3 y Reactivo4 con una temperatura de recocido/extensión de, por ejemplo, 75 °C. Una segunda combinación útil de reactivos se compone de Reactivo2 (Tabla 1) con Reactivo4. Esta combinación de Reactivos se puede usar, por ejemplo, con una temperatura de recocido de aproximadamente 60-65 °C y una temperatura de extensión de 72 °C. El Reactivo con la temperatura más baja está diseñado para tener un Tm funcional de 5 °C o más por debajo de la temperatura de recocido de la reacción y, por lo tanto, solo se convertirá en una doble cadena por debajo de la temperatura de recocido. Servirá para aumentar la selectividad de la polimerasa y la especificidad del cebador, así como para inhibir la actividad de la 5'exonucleasa a bajas temperaturas, incluidas las utilizadas antes de la amplificación o durante la adquisición de fluorescencia a baja temperatura en cualquier ciclo en el curso de la amplificación (por ejemplo, detección de una sonda de Tm baja o análisis de fusión) o al final de la amplificación. Las dos marcas de temperatura generadas por los dos Reactivos también se pueden usar para establecer la reproducibilidad del termociclador que se usa para la amplificación, como se explica a continuación.

Las marcas de temperatura simple y doble proporcionan no solo un medio para ajustar visualmente las firmas fluorescentes de muestras para compararlas con una biblioteca de curvas de muestras conocidas, sino que también proporcionan el punto de partida para el análisis matemático de curvas de fusión/fusionamiento en todos los colores en una sola muestra. Una firma fluorescente obtenida de una muestra amplificada utilizando múltiples sondas Lights On/Lights-Off puede compararse a mano con una biblioteca de curvas obtenidas de muestras conocidas, como se describe en la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 2011/050173. Cuando se utiliza la comparación manual, las variaciones en las Tm de picos y valles entre una curva de referencia y la curva de una muestra que contiene la misma diana se superan fácilmente deslizando una curva hacia la izquierda o hacia la derecha hasta que coincidan. Para el análisis matemático por ordenador, no es posible el GLIDE manual de curvas. Para el análisis matemático, por lo tanto, se usa un conjunto de algoritmos como se ilustra en el Ejemplo 17 y las Figuras17A-C. Los pasos en el análisis están diseñados para lograr lo siguiente: 1) Se verifica que la forma de la marca de temperatura "pico" o "valle" (según el signo) se ajuste a una curva gaussiana o gaussiana sesgada de acuerdo con las propiedades predeterminadas del reactivo; 2) Se establece una marca de temperatura calculada para la curva de Gauss, que se denomina aquí "Tm observada", OTM, para la marca térmica medida empíricamente en la muestra en particular; 3) Se desarrolla un valor de ajuste de temperatura, TAV, que corrige el OTM en cada muestra a un o Tm estándar predeterminado para ese Reactivo (un TAV puede basarse en el OTM de un solo Reactivo, o en un valor alto/bajo par de temperaturas de OTM de dos Regentes); 4) Se usa el TAV para una muestra para ajustar cada grado de temperatura medido empíricamente a una temperatura corregida. 5) Se normalizan las señales de fluorescencia en todos los canales utilizados para detectar la fluorescencia de la sonda de modo que estén entre 0 y 1, utilizando los valores de temperatura más baja y más alta como el valor 0 y el valor 1, respectivamente, para que se pueda examinar la forma de la fusión curvas sin tener en cuenta la abundancia del material; 6) Se calculan las derivaciones primera y segunda para resaltar el patrón de señal o los patrones relacionados con las luces ACTIVADO/luces DESACTIVADO.

7) Para evaluar una muestra desconocida, se calcula el error de temperatura promediada (como el error cuadrado) entre la primera o la segunda derivada, la curva de fusión normalizada de la muestra desconocida y una base de datos de muestras conocidas; se considera que la muestra conocida con el error más bajo es la mejor coincidencia para la muestra desconocida.

Parte experimental

En los Ejemplos que siguen, las concentraciones de reactivos y Reactivos algunas veces son caracterizadas por un solo número, por ejemplo, 50 nM. Cuando se hace esto, el número de concentración se refiere a la concentración de la cadena delantera, es decir, la cadena superior en la Tabla 1. Como se explicó anteriormente, la cadena complementaria (la cadena inferior en la Tabla 1) a menudo se agrega a una concentración más alta, particularmente cuando, como en el Reactivo1, la cadena delantera está marcada con un fluoróforo y la cadena inferior está marcada con un extintor. La concentración de cadenas dobles se determina por la menor concentración de la cadena delantera, cuando la concentración de la cadena reversa es mayor.

Ejemplo 1

Modelado molecular de interacciones Dabcilo/Taq

Procedimientos

La cristalografía de rayos X es el procedimiento de elección para comprender cómo el ReactivoB (sin dabcilos) o el Reactivo D (dos dabcilos), ambos mostrados en la Tabla 1, interaccionan con la Taq Polimerasa. Los experimentos a lo largo de estas líneas aún no han producido cristales. Mientras tanto, se ha optado por utilizar la estructura cristalina conocida de la Taq Polimerasa y un programa de acoplamiento para calcular cómo las fracciones dabcílicas 3' y 5' se ajustan mejor a una parte del dominio de la polimerasa (el sitio catalítico de la polimerasa o el "sitio poli", 105 en la Figura 1A) y parte del dominio de 5'exonucleasa (el sitio catalítico de la 5'exonucleasa, o "sitio de 5'exo", 105 en la Figura 1A) de Taq. El protocolo para generar una puntuación de GLIDE es el paquete de programas de Schroedinger: una interfaz de usuario llamada Maestro, y un programa específico utilizado para el acoplamiento es GLIDE (Gridbased Ligand Docking with Energetics. La puntuación GLIDE (puntuación G) viene dada por:

Puntuación G = a*vdW Coul Lipo Hbond = Metal BuryP RotB Site, donde

vdW = energía de van derWaals

Coul = energía de Coulomb

Lipo = término de contacto lipófilo

HBond = término de enlace de hidrógeno

Metal = término de unión al metal

BuryP = Penalización para grupos polares sepultados

RotB = Penalización por congelar enlaces rotativos

Sitio = Interacciones polares en el sitio activo'

y los coeficientes de vdW y Coul son:

a = 0,065, b = 0,130 fpr GLIDE precisión estándar (SP)

El software GLIDE esencialmente examina todas las interacciones entre una molécula de acoplamiento (un dabcilo) y una molécula de proteína (Taq Polimerasa), y calcula las mejores interacciones que tienen la energía de interacción más baja. Las interacciones de la proteína y la molécula pequeña se definen en un espacio de acoplamiento tridimensional y el programa calcula una puntuación de GLIDE basada en estas interacciones. Cuanto más negativa sea la puntuación de GLIDE, mejores serán las interacciones entre el Taq y la molécula. Desafortunadamente, en el programa GLIDE, el tamaño de la molécula pequeña es limitado. Por lo tanto, se restringe este análisis al fosfato de nucleótido 3' o 5' unido a la fracción dabcilo correspondiente. Se generaron las cuatro puntuaciones de GLIDE para las mejores interacciones: 3' fosfato de dabcilo C en el sitio poli, 5' fosfato de dabcilo G en el sitio poli, 3' fosfato de dabcilo C en el sitio 5'exo y 5' fosfato de dabcilo G en el sitio 5'exo.

Resultados

3' fosfato de dabcilo C en el sitio poli

El fosfato 3' de dabcilo C se acopló en el sitio de la polimerasa de Taq con una puntuación de acoplamiento de -8,08, lo que indica un buen ajuste. El dabcilo 3 'se adhiere al sitio catalítico, mientras que el fosfato C permanece cerca de la entrada al sitio. También está más cerca de la parte del pulgar de la polimerasa.

5' dabcilo G fosfato en el sitio poli

El 5' fosfato de dabcilo G se acopló en el sitio de la polimerasa con una puntuación de GLIDE de - 4,84, lo que indica una unión moderada. El dabcilo 5' se adhiere al sitio mientras que el fosfato G permanece cerca de la entrada al sitio poli. Está más cerca de la parte de los dedos de la polimerasa.

3' fosfato de dabcilo C en el sitio de 5'exo

El fosfato 3' de dabcilo C se acopló en el sitio 5' exo con una puntuación de GLIDE de 10,03, lo que indica una unión firme. El dabcilo 3' se adhiere al sitio, mientras que el fosfato C permanece cerca de la entrada al sitio 5'exo. La molécula encaja dentro del canal de una sola cadena, que se encuentra en la parte inferior (Figura 1A) de la parte 5'exo de la polimerasa.

5' fosfato de dabcilo G en el sitio 5'exo

El 5' dabcilo G fosfato se acopló en el sitio 5'exo con una puntuación de GLIDE de -5,33, lo que indica una unión moderada. El 5' dabcilo se adhiere al sitio, mientras que el fosfato G permanece cerca de la entrada al sitio 5'exo. La molécula encaja dentro del canal de una sola cadena, que se encuentra en la parte inferior (Figura 1A) de la parte 5'exo de la polimerasa. Con respecto a la relación espacial entre el 5' dabcilo G y el sitio 5'exo de la Taq polimerasa, el 5' dabcilo G fosfato está bellamente contorneado al canal en la estructura de relleno de espacio. Con respecto a las estructuras de relleno de espacio del sitio 5'exo, solo uno de los 5' dabcilo G fosfato y el 3' dabcilo C fosfato puede unirse al canal 5'exo monocatenario a la vez.

Discusión

Los resultados del programa de acoplamiento GLIDE muestran que tanto el 5' dabcilo G fosfato como el 3' dabcilo C fosfato tienen una puntuación de interacción GLIDE de unión razonable para los sitios de poli y 5'exo de la Taq Polimerasa. La Figura 1A muestra una estructura de la Taq Polimerasa sin nada acoplado en ella. Se nota que hay una estructura de Taq polimerasa con el 3' dabcilo C fosfato y el 5' dabcilo G fosfato acoplados en el sitio poli, ya que ambos son capaces de encajar en el sitio bicatenario al mismo tiempo, bloqueando completamente el sitio. Esto ocurre cuando hay un ReactivoB o ReactivoD de muy alta concentración, lo que detiene la función de la polimerasa. La Figura 1B muestra tanto el sitio poli catalítico 104 como el sitio 5'exo catalítico 105 llenos de un 3' dabcilo C fosfato o un 5' dabcilo G fosfato. Ambos encajan bien en el canal 5'exo. Todos los resultados de acoplamiento muestran que a ciertas concentraciones de dabcilo el sitio 5'exo estará bloqueado por un 3' dabcilo C fosfato o un 5' dabcilo G fosfato, lo que implica que el ReactivoB o el ReactivoD a bajas concentraciones inhibirá la 5'exonucleasa actividad.

Ejemplo 2

Un ensayo de temperatura de oscilación independiente del cebador para evaluar la inhibición de la actividad de la 5'exonucleasa

La ADN polimerasa de Taq tiene la capacidad de escindir el nucleótido marcado con fluorescencia en el extremo 5' de una sonda de oligonucleótido que se hibrida a su cadena diana. Esta división de 5'exonucleasa incluso se produce en condiciones isotérmicas en ausencia de extensión de un cebador corriente arriba. Por lo tanto, es la escisión independiente del cebador, en contraste con la escisión dependiente del cebador que tiene lugar en las reacciones de amplificación de la nucleasa 5' estándar. Se ha encontrado que la velocidad de escisión de la 5'exonucleasa independiente del cebador aumenta al oscilar la temperatura de la mezcla de reacción en un intervalo de temperatura limitado por encima y por debajo de la Tm del híbrido sonda/diana.

Las reacciones de oscilación se llevaron a cabo en 25 pl de volumen que consistía en un tampón de PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, dNTPs 200 nM, 1,25 unidades de ADN Taq Polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), 200 nM de una sonda con 5'FAM y 3' Extintor de Agujero Negro 1 (BHQ1), y 100 nM de una diana complementaria de 41 nucleótidos de longitud, perfectamente complementaria. Esta mezcla de reacción se usó sin ningún aditivo reactivo, así como con concentraciones variables (50 nM, 100 nM, 150 nM) de ciertos reactivos identificados en la Tabla 1. Con referencia a la Tabla 1, los aditivos reactivos fueron: ReactivoA; ReactivoC; y Reactivo1, en donde el fluoróforo, F, fue Cal Orange 560 (Figura 19) y el extintor, Q, fue Extintor de Agujero Negro 2 (Figura 18). Cada reactivo agregado fue bicatenario y todos tenían las mismas secuencias de nucleótidos inversas directas y complementarias. Como se muestra en la Tabla 1, el ReactivoA tenía solo enlazadores 3'-carbono (C3). En esta versión del ReactivoA, las cadenas inversas tenían concentraciones de 150 nM, 300 nM y 450 nM. Como se muestra en la Tabla 1, el ReactivoC tenía grupos dabcilo terminales yuxtapuestos. En esta versión del ReactivoC, las cadenas inversas tenían concentraciones de 150 nM, 300 nM y 450 nM. Como se muestra en la Tabla 1, el Reactivo1 tenía un interruptor terminal en la cadena reversa opuesto a un fluoróforo del extremo 5', una fracción voluminosa, en la cadena delantera. Este Ejemplo utilizó una versión de Reactivo1 en donde la fracción fluorescente, F, fue el fluoróforo Quasar 670 y la fracción de extinción, Q, fue Extintor de Agujero Negro 2. En esta versión de Reactivo1, las cadenas inversas tenían concentraciones de 150 nM, 300 nM, y 450 nM. Se realizó una reacción de control con la sonda como el único oligonucleótido en la mezcla de reacción. Las mezclas de reacción se oscilaron utilizando el siguiente perfil térmico: 45 °C/20s, 60 °C/10s durante 45 ciclos. La fluorescencia de FAM se adquirió durante el segmento de 45 °C del perfil térmico. Los resultados se presentan en las Figuras 2A-C, que son gráficos de la intensidad de fluorescencia de FAM frente al número de ciclos de oscilación.

Las secuencias para la sonda y la diana fueron:

Sonda:5' FAM- CCATGATACAAGCTTCC-BHQ1 (SEQ ID NO. 11)

Diana: 5' ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACCT (SEQ ID NO. 12)

La actividad de escisión de la 5' Exonucleasa separa la sonda del fluoróforo de la sonda, lo que resulta en un aumento de la fluorescencia (FAM). Los resultados reportados en las Figuras 2A-C son el promedio de tres réplicas con las reacciones de la sonda solo ajustadas hasta el valor fluorescente más bajo en el tiempo cero como las reacciones de la sonda más la diana. En la Figuras 2A, la curva 201 para la reacción de solo la sonda muestra que, en ausencia de una diana, la sonda no se escinde. La curva 202 para la reacción que contiene la sonda y la diana, pero no reactivo, muestra la división más alta de la sonda. Las curvas 203, 204 y 205 para reacciones con ReactivoA a 50, 100 y 150 nM, respectivamente, muestran una disminución gradual en la actividad de la 5'exonucleasa de una manera dependiente de la concentración.

La Figura 2B muestra los resultados con el ReactivoC (dabcilo/dabcilo), que claramente inhibe la actividad de la 5'exonucleasa. Las curvas 206, 207 y 208 son 50, 100 y 150 nM del reactivo. Para el Reactivo1 (CO560/BHQ2), los resultados se muestran en la Figuras 2C donde las curvas 210, 211 y 212 son, respectivamente, concentraciones de 50, 100 y 150 nM. Este reactivo muestra poco o ningún aumento de la inhibición de la 5'exonucleasa sobre la del ReactivoA sin fracciones en los extremos 5' y 3'.

Ejemplo 3

Ensayo de especificidad del cebador utilizando un aditivo sin Reactivo, ReactivoA, ReactivoC, Reactivol o Reactivol'

Se realizó un ensayo LATE-PCR en el que se amplifica una diana que era complementaria a ambos cebadores (diana emparejada), y en el que se amplifica por separado una diana que era complementaria al cebador en exceso pero que contenía una única falta de coincidencia con el extremo 3' nucleótido del cebador limitante. Se detecta el producto bicatenario en tiempo real, es decir, durante la porción de extensión del cebador de cada ciclo de PCR, utilizando SYBR Green, un colorante que se une al ADN bicatenario. Las secuencias de los cebadores y las dianas de una sola cadena son las siguientes:

Cebador limitante. 5'CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGT (SEQ ID NO. 13)

Cebador en exceso. 5'GCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA (SEQ ID NO. 14)

Diana emparejada (A). 5' CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGAAGGTTCTAA GTGCCATGATACAAGCTTCCCAATTACTAAGTATGC TGAGAA GAACGATAAAACTTGGG (SEQ ID No. 15)

Diana no coincidente (T).

5 ’ CGT A A G ATT A C AA T GGC A G G CTC C A G T A G G TT CT AA GT GC

C A T G AT AC A A G C TT C C C A A TT A C T A A G T AT G CTG

A G A A G A A C G A TA A A A C TTG G G C A A (SEQ ID No. 16)

El nucleótido subrayado y en negrita es el nucleótido cuyo complemento en la cadena del cebador en exceso coincidirá o no coincidirá con el nucleótido 3'-terminal del cebador limitante.

Para este ensayo que contiene dos dianas, se ejecutó una amplificación de control utilizando el cebador en exceso, que es perfectamente complementario de ambas dianas, y un cebador limitador de control que también es perfectamente complementario de ambos dianas, para garantizar que los números de copias iniciales de ambas dianas son iguales, en cuyo caso el Ct para ambas dianas es el mismo (con <0,5 Ct).

