ES2828276T3 - Detección de polimorfismo mononucleotídico usando sondas de hidrólisis solapantes - Google Patents

Detección de polimorfismo mononucleotídico usando sondas de hidrólisis solapantes Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para detectar un polimorfismo mononucleotídico (SNP) en un ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el procedimiento: - realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico para producir un producto de amplificación que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido si está presente algún ácido nucleico diana en la muestra; - realizar una etapa de hibridación que comprende proporcionar el producto de amplificación con una sonda oligonucleotídica bicatenaria que comprende: - una primera sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico complementaria a una primera región que contiene SNP de la hebra sentido, comprendiendo la primera sonda de hidrólisis específica para SNP un primer marcador interactivo y un segundo marcador interactivo, un primer extremo 5' y un primer extremo 3'; y - una segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una cuarta secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de la hebra antisentido, la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende un tercer marcador interactivo y un cuarto marcador interactivo, un segundo extremo 5' y un segundo extremo 3'; y - detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación se determina por la detección de un marcador detectable liberado de dicha primera y/o dicha segunda sonda de hidrólisis específica para SNP y es indicativa de la presencia del SNP en el ácido nucleico diana, y en el que la ausencia de un marcador detectable liberado de dicha primera y/o dicha segunda sonda de hidrólisis específica para SNP indica la ausencia del producto de amplificación y la ausencia del SNP en el ácido nucleico diana, en el que el primer marcador interactivo comprende un primer resto fluorescente donante en el primer extremo 5', y el segundo marcador interactivo comprende un primer correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del primer resto fluorescente donante en la primera sonda de hidrólisis específica para SNP, y en el que el tercer marcador interactivo comprende un segundo resto fluorescente donante en el segundo extremo 5', y el cuarto marcador interactivo comprende un segundo correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del segundo resto fluorescente donante en la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP.

Description

DESCRIPCIÓN
Detección de polimorfismo mononucleotídico usando sondas de hidrólisis solapantes
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del diagnóstico basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, más en particular, a los procedimientos de detección por PCR que utilizan sondas de hidrólisis solapantes.
Antecedentes de la invención
La PCR es un modo eficaz y rentable de copiar o 'amplificar' segmentos pequeños de ADN o ARN. Usando la PCR se generan millones de copias de una sección de ADN en tan solo unas pocas horas, proporcionando suficiente ADN requerido para su análisis. Este procedimiento permite a los médicos diagnosticar y realizar un seguimiento de enfermedades usando una cantidad mínima de muestra, tal como sangre o tejido. La PCR ultrarrápida permite que se produzca la amplificación y la detección al mismo tiempo. Se realiza un procedimiento de detección utilizando sondas de hidrólisis oligonucleotídicas (también conocidas como sondas TaqMan®) que tienen un fluoróforo enlazado covalentemente, por ejemplo, al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, y un extintor enlazado, por ejemplo, internamente o en el extremo 3'. Las sondas de hidrólisis son sondas oligonucleotídicas doblemente marcadas que se basan en la actividad nucleasa de 5' a 3' de la Taq polimerasa para escindir la sonda de hidrólisis durante la hibridación a la secuencia diana complementaria, y dan como resultado una detección basada en fluorescencia.
El documento WO2008021446 divulga procedimientos con sondas-antisondas ultrarrápidos para la detección de SNP usando sondas bicatenarias que contienen un único par de transferencia de energía.
Se pueden usar procedimientos de PCR ultrarrápida para amplificar y detectar variaciones de secuencia en ácidos nucleicos diana que tienen polimorfismo mononucleotídico (SNP). Sin embargo, muchos de los ensayos de detección/genotipado de SNP disponibles se basan en la suposición de que el SNP es bialélico (véase, por ejemplo, Morita et al., Mol. Cel. Probes, 2007, 21, 171-176). La detección de SNP con procedimientos de PCR ultrarrápida existentes actualmente carece de suficiente sensibilidad y especificidad. Las sondas de hidrólisis, tales como las sondas TaqMan® estándar, típicamente se diseñan para que sean aproximadamente de 18 a 22 bases de longitud para que tengan una temperatura de fusión (Tf) 8-10 °C más alta en comparación con el cebador oligonucleotídico. Las sondas TaqMan® estándar demuestran, en general, ser menos específicas y sensibles para la detección de SNP y no muestran discriminación completa entre las dianas WT (naturales) y las MT (mutantes). Los ensayos de genotipado de SNP basados en TaqMan® actuales implican el uso de sondas TaqMan® MGB (Minor Groove Binders) que son más cortas en longitud con estabilidad de unión sonda-molde incrementada para la discriminación alélica. También se pueden incluir modificaciones de bases adicionales, tales como bases estabilizantes (propinil-dU, propinil-dC) en el diseño de sondas TaqMan® estándar para la detección de SNP mejorada y la discriminación. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de obtener un procedimiento rápido y fiable para detectar específicamente los SNP de una manera sensible.
Sumario de la invención
El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
La materia objeto de la presente divulgación incluye sondas de hidrólisis específicas para SNP bicatenarias donde ambas hebras de sonda oligonucleotídica son específicas para SNP y se solapan en la localización de SNP. En algunos modos de realización, una de las hebras de sonda oligonucleotídica se diseña para que incluya una estructura de horquilla hacia el extremo 3'. La estructura de horquilla cerca del extremo 3' de la sonda oligonucleotídica retrasa la hibridación de la porción 3' de la sonda al molde y, por tanto, ayuda en la discriminación de las dianas WT y las MT en base al único emparejamiento erróneo entre el indicador y el extintor que está cerca del extremo 5'. La porción 5' de la sonda oligonucleotídica específica para SNP se puede hibridar más eficazmente al molde MT en comparación con el molde WT. Cuando la sonda oligonucleotídica específica para SNP encuentra la diana WT, el único emparejamiento erróneo con la diana WT puede prevenir la hibridación y la escisión de la sonda y, por tanto, no se puede detectar ninguna fluorescencia.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar un SNP en un ácido nucleico diana en una muestra, incluyendo el procedimiento realizar una etapa de amplificación que incluye poner en contacto la muestra con un primer cebador oligonucleotídico que tiene un primer ácido nucleico y un segundo cebador oligonucleotídico que tiene una segunda secuencia de ácido nucleico para producir un producto de amplificación que incluye una hebra sentido y una hebra antisentido si está presente algún ácido nucleico diana en la muestra; realizar una etapa de hibridación que incluye proporcionar el producto de amplificación con una sonda bicatenaria que incluye una primera sonda de hidrólisis específica para SNP que tiene una tercera secuencia de ácido nucleico complementaria a una primera región que contiene SNP de la hebra sentido, incluyendo la primera sonda de hidrólisis específica para SNP un primer marcador interactivo y un segundo marcador interactivo, un primer extremo 5' y un primer extremo 3'; y una segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que tiene una cuarta secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene s Np de la hebra antisentido, incluyendo la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP un tercer marcador interactivo y un cuarto marcador interactivo, un segundo extremo 5' y un segundo extremo 3'; y detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia de los productos de amplificación es indicativa de la presencia del SNP en la diana de ácido nucleico diana, y en el que la ausencia de los productos de amplificación es indicativa de la ausencia del SNP en la diana de ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP puede incluir una estructura de horquilla hacia el segundo extremo 3', incluyendo la estructura de horquilla una región de secuencia de ácido nucleico no natural (por ejemplo, cambiada o adicional) que incluye uno o más nucleótidos adicionales para producir la estructura de horquilla. El primer marcador interactivo puede comprender un primer resto fluorescente donante en el primer extremo 5', y el segundo marcador interactivo comprende un primer correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del primer resto fluorescente donante en la primera sonda de hidrólisis específica para SNP, y en el que el tercer marcador interactivo comprende un segundo resto fluorescente donante en el segundo extremo 5', y el cuarto marcador interactivo comprende un segundo correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del segundo resto fluorescente donante en la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP. En algunos modos de realización, el primer resto fluorescente aceptador es un primer extintor y el segundo resto fluorescente aceptador es un segundo extintor. En determinados modos de realización, el primer y segundo extintor son el mismo extintor. En determinados modos de realización, el primer y segundo extintor son extintores diferentes. En algunos modos de realización, la amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'. En algunos modos de realización, la primera y/o la segunda secuencias de ácido nucleico de los cebadores oligonucleotídicos y/o la tercera y/o la cuarta secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis comprenden al menos un nucleótido modificado. En algunos modos de realización, la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico de los cebadores oligonucleotídicos y/o la tercera y la cuarta secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis tienen 40 nucleótidos o menos.
