ES2886602T3 - Procedimientos y kits para unir entre sí ácidos nucleicos fragmentados - Google Patents

Abstract

Un procedimiento homogéneo para unir entre sí ácidos nucleicos fragmentados, que comprende las etapas de: - realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha que comprende un ácido nucleico diana fragmentado con: - un par de cebadores externos que comprenden una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico para producir un primer producto de amplificación que comprende una primera hebra sentido y una primera hebra antisentido si algún ácido nucleico diana está presente en la muestra; y - un par de cebadores internos complementarios entre sí que comprenden una tercera secuencia de ácido nucleico y una cuarta secuencia de ácido nucleico, la tercera secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra antisentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra sentido de un segundo producto de amplificación y la cuarta secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra sentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra antisentido del segundo producto de amplificación; y - generar un ácido nucleico diana de longitud completa: - hibridando una primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido con una segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido, en el que la primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido ceba la extensión de la primera hebra sentido sobre la primera hebra antisentido, y la segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido ceba la extensión de la primera hebra antisentido sobre la primera hebra sentido; e - hibridando una tercera región de extremo 3' de la segunda hebra sentido con una cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido, en el que la tercera región de extremo 3' de la segunda hebra sentido ceba la extensión de la segunda hebra sentido sobre la segunda hebra antisentido, y la cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido ceba la extensión de la segunda hebra antisentido sobre la segunda hebra sentido, en el que todas las etapas se realizan de manera homogénea.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y kits para unir entre sí ácidos nucleicos fragmentados

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere al campo de amplificación de ácidos nucleicos y, en particular, a la unión de porciones fragmentadas de ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

La extracción de ADN de tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPE) sigue siendo una dificultad debido a que el formaldehído, el componente eficaz de formol, da lugar a la generación de reticulación entre ácidos nucleicos y proteínas, y, adicionalmente provoca que los ácidos nucleicos se fragmenten debido a las condiciones del procedimiento de fijación, por ejemplo, el pH extremadamente bajo (Lin et al., Anal Biochem., 395(2): 265-267 (2009)). Además, la detección de ADN libre de células (ADNlc) circulante y ARN en sangre humana, que ha generado mucho interés por su uso en el llamado enfoque de biopsia líquida, tiene determinadas limitaciones, incluyendo la naturaleza fragmentada de dicho ADN, siendo el tamaño promedio de aproximadamente 160 a 180 pb (Suzuki et al., Clinica Chimica Acta, 387, 55-58 (2008)).

Para los ensayos de diagnóstico del cáncer basados en PCR, la limitación de tamaño para el ADN fragmentado puede no ser un problema para puntos calientes mutacionales como V600 de BRAF, G12/G13 de KRAS o E542/E545/E546 de PIK3CA donde las mutaciones se agrupan en pocos codones cercanos, pero es una dificultad para otros como el exón 20 de EGFR, donde las mutaciones abarcan 25 codones. La abundancia de ADN intacto en cualquier muestra también puede ser insuficiente para la detección exacta y sensible de múltiples sitios mutacionales, por lo que es deseable un procedimiento de enriquecimiento previo de diana antes de la detección de la mutación. Son conocidos procedimientos para el enriquecimiento previo de ácidos nucleicos diana, pero estos procedimientos implican múltiples etapas de adición de reactivo o son procedimientos para la amplificación lineal de las hebras diana.