Las amplificaciones de LATE-PCR se llevaron a cabo por triplicado (tres ensayos repetidos) en 25 |jl de volumen que consiste en un tampón de Invitrogen PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, dNTPs 200 nM, 50 nM de cebador limitante, 1000 nM de exceso cebador, 0,24X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,25 unidades de ADN polimerasa Plaq de Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) con aproximadamente 1000 diana monocatenaria A (emparejada) o T (desajustada). Una excepción fue el ReactivoB, donde se llevaron a cabo dos ensayos repetidos. Las reacciones adicionalmente no contenían reactivo agregado, o varias cantidades (50 nM, 100 nM o 150 nM) de ReactivoA, ReactivoC, Reactivo1 con un fluoróforo Cal Orange 560 y un Extintor de Agujero Negro 2, Reactivo1 con un fluoróforo Quasar 670 y un Extintor de Agujero Negro 2, o Reactivo1' con un fluoróforo Quasar 670 y un fluoróforo Cal Orange 560. Para el ReactivoA, las concentraciones de la cadena reversa fueron 150 nM, 300 nM y 450 nM. Para el ReactivoC, las concentraciones de la cadena reversa fueron 150 nM, 300 nM y 450 nM. Para ambas versiones de Reactivol, las concentraciones de la cadena reversa fueron 150 nM, 300 nM y 450 nM. Para el Reactivo 1' las concentraciones de la cadena reversa fueron 150 nM, 300 nM y 450 nM. Las condiciones del perfil térmico para estas reacciones fueron: 95 °C durante 3 minutos seguidos de 95 °C/5s-62 °C/20s-72 °C/33s durante 60 ciclos. A esto le siguió una fusión (véase el Ejemplo 5 a continuación) con adquisición fluorescente para Fam, Cal Orange 560 y Quasar 670 en cada grado, comenzando a 35 °C con incrementos de 1 °C en intervalos de 33 s a 95 °C.

Las Figuras 3A-O muestran las curvas de fluorescencia en tiempo real para el colorante SYBR Green, que se leyó en el canal FAM del instrumento y, por lo tanto, se indica como "Fluorescencia FAM". Cada figura incluye la curva 301 para las reacciones con la diana coincidente y sin aditivo, y la curva 302 para las reacciones con la diana no coincidente y sin aditivo. Las Figuras 3A-C son para reacciones con ReactivoA en concentraciones de 50 nM, 100 nM y 150 nM, respectivamente. Las curvas 303, 305 y 307 son para la diana coincidente, y las curvas 304, 306 y 308 son la diana no coincidente. Las Figuras 3D-F son para reacciones con ReactivoC a concentraciones de 50 nM, 100 nM y 150 nM, respectivamente. Las curvas 309, 311 y 313 son para la diana coincidente, y las curvas 310, 312 y 314 son para la diana no coincidente. Las Figuras 3G-I son para reacciones con una primera versión de Reactivo1, en donde la fracción fluorescente, F, es Cal Orange 560 y la fracción de desactivador, Q, es Extintor de Agujero Negro 2. Las concentraciones de esa versión de Reactivo1 en las Figuras 3G-I son 50 nM, 100 nM y 150 nM, respectivamente. Las curvas 315, 317 y 319 son para la diana coincidente, y las curvas 316, 318 y 320 son para la diana no coincidente. Las Figuras 3J-L son para reacciones con una segunda versión de Reactivo1, en donde la fracción fluorescente, F, es Quasar 670 y la fracción de desactivador, Q, es Extintor de Agujero Negro 2. Las concentraciones de esa segunda versión de Reactivo1 en las Figuras 3J-L son 50 nM, 100 nM y 150 nM, respectivamente. Las curvas 321, 323 y 325 son para la diana coincidente, y las curvas 322, 324 y 326 son para la diana no coincidente. Las figuras 3M-O son para reacciones con una versión de Reactivo1', en donde 5'F es Quasar 670 y 3'F es Cal Orange 560. Las concentraciones de esa versión de Reactivo1' son 50 nM, 100 nM y 150 nM, respectivamente. Las curvas 327, 329 y 331 son para la diana coincidente, y las curvas 328, 330 y 332 son para la diana no coincidente.

La extensión del cebador a favor de la diana/cebador emparejados frente a la diana/cebador no coincidentes en 3'-terminal es la diferencia entre el ciclo de umbral (C^t) de la señal de amplificación de la diana no coincidente y el C^tde la señal de amplificación de la diana coincidente (A C^t). Las reacciones de amplificación de replicación se ejecutaron, como se indica. Las diferencias de C^tse calcularon usando promedios de las repeticiones. Se realizó un ensayo sin ningún reactivo o Reactivo añadido. Las señales de SYBR Green se detectaron en tiempo real, es decir, durante la porción de extensión del cebador de todos los ciclos de PCR. Las lecturas de intensidad de fluorescencia en función del número de ciclo de amplificación muestran que la enzima tiene una modesta selectividad inherente para la diana emparejada. Se obtuvo la diferencia de C^tentre las secuencias diana coincidentes y no coincidentes (véase la Figura 3A, círculos 301, 302). Ese A C^tpara las dos plantillas con el mismo cebador limitante fue 2,1. La efectividad de un reactivo o reactivo para aumentar la especificidad del cebador es la diferencia de C^t(A C^t) observada en las reacciones de PCR con el reactivo o Reactivo menos la A C^tsin ningún reactivo o Reactivo. Por lo tanto, para cada reactivo o Reactivo, primero se determinó un A C^t, y luego se calculó un A AC^trestando 2,1.

Los resultados se presentan en la Tabla 2, donde la mejora (o, si es un número negativo, la degradación), en la diferencia de C^tresultante del uso de reactivo o Reactivo frente a ningún reactivo es la columna encabezada por AAC^t.

Tabla 2

Reactivo Conc. (nM) AAC_t

ninguna

reactivoA

50 -0,35

100 1,88

150 -0,06

reactivoC 50 N/A

100 (sin amplificación)

150 (sin amplificación)

Reactivo1 (CO 560) 50 5,23

100 7,47

150 7,74

Reactivo1 (QSR670) 50 4,72

100 6,01

150 8,02

Reactivo1' 50 0,46

100 2,58

150 3,34

N/A: los resultados se retrasan significativamente, por lo que no son aplicables, véase Figura 3D

Ejemplo 4

Cebado incorrecto tipo II y selectividad de la polimerasa

Se realizó un ensayo LATE-PCR en el que se amplifica una diana que era complementaria a ambos cebadores (diana emparejada), y en el que se amplifica por separado una diana que era complementaria al cebador en exceso pero que contenía una única falta de coincidencia con el nucleótido 3'-terminal del cebador limitante. Se detecta productos bicatenario en tiempo real, es decir, durante la porción de extensión del cebador de cada ciclo de PCR, mediante un colorante de ADN, en este caso SYBR Green. La selectividad frente a una falta de coincidencia 3'-terminal en presencia de reactivo en cualquier concentración es la diferencia entre el ciclo de umbral (C^t) de la señal de amplificación de la diana no coincidente y el C^tde la señal de amplificación de la diana coincidente (AC^t). Las reacciones de amplificación se realizaron por triplicado. Las diferencias de C^tse calculan utilizando los promedios de las tres repeticiones. La efectividad de un reactivo para mejorar la selectividad de una ADN polimerasa es la diferencia C^t, AC^t, con el reactivo menos la diferencia C^t, AC^t, sin ningún reactivo, es decir, la AAC^t. Bajo el encabezado "Selectividad" en este Ejemplo, informamos la mejora en la diferencia de C^t, AAC^t, resultante del uso de un reactivo.

Las secuencias de los cebadores y las dianas monocatenarias fueron las mismas que en el Ejemplo 3. Para el ReactivoA, las concentraciones de la cadena directa fueron 50, 100 y 150 nM; y las concentraciones de la cadena reversa fueron 150, 300 y 450 nM, respectivamente. Para el Reactivol, en el que la fracción fluorescente, F, en la cadena delantera era Cal Orange 560 y la fracción de enfriamiento, Q, en la cadena reversa fue Extintor de Agujero Negro 2, las concentraciones de la cadena directa fueron 50, 100 y 150 nM; y las concentraciones de la cadena reversa fueron 150, 300 y 450 nM, respectivamente. Para el Reactivo2, en donde la fracción fluorescente, F, en la cadena delantera fue Cal Red 610 y la fracción de enfriamiento, Q, en la cadena reversa fue el Extintor de Agujero Negro 2, las concentraciones de la cadena directa fueron 50, 100 y 150 nM, y las concentraciones de la cadena reversa fueron 150, 300 y 450 respectivamente.

Las amplificaciones de LATE-PCR se llevaron a cabo por triplicado (tres ensayos repetidos) en 25 pl de volumen que consiste en un tampón de Invitrogen PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, dNTPs 200 nM, 50 nM de cebador limitante, 1000 nM de cebador en exceso, 0,24X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,25 unidades de polimerasa de ADN Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) con aproximadamente 10000 unidades de diana monocatenarias A (emparejada) o T (desajustada). Las condiciones del perfil térmico para estas reacciones fueron: 95 °C durante 3 minutos seguidos de 95 °C/5s-62 °C/20s-72 °C/33s durante 60 ciclos con adquisición de fluorescencia en cada ciclo en el paso de 72 °C. A esto le siguió una fusión con adquisición fluorescente para Fam, Cal Red 610 y Quasar 670 en cada grado, comenzando a 35 °C con incrementos de 1 °C en intervalos de 30 s a 95 °C. Para este ensayo que contiene dos dianas, se ejecutó una amplificación de control utilizando el cebador en exceso, que es perfectamente complementario de ambas dianas, y un cebador limitador de control que también es perfectamente complementario de ambos dianas, para garantizar que los números de copias iniciales de ambas dianas son iguales, en cuyo caso el C^tpara ambas dianas es el mismo (dentro de <0,5 C^t). Los resultados se presentan en la Tabla 3, donde AC^tes la diferencia entre los C^tpara las dianas emparejados y no coincidentes, y A AC^tes la diferencia entre los AC^tcon y sin el Reactivo.

Tabla 3

Reactivo Conc. (nM) AC^tAAC^t

ninguna ----- 2,1 -----

reactivoA 50 -0,35

100 1,88

Reactivo Conc. (nM) AC_tAAC^t

150 -0,06

Reactivo1 50 6,6 4,5

100 8,6 6,5

150 10,0 7,9

Reactivo2 50 3,2 1,1

100 4,3 2,2

150 5,6 3,5

Cuando se analizó una muestra con un reactivo o Reactivo en este ensayo, también se incluyó un control sin reactivo, y la diferencia de C^tentre las secuencias diana emparejadas y no coincidentes para el control sin reactivo, en general, se restaron aproximadamente 2 ciclos de C^tde la diferencia de C^tentre las secuencias diana emparejadas y no coincidentes para que el reactivo llegue a los números de mejora de selectividad (AA C^t) presentados en la Tabla 3.

Las curvas en tiempo real de la fluorescencia de SYBR Green para dos de las muestras se muestran en la Figura 4, donde el círculo 401 denota las reacciones triplicadas con Reactivo2 150 nM y la diana emparejada, y el círculo 402 denota las reacciones triplicadas con 1 Reactivo1 50 nM y la diana emparejada. Una de las curvas del círculo 401 muestra la evolución del producto, evidenciada por un aumento tardío de la fluorescencia una vez que se ha alcanzado la meseta. En tal evidencia de evolución del producto se ve en cualquier curva del círculo 402.

Ejemplo 5

Reactivol y Reactivo2 como marcas de temperatura

Las amplificaciones de LATE-PCR se realizaron como se describe en el Ejemplo 3, con la adición de varias cantidades (50 nM, 100 nM o 150 nM) de Reactivo1 o Reactivo2 más corto, en donde en cada una de las fracciones fluorescentes, F, era Cal Orange 560 o Cal Red 610 y la fracción de extinción, Q, era un Extintor de Agujero Negro 2. Para ambos Reactivos, se añadió la cadena reversa a una concentración tres veces mayor que la concentración de la cadena delantera. Las reacciones de amplificación fueron seguidas por una fusión con adquisición de fluorescencia para el fluoróforo en cada grado comenzando a 35 °C con incrementos de 1 °C a intervalos de 33 s a 95 °C. Los primeros derivados de la intensidad de fluorescencia se muestran en las Figuras 5A-B. Los tres conjuntos de curvas en la Figura 5A son las diferentes concentraciones de Reactivo1, y los tres conjuntos de curvas en la Figura 5B son las diferentes concentraciones de Reactivo2. Para ambos reactivos, las concentraciones son 50 nM/150 nM (cadena de fluoróforo/cadena de extinción), curvas 501 y 504. Las curvas 502 y 505 son de 100 nM/300 nM (cadena de fluoróforo/cadena de desactivación), mientras que las curvas 503 y 506 son de 150 nM/450 nM (cadena de fluoróforo/cadena de extinción). Las Figuras 5A-B muestran la fusión del Reactivo en la mezcla de reacción, con el Reactivo1 que tiene una Tm más alta que el Reactivo2, como se esperaba. Los resultados muestran que la temperatura Tm (valor nadir, o pico negativo) se desplaza ligeramente hacia arriba a medida que aumenta la concentración del Reactivo. Esto se debe a la naturaleza dependiente de la concentración de la hibridación.

Ejemplo 6

La detección de resistencia a múltiples fármacos en los genes rpoB, katG y gyrA para dos cepas de M. tuberculosis y la profundidad del valle de fluorescencia en función de la concentración de Reactivo1

Se utilizó un ensayo LATE-PCR múltiple para generar múltiples ácidos nucleicos diana monocatenarios que contienen secuencias que confieren sensibilidad al fármaco o resistencia al fármaco para los siguientes antibióticos (y sus genes diana): rifampicina (rpoB), isoniazida (katG), y fluoroquinolona (gyrA) en dos cepas de M. tuberculosis. En este Ejemplo, las hibridaciones se caracterizaron por el uso del análisis del perfil de fusión usando conjuntos de sondas de ACTIVACIÓN/DESACTIVACIÓN como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 2011/050173. Se utilizaron dos versiones de Reactivo1 (Tabla 1). Una primera versión tenía la cadena delantera marcada con Cal Orange 560. Una segunda versión tenía la cadena delantera marcada con Quasar 670. Ambas versiones tenían la cadena reversa marcada con un Extintor de Agujero Negro 2. Otros oligonucleótidos en las reacciones fueron los siguientes:

Cebadores para la amplificación de dianas del gen rpoB:

Cebador limitante: 5' CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG (SEQ ID No. 17)

Cebador en exceso: 5'ACGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTT (SEQ ID No. 18)

El subrayado en la secuencia del cebador limitante denota un cambio deliberado en la secuencia de nucleótidos para prevenir la formación de una estructura de horquilla secundaria.

Diana rpoB: Cepa 24609 CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCA TGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCT GGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 19)

Diana rpoB: Cepa 4557 CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCA TGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCGACAAGCGCCGACTGTCGGCGCT GGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 20)

Sonda rpoB 1 Desactivada 5'- BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAG-C3 (SEQ ID No. 21)

Sonda rpoB 1 Activada: 5'- BHQ2-TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA-Quasar 670 (SEQ ID No. 22) Sonda rpoB 2 Desactivada 5'-BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C3 (SEQ ID No. 23)

Sonda rpoB 2 Activada: 5'-BHQ2-ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT-Quasar 670 (SEQ ID No. 24) Sonda rpoB 3 Activada: 5'-Quasar 670-AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTT BHQ2 (SEQ ID No. 25) Sonda rpoB 3 Desactivada 5'-ACAGACCGCCGG BHQ2 (SEQ ID No. 26)

Cebadores para la amplificación de la diana del gen katG:

Cebador limitante: 5' AGCGCCCACTCGTAGCCGTACAGGATCTCGAGGAAAC (SEQ ID No. 27) Cebador en exceso: 5' TCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCAC (SEQ ID No. 28)

Diana katG: Cepa 24609 5’GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACC AGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTC CTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT (SEQ ID No. 29)

Diana katG: Cepa 4557 5’GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACC ACCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCC TCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT (SEQ ID No. 30)

Sonda katG Activada:5' Cal Orange 560-AAGTGATCGCGTCCTTACCTT-BHQ2 (SEQ ID No. 31) Sonda katG Desactivada: 5' GACCTCGATGCAGCTG-BHQ2 (SEQ ID No. 32)

Cebadores para amplificación diana del gen gyrA:

Cebador Limitante: 5' AGCCGAAGTTGTTCTGGTCGTCCACCAGCGGGTAGCGCA (SEQ ID No. 33) Cebador en exceso: 5' TTGCCGAGACCATGGGCAACTACCACCCGC (SEQ ID No. 34)

Diana gyrA: Cepa 4557 5’TTGCCGAGACCATGGGCAACTACCACCCGCACGGCGACGCGTCGATCTACGACA GCCTGGTGCGCATGGCCCAGCCCTGGTCGCTGCGCTACCCGCTGGTGGACGGCCA GGGCAACTTCGGCT (SEQ ID No. 35)

DianagyrA: Cepa 24609

sin secuencia disponible

Sonda gyrA Activada: 5' Cal Orange 560-TTGCTGCCGTAGATTGTGAGGTCGCCGTAA-BHQ1 (SEQ ID No. 36)

Sonda gyrA Desactivada 5' GGCTATGAGCACACCAG-BHQ1 (SEQ ID No. 37)

Un enlazador de tres carbonos se denota con C3 mientras que un Extintor de Agujero Negro 2 se denota con BHQ2 (Biosearch Technologies, Novato CA). El subrayado en la secuencia de cada uno denota la ubicación del cambio de nucleótido de la secuencia de M. tuberculosis sensible al fármaco.

Se llevaron a cabo amplificaciones de LATE-PCR por triplicado en un volumen de 25 pl que consiste en un tampón de PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,24x SYBR Green, MgC^2 mM, dNTPs300 nM, cebador limitante 50 nM y cebador en exceso 1000 nM para cada un conjunto de cebadores, 1,5 unidades de Platinum Taq DNA Polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), sondas desactivadas 500 nM, sondas 200 nM, cadena reversa (extintor) Reactivol 500 nM y aproximadamente 10000 genomas de cada cepa diana. Esta mezcla de reacción se subdividió en nueve submezclas que contenían cantidades diferentes de cadena directa del Reactivol, ya sea la versión etiquetada con Cal Orange 560 o la versión etiquetada con Quasar 670, o ambas, como sigue: 1) La submezcla 1 contenía 50 nM de Cal Orange 560 filamento fluoróforo; 2) La submezcla 2 contenía 25 nM de la cadena de fluoróforos Cal Orange 560 y 25 nM de la cadena de fluoróforos Quasar 670; 3) La submezcla 3 contenía 50 nM de la cadena de fluoróforos Quasar 670; 4) La submezcla 4 contenía 100 nM de cadena de fluoróforo Cal Orange 560; 5) La submezcla 5 contenía 50 nM de la cadena de fluoróforos Cal Orange 560 y 50 nM de la cadena de fluoróforos Quasar 670; 6) La submezcla 6 contenía 100 nM de la cadena de fluoróforos Quasar 670; 7) La submezcla 7 contenía 200 nM de la cadena de fluoróforo Cal Orange 560; 8) La submezcla 8 contenía 100 nM de la cadena de fluoróforos Cal Orange 560 y 100 nM de la cadena de fluoróforos Quasar 670; y 9) La submezcla 9 contenía 200 nM de la cadena de fluoróforos Quasar 670. Además, todas las reacciones de amplificación contenían aproximadamente 20000 genomas de ADN genómico humano (Promega, Madison, WI).