En otro aspecto, se proporciona un kit para detectar un SNP en un ácido nucleico diana en una muestra, incluyendo el kit un primer cebador oligonucleotídico que tiene un primer ácido nucleico y un segundo cebador oligonucleotídico que tiene una segunda secuencia de ácido nucleico específica para producir un producto de amplificación que incluye una hebra sentido y una hebra antisentido de un ácido nucleico diana; y una sonda oligonucleotídica bicatenaria que incluye una primera sonda de hidrólisis específica para SNP que tiene una tercera secuencia de ácido nucleico complementaria a una primera región que contiene SNP de la hebra sentido, incluyendo la primera sonda de hidrólisis específica para SNP un primer marcador interactivo y un segundo marcador interactivo, un primer extremo 5' y un primer extremo 3'; y una segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que tiene una cuarta secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de la hebra antisentido, incluyendo la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP un tercer marcador interactivo y un cuarto marcador interactivo, un segundo extremo 5' y un segundo extremo 3'. En algunos modos de realización, la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP puede incluir una estructura de horquilla hacia el segundo extremo 3', incluyendo la estructura de horquilla una región de secuencia de ácido nucleico no natural (por ejemplo, cambiada o adicional) que incluye uno o más nucleótidos adicionales para producir la estructura de horquilla. En algunos modos de realización, el primer marcador interactivo comprende un primer resto fluorescente donante en el primer extremo 5', y el segundo marcador interactivo comprende un primer correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del primer resto fluorescente donante en la primera sonda de hidrólisis específica para SNP, y en el que el tercer marcador interactivo comprende un segundo resto fluorescente donante en el segundo extremo 5', y el cuarto marcador interactivo comprende un segundo correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del segundo resto fluorescente donante en la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP. En algunos modos de realización, el primer resto fluorescente aceptador es un primer extintor, y en el que el segundo resto fluorescente aceptador es un segundo extintor. En determinados modos de realización, el primer y segundo extintor son extintores diferentes. En algunos modos de realización, la amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'. En algunos modos de realización, el kit comprende además una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'. En algunos modos de realización, la primera y/o segunda secuencias de ácido nucleico de los cebadores oligonucleotídicos y/o la tercera y/o cuarta secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis comprenden al menos un nucleótido modificado. En algunos modos de realización, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico de los cebadores oligonucleotídicos y/o la tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis tienen 40 nucleótidos o menos.
En un aspecto, se proporciona una sonda oligonucleotídica bicatenaria que incluye una primera sonda de hidrólisis específica para SNP que tiene una primera secuencia de ácido nucleico complementaria a una primera región que contiene SNP de la hebra sentido, incluyendo la primera sonda de hidrólisis específica para SNP un primer marcador interactivo y un segundo marcador interactivo, un primer extremo 5' y un primer extremo 3'; y una segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que tiene una segunda secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de la hebra antisentido, incluyendo la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP un tercer marcador interactivo y un cuarto marcador interactivo, un segundo extremo 5' y un segundo extremo 3'. El primer y el tercer marcadores interactivos pueden ser un resto fluorescente donante hacia, cerca del o en el extremo 5' de cada hebra de sonda oligonucleotídica, y el segundo y cuarto marcadores interactivos pueden ser un correspondiente resto fluorescente aceptador, por ejemplo, un extintor, por ejemplo, dentro de no más de 8 nucleótidos del resto fluorescente donante en cada una de las hebras de la sonda de hidrólisis bicatenaria. En determinados modos de realización, el primer y segundo extintor son el mismo extintor. En determinados modos de realización, el primer y segundo extintor son extintores diferentes. En algunos modos de realización, la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP puede incluir una estructura de horquilla hacia el segundo extremo 3', incluyendo la estructura de horquilla una región de secuencia de ácido nucleico no natural (por ejemplo, cambiada o adicional) que incluye uno o más nucleótidos adicionales para producir la estructura de horquilla. En algunos modos de realización, el primer resto fluorescente aceptador es un primer extintor, y en el que el segundo resto fluorescente aceptador es un segundo extintor. En algunos modos de realización, la primera y/o segunda secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis comprenden al menos un nucleótido modificado. En algunos modos de realización, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis tienen 40 nucleótidos o menos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuación. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Los detalles de uno o más modos de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La FIGURA 1 muestra curvas de amplificación por PCR ultrarrápida para la detección de SNP 526N natural y mutante usando una sonda de hidrólisis bicatenaria con hebras de sonda tanto sentido como antisentido que son específicas para SNP y teniendo la hebra sentido una estructura de horquilla hacia el extremo 3'.
La FIGURA 2 muestra una sonda de hidrólisis bicatenaria específica para SNP 526N con hebras de sonda tanto sentido como antisentido que son específicas para SNP y teniendo la hebra sentido una estructura de horquilla hacia el extremo 3'.
La FIGURA 3 muestra las curvas de amplificación por PCR ultrarrápida para la detección de SNP 531L natural y mutante usando una sonda de hidrólisis bicatenaria con hebras de sonda tanto sentido como antisentido que son específicas para SNP.
La FIGURA 4 muestra una sonda de hidrólisis bicatenaria específica para SNP 531L con hebras de sonda tanto sentido como antisentido que son específicas para SNP.
La FIGURA 5 muestra las curvas de amplificación por PCR ultrarrápida para la detección de SNP 526Y natural y mutante usando una sonda de hidrólisis bicatenaria con hebras de sonda tanto sentido como antisentido que son específicas para SNP.
La FIGURA 6 muestra una sonda de hidrólisis bicatenaria específica para SNP 526Y con hebras de sonda tanto sentido como antisentido que son específicas para SNP.
Descripción detallada de la invención
En el presente documento se describen procedimientos, kits y sondas de hidrólisis para detectar un polimorfismo mononucleotídico (SNP) en un ácido nucleico diana en una muestra. La sensibilidad incrementada de la PCR ultrarrápida para la detección de un SNP en un ácido nucleico diana en comparación con otros procedimientos, así como los rasgos característicos mejorados de la PCR ultrarrápida que incluyen la contención de la muestra y la detección ultrarrápida del producto amplificado, hacen factible la implementación de esta tecnología para el diagnóstico y la detección rutinarios de un SNP en un ácido nucleico diana en el laboratorio clínico.
Los procedimientos pueden incluir realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una o más porciones de una molécula de ácido nucleico diana, por ejemplo, una diana génica que contiene el SNP de interés que se va a detectar, en una muestra usando un cebador oligonucleotídico que incluye un ácido nucleico y otro cebador oligonucleotídico que incluye otra secuencia de ácido nucleico para producir un producto de amplificación que incluye una hebra sentido y una hebra antisentido. Como se usa en el presente documento, "cebador", "cebadores" y "pares de cebadores" se refieren a cebador(es) oligonucleotídico(s) que se hibridan específicamente a la diana de secuencia de ácido nucleico, e inician la síntesis a partir de la misma en condiciones apropiadas. Cada uno de los cebadores se hibrida a una región dentro de o contigua a la respectiva molécula de ácido nucleico diana de modo que al menos una porción de cada producto de amplificación contenga una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la respectiva diana y SNP, si está presente. Se produce un producto de amplificación siempre que el ácido nucleico diana esté presente en la muestra, si el SNP de interés está presente o no en la molécula de ácido nucleico diana.
El procedimiento también puede incluir una etapa de hibridación que incluye proporcionar el producto de amplificación con una sonda oligonucleotídica bicatenaria que incluye una sonda de hidrólisis específica para SNP que incluye una secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de la hebra sentido del producto de amplificación, y otra sonda de hidrólisis específica para SNP que incluye otra secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de la hebra antisentido del producto de amplificación. Las sondas de hidrólisis específicas para s Np bicatenarias pueden ser completamente bicatenarias a lo largo de todas las longitudes de las hebras sentido y las antisentido de las sondas oligonucleotídicas, o la sonda oligonucleotídica bicatenaria puede ser parcialmente bicatenaria a lo largo de una región de las longitudes de la hebra sentido y la antisentido de las sondas oligonucleotídicas. Por ejemplo, la región donde las hebras sentido y las antisentido de la sonda oligonucleotídica bicatenaria forman una región bicatenaria puede ser, por ejemplo, una región hacia el extremo 5', o el extremo 3', o el área central de las hebras sentido y las antisentido de la sonda oligonucleotídica bicatenaria. La sonda oligonucleotídica bicatenaria se debe solapar a lo largo del área donde se localiza el SNP de interés. Cada una de las sondas de hidrólisis específicas para s Np de la sonda oligonucleotídica bicatenaria puede incluir un primer y un segundo marcador interactivo, un extremo 5' y un extremo 3'. En algunos modos de realización, una sonda de hidrólisis de la sonda oligonucleotídica bicatenaria, por ejemplo, las sondas oligonucleotídicas antisentido, puede incluir una estructura de horquilla hacia el extremo 3'. En el presente documento, la sonda de hidrólisis específica para SNP puede tener una secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de una hebra del producto de amplificación, una estructura de horquilla hacia el extremo 3' y puede comprender además un primer y un segundo marcador interactivo. Además, el primer marcador interactivo se puede situar cerca del o en el extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, mientras que el segundo marcador interactivo se puede situar internamente o en el extremo 3' de la sonda oligonucleotídica. En algunos modos de realización, el primer marcador interactivo puede ser un resto fluoróforo enlazado covalentemente, por ejemplo, al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, mientras que el segundo marcador interactivo puede ser un resto fluorescente aceptador enlazado covalentemente, por ejemplo, internamente o en el extremo 3'. En otros modos de realización, el primer marcador interactivo puede ser un resto fluorescente aceptador enlazado covalentemente, por ejemplo, al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, mientras que el segundo marcador interactivo puede ser un resto fluoróforo enlazado, por ejemplo, internamente o en el extremo 3'. En algunos modos de realización, el resto fluorescente aceptador es un extintor. La estructura de horquilla se puede diseñar para que incluya una región de ácido nucleico que no es natural que puede incluir uno o más nucleótidos cambiados que no son parte de la secuencia natural, o puede incluir uno o más nucleótidos no naturales adicionales, que son nucleótidos añadidos a la secuencia natural, para producir la estructura de horquilla. De esta manera, una secuencia de ácido nucleico que normalmente no forma una estructura de horquilla en el extremo 3' se puede diseñar para que forme una horquilla, por ejemplo, alterando la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, cambiando uno o más nucleótidos en la secuencia hacia el extremo 3', o añadiendo uno o más nucleótidos a la secuencia de ácido nucleico en el extremo 3'.
Para detectar si el SNP de interés está presente o no en la diana de ácido nucleico en la muestra, se detecta el producto de amplificación por medio del marcador detectable que se libera de tanto la primera como segunda sondas de hidrólisis específica para SNP. Si el producto de amplificación se detecta por medio de las sondas de hidrólisis específicas para SNP bicatenarias, se indica la presencia de SNP. Si, de forma alternativa, el producto de amplificación no se detecta por medio de las sondas de hidrólisis específicas para SNP bicatenarias, no se indica la presencia de SNP. Por tanto, la presencia de los productos de amplificación (sentido y/o antisentido) es indicativa de la presencia del SNP en la diana de ácido nucleico diana, y la ausencia de los productos de amplificación es indicativa de la ausencia del SNP en la diana. de ácido nucleico diana.
Como se usa en el presente documento, el término "amplificar" se refiere al procedimiento de sintetizar moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una o ambas hebras de una molécula de ácido nucleico molde (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico diana para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o Mycobacterium tuberculosis (MTB) o virus de la hepatitis C (VHC)). Amplificar una molécula de ácido nucleico típicamente incluye desnaturalizar el ácido nucleico molde, hibridar cebadores oligonucleotídicos al ácido nucleico molde a una temperatura que está por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores oligonucleotídicos y alargar enzimáticamente a partir de cebadores oligonucleotídicos para generar un producto de amplificación. La amplificación típicamente requiere la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Taq Platinum®) y un tampón y/o cofactores apropiados para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCl2 y/o KCl).