El perfil térmico para la reacción de amplificación fue el siguiente: 95 °C/3 min durante 1 ciclo, seguido de 98 °C/10s-75 °C/42s durante 60 ciclos, seguido de un solo ciclo a 75 °C durante 10 minutos, seguido de 10 minutos a 25 °C. Esto fue seguido por una fusión que comenzó a 25 °C con incrementos de 1 °C a intervalos de 42 s a 97 °C.

Las hibridaciones de sonda-diana se analizaron mediante el análisis de la curva de fusión usando el primer derivado para cada fluoróforo por separado para las temperaturas entre 25 °C y 95 °C.

Los resultados en las Figuras 6A-C muestran las firmas fluorescentes Quasar 670 de la cepa sensible 24609 para rifampicina (rpoB) con Reactivo1 en diferentes concentraciones y combinaciones de la cadena de fluoróforo. Las Figuras 6D-F muestran las firmas Cal Orange 560 de la cepa resistente 4557 para isoniazida (katG) y fluoroquinolona (gyrA). El Reactivo1 es visible en estos derivados de fusión como un valle distinto de alta temperatura a 81 °C.

La Figura 6A muestra las primeras curvas derivadas para la fluorescencia de Quasar con las submezclas 1, 2 y 3, cada una de las cuales contiene un total de 50 nM de la cadena de fluoróforo del Reactivo! Existen dos fuentes de fluorescencia de Quasar: el Reactivo1 y el gen rpoB en las sondas. La submezcla 1 (curvas de repetición denotadas por el círculo 601) no contiene una cadena de fluoróforo Quasar (solo el fluoróforo Cal Orange 560); por lo tanto, no se ve ningún valle distintivo a 81 °C. La submezcla 2 (círculo 602) contiene solo 25 nM de la cadena Quasar 670, y muestra un valle moderado, mientras que la submezcla 3 (círculo 603), con 50 nM de la cadena del fluoróforo Quasar 670, tiene el valle más profundo. Los resultados en la Figura 6B son las submezclas 4 (círculo 604), 5 (línea 605) y 6 (línea 606), cada una con un total de 100 nM de la cadena de fluoróforo del Reactivo! Los resultados mostrados son similares a los de la Figura 6A. Los resultados de la concentración de cadena de fluoróforo más alta (200 nM) se muestran en la Figura 6C con la submezcla 7 (círculo 607), la submezcla 8 (círculo 608) y la submezcla 9 (círculo 609). Comparando las magnitudes de los picos y valles por debajo de 75 °C de la Figura 6C con la Figura 6A, los resultados muestran que el Reactivo1 con una combinación de los dos fluoróforos, submezcla 8 (círculo 608), inhibió la amplificación de la diana rpoB mientras que el Reactivo1 con cada uno de los fluoróforos individuales (círculos 607, 609) redujo el nivel general de fluorescencia.

La Figura 6D muestra los resultados derivados de la fusión de gyrA (pico a 57 °C) y katG (pico a 66 °C) en el canal de Cal Orange utilizando las submezclas 1, 2 y 3. El Reactivo1 en la submezcla 3 (círculo 610) contiene solo el Quasar 670 cadena fluorófora, y, por lo tanto, no se ve ningún valle distintivo a 81 °C. La submezcla 2 (círculo 611), que contiene 25 nM de la cadena Reactivo1 Cal Orange muestra un valle moderado, mientras que la submezcla 1 (círculo 612), con 50 nM de la cadena Reactivo1 Cal Orange, tiene el valle más profundo. Los resultados en la Figura 6E son las submezclas 6 (círculo 613), 5 (círculo 614) y la submezcla 4 (círculo 615), cada una con un total de 100 nM de la cadena de fluoróforo Reactivo! Los resultados mostrados son similares a los de la Figura 6D. Los resultados de la concentración de cadena de fluoróforo más alta (200 nM) se muestran en la Figura 6F con la submezcla 9 (círculo 616), la submezcla 8 (círculo 617) y la submezcla 7 (círculo 618). Los resultados muestran que una combinación de los fluoróforos, submezcla 8, inhibió la amplificación de la diana katG mientras que los fluoróforos individuales redujeron el nivel general de fluorescencia.

Ejemplo 7

El Reactivol y el Reactivo2 mejoran la especificidad del cebador para la amplificación de dianas totalmente coincidentes en comparación con las no coincidentes con el extremo 3' del cebador limitante

Este ejemplo compara el ensayo de amplificación y detección LATE-PCR para dos dianas de ADN con secuencias análogas a los segmentos de los genotipos 1b y 2b de la Región 5' no codificadora de virus de la hepatitis C (VHC) utilizando un cebador limitante que es completamente complementario al diana HCV 1b, pero tiene un desajuste desestabilizador en el extremo 3' del cebador al diana HCV2b (así como un desajuste adicional en el noveno nucleótido del extremo 3' del cebador limitante). Se generaron dianas de ADN bicatenario a partir de ARN blindados de HCV1b y HCV2b (Asuragen, Austin, TX, Estados Unidos) con un cebador en exceso de 1,000 nM, cebador limitante de 50 nM y un protocolo de RT-PCR publicado (Pierce KE, Mistry R, Reid SM, Bharya S, Dukes JP, Hartshorn C, King DP, Wangh LJ: Design and optimization of a novel reverse transcription linear-after-the-exponential PCR forthe detection of foot-and-mouth disease virus. J Appl Microbiol 2010, 109: 180 -189). La amplificación se detuvo después de 31 ciclos para asegurar que la mayoría del producto fuera bicatenario.

Para la posterior amplificación de una región del ADN diana generado de este modo, con la detección utilizando una sonda de doble etiquetado (F/Q) en un ensayo de amplificación y detección, las secuencias de la cadena de sentido del ADN, las secuencias del cebador y la sonda son:

Diana HCV 1b: 5'- TGACTGGGTC CTTTCTTGGA TCAACCCGCT CAATGCCTGG AGATTTGGGC GTGCCCCCGC GAGACTGCTA GCCGAGTAGT GTTGGGTCGC GAAAGGCCTT GTGGTACTGC CTGATAGGGT GCTT -3' (SEQ ID No. 38)

Diana HCV 2b: 5'-TGACTGGGTC CTTTCTTGGA TAAACCCACT CTATGTCCGG TCATTTGGGC GTGCCCCCGC AAGACTGCTA GCCGAGTAGC GTTGGGTTGC GAAAGGCCTT GTGGTACTGC CTGATAGGGT GCTT-3' (SEQ ID No. 39)

Cebador Limitante: 5'- CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACA-3' (SEQ ID No. 40)

Cebador en Exceso: 5'-TGACTGGGTCCTTTCTTGGA-3' (SEQ ID No. 41)

Sonda: 5'-Cal Red 610- TCGGCTAGTAGTCTTGTGG-BHQ2-3' (SEQ ID No. 42)

En las secuencias diana, las secuencias de unión para el cebador limitante están en negrita. En la diana HCV 2b (no coincidente), los dos nucleótidos no coincidentes en la secuencia de unión del cebador están subrayados.

La versión de Reactivo1 utilizada en este Ejemplo tenía una fracción fluorescente, F, que era el fluoróforo Cal Orange 560, y tenía una fracción desactivadora, Q, que era un Extintor de Agujero Negro 2. La versión de Reactivo2 utilizada en este el Ejemplo tenía una fracción fluorescente, F, que era el fluoróforo Cal Red 610, y tenía una fracción desactivadora, Q, que era un extintor de agujeros negros 2.

Las dianas de ADN de HCV 1b y HCV 2b se amplificaron y detectaron en presencia de Reactivo1, Reactivo2, o ningún reactivo. El cebador limitante se hibrida a una región interna de las dianas (que se muestra en negrita, los nucleótidos 80 a 104). Es totalmente complementario a la línea de sentido de la diana HCV 1b. Es parcialmente complementario a la misma región en la diana HCV 2b, pero tiene un desajuste altamente desestabilizador (C con A) en el extremo 3' del cebador y un desajuste débilmente desestabilizador (G con T) nueve nucleótidos del extremo 3' del cebador. Con base en nuestra experiencia previa sin los Reactivos, una falta de coincidencia de G con T tiene un efecto mínimo en el ciclo de PCR en el que la fluorescencia se hace visible sobre el fondo, el ciclo umbral (C^t). Los expertos en la técnica entenderán que la falta de coincidencia más desestabilizadora y la posición de una falta de coincidencia en el extremo 3' del cebador tendrán un efecto mucho mayor sobre la eficiencia de la amplificación inicial y los valores de C^tresultantes. Todas las muestras contenían 1X de tampón de reacción Tfi Platinum (Invitrogen), MgCh 3 mM, 0,4 mM de cada dNTP, SYBR Green 0,24X, sonda 400 nM, cebador en exceso 1000 nM, cebador limitante 50 nM, aproximadamente 1000 copias de un tipo diana, y 2 unidades de platino Tfi exo(-) ADN polimerasa (Invitrogen) en un volumen final de 25 microlitros.

Cada diana se probó en cuatro reacciones de amplificación repetidas sin reactivo, cuatro repeticiones con Reactivo1 100 nM, cuatro repeticiones con Reactivo2 100 nM, cuatro muestras repetidas con Reactivo2 150 nM, cuatro repeticiones con Reactivo2 200 nM. En cada caso, la concentración declarada es la de la cadena marcada con fluorescencia, y la cadena marcada con extintor se usó a tres veces esa concentración. Se utilizó un termociclador en tiempo real Stratagene Mx30005P. El protocolo de PCR para ciclos térmicos incluyó desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 minuto, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 64 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 60 segundos con detección de fluorescencia en el punto final de ese paso. Luego, la temperatura se redujo de 72 °C a 40 °C en pasos de 1 °C cada 30 segundos, se mantuvo durante 10 minutos, luego se elevó en pasos de 1 °C cada 30 segundos a una temperatura final de 95 °C con detección de fluorescencia en cada paso. Los valores de C^ten tiempo real para la fluorescencia SYBR Green se obtuvieron utilizando la configuración de línea de base adaptable del software Stratagene. Los valores de fluorescencia de la sonda obtenidos de la fusión posterior a la PCR se normalizaron en función de la fluorescencia a 66 °C. La intensidad de la señal de fluorescencia se calculó restando el control sin plantilla promedio (NTC).

Las gráficas de amplificación en tiempo real de la fluorescencia de SYBR Green versus el número del ciclo de PCR se muestran en el lado izquierdo de la Figura 7A, en donde el panel 1 es para ningún reactivo, el panel 2 es para 100 nM del Reactivo2, el panel 3 es para 150 nM del Reactivo2, el panel 4 es para 200 nM del Reactivo2 y el panel 5 es para 100 nM del Reactivo! Las líneas continuas (curvas denotadas por los círculos 701, 704, 707, 710 y 713) son para la diana perfectamente emparejada, las líneas discontinuas (curvas denotadas por los círculos 702, 705, 708, 711 y 714) son para la diana no coincidente y las líneas de puntos (las curvas denotadas por los círculos 703, 706, 709, 712 y 715) son para los controles sin diana. Los valores medios de Ct para las réplicas con destino se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4

Diana HCV 1b Diana HCV 2b

Reactivo C_tCR-I C_tCR-I AC_tAAC_tDemora (AC^t)

sin reactivo 24,6 4985 28,7 7441 4,1 --- ----Reactivo1, 100 nM 29,4 4528 42,8 32 13,4 9,3 4,8

Reactivo2, 100 nM 25,3 7448 31,9 5478 6,6 2,5 0,7

Reactivo2, 150 nM 26,2 6293 35,3 2998 9,1 5,0 1,6

Reactivo2, 200 nM 28,1 4519 40,3 209 12,2 8,1 3,5

La Tabla 4 muestra los valores del ciclo de umbral, "C^t", para la fluorescencia SYBR Green para los diversos tipos de muestras, con y sin un reactivo. La Tabla 4 también informa cada tipo de muestra de la diferencia de C^t"AC^t" entre el dianaseado HCV 1b y la diana diferenciada HCV 2b. Como era de esperar, para las muestras sin reactivo, se observó un aumento de fluorescencia en tiempo real antes en la diana de HCV 1b totalmente complementaria (véase la Figura 7A, panel 1, círculo 701) en comparación con la diana de 2b de HCV no coincidente (véase la Figura 7A, panel 1, círculo 702). La diferencia en los valores medios de C^t, (AC^t) fue de 4,1 ciclos (Tabla 4). La Tabla 4 también informa para cada tipo de muestra la mejora de selectividad, es decir, el AC^tcon Reactivo menos 4,1, el AC^tsin reactivo. Finalmente, la Tabla 4 también informa para cada tipo de muestra la diferencia entre la C^tpara la diana emparejada con el Reactivo y 24,6, la C^tsin el Reactivo, "Demora (AC^t)", una medida de inhibición de la actividad de la polimerasa.

Como se puede verse en las curvas del panel 1, círculo 701, tres de las cuatro repeticiones para la diana HCV1b sin reactivo mostraron un aumento secundario en la fluorescencia inmediatamente después de alcanzar los valores típicos de meseta, lo que indica la evolución del producto. (Tenga en cuenta también el aumento de la fluorescencia con el control sin diana (círculo 703.) Para investigar la evolución del producto, las muestras sin reactivo se sometieron a análisis de fusión, junto con el control sin plantilla. La Figura 7B presenta las curvas para el primer derivado de la intensidad de SYBR Green en función de la temperatura. La curva 730 corresponde a la muestra que no mostró un aumento secundario. Las curvas 731 corresponden a las tres muestras que mostraron un aumento secundario. Las curvas 732 son el control sin plantilla. La evolución del producto fue confirmada mediante una temperatura de fusión medida en SYBR Green aproximadamente 2 grados más alta que el producto específico. Ninguna de las muestras de HCV 2b (Figura 7A, panel 1) tuvo una evolución detectable del producto. La evolución del producto con la diana emparejada se suprimió en gran medida a Reactivo2 100 nM (solo una muestra indicada por el círculo 704 mostró un pequeño aumento de la fluorescencia secundaria en los últimos ciclos) y no se detectó en ninguna de las muestras con concentraciones más altas de Reactivo2 o con Reactivo1 100 nM. Aquí nuevamente, ninguna de las muestras de HCV 2b con Reactivo (círculos 705, 708, 711, 714) tuvo una evolución detectable del producto.

Las muestras que contienen la diana HCV 1b (emparejada) y el Reactivo2 mostraron un pequeño "Retardo" (inhibición medida como un aumento en los valores de C^ten relación al diana emparejada sin reactivo). Como se muestra en la Tabla 4, los valores medios de C^taumentaron en 0,7 ciclos con la adición de Reactivo2 100 nM, en 1,6 ciclos con la adición de Reactivo2 150 nM, y en 3,5 ciclos con la adición de Reactivo2 200 nM. El valor medio de C^tpara las muestras de HCV 1b que contienen 100 nM Reactivo1 aumentó algo más, en 4,8 ciclos. Es posible que parte de estos aumentos se deba a la reducción en la amplificación no específica en comparación con las amplificaciones sin reactivo, ya que el colorante SYBR Green detecta productos específicos y no específicos. Se observó un aumento de la fluorescencia debido a la amplificación del dímero del cebador (Figura 7A, círculo 703, confirmado por análisis de fusión, Figura 7B, círculo 732) en muestras de control sin diana sin reactivo. La ausencia de aumento de fluorescencia en muestras sin diana ya sea con el Reactivo1 (círculo 715) o el Reactivo2 (círculos 706, 709, 712) proporciona evidencia adicional de que estos reactivos suprimen la amplificación no específica.

Como se refleja en la Tabla 4, la amplificación se detectó después de demoras de C^tmás grandes (A C^t) en muestras que contenían el diana HCV 2b no coincidente frente al diana HCV 1b emparejado con Reactivo1 o Reactivo2 en comparación con muestras que no contienen reactivo. La diferencia en los valores medios de Ct entre las muestras con las dianas emparejadas y no coincidentes aumentó a medida que aumentaba la concentración del Reactivo2, aumentando de 6,6 ciclos a 100 nM (Panel 2, círculos 705, 704), a 9,1 ciclos a 150 nM (Panel 3, círculos 708, 707), y hasta 12,2 ciclos a 200 nM (panel 4, círculos 711, 710). Esa diferencia fue de 13,4 ciclos con 100 nM Reactivo1 (panel 5, círculos 714, 713). La mejora es que la selectividad sobre las muestras sin Reactivo (AA Ct) fue menor en 4,1 ciclos (el ACt sin Reactivo) en cada caso.

Los valores de Ct de la medida SYBR Green combinaron amplificación específica y no específica. Las señales fluorescentes de la sonda de hibridación marcada con Cal Red miden la amplificación específica. Esas señales confirmaron una reducción en la cantidad de producto específico de la diana no coincidente. Las intensidades máximas de la sonda Cal Red (CR-I) se informan en la Tabla 4. La Figura 7A los paneles 6-10 presentan el primer derivado de la fluorescencia de la sonda en función de la temperatura a temperaturas por debajo de la Tm de los Reactivos. El panel 6 es para ningún reactivo, el panel 7 es para 100 nM del Reactivo2, el panel 8 es para 150 nM del Reactivo2, el panel 9 es para 200 nM del Reactivo2 y el panel 10 es para 100 nM del Reactivo! Las líneas continuas (círculos 716, 718, 720, 722 y 724) son para la diana perfectamente emparejada, y las líneas discontinuas (círculos 717, 719, 721, 723 y 725) son para la diana no coincidente. El producto específico fue detectable por encima del fondo en solo una de cuatro muestras con la diana HCV2b no coincidente (panel 9, círculo 723) y 200 nM de Reactivo2 y no se detectó en ninguna muestra con las dianas HCV2b no coincidentes y 100 nM de Reactivo1 (panel 10). Con referencia al panel 6, círculo(s) 716, se observa que la fluorescencia específica fue alta en la muestra de diana HCV1b emparejada única que no mostró la evolución del producto, como lo demuestra la mayor magnitud de su pico a aproximadamente 55 °C. Además, al comparar las curvas del panel 6, círculo 717 con las curvas en el panel 7, círculo 719 y las curvas en el panel 8, círculo 721, se observa que las réplicas sin Reactivo tuvieron más variabilidad para el diana HCV 1b emparejado pero menos variabilidad para la diana HCV2b no coincidente que las réplicas con 100 nM o Reactivo2 150 nM. Con referencia a la Tabla 4, se observa que la señal fluorescente media (CR-I) disminuyó a medida que aumentaba la concentración de Reactivo2, pero la relación entre la señal media de las muestras emparejadas y desajustadas aumentó. Los expertos en la técnica reconocerán que la mayor selectividad lograda por estos reactivos se puede usar para identificar mutaciones genéticas específicas o variaciones de nucleótidos entre diferentes cepas o especies de organismos.

La fusión de las dos cadenas del Reactivo1 y el Reactivo2 proporciona una idea de las posibles diferencias en la acción de los dos Reactivos. A medida que aumenta la temperatura, las cadenas marcadas con fluorescencia (Cal Orange para Reactivo1, Cal Red para Reactivo2) se separan de sus cadenas complementarias con los Extintores de Agujero Negros, y la fluorescencia aumenta. Las gráficas derivadas de la intensidad de fluorescencia frente a la temperatura se muestran en la Figura 7C. El círculo 740 denota las curvas para el Reactivo1 a 100 nM. El círculo 741 denota las curvas para el Reactivo2 a 100 nM. El círculo 742 denota las curvas para el Reactivo2 a 150 nM. El círculo 743 denota las curvas para el Reactivo2 a 200 nM. Notado por líneas verticales en la Figura 7C son varias temperaturas de referencia, incluidas las temperaturas de recocido y extensión, la Tm calculada del cebador en exceso (denotada Tm XP), la Tm del cebador limitante con diana HCV1b (denotada Tm LP con: HCV1b) y la Tm del cebador limitante con diana HCV2b (indicado LP Tm con: HCV2b). El Reactivo2 tiene una Tm de aproximadamente 71 °C (que varía ligeramente con la concentración), que está ligeramente por debajo de la Tm predicha del cebador limitante con la diana HCV1b emparejado y la temperatura de extensión de 72 °C, pero por encima de la Tm predicha de ese cebador con la diana HCV2b no coincidente. El Reactivo1 tiene una Tm de aproximadamente 78 °C. Por lo tanto, aunque ambos Reactivos muestran una amplificación selectiva a las concentraciones elegidas, el Reactivo2 muestra una inhibición más baja a una concentración de 100 nM (mostrada por la altura máxima en el panel 7, círculo 718, en comparación con la altura máxima en el panel 10, círculo 724), posiblemente debido a la capacidad del híbrido cebador-HCVlb para competir más efectivamente contra el reactivo para la polimerasa disponible, particularmente durante la etapa de extensión. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden lograr aumentos adicionales en la selectividad entre dianas emparejadas y desajustadas alterando la temperatura o la duración de los pasos del ciclo térmico (por ejemplo, disminuyendo la temperatura de recocido para proporcionar una mayor concentración de Reactivo2 para ser bicatenario) durante ese paso, es decir, aumentando su concentración efectiva).

Ejemplo 8

Funciones de Reactivo2 para suprimir la dispersión entre las réplicas en una amplificación de PCR simétrica

La dispersión entre réplicas también es un fenómeno bien conocido en amplificaciones por PCR simétricas a medida que se acercan a la fase de meseta de la reacción. R.G. Rutledge, Nucl. Acids Res. (2004) 32 (22): e178. doi: 10,1093/nar/gnh177. El Ejemplo 8 ilustra la dispersión entre las reacciones replicadas en una amplificación por PCR simétrica utilizando un par de cebadores utilizados para amplificar una porción del gen que causa la enfermedad de Tay Sachs [J.E. Rice et al. (2002) Prenatal Diagn. 22: 1130-1134]. La versión de Reactivo2 (véase Tabla 1) utilizada en este Ejemplo tenía Cal Red 610 como la fracción fluorescente, F, y Extintor de Agujero Negro 2 como el extintor, Q. Las secuencias de los cebadores y la diana fueron las siguientes:

Cebadores para la amplificación de la diana del gen TSD:

Avance: 5' CCTTCTCTCTGCCCCCTGGT (SEQ ID No. 43)

Reversa: 5' AGGGGTTCCACTACGTAGAA (SEQ ID No. 44)

Diana TSD:

5 ’ AGGGGTT C C ACT AT GT AG AA AT C CTTCC AGT C AGGGCC AT AGG AT AT AC GGTT C

AGGTACCAGGGGGCAGAGAGAAGG (SEQ ID No. 45)

Las amplificaciones simétricas se realizaron por triplicado en un volumen de 25 ^l que consiste en un tampón de PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 0,24x SYBER Green (Invitrogen), MgCh 3,0 mM, 0,3 mM cada dNTP, 300 nM de cada cebador, y 1,25 unidades de ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen), y aproximadamente 5 copias de ADN genómico humano. Las réplicas comparativas no contenían reactivos añadidos. Otras réplicas contenían Reactivo2. El Reactivo2 se agregó como 100 nM de la cadena delantera que contiene fluoróforos con 300 nM de la cadena reversa que contiene el inhibidor. La amplificación y la detección de fluorescencia se llevaron a cabo en un Stratagene MxP 3005P.

El perfil térmico para la reacción de amplificación fue el siguiente: 95 °C/3 min durante 1 ciclo, seguido de 95 °C/10s, 65 °C/30s y 72 °C/15s durante 10 ciclos, seguido de 50 ciclos de 95 °C/10s, 55 °C/30s, y 72 °C/30s con adquisición de fluorescencia durante el paso de 72 °C. Esto fue seguido por una fusión que comenzó a 43 °C con incrementos de 1 °C en intervalos de 30 segundos a 97 °C.

La Figura 8A presenta curvas en tiempo real de la intensidad de fluorescencia de SYBR Green, medidas en el canal FAM del instrumento, frente al número de ciclos de PCR. La Figura 8B presenta curvas derivadas de la fluorescencia de SYBR Green como una función de la temperatura para muestras que contienen Reactivo2. La Figura 8C presenta curvas derivadas de la intensidad de SYBR Green en función de la temperatura para muestras sin reactivo.

Haciendo referencia a la Figura 8A, doce réplicas sin reactivo agregado se indican con un círculo 801, y doce réplicas con 100 nM de Reactivo2 se indican con un círculo 802. En ausencia de Reactivo agregado (círculo 801), varias muestras en el conjunto de 12 se estabilizaron en una gran cantidad de niveles más altos o más bajos que la mayoría de las muestras. En contraste, la adición de 100 nM de Reactivo2 (círculo 802) redujo significativamente el nivel de dispersión entre todas las repeticiones. Las señales de SYBR Green aparecieron después de un promedio de 33-35 ciclos térmicos. La meseta se alcanzó después de 40 o 45 ciclos, dependiendo de si se agregó Reactivo2. Todas las muestras incubadas sin el Reactivo2 se amplificaron y se estabilizaron antes de las incubadas con el Reactivo2, lo que concuerda con la posibilidad de que las reacciones que no contienen el Reactivo2 estuvieran integradas tanto por el amplicón bicatenario deseado como por el ADN bicatenario adicional no específico. El análisis de la curva de fusión de todas las muestras se realizó después de 60 ciclos de amplificación. Estos resultados confirmaron que las muestras incubadas con Reactivo2 (Figura 8^b) eran muy similares y estaban libres de ADN bicatenario inespecífico. En contraste, todas las muestras amplificadas sin Reactivo2 (Figura 8C) tenían algún nivel de ADN bicatenario inespecífico de mayor fusión. Las réplicas amplificadas en ausencia de Reactivo2 solo divergen unas de otras (Figura 8A) a medida que se acercan a los niveles de meseta. Esto demuestra que la divergencia es un fenómeno dependiente de la concentración. En otras palabras, depende de niveles relativamente altos de productos acumulados. No se observa divergencia entre las réplicas en las muestras que contienen Reactivo2, aunque las concentraciones de ADN bicatenario en estas muestras son más altas que las que divergen en ausencia de Reactivo2. Se concluye de estos resultados que el Reactivo2 aumenta la selectividad de la polimerasa en la PCR simétrica y, por lo tanto, evita la extensión de los extremos 3' no coincidentes de las cadenas de productos que interactúan con otras cadenas de productos, es decir, la evolución del producto. Este resultado es consistente con los mostrados en los ejemplos anteriores para la amplificación LATE-PCR. La evolución del producto es más fácil de observar en LATE-PCR, porque hace que los amplicones monocatenarios se conviertan en bicatenarios. En contraste, en la PCR simétrica, los amplicones bicatenario simplemente se convierten en moléculas bicatenario más grandes.

Ejemplo 9:

Efecto del Reactivol en la amplificación de dianas de ADN sintético con secuencias del virus de la fiebre aftosa (FMDV) que son total o parcialmente complementarias a un cebador limitante.

Este ejemplo compara la amplificación de diferentes variantes de secuencia del gen FMDV 1D a las que se dirige un cebador limitador único en presencia o ausencia de Reactivo! La cadena modificada por Cal Orange del Reactivo1 (Tabla 1) se usó a 50 nM, y la cadena modificada Extintor de Agujero Negro 2 se usó a 150 nM. Cada uno de varios oligonucleótidos de ADN monocatenario sintéticos se amplificó por LATE-PCR utilizando un cebador limitante único y un cebador en exceso único. El cebador limitante, 5'-ACCATCACTGAGCTGTTGATCCGCATGAAACG-3' (SEQ iD No.) es la secuencia de ADN análoga al ARN de cadena positiva del aislado IND 339-96 de FMDV y tiene una Tm predicha de 74,9 °C a 50 nM con el complemento completo diana en la mezcla de reactivos de PCR que se describe a continuación. El cebador en exceso, 5-AGGGCCCAGGGTTGGACTC-3' (SEQ ID No.) y tiene una Tm predicha de 73,7 °C a 1,000 nM con la diana complementario. La sonda, 5'-Cal Red 610-ATAGCTCTTGACACCACTCAT-Extintor de Agujero Negro 2 -3' (SEQ ID No.) se usó en todas las amplificaciones para confirmar la amplificación de la diana específica y tiene una Tm predicha de 61,9 °C con cada una de los dianas. Tm se predijo usando Visual OMP (software de ADN). Una diana (que se muestra a continuación y en la Figura 9) contenía 105 nucleótidos complementarios a los segmentos de la cadena positiva ARN del FMDV 1D a los genes 2A/B del aislado de serotipo Asia1 IND 339-96. Una parte de la secuencia de FMDV no se incluyó para simplificar la síntesis de oligonucleótidos.

5 ’ AG AAG AAGGGCC C AGGGTTGG ACT CT G AGT GGT GT C AAG AGCT AGC AAAGGC C TGGGGCAGTATGTCTCCGCGCGTTTCATGCGGATCAACAGCTCAGTGATGGT-3’.(SEQ ID No. 46)

En la secuencia diana anterior, la región que es la misma que la secuencia del cebador en exceso está subrayada, y la región que hibrida con el cebador limitante está en negrita. Otras dianas, cuyas secuencias también se dan en la Figura 9, contenía la misma secuencia, excepto por variaciones en la región que hibrida el cebador limitante (que se muestra arriba en negrita) Esa región de las otras dianas incluyó nucleótidos complementarios a diferentes aislados de serotipos de FMDV Asia1 y se muestra en la Figura 9. (Las dianas IND 324-98 y IND 82-96 tienen 3 nucleótidos adicionales, GTC, en el extremo 3' que se incluyeron para la prueba inicial con cebadores complementarios, pero esos nucleótidos tienen un efecto mínimo en la hibridación con el cebador limitante descrito anteriormente). Los nucleótidos diana no coincidentes con el cebador limitante están sombreados en la Figura 9.

Las muestras incluyeron IX Platinum Taq buffer de reacción (Invitrogen), MgCh 3 mM, 0,4 mM de cada dNTP, sonda250 nM, 0,24X SYBR cebador en exceso1000 nM, cebador limitante50 nM, aproximadamente 10000 copias de un tipo diana, 1,5 unidades de Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen), y sin reactivo o Reactivo1 a una concentración de 50 nM, en un volumen final de 25 microlitros. Cada diana se probó por triplicado con y sin Reactivo1 utilizando un termociclador Stratagene Mx3005P programado para calentar a 95 °C durante 1 minuto, seguido de 60 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 70 °C durante 30 segundos y 75 grados para 20 segundos con detección de fluorescencia. La temperatura se redujo en pasos de 0,5 °C de 30 segundos cada uno de 75 °C a 40 °C (para permitir que la sonda se hibride con el producto de la PCR), luego se incrementó en pasos de 0,5 °C de 30 segundos desde 40 °C a 96 °C con detección de fluorescencia en cada paso.

La Figura 9 presenta, para cada diana, datos de fluorescencia de la detección SYBR Green, a saber, el ciclo umbral, CT, de las reacciones sin reactivo; el ciclo umbral, CT, de las reacciones con Reactivo1 50 nM, y el retraso, A CT, como resultado de la inclusión de Reactivo1 en la mezcla de reacción. La detección de SYBR Green en tiempo real confirmó que la amplificación se retrasó en las muestras que contienen dianas no coincidentes con el cebador. Como se informa en la Figura 9, el CT medio de las reacciones sin Reactivo aumentó con el número de desajustes, de 24,1 para la diana perfectamente emparejada a 32,0 para la diana con cuatro desajustes. Cuando el Reactivo1 estaba presente, la CT se retrasó en todos los casos, pero la magnitud de la demora, A CT, aumentó con el número de nucleótidos no coincidentes. Para la diana IND 339-96 (cero nucleótidos no coincidentes) el retraso fue de solo 1,2 ciclos; para la diana IND 116-90 (un nucleótido no coincidente) el retraso aumentó a 1,7 ciclos; para las dianas IND 224-98, IND 82 96 y IND 23-95 (dos nucleótidos no coincidentes) el retardo varió con la identidad y la ubicación de los no coincidencias pero promedió 4,2 ciclos: y para la diana BR/Myanmar 001 (cuatro desajustes), el retraso aumentó a 9,3 ciclos. El CT con la diana BR.Myanmar 001 y el Reactivo1,41,3, fue 16 ciclos completos más alto que el CTcon la diana coincidente IND 339-96 y el Reactivo1, 25,2, lo que demuestra la capacidad del Reactivo1 para retrasar la amplificación de las dianas no coincidentes y, por lo tanto, mejorar la selectividad de Taq polimerasa para la diana totalmente complementario.

Ejemplo 10

Uso del Reactivol para mejorarla amplificación de PCRmultiplex

Las reacciones LATE-PCR se usaron para amplificar las secuencias HV2, CO2 y ND1 del genoma de las mitocondrias humanas simultáneamente en una sola mezcla de reacción utilizando tres pares de cebadores y sondas con Lights On/Lights-Off para generar una firma fluorescente para cada diana, de acuerdo con la Solicitud de Patente Internacional WO 2011/050173. Los productos de amplificación se identificaron utilizando firmas fluorescentes de conjuntos de sondas con Lights On/Lights-Off de un color único que abarcan la longitud de cada amplicón. Las reacciones se llevaron a cabo en presencia de Reactivo1 o un aditivo descrito en el documento WO 2010/104074 en [0164], donde se denomina "Aditivo EP042". El aditivo EP042 es una mezcla de dos reactivos bicatenario que tienen tres grupos dabcilo terminales cada uno. Las dos cadenas dobles en la mezcla se reducen a solo tres cadenas al incluir una cadena común, denominada "cadena media", en ambos reactivos. Las secuencias de las tres cadenas de oligonucleótidos del aditivo EP042 son las siguientes:

Cadena superior: 3' Dabcilo CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT Dabcilo 5'

Cadena media: 5' GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA Dabcilo 3'

Cadena inferior: 3' Dabcilo CCTGGTCTGATTGTGSCTCCAT Dabcilo 5' (SEQ ID NO. 54)

Se añadió el aditivo EP042 a las mezclas de reacción de la siguiente manera: 525 nM de cada una de las cadenas inferior y media y la cadena superior 25 nM. La versión del Reactivo1 utilizada aquí tenía Cal Orange 560 como la fracción fluorescente, F, y Extintor de Agujero Negro 2 como la fracción de extinción, Q. El Reactivo1 se añadió a las mezclas de reacción a una concentración de 50 nM (oligonucleótido que contiene fluoróforo) con 150 nM del oligonucleótido que contiene el interruptor.