El término "cebador" se usa en el presente documento como es conocido por los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3', por ejemplo, del oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre al que se pueden enlazar otros "nucleótidos" por una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster de 3' a 5', con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato, y con lo que se libera pirofosfato. En general, los cebadores se diseñan en base a en secuencias molde conocidas. Un cebador ceba la hebra sentido y el otro ceba la hebra complementaria (antisentido) del ADN o ADNc diana. La PCR se puede realizar en un ADN o ARN diana uniforme (es decir, dianas con la misma secuencia) o en ADN o ARN dianas mixtos (es decir, dianas con diferentes intrones flanqueados por secuencias conservadas). Para ADN/ARN mixtos (por ejemplo, que contienen heterogeneidad de secuencia), incluso los cebadores oligonucleotídicos emparejados erróneamente pueden funcionar en la reacción PCR si las secuencias de las dianas tienen suficiente complementariedad con los cebadores oligonucleotídicos emparejados erróneamente (es decir, cebadores oligonucleotídicos tolerantes).
El término "hibridación" se refiere a la hibridación de una o más sondas oligonucleotídicas a un producto de amplificación. Las condiciones de hibridación típicamente incluyen una temperatura que está por debajo de la temperatura de fusión de las sondas oligonucleotídicas pero que evita la hibridación no específica de las sondas oligonucleotídicas.
El término "actividad nucleasa de 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de hebras de ácido nucleico, con lo que se retiran los nucleótidos del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.
El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión del cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador oligonucleotídico y avanza en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Se han aislado polimerasas termoestables de Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no sean termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.
El término "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico que al mismo tiempo tiene la misma longitud que, y es exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.
El término "extensión" o "alargamiento" cuando se usa con respecto a ácidos nucleicos, se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótidos, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo terminal 3' de un ácido nucleico.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o por inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los programas BLAST, que se describen, por ejemplo, en Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search", Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996) "Applications of network BLAST server", Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSi-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 y Zhang et al. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation", Genome Res. 7:649-656.
Un "nucleótido modificado" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia de oligonucleótidos se remplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, una C5-metil-dC, una C5-etil-dC, una C5-metil-dU, una C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, una C5-propinil-dC, una C5-propinil-dU, una C7-propinil-dA, una C7-propinil-dG, una C5-propargilamino-dC, una C5-propargilamino-dU, una C7-propargilamino-dA, una C7-propargilamino-dG, una 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, una seudo-dU, un nitropirrol, un nitroindol, 2'-0-metil-ribo-U, 2'-0-metil-ribo-C, una N4-etil-dC, una N6-metil-dA y similares. En el presente documento se hace referencia a muchos otros nucleótidos modificados que se pueden sustituir en los oligonucleótidos de la presente divulgación o son conocidos de otro modo en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tf) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los correspondientes oligonucleótidos no modificados. Para ilustrar adicionalmente, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácido nucleico no específica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebadores o similares), incrementar el rendimiento de un amplicón diana pretendido y/o similares en algunos modos de realización. Se describen ejemplos de estos tipos de modificaciones en ácidos nucleicos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.001.611.
Como se usa en el presente documento, el término "nucleótido no natural", en el contexto de la estructura de horquilla hacia el extremo 3' de la sonda oligonucleotídica como se describe en el presente documento, se refiere a un nucleótido que no es un nucleótido natural en la secuencia natural, por ejemplo, en la secuencia natural. Dicho nucleótido no natural puede ser un nucleótido que se ha cambiado, por ejemplo, de A a G, o puede ser un nucleótido no natural añadido, por ejemplo, se puede insertar una G en la secuencia. La inclusión de los nucleótidos no naturales se puede diseñar en la secuencia natural para producir la estructura de horquilla, en otras palabras, la secuencia natural se puede genomanipular para forzar una estructura de horquilla donde una estructura de horquilla no se produciría de forma natural. La secuencia natural se puede diseñar para que incluya una estructura de horquilla hacia el extremo 3' cambiando o añadiendo al menos un nucleótido no natural en la secuencia natural, por ejemplo, se pueden incluir 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 nucleótidos no naturales en la secuencia natural para producir la estructura de horquilla. En algunos modos de realización, por ejemplo, se pueden incluir 1-7, 1-5, 1-3, 3-7, 3-5 o 5-7 nucleótidos no naturales en la secuencia natural para producir la estructura de horquilla. En determinados modos de realización, el/los nucleótido(s) no natural(es) también pueden comprender un nucleótido modificado.
Ácidos nucleicos diana y oligonucleótidos
La presente descripción proporciona procedimientos para detectar SNP en un ácido nucleico diana amplificando, por ejemplo, una porción de las secuencias de ácido nucleico diana, que pueden ser cualquier secuencia de ácido nucleico diana que se sabe o se sospecha que comprende uno o más SNP, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico diana, por ejemplo, de VIH, VHC o MTB que sea resistente a rifampicina.
Para la detección de SNP en la secuencia de ácido nucleico diana, se pueden preparar cebadores oligonucleotídicos y sondas oligonucleotídicas para amplificar las secuencias de ácido nucleico diana. Además, se pueden evaluar variantes funcionales en cuanto a la especificidad y/o sensibilidad por los expertos en la técnica usando procedimientos rutinarios. Las variantes funcionales representativas pueden incluir, por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones en los cebadores oligonucleotídicos y/o sondas oligonucleotídicas divulgados en el presente documento. Por ejemplo, se puede proporcionar una variante sustancialmente idéntica de los cebadores oligonucleotídicos o sondas oligonucleotídicas en la que la variante tenga al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con respecto a un cebador oligonucleotídico y sonda oligonucleotídica originales, o un complemento de los mismos.
Se puede identificar una variante funcionalmente activa de cualquiera de un cebador oligonucleotídico y/o sonda oligonucleotídica que proporcione una especificidad y sensibilidad similar o mayor en los procedimientos, kits o sondas de hidrólisis descritos actualmente en comparación con las respectivas secuencias originales.
Como se detalla anteriormente, un cebador oligonucleotídico (y/o sonda oligonucleotídica) se puede modificar químicamente, es decir, un cebador oligonucleotídico y/o sonda oligonucleotídica puede comprender un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. Una sonda oligonucleotídica (o un cebador oligonucleotídico) es, entonces, un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos de nucleótido") difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base o compuesto similar a base, un azúcar pentofuranosilo o un compuesto similar a azúcar pentofuranosilo, una porción fosfato o porción similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se puede enlazar un "marcador" a la porción de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede remplazar por, por ejemplo, una 7-desazapurina, con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo de nucleótido" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo de nucleósido") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera como se explica anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo de nucleótido").
Se pueden diseñar oligonucleótidos, incluyendo oligonucleótidos modificados y análogos de oligonucleótido, que amplifican las secuencias de ácido nucleico diana usando, por ejemplo, un programa informático, tal como OLIGo (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores oligonucleotídicos y la longitud de cada cebador oligonucleotídico (es decir, los cebadores oligonucleotídicos necesitan ser lo suficientemente largos para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que la fidelidad se reduzca durante la síntesis de oligonucleótidos). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos son de 8 a 50, en particular, de 10 a 40 o de 12 a 40 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 nucleótidos de longitud).
Además de un conjunto de cebadores oligonucleotídicos, los presentes procedimientos pueden usar sondas oligonucleotídicas bicatenarias para detectar la presencia o ausencia de SNP en una secuencia de ácido nucleico diana. El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que, por diseño o selección, contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridarse en restricciones predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) a "ácidos nucleicos diana".
Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", lo que significa que detecta el ácido nucleico diana.
En algunos modos de realización, las sondas oligonucleotídicas descritas se pueden marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, las sondas oligonucleotídicas se pueden marcar con un resto fluorescente donante, por ejemplo, un tinte fluorescente, y un correspondiente resto fluorescente aceptador, por ejemplo, un extintor. En el presente documento, el primer marcador interactivo se puede situar cerca del o en el extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, mientras que el segundo marcador interactivo se puede situar internamente o en el extremo 3' de la sonda oligonucleotídica. En algunos modos de realización, el primer marcador interactivo puede ser un resto fluoróforo enlazado covalentemente, por ejemplo, al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, mientras que el segundo marcador interactivo puede ser un resto fluorescente aceptador enlazado covalentemente, por ejemplo, internamente o en el extremo 3'. En otros modos de realización, el primer marcador interactivo puede ser un resto fluorescente aceptador enlazado covalentemente, por ejemplo, al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, mientras que el segundo marcador interactivo puede ser un resto fluoróforo enlazado, por ejemplo, internamente o en el extremo 3'. En algunos modos de realización, el resto fluorescente aceptador es un extintor.
Se puede realizar el diseño de los oligonucleótidos que se van a usar como sondas de hidrólisis TaqMan de una manera similar al diseño de los cebadores oligonucleotídicos. Los modos de realización de la presente divulgación pueden usar una sonda oligonucleotídica bicatenaria para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, la sonda oligonucleotídica puede incluir al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Como con los cebadores oligonucleotídicos, las sondas oligonucleotídicas normalmente tienen temperaturas de fusión similares, y la longitud de cada sonda oligonucleotídica debe ser suficiente para que se produzca la hibridación específica de secuencia, pero no tan largos como para que la fidelidad se reduzca durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas tienen, en general, 40 nucleótidos o menos y son, en particular, de entre 12 a 40, de 15 a 40 y de 15 a 30 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) nucleótidos de longitud.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las pat. de EE. UU. n.os 4.683.202; 4.683.195; 4.800.159; y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. Las pat. de EE. UU. n.os 5.210.015; 5.487.972; 5.804.375; 5.804.375; 6.214.979; y 7.141.377 divulgan técnicas con TaqMan® y de PCR ultrarrápida. La PCR típicamente emplea dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores oligonucleotídicos útiles en los modos de realización descritos incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como puntos de iniciación de la síntesis de ácidos nucleicos dentro de las secuencias de ácido nucleico diana. Un cebador oligonucleotídico se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador oligonucleotídico es preferentemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero el cebador oligonucleotídico puede ser bicatenario. Los cebadores oligonucleotídicos bicatenarios se desnaturalizan en primer lugar, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento de desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento.
Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de hebras se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado que incluya medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento de separación de las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal tampón y de la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se desnaturalizan, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo que depende de los rasgos característicos de la reacción, tal como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización típicamente se realiza durante aproximadamente 30 s a 4 min (por ejemplo, de 1 min a 2 min 30 s, o 1,5 min).
Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador oligonucleotídico a su secuencia diana en las moléculas de ácido nucleico diana. La temperatura para la hibridación es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). A continuación, se ajusta la mezcla de reacción a una temperatura a la que se promueve u optimiza la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador oligonucleotídico hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador oligonucleotídico que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía, en general, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, de aproximadamente 30 s a aproximadamente 4 min; de aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min; de aproximadamente 1 min 30 s a aproximadamente 2 min).
Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico diana, tal como ARN o ADN (ADNc). No se necesita purificar el ácido nucleico molde; puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, tal como el ácido nucleico diana contenido en células humanas. Las moléculas de ácido nucleico diana se pueden extraer de una muestra biológica por técnicas rutinarias, tales como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications (Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se pueden obtener ácidos nucleicos a partir de una serie de fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales, incluyendo bacterias, levaduras, virus, orgánulos u organismos superiores, tales como plantas o animales.
Los cebadores oligonucleotídicos se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reacción que inducen la extensión del cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de la cadena incluyen, en general, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 0,5-1,0 pg de ADN molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de Taq polimerasa y DMSO al 10 %). Las reacciones contienen normalmente de 150 a 320 pM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP, dGTP o uno o más análogos de los mismos.
Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación, hibridación y alargamiento de hebras se pueden repetir con tanta frecuencia como sea necesario para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a las moléculas de ácido nucleico diana. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores oligonucleotídicos, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana lo suficiente para la detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir hasta 40, 60 o incluso 100 veces.
Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)
La tecnología de FRET (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en un concepto de que cuando un resto fluorescente donante y un correspondiente resto fluorescente aceptador se sitúan a una determinada distancia entre sí, tiene lugar una transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o de otro modo detectar y/o cuantificar. El donante típicamente transfiere la energía al aceptador cuando se excita el donante por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptador típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. En determinados sistemas, se puede transferir energía no fluorescente entre restos donantes y aceptadores, por medio de biomoléculas que incluyen restos donantes sustancialmente no fluorescentes (véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 7.741.467).
En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto fluorescente donante y un correspondiente extintor, que puede ser fluorescente o no, y que disipa la energía transferida en una forma distinta de la luz. Cuando la sonda oligonucleotídica está inalterada, la transferencia de energía típicamente se produce entre los dos restos fluorescentes, de modo que se extingue la emisión fluorescente del resto fluorescente donante. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, una sonda oligonucleotídica unida a un producto de amplificación se escinde por la actividad nucleasa de 5' a 3', por ejemplo, de una Taq polimerasa, de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante ya no se extingue. Se describen sondas oligonucleotídicas ejemplares para este propósito, por ejemplo, en las pat. de EE. UU. n.os 5.210.015; 5.994.056; y 6.171.785. Los pares donante-aceptador usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para realizar un seguimiento de la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. Se puede llevar a cabo la excitación para iniciar la transferencia de energía, o para permitir la detección directa de un fluoróforo, con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.
Como se usa en el presente documento con respecto a los restos fluorescentes donantes y correspondientes aceptadores, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptador que tiene un espectro de absorbancia que se solapa con el espectro de emisión del resto fluorescente donante. El máximo de longitud de onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptador debe ser al menos 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donante. En consecuencia, se puede producir una transferencia de energía no radiativa eficaz entre los mismos.