Las secuencias de los cebadores utilizadas para la amplificación fueron las siguientes (las bases subrayadas en los cebadores limitantes son nucleótidos no coincidentes con la secuencia diana normal):HV2 - Cebador limitante:

5 '-AAAGCGGTGTGTGTGTGCTGGGTAGGAT- 3' (SEQ ID No. 55)

HV2 - Cebador en exceso: 5'- ACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGC- 3' (SEQ ID No. 56)

CO2 - Cebador limitante: 5 '-AATAGAGGGGGTAGAGGGGGTGCTATAGGGT- 3' (SEQ ID No. 57) CO2 - Cebador en exceso: 5'-TCCTTATCTGCTTCCTAGTCCTGTATGC- 3' (SEQ ID No. 58)

ND1 - Cebador limitante: 5 '-AACATAAGAACAGGGAGGTTAGAAGTA GGGTCTTGGT- 3' (SEQ ID No. 59) ND1 - Cebador en exceso: 5'- CGCCCCGACCTTAGCTCT- 3' (SEQ ID No. 60)

Los conjuntos de sondas Lights-On/Lights Off utilizados fueron los siguientes (las bases subrayadas en las sondas son nucleótidos no coincidentes con la secuencia diana normal):Lights-On HV2:

Quasar 6705' TGGTTAGGGTTCTTTATTTTGGGGTTCA - 3' BHQ-2 (SEQ ID No. 61)

BHQ-25' AATGGCAGAGATGTCTTTAAGTGCTGTTT - 3' Quasar 670 (SEQ ID No. 62)

BHQ-2 - 5' AAATGTAATCGCGTTCATATCACCCAGTT - 3' Quasar 670 (SEQ ID No. 63)

Quasar 670 - 5' TAATTGAACATAGGTACGATAAATAATTA - 3' BHQ-2 (SEQ ID No. 64)

Quasar 670 - 5' AACTGGGTGAAAAGTGACTATGCGGACTT - 3' BHQ-2 (SEQ ID No. 65)

Sondas Lights-Off HV2:

5' AATGTGAAATCTGCTTGGGCTGGT - 3' BHQ - 2 (SEQ ID No. 66)

BHQ-2 - 5' GGCTAGGAGTTGGGGAGGGCGGGTT-C3 - 3' (SEQ ID No. 67)

BHQ-2 - 5' ACGAGAGTACCCAACGCATGGAGAG -C33' (SEQ ID No. 68)

5' TTTAGTAAATGTGTTCACCTGTAAT - 3' BHQ- 2 (SEQ ID No. 69)

5' TGGGGGAAGTTTTTTCTTATTATGT - 3' BHQ-2 (SEQ ID No. 70)

Sondas Lights-On CO2:

BHQ-2 - 5' AAACTACTCGATTATCAACGTCAAGGATT - 3' CaL Red 610 (SEQ ID No, 71)

BHQ-2 - 5' AAAATGGGGGAAGTTTGTATGAGTTGATT- 3' Cal Red 610 (SEQ ID No. 72)

Cal Red 610 -5 ' AAACGATTGGGGACTTTAATTGGGAGTTT - 3' BHQ-2 (SEQ ID No. 73)

Cal Red 610 -5 ' TTTGTAAAGAATGCGTAGAGATAGGAGAA - 3' BHQ-2 (SEQ ID No, 74)

BHQ-2 - 5' TTTTTATACGTACGGCAATTACATCTGAA - 3' Cal Red 610 (SEQ ID No. 75)

BHQ-2 - 5 'AGTGACCATAATATACCTCCGGCT - 3' Cal Red 610 (SEQ ID No. 76)

Sondas Lights-Off CO2:

BHQ-2 - 5' GTCGCAGGACGCCTAGTTTTAGGAA -C33' (SEQ ID No. 77)

BHQ-2 - 5' AGATAAGTTCGCTGTATTCGGTGT -C33' (SEQ ID No. 78)

5' AGACGTCTTATGTTGTAATTAT - 3' BHQ-2 (SEQ ID No. 79)

5' GAGGCATTGTTCACGTCGTTTGTTA - 3' BHQ-2 (SEQ ID No. 80)

5' BHQ2-TTTTTAAATTTAATATGGGGATAGC C33' (SEQ ID No. 81)

5' BHQ2-TCGTATAGTGGTCAATGTGGTATGG -C33' (SEQ ID No. 82)

Sondas Lights-On ND1:

Cal Orange 560 - 5' AAGTTCGGTTGGTTTTTGCTGGTGTGGTT - 3' BHQ-1 (SEQ ID No. 83)

BHQ-1 - 5' AATATGAAGAATAGAGCGAAGAGGCCTTT - 3' Cal Orange 560 (SEQ ID No. 84)

BHQ-1 - 5' TTAAGGTTGTAGTGATGGGGGTGTTTAAA - 3' Cal Orange 560(SEQ ID No. 85)

BHQ-1 - 5' AATTGATCAAGGGGTTTGGTATAGGGATT - 3' Cal Orange 560 (SEQ ID No. 86)

BHQ-1 - 5' TTAGATAAACCATAGTATGTCCGAGGGAA - 3' Cal Orange 560 (SEQ ID No. 87)

Sondas Lights-Off ND1:

5' TTCGGCAATGTCGAGGGGG - 3' BHQ-1 (SEQ ID No. 88) (53 °C)

BHQ-1 - 5' GCGGCCTATTCCATGTTGACGCCTG C33' (SEQ ID No. 89)

BHQ-1 - 5' TTATAATAATCTTTGTGTTTTCGGC -C33' (SEQ ID No. 90)

BHQ-1 - 5' GGGAGGTTTATAGTAAAAGAGAGAT -C33' (SEQ ID No. 91)

BHQ-1 - 5' TCATGATTGCAGTAGTGGTAAGAGG -C33' (SEQ ID No. 92)

Las amplificaciones LATE-PCR se llevaron a cabo en un volumen de 25 pl. La mezcla de reacción consistió en un tampón de PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, dNTPs 250 nM, cebador limitador HV2 50 nM, cebador en exceso HV21000 nM, cebador limitador de CO2100 nM, cebador en exceso de CO2 1000 nM, 50 nM ND1 cebador limitador, 1500 nM ND1 cebador en exceso, 2,5 unidades de Platinum Taq DNA Polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), 50 nM de cada sonda Lights-On, 150 nM de cada sonda Lights-Off, más reactivo EP042 o Reactivo1 como indicado arriba. Todas las amplificaciones se llevaron a cabo en el Strategene MX3005P (Agilent Technologies, CA). El perfil del ciclo térmico para todas las amplificaciones fue: 95 °C durante 3 minutos; luego 75 ciclos de 95 °C durante 5 segundos, 65 °C durante 45 segundos y 72 °C durante 90 segundos; luego a 75 °C durante 10 minutos; luego 25 °C durante 10 minutos. Las fusiones de ADN posteriores a la amplificación fueron controladas por la señal de fluorescencia de la sonda a medida que la temperatura aumentaba gradualmente de 25 a 80 °C en pasos de 45 segundos a 1 °C por paso. Los datos de fusión se mostraron y analizaron como la primera derivada negativa de las señales de la sonda fluorescente en relación con la temperatura (firma fluorescente). La Figura 10 presenta las firmas fluorescentes obtenidas. La Figura 10, el Panel 1 es la firma del conjunto de sondas Quasar para la secuencia HV2 utilizando el Aditivo EP042. El panel 2 es la firma del conjunto de sondas Quasar para la secuencia HV2 usando Reagent1. El panel 3 es la firma del conjunto de sondas Cal Red para la secuencia de CO2 utilizando el Aditivo EP042. El panel 4 es la firma del conjunto de sondas Cal Red para la secuencia de CO2 usando Reactivo! El panel 5 es la firma del conjunto de sondas Cal Orange para la secuencia ND1 utilizando el Aditivo EP042. El panel 6 es la firma del conjunto de sondas Cal Orange para la secuencia ND1 usando Reactivo!

La firma fluorescente ND1 fue apenas perceptible en presencia del reactivo dabcilado, Aditivo EP042 (Figura 10, panel 5). Por el contrario, el reemplazo del reactivo dabcilado con Reactivo1 llevó a una fuerte firma fluorescente ND1 (Figura 10, panel 6). La fusión del Reactivo1, aquí etiquetado con un fluoróforo de Cal Orange, se muestra en la curva de firma para la diana ND1 en el panel 6. En el panel 6, el Reactivo1 es visible como el valle más a la derecha a 79 °C en la firma fluorescente ND1. El uso de Reactivo1 también incrementó las intensidades de las firmas fluorescentes HV2 y CO2 (compare el panel 2 con el panel 1, y compare el panel 4 con el panel 3). Las firmas fluorescentes no se generaron en ausencia de reactivo dabcilado o Reactivo1 (datos no mostrados).

Ejemplo 11

Un cebado incorrecto previene el efecto del Reactivol en la RT-LATE-PCR multiplex de las secuencias de la influenza humana

Se propuso utilizar una secuencia del gen de la neuraminidasa de la influenza pandémica 2009 (09N1) en un ensayo de RT-LATE-PCR altamente multiplexado. Para fines de desarrollo, los ARN de secuencias de influenza humana se sintetizaron por transcripción in vitro y se utilizaron como dianas. El ARN genómico purificado disponible comercialmente del fago MS2 también se incluyó como control de la eficacia de la RT-PCR.

En el esquema de este ensayo, el gen de la neuraminidasa de la influenza pandémica 2009 (09N1) se detecta por un total de tres sondas. Dos de las sondas (sondas ACTIVADAS) se conjugan con el fluoróforo CAL Red 610 en el extremo 5' y con un Extintor de Agujero Negro 2 (BHQ2) en el extremo 3', y una sonda (sonda DESACTIVADA) se conjuga solo con una BHQ2 en el extremo 3'. (Véase la sección del ensayo RT-LATE-PCR Triplex para Véase las secuencias de la sonda). Estas tres sondas están diseñadas para tener diferentes temperaturas de fusión ajustadas a la concentración (Tm) a sus secuencias diana, de la siguiente manera: 09N1-Zan ACTIVADAS Tm> 09N1-Zan DESACTIVADA Tm> 09N1-Os Sonda Tm.

Cuando se analiza la unión de la sonda en un intervalo de temperaturas al final de la amplificación LATE-PCR, el conjunto de sondas CAL Red 610-09N1 produce un contorno de fluorescencia combinado como se muestra en la Figura 11A. A medida que la temperatura disminuye desde 95 °C, la Sonda activada 09N1-Zan comienza a hibridarse para apuntar a 65 °C y alcanza la fluorescencia máxima a 55 °C; la unión de la sonda DESACTIVADA 09N1-Zan a temperaturas más bajas reduce la intensidad de la fluorescencia porque esta sonda se encuentra contigua a la Sonda activada. Por lo tanto, el par de sondas 09N1-Zan ACTIVADAS Zan DESACTIVADA forma un pico distintivo a 55 °C. Cuando la temperatura desciende aún más, la sonda 09N1-Os se une a la diana y la fluorescencia de rojo CAL aumenta nuevamente, alcanzando un máximo de aproximadamente 40 °C. (Es probable que la disminución de la fluorescencia a temperaturas más frías se deba al aumento de la estructura secundaria de la diana y/o la sonda que interfiere con la hibridación de la sonda).

Se encontró que esta "firma fluorescente" CAL Red 610 bifásica es muy consistente en reacciones que contienen un solo par de cebadores para la amplificación de la diana 09N1. Sin embargo, se observó que el hombro de fluorescencia CAL Red a 40 °C disminuía constantemente a medida que se añadían más pares de cebadores en la reacción, mientras que el pico a 55 °C siempre estaba presente de manera prominente. La presencia del pico de 55 °C demostró que el amplicón se generó incluso en presencia de varios pares de cebadores. Se planteó la hipótesis de que las interacciones entre los cebadores generaban productos no específicos que impedían que la sonda 09N1-Os se uniera de manera eficiente a la diana incluso cuando la diana estaba presente. La eficacia del Reactivo1 para reducir este problema se investigó en el trabajo descrito en el Ejemplo 11.

Se eligió un ensayo triple RT-LATE-PCR como modelo conveniente para estudiar el efecto del Reactivo1 en la unión de la sonda al amplicón 09N1. La mezcla de ensayo contenía cebadores y sondas para la diana 09N1, la diana 09H1 de hemaglutinina y la diana MS2 de control de RT-PCR. Además de las dianas de a Rn , la mezcla de reacción contenía 16 mM de tampón Tris-HCl, pH 8,5, MgCh 3,9 mM, KCl 50 mM, dNTPs 0,52 mM, 0,5 pl/ensayo detranscriptasa reversa qScript de Quanta Biosciences (concentración no descrita), 2,5 unidades/ensayo de Taq liofilizado en perlas (Perlas de PCR listas para usar Taq Ready-to-Go puras de Illustra, GE Healthcare), 100 nM de cada cebador limitante y 1 pM de cada cebador en exceso. Cada cebador en exceso también cebó la transcripción inversa del ARN respectivo. La mezcla de ensayo también contenía 100 nM de cada sonda, excepto la sonda 09N1-Zan DESACTIVADA, que se usó a una concentración de 300 nM. Los ensayos se realizaron por triplicado sin reactivo adicional, con 1,5 unidades/ensayo de Platinum Taq Antibody (Invitrogen Life Technologies) y con Reactivo1 50 nM más la misma cantidad de ese anticuerpo agregado a la mezcla de reacción. El Reactivo1 se incluyó a una concentración de 50 nM para la cadena que contiene fluoróforo y 150 nM para la cadena que contiene el extintor. La versión de Reactivo1 utilizada en este ensayo incluyó a Cal Orange 560 como la fracción fluorescente, F, y Extintor de Agujero Negro 2 como la fracción de extintor, Q. Las dianas de ARN 09N1 y 09H1 se incluyeron en todos los ensayos a una dilución 1:1000 del estándar las existencias, y el ARN de control de MS2 (Roche Diagnostics) se incluyó a 100 000 copias/ensayo.

Si bien las reacciones contenían cebadores y sondas para hemaglutinina 09H1, la detección de esa diana no fue el objeto de este experimento. En cuanto a 09N1 y MS2, cuya detección fue objeto de este experimento, las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para el experimento fueron:

09N1-Cebador limitador 5' CACACACATGTGATTTCACTAGAATCAGGATAACAG (SEQ ID No. 93)

09N1-Cebador en exceso: 5' CCATTCATATCATGCTCCCCCTT (SEQ ID No. 94)

Sonda activada 09N1-Zan: 5' CALRed 610-CTGCCCCTTGAGTCAAGAG-BHQ2 (SEQ ID No. 95)

Sonda desactivada 09N1-Zan: 5' GTCATTTAGCAAG-BHQ2 (SEQ ID No. 96)

Sonda 09N1-Os: 5' CALRed 610-CTCTCATAGTGATAATTAAG-BHQ2 (SEQ ID No. 97)

Diana 09N1 /Amplicón:

5 ’ CCATTCATATCATGCTCCCCCTTGGAATGCAGAACCTTCTTCTTGACT

C AAGGGGCCTT GCT AAATGAC AAAC ATTCC AATGGAACC ATT AAAGAC AG GA

GCCCATATCGAACCCTAATGAGCTGTCCTATTGGTGAAGTTCCCTCTCCATAC

AACTC AAG ATTT G AGT C AGT C GCTT GGT C AGC AAGT GCTT GT C AT G AT GGC AT C AATT GGCT AAC AATT GG AATTT CT GGCC C AG AC AAT GGGGC AGT GGCT GT G

TT AAAGT AC AAC GGC AT AAT AAC AG AC ACT AT C AAG AG TTGGAG AAAC AA T A

T ATT G AG A AC AC AAG AGT CT G AAT GT GC AT GT GT AAAT GGTTCTT GCTTT ACT

GTAATGACCGATGGACCAAGTAATGGACAGGCCTCATACAAGATCTTCAGAA

T AG AAAAGGG A A A G AT AGT C AAAT C AG T C G AAAT G A AT GC CC CT AATT A T C A

CTAT GA GGAATGCTCCTGTTATCCTGATTCTAGTGAAATCACATGTGTGTG 3 ’

(SEQ ID No. 98)

MS2- Cebador limitador: 5' CCGACCTGACGTACGGCTCTCATAGGA (SEQ ID No. 99)

MS2- Cebador en exceso: 5' TGGTTGGAGTTGCAGTTCG (SEQ ID No. 100)

MS2-Sonda: 5' CAL Orange 560-CAGTAAGCATCTCTTATGCATG-BHQ1 (SEQ ID No. 101)

MS2-Amplicón

5 ’ TGGTTG GA GTTG CA GTTCGG TTG GTTA CCACTAATGAG TGA TATCCA GG

GT GC A T AT G AG AT GCTT AC G AAGGTT C AC CTT C AA G AGTTTCTT C CT A T GAGA

GCCGTACGTCAGGTCGG 3 ’ (SEQ ID No. 102)

Para mejorar el cebado a RT, se llevó a cabo una preincubación inicial de los moldes de ARN con cebador en exceso en Tris-Hcl (10 mM, pH 8,3) durante 5 minutos a temperatura ambiente, en un volumen final de 10 |jl/ensayo. Todos los demás reactivos se agregaron posteriormente a un volumen final de 25 jl/ensayo, y se realizó RT-LATE-PCR en un sistema de detección de PCR en tiempo real iQ™ 5 (Bio-Rad). El perfil térmico de RT-LATE-PCR fue: 10 minutos a 50 °C (RT); 3 minutos a 89 °C; 50 ciclos que comprenden los siguientes tres pasos: 5 segundos a 95 °C, 15 segundos a 62 °C y 30 segundos a 72 °C. La amplificación fue seguida por recocido/fusión: 3 minutos a 95 °C; recocido de 95 a 25 °C a intervalos de 1 °C/30 segundos; fusión de 25 a 95 °C a intervalos de 1 °C/30 segundos. La fluorescencia de la sonda se adquirió en el punto final durante los pasos de recocido y fusión.

La Figura 11A muestra la primera derivada de la fluorescencia de Cal Red, es decir, la curva de fusión de las sondas 09N1-Zan ACTIVADO Zan DESACTIVADO y 09N1-Os del amplicón 09N1 generado en el ensayo triple RT-LATE-PCR. La fluorescencia de Cal Red se normalizó de la siguiente manera: en primer lugar, se restó la fluorescencia de fondo de los controles sin plantilla promediados (NTC) del conjunto de ensayo correspondiente. Todas las lecturas de fluorescencia de cada curva se dividieron luego por la lectura de fluorescencia para esa misma curva a 55 °C, asignando así el valor de fluorescencia normalizado de 1,0 al pico de 55 °C de todas las curvas. Esta estrategia permitió un análisis directo de las fluctuaciones de la fluorescencia a 40 °C en diferentes condiciones experimentales en relación con la amplitud del pico de 55 °C. En la Figura 11A, el círculo 110 denota las curvas normalizadas para las réplicas sin reactivo agregado, el círculo 111 denota las réplicas para mezclas de reacción que contienen anticuerpo (inicio en caliente) y el círculo 112 denota las réplicas que contienen anticuerpo y Reactivo! Los resultados en la Figura 11A muestran que en ausencia de un "arranque en caliente" (curvas 110) o cuando solo estaba presente el anticuerpo (curvas 111), la fluorescencia CAL Red 610 a 40 °C fue considerablemente más baja que la fluorescencia a 55 °C, como lo muestran las alturas máximas relativas a las dos temperaturas. Sin embargo, en ensayos que también contienen Reactivo1 (curvas 112), la fluorescencia a 40 °C aumentó considerablemente en comparación con la fluorescencia a 55 °C. Esta diferencia muestra que el Reactivo1 suprime el cebado incorrecto y permite una unión más eficiente de la sonda 09N1-Os para apuntar en el espacio de temperatura entre 45 y 25 °C.