Los restos donantes y correspondientes aceptadores fluorescentes se eligen, en general, para (a) la transferencia de energía de Forster de alta eficacia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) un desplazamiento de la emisión lo más lejos posible en la porción roja del espectro visible (>600 nm); y (d) un desplazamiento de la emisión a una mayor longitud de onda que la emisión fluorescente del agua de Raman producida por excitación en la longitud de onda de excitación del donante. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donante que tenga su máximo de excitación cerca de una línea láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y un buen solapamiento de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del correspondiente resto fluorescente aceptador. Se puede elegir un correspondiente resto fluorescente aceptador que tenga un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, un buen solapamiento de su excitación con la emisión del resto fluorescente donante y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm).
Los restos fluorescentes donantes representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptadores en la tecnología de FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, 9-acridinisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenbutirato de succinimidilo y derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptadores representativos, que dependen del resto fluorescente donante usado, incluyen LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonil lisamina rodamina B, tetrametilrrodamina-isotiocianato, rodamina x-isotiocianato, eritrosina-isotiocianato, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donantes y aceptadores, por ejemplo, a partir de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).
Los restos fluorescentes donantes y aceptadores se pueden enlazar al oligonucleótido de sonda apropiado por medio de un brazo conector. La longitud de cada brazo conector es importante, ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donantes y aceptadores. La longitud de un brazo conector para el propósito de la presente divulgación es la distancia en Angstroms (A) desde la base nucleotídica al resto fluorescente. En general, un brazo conector es de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. El brazo conector puede ser de la clase descrita en el documento WO 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para enlazar brazos conectores a una base nucleotídica particular, y también para enlazar restos fluorescentes a un brazo conector.
Se puede combinar un resto fluorescente aceptador, tal como un LC Red 640, con un oligonucleótido que contenga un conector amino (por ejemplo, C6-aminofosforamiditas disponibles de ABI (Foster City, Calif.) o Glen Research (Sterling, VA)) para producir, por ejemplo, un oligonucleótido marcado con LC Red 640. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donante, tal como fluoresceína, a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de fluoresceína-éster de NHS, tales como CX-fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, Calif.)) o 3'-amino-CPG, que requieren el acoplamiento de fluoresceína-éster de NHS después de la síntesis de oligonucleótidos.
Detección de un SNP en un ácido nucleico diana
La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un SNP en un ácido nucleico diana en un producto biológico. Los procedimientos proporcionados evitan problemas de contaminación de las muestras, negativos falsos y positivos falsos. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una porción de la molécula de ácido nucleico diana de una muestra usando un par de cebadores oligonucleotídicos, y una etapa de detección fluorescente que utiliza sondas de hidrólisis específicas para SNP bicatenarias en las que, en algunos modos de realización, una hebra de las sondas oligonucleotídicas bicatenarias incluye una estructura de horquilla hacia el extremo 3'. Se pueden realizar múltiples etapas de ciclado, preferentemente en un termociclador. Los procedimientos descritos se pueden realizar usando los cebadores oligonucleotídicos y sondas oligonucleotídicas para detectar la presencia del SNP en un ácido nucleico diana en la muestra.
Como se describe en el presente documento, se pueden detectar productos de amplificación usando sondas de hidrólisis e hibridación marcadas que aprovechan la tecnología de FRET. Un formato de FRET utiliza la tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, y de ahí la presencia o ausencia del ácido nucleico diana. La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hidrólisis e hibridación monocatenaria marcada, por ejemplo, con un tinte fluorescente y un extintor, que puede ser fluorescente o no. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente es, en general, una molécula extintora. Durante la etapa de hibridación de la reacción PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad nucleasa de 5' a 3', por ejemplo, de la Taq polimerasa durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) usa la tecnología TaqMan® y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia del ácido nucleico diana en la muestra.
En general, la presencia de FRET indica la presencia del SNP en un ácido nucleico diana en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia del SNP en la muestra. Sin embargo, la inadecuada obtención de muestras, los retrasos debidos al transporte, las inapropiadas condiciones de transporte o el uso de determinados hisopos de obtención (varilla de alginato de calcio o de aluminio) son, en conjunto, las condiciones que pueden afectar al éxito y/o la exactitud del resultado de la prueba. Usando los procedimientos divulgados en el presente documento, la detección de FRET, por ejemplo, en 45 etapas de ciclado es indicativa de la presencia de un SNP en un ácido nucleico diana en una muestra.
Las muestras biológicas representativas que se pueden usar en la práctica de los procedimientos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, frotis dérmicos, frotis nasales, frotis en heridas, hemocultivos, piel e infecciones de partes blandas. Son conocidos procedimientos de obtención y almacenamiento de muestras biológicas por los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, por procedimientos y/o kits de extracción de ácido nucleico conocidos en la técnica) para liberar ácido nucleico diana o, en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de la reacción PCR y los oligonucleótidos apropiados.
Dentro de cada tanda de termociclador, también se pueden ciclar muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico diana (distinto de los productos de amplificación descritos de genes diana) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción plasmídica que contenga las moléculas de ácido nucleico diana. Dicho control plasmídico se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una tanda de muestras separada lado a lado con las muestras de los pacientes usando los mismos cebadores oligonucleotídicos y sonda oligonucleotídica que se usan para la detección de la diana pretendida. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Cada tanda de termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carezca de ADN molde diana. El control negativo puede medir la contaminación. Esto garantiza que el sistema y los reactivos no den lugar a una señal positiva falsa. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores oligonucleotídicos de hibridarse con especificidad de secuencia e iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas oligonucleotídicas de hibridarse con especificidad de secuencia y para que se produzca la FRET.
En un modo de realización, los procedimientos incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, se describe un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa en las pat. de EE. UU. n.os 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una tanda de termociclador y la siguiente.
Se pueden usar procedimientos de PCR convencionales junto con tecnología de FRET para poner en práctica los procedimientos de la presente divulgación. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR ultrarrápida como se usa en la tecnología de LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.
El LightCycler® se puede hacer funcionar usando una estación de trabajo con PC y puede utilizar un sistema operativo Windows NT. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede presentar las señales de fluorescencia ultrarrápido inmediatamente después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una presentación cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclo para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para un análisis posterior.
Se entiende que los modos de realización de la presente divulgación no se limitan por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.
Artículos de fabricación/kits
La presente divulgación proporciona además artículos de fabricación o kits para detectar un SNP en un ácido nucleico diana. Un artículo de fabricación puede incluir cebadores oligonucleotídicos y sondas oligonucleotídicas bicatenarias usadas para detectar el SNP como se describe en el presente documento, conjuntamente con materiales de envasado adecuados. Los cebadores oligonucleotídicos y las sondas oligonucleotídicas representativos para la detección del SNP se pueden hibridar a las moléculas de ácido nucleico diana. Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. En el presente documento se divulgan procedimientos de diseño de cebadores oligonucleotídicos y sondas oligonucleotídicas, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores oligonucleotídicos y sondas oligonucleotídicas que amplifican y se hibridan a un SNP en moléculas de ácido nucleico diana de ácido nucleico diana.