La Figura 11B presenta la primera derivada negativa de la fluorescencia Cal Orange 560 durante el fusionamiento/fundido posterior a la amplificación en los mismos conjuntos de ensayos que se muestran en la Figura 11A. El círculo 113 denota las curvas para las repeticiones sin reactivo agregado, el círculo 114 denota las curvas para las mezclas de reacción que contienen anticuerpo, y el círculo 115 denota las curvas para las repeticiones que contienen anticuerpo y Reactivo! Las líneas de referencia verticales en la Figura 11B indican varias temperaturas relevantes. La línea 116, a 50 °C, es la temperatura de transcripción inversa; la línea 117, a 62 °C, es la temperatura de recocido de PCR; la línea 118, a 66 °C, es la temperatura de fusión ajustada por concentración del cebador en exceso MS2 al inicio de la amplificación; y la línea 119, a 72 °C, es tanto la temperatura de extensión de la PCR como la temperatura de fusión ajustada por la concentración del cebador limitante de MS2 al comienzo de la amplificación. El valle en las curvas 115 a aproximadamente 80 °C indica la temperatura de fusión del Reactivo1, mientras que el pico positivo a 50 °C corresponde a la temperatura de fusión de la sonda MS2 hasta su diana. (Los resultados se normalizaron a 50 °C, de modo que los picos positivos tuvieron un valor de 1,0 para todas las muestras). La dirección opuesta de los dos picos se explica por el hecho de que el Reactivo1 es fluorescente cuando la cadena con sentido no está unida a la cadena antisentido, mientras que la sonda MS2 emite fluorescencia cuando se hibrida con su diana.

Ejemplo 12

El Reactivol proporciona un marcador estable y consistente durante la PCR, no afectado por generación de amplicón

La mezcla de LATE-PCR utilizada para este experimento contenía, en un volumen final de 25 ^l/ensayo, 2,5 unidades de ADN polimerasa de platino Taq (Invitrogen Life Technologies) y el tampón proporcionado por el fabricante a la concentración final IX. También contenía MgCh 3 mM, dNTPs 0,2 mM, Reactivo1 a una concentración de 50 nM para la cadena marcada con fluorescencia y 150 nM para la cadena marcada con extintor, cebador de limitación de HV2 50 nM, cebado de exceso de HV2 de 1 ^M, cebado de exceso de HV2 de 100 nM y las dianas para estos cebadores y sondas: 1000 copias de ADN genómico humano (Promega Human DNA). Se estima que 1000 genomas humanos incluyen aproximadamente 10000 genomas mitocondriales donde se localiza la secuencia HV2. La variante de Reactivo1 utilizada en este Ejemplo incluía Cal Orange 560 como la fracción fluorescente, F, y Extintor de Agujero Negro 2 como la fracción de extinción, Q. La sonda se marcó con un fluoróforo espectralmente distinto, Quasar 670. Las secuencias de los cebadores, la sonda y la diana utilizados para el experimento se enumeran a continuación.

HV2-Cebador limitador: 5' AAAGCGGTGTGTGTGTGCTGGGTAGGAT 3' (SEQ ID No. 103)

HV2-Cebador en exceso: 5' ACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGC 3' (SEQ ID No. 104)

HV2-Sonda: 5' BHQ2-AATGGCAGAGATGTCTTTAAGTGCTGTTT-Quasar 6703' (SEQ ID No. 105) HV2 Amplicón:

5 ’ GCTCGCCACACACACACGACCCATCCTACCCGCCCCCAACATAACTA

CTCTAATCATCATACCCTCACCCTCCCCTTTTATTACACAATCAACCCCCCAC

T G AC AATTTT C AC GT AT GGC GGTTTT CT ATTTT AAACTTT AG ACC AAT C C G AC

CACAATCCCAAGAAACAAAAACCCCAAACCGTCTCTACACAAATTCACGACA

CCGGTCTTCGCCCCCTCCCCCCCAAACCACCTTTAAAAAACAATACTACAGA

C AC AC CTTT C ACC G AC ACGT CTGT AAGTT A AC AAT AAT AAT AC AGG AT GTTCG

T AATT AATT AATT GT GT G AAAT C ATT C AT AC AAGCGG AC ATT AT AACTT GC AT

CCACGCTATTTATTATCCTACTCCGTCCTTAGTTTCTGTCTATGACGCTGTATC

CCACGAGGCCGAGGTCGCAGAGCGTTACGATAGCGCACGTATGGGGGGTCTG

CTTTTATGGTTTACGTACCTCTCGAGGGCACTCACCAATTATCCCACTATCTG

GACACTAGGTAGCACTACAGAATAAATTCCCCTTGCACACCCGATAAATCCG

AAATACTGGGACTTCA 3 ’ (SEQ ID No. 106)

La LATE-PCR se realizó en un termociclador Mx3005P (Stratagene, Agilent Technologies). El perfil térmico de LATE-PCR fue de 3 minutos a 95 °C; una minifusión de 16 ciclos de 70 a 85 °C a intervalos de 1 °C/30 segundos (esta etapa se denominó "Tiempo 0" para el análisis de datos); 30 ciclos de PCR comprendidos por los siguientes tres pasos: 5 segundos a 95 °C, 20 segundos a 62 °C y 45 segundos a 75 °C; 30 segundos a 95 °C; una minifusión de 16 ciclos de 70 a 85 °C a intervalos de 1 °C/30 segundos; 30 ciclos de PCR comprendidos por los siguientes tres pasos: 5 segundos a 95 °C, 20 segundos a 62 °C y 45 segundos a 75 °C; 30 segundos a 95 °C; una minifusión de 16 ciclos de 70 a 85 °C a intervalos de 1 °C/30 segundos; una fusión total final de 66 ciclos de 25 a 90 °C a intervalos de 1 °C/30 segundos. La fluorescencia se adquirió en cada paso de fusión durante todas las fundiciones, en los canales Cal Orange 560 (Reactivo1) y Quasar 670 (Sonda).

La Figura 12A muestra la primera derivada negativa de fluorescencia de Cal Orange 560, indicativa de la fusión del Reactivol, en diferentes momentos en el transcurso del experimento. El círculo 121 denota las curvas para tres ensayos repetidos en el Tiempo 0; el círculo 122 denota las curvas para las tres repeticiones después de 30 ciclos de amplificación; y el círculo 123 denota las curvas para las tres repeticiones después de 60 ciclos de amplificación. La línea vertical 124 se dibuja a través de los mínimos de los valles en las curvas, indicando la Tm del Reactivol La Figura 12B muestra los primeros derivados negativos de la fluorescencia durante la fusión posterior a la amplificación. La curva 125 es la fluorescencia Quasar 670 de la sonda, y la curva 126 es la fluorescencia Cal Orange 560 del Reactivol Haciendo referencia a la Figura 12A, la Tm del Reactivo1 permaneció exactamente igual antes de que se iniciara la PCR (Tiempo 0), después de 30 ciclos de LATE-PCR y después de 60 ciclos de LATE-PCR. Además, la Tm del Reactivo1 no se vio afectada por la acumulación progresiva del amplicón HV2 durante el curso de la PCR. El amplicón no estaba presente en el Tiempo 0, porque la amplificación no había comenzado, pero estaba claramente presente después de 60 ciclos de LATE-PCR, como lo muestra el pico Quasar 670 en la Figura 12B. Este pico representa el derivado negativo de la fluorescencia Quasar 670 adquirida en el punto final e indica que la sonda HV2 se ha hibridado a su diana prevista que se generó durante la PCR. También se encontró que la Tm del Reactivo1 es exactamente igual en la serie de ensayos "Sin control de plantilla" que se ejecutan en paralelo a los que se muestran en la Figura, con o sin cebadores y sonda para el amplicón HV2 (no se muestra).

Ejemplo 13 Parte I: Uso del Reactivol para identificar la evaporación parcial de una muestra durante los ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento en una reacción de "tubo cerrado".

Se llevó a cabo una prueba de evaporación parcial utilizando veinticuatro tubos en un volumen de 25 pl que consiste en un tampón de PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos), MgCh 3,0 mM, reactivo 1 (50 nM de la cadena que contiene fluoróforo con 150 nM) de la cadena del extintor). El perfil térmico fue el siguiente: 95 °C/3 min durante 1 ciclo, seguido de 98 °C/10s-75 °C/40s durante 60 ciclos. Esto fue seguido por una fusión que comenzó a 45 °C con incrementos de 1 °C a intervalos de 27 s a 97 °C. Los resultados de la primera derivada mostrados en la Figura 13A se normalizan al valor fluorescente más bajo. La gran mayoría de las repeticiones (23/24) no mostraron evaporación (círculo 131) mientras que una única repetición (curva 132) tuvo un cambio de temperatura ascendente que indica un cambio.

Ejemplo 13 parte II

Uso de Reactivo1 para identificar cambios de temperatura en la firma fluorescente como resultado de la evaporación de la muestra o cambios en la fuerza iónica de la muestra

Las Figuras 13B-E ilustra el uso de Reactivo1 para identificar artefactos que generan falsos positivos durante el análisis de mutación utilizando el ensayo LATE-PCR multiplex de un solo tubo y las sondas Lights On/Lights-Off. Estos ejemplos específicos muestran el análisis mutacional de los Exones 18-21 del gen del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) de dos biopsias de cáncer de pulmón. Las mutaciones en estos Exones definen la respuesta del paciente a las terapias contra el cáncer con inhibidores de tirosina quinasa anti-EGFR. Para cada uno de estos análisis, los Exones EGFR 18-21 de la biopsia de cáncer y de una muestra normal de referencia se amplificaron en paralelo como dos reacciones múltiplex de un solo tubo separadas. Los amplicones individuales de cada una de estas reacciones se interrogaron al final de la amplificación en el mismo tubo cerrado utilizando conjuntos de sondas Lights On/Lights-Off que abarcaban toda la longitud de cada amplicón y que estaban etiquetados con un color diferente para cada exón. (FAM para el exón 18, Cal Red 610 para el exón 19, Quasar 670 para el exón 20 y Cal Orange 560 para el exón 21). Los conjuntos de sondas para el exón 21 incluyeron el Reactivo1 que también se marcó con Cal Orange 560. Los datos fluorescentes resultantes se representaron como la primera derivada negativa de las señales fluorescentes en función de la temperatura para generar firmas fluorescentes. Las firmas fluorescentes para los Exones individuales de la referencia normal y las muestras de cáncer se compararon posteriormente para identificar los cambios de temperatura indicativos de mutaciones.

La versión de Reactivo1 utilizada en este Ejemplo incluyó a Cal Orange 560 como la fracción fluorescente, F, y Extintor de Agujero Negro 2 como la fracción del extintor, Q.

Los cebadores usados para la amplificación fueron los siguientes:

Exón 18 - Cebador limitador: 5' CCCAGAGGCCTGTGCCAGGGACCTTAC 3' (SEQ ID No. 107)

Exón 18 - Cebador en exceso: 5' CTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCC 3' (SEQ ID No. 108)

Exón 19 - Cebador limitador: 5' CCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAA CTCAC 3' (SEQ ID No. 109)

Exón 19 - Cebador en exceso: 5' GCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATA 3' (SEQ ID No. 110)

Exón 20 - Cebador limitador: 5' TGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTC CCGGACATAGT 3' (SEQ ID No. 111)

Exón 20 - Cebador en exceso: 5' GTGCCTCTCCCTCCCTCCAG 3' (SEQ ID No. 112)

Exón 21 - Cebador limitador: 5' AGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGC CACCTCCTTAC 3' (SEQ ID No. 113) Exón 21 - Cebador en exceso: 5' CTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAG 3' (SEQ ID No. 114)

Los conjuntos de sondas Lights On/Lights-Off utilizados fueron los siguientes:

Sondas Exón 18 Lights-On:

FAM - 5' GGTTGATCTTTTTGAATTCAGTTTCCTTCAAGATCCTCCC 3' BHQ1 (SEQ ID No. 115) BHQ1 - 5' CAAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCTTTG - 3' FAM (SEQ ID No. 116)

BHQ1 - 5' GGCTCCACTGGGTGTAAGCC - 3' FAM (SEQ ID NO. 117)

Sondas Exón 18 Lights-Off

BHQ1 -5 ' CGGAGCCCAGCACT - 3' BHQ1 (SEQ ID No. 118)

BHQ1 - 5' AGGCTCCACAAGCTG-C3 - 3' (SEQ ID No. 119)

Sondas Exón 19 Lights-On

CAL Red 610 -5 ' GGACCTTCTGGGATCCAGAGTCCCCC - 3' BHQ2 (SEQ ID No. 120)

BHQ1 - 5' CCGCTTTCGGAGATGTTGCTTGG - 3' CAL Red 610 (SEQ ID No. 121)

BHQ2 - 5' TTATCGAGGATTTCCTTGTTGGAA - 3' CAL Red 610 (SEQ ID No. 122)

Sondas Exón 19 Lights-Off

5' ACGGGAATTTTAACTTTCTC - 3' BHQ2 (SEQ ID No. 123)

BHQ2 - 5' CTCTTAATTTCTTGATAGCG - 3' BHQ2 (SEQ ID No. 124)

Sondas Exón 20 Lights-On

Quasar 670 - 5' GCAGATACCCAGTAGGCGG - 3' BHQ2 (SEQ ID No. 125)

BHQ2 - 5' CCAGGGGGCAGCCGAAGG - 3' Quasar 670 (SEQ ID No. 126)

Sondas Exón 20 Lights-Off

BHQ2 - 5' CTGCATGGTGAAGGTGAG - 3' BHQ2 (SEQ ID No. 127)

BHQ2 - 5' GCATGAGCCGCGTGATGAG - 3' BHQ2 (SEQ ID No. 128)

Sondas Exón 21 Lights-On

CAL Orange 560 - 5' CCACGGTCCCCCAAGTAGTTTATGCCGG - 3' BHQ1 (SEQ ID No. 129)

CAL Orange 560 - 5' TTAAAATCTGTGATCTTGGCATGCTGCG GTGAA - 3' BHQ-1 (SEQ ID No. 130) BHQ1 - 5' TTTTTGTCTCCCCCTGCATGGTATTCTTAA - 3' CAL Orange 560 (SEQ ID No. 131) BHQ1 - 5' CCCACCAGTATGTTCCTGGTTGGG - 3' CAL Orange 560 (SEQ ID No. 132)

Sondas Exón 21 Lights-Off

BHQ1 - 5' CCAGCATTATGGCTCGCCC C33' (SEQ ID No. 133)

BHQ1 - 5' TCTCTTCTGTACCC -C33' (SEQ ID No. 134)

BHQ1 - 5' CTAGGTCTTGGTGGATTGAGCG - 3' BHQ1 (SEQ ID No. 135)

En las secuencias anteriores, BHQ1 es un Extintor de Agujero Negro 1, BHQ2 es un Extintor de Agujero Negro 2, y C3 asigna un enlazador de tres carbonos.

Se llevaron a cabo amplificaciones multiplex de LATE-PCR en reacciones de 25 gl y consistieron en un tampón IX Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, desoxinucleótido trifosfato 400 j M, 50 nM de cada cebador limitante, 1 j M de cada en cebador en exceso, 100 nM de cada sonda Lights-On, 300 nM de cada sonda Lights-Off, 2,5 unidades de polimerasa de ADN Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1-1000 copias de ADN genómico y Reactivo1 50 nM, en donde se añadió la cadena de extinción a 150 nM. La amplificación se llevó a cabo en un Stratagene MX3500P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) durante 60-70 ciclos térmicos. Cada ciclo térmico consistió en desnaturalización a 99 °C durante 10 segundos, recocido del cebador a 72 °C durante 15 segundos y extensión del cebador a 75 °C durante 30 segundos. Al final de la amplificación hubo un paso de extensión final a 75 °C durante 3 minutos. Para el análisis del punto final, la reacción se enfrió lentamente de 85 °C a 35 °C en grados de 1 °C cada 30 segundos para permitir la hibridación de las sondas Lights On/Lights-Off. Después de 10 minutos de incubación a 35 °C para permitir el equilibrio de las sondas unidas, la reacción se calentó de 35 °C a 85 °C en incrementos de 1 °C cada 30 segundos con adquisición de fluorescencia en cada grado. Las firmas de señales fluorescentes se obtuvieron representando la primera derivada negativa de las señales fluorescentes sin procesar con respecto a la temperatura (-dF/dT) en función de la temperatura. Las mutaciones se detectan a medida que los cambios de temperatura en las firmas fluorescentes de la muestra de prueba se relacionan con las firmas fluorescentes de referencia de los genomas normales para el exón EGFR correspondiente.

La Figura 13B muestra un cambio de temperatura a la derecha entre las firmas fluorescentes de la referencia normal (curva 133) y una de las muestras de cáncer (curva 134) del canal fluorescente FAM para el exón 18. Estos resultados sugieren que la muestra de cáncer tuvo mutaciones en el exón 18 que proporcionó una mejor coincidencia con las sondas Lights On/Lights-Off utilizadas para interrogar a este exón (en este ensayo en particular, las sondas Lights On/Lights-Off tenían desajustes de nucleótidos con sus secuencias diana normales y podrían tener una mejor complementariedad con ciertas mutaciones). Sin embargo, el análisis de la firma fluorescente del Reactivo1 en el canal Cal Orange 560 en las mismas reacciones, que se muestran en la Figura 13C, reveló un cambio de temperatura similar hacia la derecha (véase el valle más a la derecha en las firmas fluorescentes correspondientes en la Figura 13C, curvas 135 y 136, respectivamente). Este hallazgo demuestra que los cambios relativos en las firmas fluorescentes entre el cáncer y las muestras normales de referencia no fueron el resultado de mutaciones, sino el resultado de un artefacto técnico causado por la evaporación de la muestra o por las diferencias en las concentraciones relativas de sal del cáncer. y las muestras de ADN normal de referencia (estas muestras de ADN se prepararon a partir de dos instituciones diferentes y contribuyeron a casi la mitad del volumen de reacción, véanse los detalles a continuación).

La Figura 13D muestra un Ejemplo de un cambio de temperatura a la izquierda entre las firmas fluorescentes Cal Red del exón 19 para la referencia normal (curva 137) y otra muestra de biopsia de cáncer (curva 138). Una vez más, la presencia de un cambio de temperatura similar hacia la izquierda en la firma fluorescente del Reactivo 1 (Figura 13E, curvas 139 y 140, respectivamente) demuestra que los cambios relativos en las firmas fluorescentes no fueron el resultado de mutaciones desestabilizadoras sino que fueron el resultado de un artefacto técnico. Este cambio hacia la izquierda en las señales fluorescentes solo puede explicarse por una fuerza iónica más baja en el ADN del cáncer analizado. En este Ejemplo, hubo pocos productos de amplificación del exón 21 de la muestra de cáncer (curva 140).

Ejemplo 13 Parte III

Sensibilidad del Reactivol a pequeños cambios en la mezcla de PCR

Los resultados ilustrados en esta parte del Ejemplo se obtuvieron en el curso del experimento descrito en el Ejemplo 11, en conjuntos paralelos de ensayos. Todas las condiciones experimentales, secuencias y reactivos, así como el perfil térmico utilizado durante RT-LATE-PCR fueron, por lo tanto, los mismos que se describen en el Ejemplo 11.

Como se informa en el Ejemplo 11, ambos conjuntos de ensayos contenían el Reactivo1 a una concentración de 50 nM para la cadena con sentido y 150 nM para la cadena antisentido. Un conjunto de ensayos, pero no el otro, también contenía 1,5 unidades de Anticuerpo Taq Platinum (Invitrogen Life Technologies). La inclusión de esta cantidad de anticuerpo en la mezcla de RT-PCR implicó la adición de la cantidad correspondiente de tampón de almacenamiento. Por lo tanto, también se agregaron los siguientes reactivos adicionales a cada uno de los ensayos que contienen el anticuerpo: Tris-HCl 0,24 mM (pH 8,0), NaCl 0,48 mM, fosfato de sodio 24 mM, EDTA 1,2 mM, Dt T 12 mM, 0,6 % (v/v) glicerol y estabilizadores (concentración y naturaleza no revelada por el fabricante). El perfil térmico incluyó un período de 3 minutos a 89 °C al final de la transcripción inversa y antes del inicio de LATE-PCR, destinado a desnaturalizar el anticuerpo y liberarlo de la ADN Taq Polimerasa; después de esta etapa, el anticuerpo estaba presente en cada ensayo como una proteína desnaturalizada.

Como se detalla anteriormente, las concentraciones de los reactivos adicionales presentes en los ensayos que contienen el anticuerpo son muy bajas. Tales adiciones generalmente son pasadas por alto o ignoradas incluso por los expertos en la materia. En general, se supone que la presencia de anticuerpos no afecta a la PCR más allá del efecto de bloquear la ADN polimerasa hasta que se inicia la PCR en el termociclador. Los resultados en este Ejemplo, sin embargo, indican que también se produce un cambio sutil en la Tm de las secuencias de ácido nucleico presentes en el ensayo. Este cambio es revelado por el Reactivo1, que proporciona una herramienta muy útil para la normalización de datos cuando existen ligeras diferencias entre la composición de la mezcla de reacción.

La Figura 13F muestra el derivado negativo de la fluorescencia Cal Orange 560 al final de este experimento, en la ventana de temperatura donde el Reactivo1 se acopla a su cadena antisentido y genera una caída en la fluorescencia. El Reactivo1 estuvo presente en los seis ensayos cuyos resultados se muestran en la tabla. El anticuerpo se agregó a tres de los ensayos (curvas denotadas por el círculo 142) pero no a los otros tres (curvas denotadas por el círculo 141). Las Tm resultantes del Reactivo1 se indican mediante la línea vertical 143 (sin anticuerpo) y 144 (con anticuerpo. La adición del anticuerpo en su tampón de almacenamiento disminuye ligeramente pero claramente la Tm del Reactivo! Este cambio podría deberse a varios factores, entre ellos la presencia de glicerol y la capacidad del EDTA para quelatar magnesio, y se sabe que ambos disminuyen la Tm de los ácidos nucleicos durante la PCR.

Ejemplo 14

Uso de Reactivol como un sustituto para el arranque en caliente reforzado por la adición de oligonucleótido bicatenario dabcilado en cuatro de sus nucleótidos terminales

Los ensayos de LATE-PCR se llevaron a cabo para el gen rpoB, similar a los ensayos para ese gen descritos en el Ejemplo 6. La versión del Reactivo1 utilizado en este Ejemplo tenía Quasar 670 como la fracción fluorescente, F y Agujero Negro Extintor 2 como la fracción de extinción, Q. Las secuencias del cebador de M. tuberculosis B y cuatro de las seis secuencias de sonda de activación/desactivación, a saber, Sonda 2 desactivada, Sonda 2 activada, Sonda 3 desactivada y Sonda 3 activada, fueron las mismas que las enumeradas en el Ejemplo 6, excepto que la secuencia del cebador en exceso se modificó para hacer que este cebador sea menos específico que la micobacteria que es no M. tuberculosis:

rpoB Cebador en exceso modificado:

5'-CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAG_-3' (SEQ. ID No. 136)

El aditivo modificado con dabcilo consistía en las siguientes cadenas complementarias:

5' Dabcilo - GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA - Dabcilo 3'

3' Dabcilo - CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT - Dabcilo 5' (SEQ ID No. 137)

El oligonucleótido modificado con dabcilo tenía una Tm por debajo de la de los cebadores para minimizar cualquier interferencia con la extensión del cebador.

Las amplificaciones de LATE-PCR se llevaron a cabo en reacciones de 25 pl que contenían el tampón de PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, dNTPs 250 nM, cebador limitante rpoB 50 nM, cebador en exceso rpoB 1000 nM, 50 nM de cada uno de las dos Lights-On, 150 nM de cada una de las dos Lights-Off. Un conjunto de reacciones tuvo 1 unidad de Platinum Taq DNA Polimerasa, una polimerasa de inicio en caliente con el anticuerpo denominado "Taq de anticuerpo" (Invitrogen, Carlsbad, CA). El otro tenía 1 unidad de Taq DNA Polimerasa recombinante, una polimerasa de inicio no caliente sin anticuerpo, denominada a continuación "Taq regular" (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un primer subconjunto de cada uno de estos conjuntos de reacciones no tenía componente adicional, un segundo subconjunto se complementó con 500 nM del oligonucleótido modificado de 22 pb con cuatro dabcilos terminales (Tm=67 °C), y un tercer subconjunto se complementó con 75 nM Reactivo1 (oligonucleótido que contiene fluoróforo 75 nM y oligonucleótido desactivador del Reactivo1 225 nM) más 500 nM del oligonucleótido modificado de 22 pb con cuatro dabcilos terminales. Los oligonucleótidos individuales que comprenden Reactivo1 y el dúplex dabcilado se combinaron primero en sus concentraciones finales y se incubaron en hielo durante 5 minutos antes de agregarse. Las reacciones se iniciaron desde 10, 100 o 1000 copias de ADN genómico de M. tuberculosis en presencia de 20000 copias de ADN genómico humano (Promega, Madison, WI). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un Strategene MX3005P (Agilent Technologies, CA). El perfil del ciclo térmico consistió en 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 75 °C durante 40 segundos, seguidos de fusiones de ADN de 30 a 85 °C en intervalos de 30 segundos a 1 °C grado por paso con adquisición de fluorescencia del Quasar 670-laleled en sondas. El mismo perfil de ciclo térmico seguido de las mismas fusiones de ADN se llevó a cabo cada cinco ciclos durante un total de 60 ciclos.

Las Figuras 14A-F presenta los resultados de fusión de la sonda (canal Quasar670) después del ciclo 35 de la reacción de amplificación de 60 ciclos. Los datos de fusión se muestran como la primera derivada negativa de las señales de fluorescencia en relación con la temperatura (firma fluorescente). La Figura 14A es de las reacciones con Taq regular y sin aditivo, donde el círculo 1401 denota las curvas replicadas para 10 copias de la plantilla de ADN, el círculo 1402 denota las curvas para 100 copias de la plantilla de ADN, y el círculo 1403 denota las curvas para 1000 copias de la plantilla de ADN. La Figura 14B es de las reacciones con Taq regular más el aditivo dabcilado, donde el círculo 1404 denota las curvas replicadas para 10 copias de la plantilla de ADN, el círculo 1405 denota las curvas para 100 copias, y el círculo 1406 denota las curvas para 1000 copias. La Figura 14C proviene de las reacciones con Taq regular más el aditivo administrado y el Reactivo1, donde el círculo 1407 denota las curvas replicadas de 10 copias del ADN plantilla, el círculo 1408 denota las curvas para 100 copias, y el círculo 1409 denota las curvas para 1000 copias. La Figura 14D es de las reacciones con el anticuerpo Taq y sin aditivo, en donde el círculo 1410 denota las curvas replicadas para 10 copias de la plantilla de ADN, el círculo 1411 denota las curvas para 100 copias, y el círculo 1412 denota las curvas para 1000 copias. La Figura 14E es de las reacciones con el anticuerpo Taq más el aditivo dabcilado, donde el círculo 1413 denota las curvas replicadas para 10 copias de la plantilla de ADN, el círculo 1414 denota las curvas para 100 copias, y el círculo 1415 denota las curvas para 1000 copias. La Figura 14F proviene de las reacciones con el anticuerpo Taq más el aditivo dabcilado y el Reactivo1, donde el círculo 1416 denota las curvas replicadas para 10 copias del ADN plantilla, el círculo 1417 denota las curvas para 100 copias, y el círculo 1418 denota las curvas para 1000 copias. Señales fluorescentes para la Figura 14C y la Figura 14F se normalizaron a la señal más baja del dúplex del Reactivo1 adquirido a 80 °C.

El Ejemplo 14 ilustra las ventajas de reemplazar el anticuerpo de inicio en caliente (Figura 14D) con el Reactivol 75 nM más 500 nM de un oligonucleótido de 22 pb modificado con 4 grupos dabcilo (Figura 14C) frente a 500 nM de un oligonucleótido de 22 pb modificado con 4 grupos dabcilo solos (Figura 14b).

Las Figuras 14Ay D muestran reacciones sin aditivos en ausencia de la presencia del anticuerpo de inicio en caliente. Estos datos ilustran el aumento de la variabilidad debido a errores de cebado incorrecto antes del inicio de la amplificación entre las réplicas sin anticuerpo (véase la región de las flechas 1 y 1', 2 y 2'). Las reacciones de las Figuras 14B y E contenían 500 nM del oligonucleótido de 22 pb modificado con cuatro grupos dabcilo. Comparación de la Figura 14B con la Figura 14A, y la comparación de la Figura 14E con la Figura 14D muestra que la adición del oligonucleótido modificado solo alteró el patrón del híbrido sonda/diana (particularmente en la región de las flechas 2 y 2') debido a la inhibición de cebado incorrecto antes y durante la amplificación. Las reacciones de las Figuras 14C y F contenían 500 nM del oligonucleótido de 22 pb modificado con 4 grupos dabcilo, más 75 nM de Reactivol La comparación de la Figura 14C con la Figura 14B, y la comparación de la Figura 14F con E muestra que el Reactivo1 reduce aún más la dispersión entre las reacciones replicadas. La comparación de la Figura 14F con la Figura 14C muestra que, cuando el Reactivo1 está presente, el anticuerpo de inicio en caliente no mejora significativamente la similitud de las reacciones replicadas en ninguno de los tres niveles objetivo iniciales (10, 100, 1000 copias de ADN genómico de M. tuberculosis). Estos resultados demuestran que el Reactivo1 combinado con un oligonucleótido bicatenario con múltiples dabcilos y una Tm por debajo de la de los cebadores mejora la selectividad del cebador y reemplaza efectivamente al anticuerpo de inicio en caliente.

Ejemplo 15

Efecto del Reactivo2 en la amplificación simétrica del gen de la fibrosis quística (CFTR); Reducción de la variación de la señal de punto final y uso como un arranque en caliente de PCR

Este Ejemplo compara la amplificación simétrica de tubo cerrado por PCR y la detección de un segmento del exón 10 del gen CFTR en presencia y ausencia del Reactivo2. La versión del Reactivo2 utilizado en este Ejemplo tenía Cal Red 610 como la fracción fluorescente, F, y Extintor de Agujero Negro II como la fracción, Q. Las muestras incluían 1X de tampón de reacción Taq de platino (Invitrogen), 3 mM MgCh, 0,2 mM de cada uno dNTP, 0,24X SYBR Green, 300 nM de cada cebador, 300 nM sonda, aproximadamente 1,000 copias de ADN genómico humano y 1,25 Unidades de platino Taq ADN polimerasa (Invitrogen) en un volumen final de 25 microlitros. El cebador de sentido, 5'-GGATTATGCCTGGCACCAT -3' (SEQ ID No, 138) tiene una Tm predicha de 66,2 °C a 300 nM y el cebador antisentido, 5'- GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA -3' (SEQ ID No. 139) y tiene una Tm predicha de 65,8 °C a 300 nM. La sonda, 5'-Quasar 670-TCATCTTTGGTGTTTCc Ta TGA -Extintor de Agujero Negro 2 -3' (SEQ ID No. 140) se usó en todas las amplificaciones para confirmar la amplificación de la diana específica y tiene una Tm predicha de 64,1 °C en las concentraciones de sonda y amplicón de 300 nM de cada uno. Las Tm se predijeron usando Visual OMP (software de ADN). Las mezclas de reacción no contenían aditivo o contenían Reactivo2 200 nM (cadena de extinción a 600 nM). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Stratagene Mx3005P programado para calentar a 95 °C durante 2 minutos, seguido de 60 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 15 segundos y 75 °C durante 30 segundos. La detección de fluorescencia se realizó a 60 °C para la sonda marcada con Quasar y a 75 °C para SYBR Green.

Los gráficos de amplificación en tiempo real de la fluorescencia de la sonda se presentan en la Figura 15A, donde el círculo 151 denota las curvas para los ensayos duplicados (cuatro) que no contienen reactivo agregado, el círculo 152 denota las curvas para los ensayos replicados que contienen Reactivo2200 nM, y el círculo 153 corresponde a un control sin plantilla. Las muestras con Reactivo2 muestran un retraso menor en el aumento de fluorescencia en comparación con los que no tienen Reactivo2 (diferencia de valor de Ct media de 0,5 ciclos). Se observa una pequeña variación en el aumento de fluorescencia en muestras sin Reactivo2. Prácticamente no se detecta variación de fluorescencia hasta el ciclo 45 en muestras con Reactivo2, y la variación se mantiene baja en el ciclo 60. A pesar del retraso inicial, la fluorescencia promedio en el punto final es mayor en muestras con Reactivo2 que en muestras sin Reactivo2. Además, las muestras sin Reactivo2 generaron un valor de Ct promedio con SYBR Green (que detecta todo el ADN bicatenario) 1,3 ciclos antes que con Reactivo2 (gráficos no mostrados), lo que indica un mayor nivel de amplificación no específica en el primero. En conjunto, estos resultados sugieren que el Reactivo2 reduce la amplificación no específica que puede aumentar la variación y reducir la amplificación general del dianaseado. La consistencia posible con Reactivo2 podría ser útil en la cuantificación del punto final donde la detección en tiempo real no es posible. También es probable que mejore la sensibilidad de detección en concentraciones de diana bajas y proporcione una pureza mejorada del producto para las reacciones de secuenciación.

Se realizó un experimento separado para probar la capacidad del Reactivo2 para proporcionar un arranque en caliente para la amplificación simétrica de CFTR. Las muestras se prepararon como se describe anteriormente, excepto que las muestras con Reactivo2200 nM contenían 1,25 Unidades de Taq ADN polimerasa que carece del anticuerpo para la polimerasa presente en Platinum Taq. (Ambas enzimas son ADN polimerasas Taq recombinantes fabricadas por Invitrogen). Todas las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos antes del ciclo térmico para brindar un desafío mayor para cada procedimiento de arranque en caliente.

La Figura 15B muestra gráficos de fluorescencia de la sonda en tiempo real de las muestras replicadas con el círculo 154, y el círculo 155 no tiene controles de plantilla. La Figura 15C muestra gráficas de fluorescencia de la sonda en tiempo real de muestras duplicadas con el Reactivo2, el círculo 156 y ningún control de plantilla, círculo 157. Estos grupos generaron valores de Ct comparables (el retraso con Reactivo2 fue de 0,4 ciclos). La fluorescencia final fue similar en los dos grupos, alcanzando valores medios de 7426 ± 387 con anticuerpo y 7174 ± 490 con Reactivo2.

Ejemplo 16

Uso de Reactivo3 y Reactivo4 para generar marcas de alta temperatura y baja temperatura para la normalización de la señal fluorescente

En este Ejemplo, las versiones de Reactivo3 y Reactivo4 (Tabla 1) tenían FAM como la fracción fluorescente, F, y Extintor de Agujero Negro 1 como la fracción, Q, junto con las dos etiquetas de dabcilo en cada Reactivo. Una mezcla de reacción de PCR típica se complementó con oligonucleótido marcado con fluoróforo 100 nM Reactivo3 y oligonucleótido marcado con Reactivo3 300 nM, además de oligonucleótido marcado con fluoróforo 50 nM Reactivo4 y oligonucleótido marcado con Reactivo4 150 nM. La Figura 16 ilustra las firmas fluorescentes para Reactivo3 y Reactivo4 en el canal FAM, donde el círculo 161 denota las curvas para la combinación de Reactivo3 y Reactivo4 y el círculo 162 denota las curvas para el Reactivo4 de 150 nM. Estas firmas fluorescentes generan una temperatura alta y una baja marca de temperatura para la normalización de las firmas de las sondas fluorescentes de los híbridos sonda/diana en el canal fAm u otros canales fluorescentes en la reacción. Estas marcas de temperatura se generaron al complementar la mezcla de reactivos de PCR con concentraciones más altas de dúplex Reactivo3, correctas para la dependencia de la temperatura de las señales fluorescentes FAM y generar una firma fluorescente cuya profundidad coincide con la del valle de la firma fluorescente de Reactivo4. El mayor ancho de las señales de valle fluorescentes en comparación con las señales fluorescentes de Reactivo1 en otros ejemplos en esta aplicación se atribuye a las interacciones conocidas entre las fracciones dabcilo extra unidas a Reactivo3 y Reactivo4. Dichas interacciones estabilizan los dúplex de oligonucleótidos que extinguen la fluorescencia en estos reactivos y dan lugar a transiciones de temperatura más amplias durante el análisis de la curva de fusión.

Ejemplo 17

Procedimiento matemático para usar una o más marcas de temperatura para normalizar los datos fluorescentes de los ensayos LATE-PCR que usan sondas Lights On/Lights-Off

Los ensayos de PCR, que incluyen particularmente los ensayos LATE-PCR, que emplean múltiples sondas Lights On/Lights-Off se utilizan para generar "firmas fluorescentes" que se comparan con una biblioteca de firmas fluorescentes de muestras conocidas, como se describe en la Publicación de la Solicitud Internacional de Patente WO 2011/050173. Las marcas de temperatura simple y doble proporcionan el punto de partida para el análisis matemático de las curvas de fusión/fusionamiento en todos los colores en una sola muestra. El análisis matemático se realiza mediante una serie de procedimientos matemáticos o algoritmos cuyo uso y resultado se ilustra en los siete pasos de este Ejemplo. Diversos pasos se basan en estándares previamente determinados: primero una Tm estándar para cada Reactivo que se usa en el ensayo cuyos resultados se están investigando y, en segundo lugar, una biblioteca de firmas fluorescentes de muestras conocidas, que se pueden almacenar en una base de datos informática en una forma adecuada para fines comparativos, por ejemplo, una serie de valores a varias o muchas temperaturas de la primera derivada normalizada de fluorescencia frente a temperatura para cada color de sonda diferente.