Los artículos de fabricación también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas oligonucleotídicas o, de forma alternativa, las sondas oligonucleotídicas suministradas con el kit se pueden marcar. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donante y/o uno aceptador para marcar las sondas oligonucleotídicas específicas para SNP. Anteriormente se proporcionan ejemplos de restos fluorescentes donantes y correspondientes restos fluorescentes aceptadores para FRET adecuados.
Los artículos de fabricación también pueden contener un prospecto del envase o ficha técnica del envase que tenga instrucciones en el mismo para usar los cebadores oligonucleotídicos y las sondas oligonucleotídicas para detectar un SNP en un ácido nucleico diana en una muestra. Los artículos de fabricación pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasa, cofactores o agentes para prevenir la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento. Los modos de realización de la materia objeto divulgada se describirán además en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
Se proporcionan los siguientes ejemplos y figuras para ayudar al entendimiento de la presente invención, exponiéndose su verdadero alcance en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo I
Detección de SNP con TaqMan® para MTB-RIF
La tuberculosis (TB) es un trastorno pulmonar grave provocado comúnmente por Mycobacterium tuberculosis (MTB) u otros miembros del complejo MTB. Las cepas de MTB resistentes a fármacos están experimentando una expansión y una forma, en particular, peligrosa de tuberculosis resistente a fármacos es la tuberculosis multirresistente (MDR-TB). La MDR-TB se define como la MTB que ha desarrollado resistencia a al menos dos de los fármacos antituberculosos más comúnmente usados, rifampicina e isoniacida. Aproximadamente un 83-87 % de la resistencia a rifampicina está provocada por un polimorfismo mononucleotídico dentro de la región determinante de la resistencia a rifampicina (RRDR) de 81 pares de bases del gen rpoB que codifica la subunidad p de la ARN polimerasa.
Se diseñaron sondas de hidrólisis TaqMan® bicatenarias específicas para mutante con un fluoróforo en el extremo 5' y un extintor interno para cada hebra de sonda. Se diseñó cada una de las hebras sentido y antisentido de las sondas oligonucleotídicas para que fuera específica para SNP, es decir, que se emparejara perfectamente con la versión mutante sentido y antisentido de la diana que contiene el SNP de interés, y se emparejara erróneamente de forma similar con la versión natural de la diana. Además, en algunos modos de realización se introdujeron bases/bases adicionales en el extremo 3' de la sonda oligonucleotídica que darían como resultado una estructura de horquilla hacia el extremo 3'. Se diseñaron sondas oligonucleotídicas de modo que el emparejamiento erróneo entre la WT y MT se encuentre entre el indicador y el extintor cerca del extremo 5' en cada hebra de las sondas. Cuando la sonda TaqMan® está inalterada, el indicador y extintor permanecen cerca entre sí, lo que previene la emisión de cualquier fluorescencia.
El cebador oligonucleotídico y la sonda TaqMan® se hibridan a la hebra de ADN complementario después de la desnaturalización durante la PCR. Después de la hibridación y durante la fase de extensión de la PCR, la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ADN polimerasa escinde la sonda oligonucleotídica que separa los tintes indicador y extintor y se detecta la fluorescencia. En los modos de realización que incluyen la estructura de horquilla, la estructura de horquilla cerca del extremo 3' de la sonda oligonucleotídica retrasa la hibridación de la mitad 3' de la sonda oligonucleotídica al molde y, por tanto, ayuda en la discriminación de la diana WT y MT en base a la diferencia de un único par de bases o emparejamiento erróneo. La mitad 5' de la sonda TaqMan® con horquilla para MT se hibridará más eficazmente al molde de ADN de plásmido MT en comparación con el molde WT. Cuando la sonda oligonucleotídica específica para MT encuentra la diana WT, el único emparejamiento erróneo con respecto a la diana WT prevendrá la hibridación y la escisión de la sonda y se detectará poca o ninguna fluorescencia.
Materiales y procedimientos
Diana de ADN: plásmidos naturales (WT) y mutantes (MT)
ADN de plásmidos MT y WT: las entradas sometidas a prueba que varían de 1 e6 cp/PCR a 10 cp/PCR mostradas en la tabla I que muestran una porción de la región determinante de la resistencia a rifampicina (RRDR) del gen rpoB en Mycobacterium tuberculosis.
TABLA I: ADN de plásmido natural y mutante
Figure imgf000013_0001
Oligonucleótidos específicos para MTB: Un conjunto de cebadores oligonucleotídicos directos e inversos para plásmidos tanto mutantes como naturales
Se muestran sondas TaqMan® bicatenarias específicas para mutante en la tabla II
TABLA II: Sondas oligonucleotídicas específicas para SNP sentido y antisentido
Figure imgf000013_0002
Designaciones: E significa treo-HEX; P significa fosfato; Q significa extintor BHQ-2; L significa propinil-dC; U significa propinil-dU; las letras doblemente subrayadas son el sitio de los SNP; y las letras subrayadas en negrita son bases que se cambian o se añaden para formar una horquilla.
Plataformas: Sistema LightCycler® 480
Se realizaron amplificaciones por PCR ultrarrápida usando un conjunto de cebadores directos e inversos y sondas TaqMan® específicas para SNP bicatenarias. Se sometió a prueba el ADN de plásmido natural o mutante a 1e6, 1e2, 1e3 y 1e1 cp/PCR. El volumen de la reacción PCR fue de 50 ul, y los componentes de la mezcla maestra y las condiciones del perfil térmico se enumeran a continuación. Las amplificaciones se realizaron en la plataforma LC480 y las curvas de crecimiento con PCR se analizaron usando el programa informático de análisis de datos ATF. Los resultados se muestran en las figuras de 1 a 6.
Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle para propósitos de claridad y entendimiento, quedará claro para un experto en la técnica, a partir de una lectura de la presente divulgación, que se pueden realizar diversos cambios de forma y detalle. Por ejemplo, se pueden usar todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente en diversas combinaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para detectar un polimorfismo mononucleotídico (SNP) en un ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
- realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico para producir un producto de amplificación que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido si está presente algún ácido nucleico diana en la muestra;
- realizar una etapa de hibridación que comprende proporcionar el producto de amplificación con una sonda oligonucleotídica bicatenaria que comprende:
- una primera sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico complementaria a una primera región que contiene SNP de la hebra sentido, comprendiendo la primera sonda de hidrólisis específica para SNP un primer marcador interactivo y un segundo marcador interactivo, un primer extremo 5' y un primer extremo 3'; y
- una segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una cuarta secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de la hebra antisentido, la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende un tercer marcador interactivo y un cuarto marcador interactivo, un segundo extremo 5' y un segundo extremo 3'; y
- detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación se determina por la detección de un marcador detectable liberado de dicha primera y/o dicha segunda sonda de hidrólisis específica para SNP y es indicativa de la presencia del SNP en el ácido nucleico diana, y en el que la ausencia de un marcador detectable liberado de dicha primera y/o dicha segunda sonda de hidrólisis específica para SNP indica la ausencia del producto de amplificación y la ausencia del SNP en el ácido nucleico diana,
en el que el primer marcador interactivo comprende un primer resto fluorescente donante en el primer extremo 5', y el segundo marcador interactivo comprende un primer correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del primer resto fluorescente donante en la primera sonda de hidrólisis específica para SNP, y en el que el tercer marcador interactivo comprende un segundo resto fluorescente donante en el segundo extremo 5', y el cuarto marcador interactivo comprende un segundo correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del segundo resto fluorescente donante en la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP comprende una estructura de horquilla hacia el segundo extremo 3', comprendiendo la estructura de horquilla una región de secuencia de ácido nucleico no natural que comprende uno o más nucleótidos adicionales para producir la estructura de horquilla.
3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el primer resto fluorescente aceptador es un primer extintor y en el que el segundo resto fluorescente aceptador es un segundo extintor.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la primera y/o la segunda secuencia de ácido nucleico de los cebadores oligonucleotídicos y/o la tercera y/o la cuarta secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis comprenden al menos un nucleótido modificado.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico de los cebadores oligonucleotídicos y/o la tercera y la cuarta secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis tienen 40 nucleótidos o menos.
7. Un kit para detectar un SNP en un ácido nucleico diana en una muestra, que comprende:
- un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico específica para producir un producto de amplificación si el ácido nucleico diana está presente en la muestra, comprendiendo el producto de amplificación una hebra sentido y una hebra antisentido de un ácido nucleico diana; y
- una sonda oligonucleotídica bicatenaria que comprende:
- una primera sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico complementaria a una primera región que contiene SNP de la hebra sentido del ácido nucleico diana, comprendiendo la primera sonda de hidrólisis específica para SNP un primer marcador interactivo y un segundo marcador interactivo, un primer extremo 5' y un primer extremo 3'; y
- una segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una cuarta secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de la hebra antisentido del ácido nucleico diana, comprendiendo la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP un tercer marcador interactivo y un cuarto marcador interactivo, un segundo extremo 5' y un segundo extremo 3',
en el que el primer marcador interactivo comprende un primer resto fluorescente donante en el primer extremo 5', y el segundo marcador interactivo comprende un primer correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del primer resto fluorescente donante en la primera sonda de hidrólisis específica para SNP, y en el que el tercer marcador interactivo comprende un segundo resto fluorescente donante en el segundo extremo 5', y el cuarto marcador interactivo comprende un segundo correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del segundo resto fluorescente donante en la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP.
8. El kit de la reivindicación 7, en el que la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP comprende una estructura de horquilla hacia el segundo extremo 3', comprendiendo la estructura de horquilla una región de secuencia de ácido nucleico no natural que comprende uno o más nucleótidos adicionales para producir la estructura de horquilla.
9. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que el primer resto fluorescente aceptador es un primer extintor y en el que el segundo resto fluorescente aceptador es un segundo extintor.
10. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende además una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'.
11. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la primera y segunda secuencias de ácido nucleico de los cebadores oligonucleotídicos y/o la tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis tienen 40 nucleótidos o menos.
12. Un oligonucleótido bicatenario para detectar un SNP si el SNP está presente en un ácido nucleico diana, comprendiendo la sonda bicatenaria:
- una primera sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una primera secuencia de ácido nucleico complementaria a una primera región que contiene SNP de una hebra sentido del ácido nucleico diana, comprendiendo la primera sonda de hidrólisis específica para SNP un primer marcador interactivo y un segundo marcador interactivo, un primer extremo 5' y un primer extremo 3'; y
- una segunda sonda de hidrólisis específica para SNP que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico complementaria a una región que contiene SNP de una hebra antisentido del ácido nucleico diana, comprendiendo la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP un tercer marcador interactivo y un cuarto marcador interactivo, un segundo extremo 5' y un segundo extremo 3',
en el que el primer marcador interactivo comprende un primer resto fluorescente donante en el primer extremo 5', y el segundo marcador interactivo comprende un primer correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del primer resto fluorescente donante en la primera sonda de hidrólisis específica para SNP, y en el que el tercer marcador interactivo comprende un segundo resto fluorescente donante en el segundo extremo 5', y el cuarto marcador interactivo comprende un segundo correspondiente resto fluorescente aceptador dentro de no más de 8 nucleótidos del segundo resto fluorescente donante en la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP.
13. La sonda oligonucleotídica bicatenaria de la reivindicación 12, en la que la segunda sonda de hidrólisis específica para SNP comprende una estructura de horquilla hacia el segundo extremo 3', comprendiendo la estructura de horquilla una región de secuencia de ácido nucleico no natural que comprende uno o más nucleótidos adicionales para producir el estructura de horquilla.
14. La sonda oligonucleotídica bicatenaria de una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en la que el primer resto fluorescente aceptador es un primer extintor y en la que el segundo resto fluorescente aceptador es un segundo extintor.
15. La sonda oligonucleotídica bicatenaria de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que la primera y segunda secuencias de ácido nucleico de las sondas de hidrólisis tienen 40 nucleótidos o menos.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9441268B2 (en) * 2014-11-26 2016-09-13 Roche Molecular Systems, Inc. Detecting single nucleotide polymorphism using overlapping hydrolysis probes
CN107119122B (zh) * 2017-05-08 2020-07-07 苏州先达基因科技有限公司 一种单核苷酸多态性检测用试剂盒及检测方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2467460A1 (en) * 2001-11-19 2003-05-30 Parallele Bioscience, Inc. Multiplex oligonucleotide addition and target amplification
US8076067B2 (en) 2006-08-15 2011-12-13 Genetag Technology, Inc. Probe-antiprobe compositions and methods for DNA or RNA detection
CN101935697B (zh) * 2010-04-16 2015-11-25 中生方政生物技术有限公司 用于核酸序列检测的方法和试剂盒
CN102373267A (zh) * 2010-08-09 2012-03-14 北京泰格瑞分子检验有限公司 一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光pcr
DE102011078342A1 (de) 2011-06-29 2013-01-03 Aj Innuscreen Gmbh Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit
BR102014005635B1 (pt) * 2013-03-12 2022-04-19 Dow Agrosciences Llc Método para identificação de pelo menos um determinante de resistência à phytophthora em uma planta de soja
US9297033B2 (en) 2013-12-13 2016-03-29 Roche Molecular Systems, Inc. Detecting single nucleotide polymorphism using hydrolysis probes with 3′ hairpin structure
US9441268B2 (en) * 2014-11-26 2016-09-13 Roche Molecular Systems, Inc. Detecting single nucleotide polymorphism using overlapping hydrolysis probes

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