Una primera tarea es determinar si y cómo la Tm de cada reactivo en la muestra que se investiga difiere de la Tm estándar previamente determinada para el reactivo. La Figura 17A muestra un procedimiento para determinar dichas Tm en dos pasos, aquí denominados Paso 1 y Paso 2. En el Paso 1, los datos para una marca térmica "valle" (-dF/dT del fluoróforo de un Reactivo) se invierten en una "colina" y se representa como un conjunto de puntos de datos en función de la temperatura. Las Figuras 17A-C muestran gráficos de puntos de datos (círculos abiertos) de tres reacciones replicadas. Cada colina de cada muestra replicada se trata por separado y en el Paso 2 se ajusta una curva Gaussiana ligeramente inclinada (líneas continuas en las Figuras 17A-C). El pico de la curva ajustada para cada muestra (flecha) es la Tm observada, (OTM), para la marca de temperatura de ese Reactivo en una muestra.

A continuación, se realiza la corrección para alinear cada curva de muestra con la biblioteca de curvas utilizando la Tm estándar del reactivo. Esto se hace en dos pasos, denominados Paso 3 y Paso 4. La Figura 17D presenta dos conjuntos de curvas. El panel superior muestra las curvas derivadas, círculo 1702, para réplicas de una muestra, en donde la flecha hacia abajo indica la OTM y la línea vertical 1703 indica la Tm estándar para el Reactivo. El Paso 3 es determinar la diferencia entre la OTM y la Tm estándar. Se hace referencia a la diferencia como el valor de ajuste de temperatura, TAV. Como se muestra en las curvas del círculo 1702, el OTM difiere en cierta medida del estándar OTM establecido previamente para ese Reactivo, siendo esta diferencia el TAV. Si se usan dos Reactivos, cada uno con una Tm diferente, se pueden producir dos TAV independientes, uno para el Reactivo de alta temperatura y otro para el Reactivo de baja temperatura. En el Ejemplo 14, por ejemplo, solo había un Reactivo, por lo tanto, un t Av . El TAV es útil para corregir el OTM en cada muestra a un OTM estándar predeterminado para ese Reactivo. Dicho ajuste puede basarse en un solo TAV, pero es preferible basar el TAV en un par de OTM de alta/baja temperatura a partir de dos Reactivos. En el Paso 4, el TAV para cada muestra se usa para ajustar las curvas de muestra (véase la Figura 17D, panel inferior, círculo 1704) muestra las curvas 1702 así ajustadas. En este caso, el TAV se restó de cada grado de temperatura, desplazando así la OTM a la izquierda a su "posición máxima teórica" y también desplazando todas las demás temperaturas en la misma cantidad. Sin embargo, como apreciará un experto en la técnica, un cambio constante no es la única forma de utilizar la OTM. Podría, por ejemplo, usarse para desplazar el OTM a la posición del pico teórico y luego usarse más para corregir todas las temperaturas por encima y por debajo del pico teórico mediante un factor de escala que es proporcional al número de grados fuera del OTM.

Queda por comparar curvas de muestra (círculo 1704) con la biblioteca de posibles dianas, previamente ingresadas en una memoria de ordenador como una serie de valores a una serie de temperaturas suficientes para distinguir entre las posibles dianas. Para nosotros se utilizan curvas normalizadas para construir la biblioteca y también para las curvas de muestra que se comparan con la biblioteca. El Paso 5 implica la normalización de las señales de fluorescencia en todos los canales para que estén entre 0 y 1, estableciendo el valor de fluorescencia a la temperatura más baja del intervalo de interrogación (30 °C en la ilustración de la Figura 17E) como 0 y el valor de fluorescencia en la temperatura más alta del intervalo de interrogación (75 °C en la ilustración de la Figura 17E) como 1. La Figura 17E, panel superior, círculo 1705, muestra curvas normalizadas de datos de fluorescencia sin procesar después del ajuste descrito anteriormente en relación con la Figura 17D. La normalización permite el examen de la forma de las curvas de fusión sin tener en cuenta la abundancia del material. El Paso 6 implica el cálculo de las derivadas primera y segunda de la curva de fluorescencia bruta normalizada para resaltar las señales relacionadas con el patrón de las señales fluorescentes en función de la temperatura. La Figura 17E, panel inferior, ilustra dichas curvas de segunda derivada, círculo 1706.

El Paso 7 implica evaluar una muestra desconocida. En este paso, calculamos el error de temperatura promediada (como el error cuadrado) entre la primera o la segunda derivada de la curva de fusión normalizada de la muestra desconocida y las mismas derivadas de una base de datos de muestras conocidas. Se considera que la muestra conocida con el error más bajo es la mejor coincidencia para la muestra desconocida. Debido a que los ordenadores son muy rápidas para realizar cálculos, cada conjunto de datos podría cambiarse y/o escalarse de dicha manera proporcional y luego compararse con patrones conocidos de señales fluorescentes para diferentes dianas relevantes muy rápidamente. Un diana mejor ajuste podría identificarse como el que tiene diferencias totales por debajo de una cantidad prescrita, o si no se identifica un diana mejor ajuste, el ordenador podría realizar un ajuste proporcional diferente y, de nuevo, comparar el patrón empírico de firmas fluorescentes con la biblioteca de todas las firmas fluorescentes posibles.

Ejemplo 18

Dependencia de la polimerasa del reactivo extensible de polimerasa

El Ejemplo 18 proporciona evidencia del concepto de un Reactivo extensible de polimerasa descrito como variante 9 en la sección de descripción detallada de esta solicitud. En este Ejemplo, realizamos un ensayo utilizando una versión abreviada (19 nucleótidos de longitud) del Reactivo que tiene un extremo 3' sin protección y una etiqueta fluorescente en el extremo 5'. Esta cadena acortada se hibridó con una complementariedad perfecta con la porción 3' de una cadena larga de 30 nucleótidos marcada en su extremo 3' con un extintor. Cuando la temperatura se reduce lo suficiente para permitir la hibridación de las dos cadenas, se observa un valle en la primera derivada de la señal fluorescente. En presencia de una polimerasa activa, el extremo 3' no tapado de la cadena larga de 19 nucleótidos se extiende sobre la cadena de plantilla larga de 30 nucleótidos, con un aumento resultante en la Tm de las dos cadenas. Por lo tanto, esta variante del reactivo sirvió como marca de temperatura y como control interno de la actividad de la Taq Polimerasa. Los componentes y condiciones de reacción fueron los siguientes:

Cadena acortada marcada con fluoróforo sin protección:

Quasar 670 IC19: 5' Quasar670- CAGCTGCACTGGGAAGGGT (SEQ ID No.)

Cadena etiquetada de Extintor complementario de longitud completa:

5' GGTCAGACTGCACCCTTCCCAGTGCAGCTG-BHQ2 (SEQ ID No.)

La reacción se llevó a cabo por triplicado (tres réplicas técnicas) en 25 pl de volumen que consistía en un tampón de Invitrogen PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, dNTP 300 nM, cadena de fluorescencia 100 nM y cadena de extinción 300 nM. Esta mezcla se dividió en dos submezclas, con y sin 1,25 unidades de polimerasa de ADN Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Antes del inicio de la reacción, se realizó una primera fusión con adquisición fluorescente para Quasar 670 en cada grado, comenzando a 69 °C con incrementos de 1 °C en intervalos de 15 s a 94 °C. Después de esta fusión, las condiciones del perfil térmico para estas reacciones fueron: 95 °C durante 3 minutos seguidos de 95 °C/5s-72 °C/20s durante 10 ciclos con adquisición de fluorescencia en cada ciclo en el paso de 72 °C. A esto le siguió una segunda fusión con adquisición fluorescente para el Quasar 670 en cada grado, comenzando a 60 °C con incrementos de 1 °C en intervalos de 15 s a 90 °C.

Los resultados en la Figura 20A muestran que las firmas fluorescentes de las réplicas en la primera fusión antes del comienzo de la reacción con la línea (201) son réplicas que no contienen polimerasa, mientras que la línea (202) son las réplicas que contienen polimerasa. La presencia de la polimerasa aumenta la profundidad del valle, pero no es la temperatura. La doble inmersión en este valle es un artefacto del Quasar 670 y no indica actividad de la polimerasa (véanse Líneas 203 en la Figura 20B). La Figura 20B muestra los resultados de las firmas fluorescentes de las réplicas de la segunda fusión después de la reacción, una vez que la polimerasa tiene la posibilidad de extender la cadena acortada marcada con fluoróforo. La línea (203) son réplicas que no contienen polimerasa y no muestran un aumento en Tm. La línea (204) son las réplicas que contienen polimerasa y muestran un aumento en Tm.

Ejemplo 19

Reactivo extensible de polimerasa en una reacción de PCR LATE dúplex

El Ejemplo 19 proporciona evidencia de que el reactivo extensible de polimerasa es compatible con la amplificación de uno o más productos en un ensayo de PCR. Se utilizó un ensayo lAt E-PCR dúplex para generar dos amplicones de una sola cadena que contienen secuencias que confieren sensibilidad al fármaco o resistencia al fármaco para los siguientes antibióticos (y genes diana): etambutol (embB), isoniacida (inhA), en varias cepas de M. tuberculosis. En este Ejemplo, las hibridaciones se caracterizaron por el uso del análisis del perfil de fusión. Los componentes y condiciones de reacción fueron los siguientes:

Reactivo Extensible de Polimerasa:

Cadena acortada marcada con fluoróforo sin protección:

Véase Ejemplo 18

Invertir Complemento de longitud completa

Extintor cadena etiquetada:

Véase Ejemplo 18

Cebadores:

cebador limitante de inh

ATTCCGGTAACCAGGACTGAACGGGATACGAATGGGGGTTTGG (SEQ ID NO: 5)

cebador de exceso inh

ATCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATAC (SEQ ID NO: 6)

cebador limitante embB

ATCCTCCGGGCTGCCGAACCAGCGGA (SEQ ID NO:)

cebador de exceso embB

TGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGT (SEQ ID NO:)

Sondas

inhA_ON

Cal Red 610-TTACAACCTATCGTCTCGCCGCAA-BHQ2 (SEQ ID NO:)

inhA_OFF

GCAGTCACCCCG-BHQ2 (SEQ ID NO:)

embB ON

BHQ2-AACGGCGTGGTCGGCTT-CalRed 610 (SEQ ID NO:)

embB ON

BHQ2-GACTCGGGCCGTGCGCAG-C3 (SEQ ID NO:)

Primesafe

Sentido Primesafe

Dabcilo-GGATCAGATTAGCACTGATGTA-Dabcilo (SEQ ID NO: 56)

Antisentido Primesafe

Dabcilo-TACATCAGTGCTAATCTGATCC-Dabcilo (SEQ ID NO: 57)

Secuencias diana

Diana embB: Cepa H37Rv

CTGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGTCGGACGACGGCTACATCCTG

GGCATGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGT

TCGGCAGCCCGGAGGAT

Diana inhA: Cepa H37Rv

TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCG

AGACGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCAT

TCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGGAGGAA

Diana embB: Cepa 18640

Igual que la secuencia de la cepa H37Rv

Diana inhA: Cepa 18640Igual que la secuencia de la cepa H37Rv

Diana embB: Cepa 8600

CTGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGTCGGACGACGGCTACATCCTG

GGCAAGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGT

TCGGCAGCCCGGAGGAT

Diana inhA: Cepa 8600

Igual que la secuencia de la cepa H37Rv

Las amplificaciones de LATE-PCR se realizaron por triplicado en un volumen de 25 ^l que consiste en un tampón de PCR IX (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCh 3 mM, dNTPs 300 nM, cebador limitante 50 nM y cebador en exceso 1000 nM para cada uno conjunto de cebadores, 1,25 unidades de Platinum Taq DNA Polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), 300 nM de sondas desactivadas y 100 nM de sondas activadas, 600 nM de cada cadena para Primesafe y 100 nM de cadena de fluorescencia y 300 nM de serie de extintor para reactivo extensible (Variante 9).

Antes del inicio de la reacción, se realizó una primera fusión con adquisición fluorescente para Quasar 670 en cada grado, comenzando a 60 °C con incrementos de 1 °C en intervalos de 21 s a 90 °C. Después de esta fusión, las condiciones del perfil térmico para estas reacciones fueron: 95 °C durante 3 minutos seguidos de 95 °C/10s-75 °C/40s durante 60 ciclos, seguidos de un solo ciclo a 75 °C durante 10 minutos seguidos de 10 min a 25 °C. A esto le siguió una segunda fusión con la adquisición fluorescente de Quasar 670, Cal Red 610 y Cal Orange 560 en cada grado, comenzando a 25 °C con incrementos de 1 °C en intervalos de 30 segundos a 90 °C.

Las hibridaciones de la sonda-diana se analizaron mediante el análisis de la curva de fusión usando la primera derivada para cada fluorescencia por separado para las temperaturas entre 25 °C y 90 °C.

Los resultados en la Figura 21A muestran el promedio de firmas fluorescentes Quasar 670 de tres repeticiones para cada cepa y ningún control de plantilla para la primera fusión antes del inicio de la reacción. Todas las cepas más el control sin plantilla muestran el mismo perfil de fusión Tm con el valle fluorescente más bajo entre 71 °C y 72 °C, lo que indica que la cadena fluorescente sin protección acortada no se ha extendido. La cepa 8600 (línea 210), la cepa H37Rv (línea 211), el control sin plantilla (línea 212) y la cepa 18460 (línea 213) mostraron perfiles casi idénticos. La Figura 21B muestra los resultados de las firmas fluorescentes Quasar 670 promedio de las réplicas de la segunda fusión después de que se completan 60 ciclos térmicos. De nuevo, todas las muestras muestran firmas idénticas con un cambio de temperatura del valle fluorescente más bajo a 80 °C a 81 °C, lo que muestra que la cadena de Reactivo extensible se extendió para producir una Tm más alta que antes del inicio de la reacción. La cepa 8600 (línea 214), la cepa H37Rv (línea 215), el control sin plantilla (línea 216) y la cepa 18460 (línea 217). La Figura 21C muestra el perfil de fusión para las dianas embB e inhA utilizando las firmas fluorescentes Cal Red 610 promedio para cada cepa y sin control de plantilla. El control sin plantilla (línea 218) no tiene firma fluorescente porque no se produjo la amplificación. La firma para la diana embB está entre 50 °C y 67 °C, mientras que la firma de la diana inhA cae por encima de 67 °C. Las cepas H37Rv (línea 219) y la cepa 18460 (línea 220) muestran firmas fluorescentes idénticas. Entre tanto la cepa 8600 (línea 221) tiene una firma diferente para el diana embB, por lo tanto, es resistente para el etambutol.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una mezcla de reacción de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que incluye, además de al menos una cadena de ácido nucleico que contiene al menos una secuencia diana, al menos un par de cebadores, una ADN polimerasa y dNTP en un tampón de reacción de la PCR,

al menos un reactivo agregado que comprende al menos un par de oligonucleótidos complementarios con la capacidad de formar una concentración de 50-800 nM de un híbrido bicatenario de 6-50 pares de bases de longitud con una temperatura de fusión (Tm) de al menos 32 °C, teniendo dicho híbrido bicatenario un extremo que incluye fracciones de etiqueta unidos covalentemente, interactivos, una fracción fluorescente no plana voluminosa en una cadena y en la otra cadena, ya sea una fracción fluorescente voluminosa no plana o una fracción no voluminosa plana,

en la que ninguna de las cadenas de dicho al menos un reactivo actúa como una sonda o un cebador en una cadena plantilla de la secuencia diana amplificada en la reacción.

2. La mezcla de reacción de la reivindicación 1, en la que la fracción fluorescente voluminosa no plana está unida a un nucleótido 5'-terminal de una de dichas cadenas.

3. La mezcla de reacción de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la fracción fluorescente es un fluoróforo.4.

4. La mezcla de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la que el híbrido bicatenario del reactivo tiene un extremo romo y las fracciones de etiqueta están unidas a nucleótidos terminales del extremo romo.

5. La mezcla de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la mezcla de reacción es una mezcla de reacción LATE-PCR.

6. La mezcla de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la ADN polimerasa es una polimerasa de arranque en caliente.

7. La mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que al menos una secuencia diana de ácido nucleico es ARN, y la mezcla de reacción incluye transcriptasa reversa.

8. La mezcla de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la mezcla de reacción incluye un colorante de ADNdc fluorescente.

9. La mezcla de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la selectividad de la polimerasa se manifiesta en al menos una de las siguientes formas: supresión de cebado incorrecto; mayor especificidad del cebador para híbridos cebador-diana perfectamente complementarios y contra híbridos que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que no son perfectamente complementarias; mayor selectividad de la polimerasa para híbridos de cebador-diana que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que son ricas en GC y contra híbridos que tienen secuencias 3'-terminales con ranuras que son ricas en AT; supresión de la evolución del producto; y dispersión reducida entre las reacciones replicadas, por lo que la concentración del híbrido bicatenario es suficiente para mejorar la selectividad de la polimerasa.

10. Un procedimiento para amplificar al menos una secuencia diana de ADN que comprende proporcionar una mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y someter la mezcla de reacción a múltiples ciclos térmicos de PCR que tienen una temperatura de recocido del cebador y una temperatura de extensión del cebador.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la temperatura de fusión (Tm) del reactivo de oligonucleótido bicatenario no está más de 5 °C por debajo de la temperatura de recocido del cebador.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la mezcla de reacción incluye un reactivo de arranque en caliente que consiste en un oligonucleótido bicatenario que está marcado terminalmente con tres o cuatro grupos dabcilo y que tiene una temperatura de fusión que está por debajo de la temperatura de recocido del cebador pero está al menos a 30 °C.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la mezcla de reacción incluye al menos una sonda marcada con fluorescencia que es capaz de hibridar con dicha secuencia diana amplificada y señalización, y el procedimiento incluye la detección de productos de amplificación monocatenarios con dicha al menos una sonda.

14. El procedimiento de amplificación de la reivindicación 13, en el que la detección es la detección del punto final después de la amplificación.

15. Un kit de reactivos que amplifica al menos una secuencia diana de ADN, incluyendo dicho kit los reactivos para una mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.