Heckman et al. (Nature Protocols, vol. 2, n.° 4, 1 de abril de 2007, páginas 924-93) divulgan un procedimiento para la generación de genes mutantes o quiméricos por mutagénesis dirigida a sitio, pero no divulgan un procedimiento para unir entre sí ácidos nucleicos fragmentados. En Dahnse et al. (Anticancer Research, 1 de enero de 2008, páginas 2265-2270) se divulgan procedimientos para identificar mutaciones puntuales de EGFR específicas usando cebadores específicos de alelo. Sin embargo, los cebadores internos usados en estos procedimientos no son autocomplementarios y no se hibridan entre sí. Castellanos-Rizaldos et al. (Journal of Molecular Diagnostics, vol. 17, n.° 3, 1 de mayo de 2015, páginas 284-292) divulgan procedimientos de ddPCR para la detección de mutaciones en el ADN de bajo nivel usando COLD-PCR y dos sondas fluorescentes para suprimir secuencias naturales y amplificación preferencial de gotitas que contienen mutaciones. Sin embargo, Castellanos-Rizaldos et al. no ahondan en la cuestión del ARN/ADN/ADNlc fragmentado ni proporcionan la utilización de un par de cebadores internos complementarios entre sí para generar un ácido nucleico diana de longitud completa a partir de ARN/ADN/ADNlc fragmentado de manera homogénea.

La presente divulgación aborda procedimientos de dicho enriquecimiento previo de diana de una manera exponencial y homogénea sin la necesidad de múltiples etapas discretas y reactivos. Por lo tanto, es deseable un procedimiento que pueda juntar entre sí fragmentos de ácido nucleico cortos solapantes y, por tanto, sirva como molde para la detección por PCR en dirección 3', lo que aborda la presente divulgación.

Sumario de la invención

En un aspecto, se proporciona un procedimiento homogéneo para unir entre sí ácidos nucleicos fragmentados, que incluye realizar una etapa de amplificación que incluye poner en contacto una muestra que se sospecha que incluye un ácido nucleico diana fragmentado con: un par de cebadores externos que incluyen una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico para producir un primer producto de amplificación que incluye una primera hebra sentido y una primera hebra antisentido si algún ácido nucleico diana está presente en la muestra; y un par de cebadores internos complementarios entre sí que incluyen una tercera secuencia de ácido nucleico y una cuarta secuencia de ácido nucleico, la tercera secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra antisentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra sentido de un segundo producto de amplificación y la cuarta secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra sentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra antisentido del segundo producto de amplificación; y generar un ácido nucleico diana de longitud completa: hibridando una primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido con una segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido, en el que la primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido ceba la extensión de la primera hebra sentido sobre la primera hebra antisentido, y la segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido ceba la extensión de la primera hebra antisentido sobre la primera hebra sentido; e hibridando una tercera región de extremo 3' de la segunda hebra sentido con una cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido, en el que la tercera región de extremo 3' de la segunda hebra sentido ceba la extensión de la segunda hebra sentido sobre la segunda hebra antisentido, y la cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido ceba la extensión de la segunda hebra antisentido sobre la segunda hebra sentido, en el que todas las etapas se realizan de manera homogénea. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación de longitud completa con una o más sondas detectables y detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación de longitud completa, en la que la presencia del producto de amplificación de longitud completa es indicativa de la presencia del ácido nucleico diana en la muestra y en la que la ausencia del producto de amplificación de longitud completa es indicativa de la ausencia del ácido nucleico diana en la muestra. En algunos modos de realización, la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación de longitud completa con una de las una o más sondas detectables que comprenden una quinta secuencia de ácido nucleico que está marcada con un resto fluorescente donante y un resto aceptor correspondiente, y la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donante y el resto aceptor de la sonda, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia del ácido nucleico diana en la muestra. En algunos modos de realización, dicha etapa de amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'. En algunos modos de realización, el resto fluorescente donante y el resto aceptor correspondiente están separados en no más de 8 nucleótidos entre sí en la sonda. En algunos modos de realización, el resto aceptor es un extintor. En algunos modos de realización, la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación de longitud completa con una de las una o más sondas detectables que comprenden una sonda molecular que comprende un tinte de unión a ADN bicatenario que tras la interacción con un ácido nucleico bicatenario del producto de amplificación de longitud completa emite una señal de fluorescencia y la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de resonancia de fluorescencia por un análisis de la curva de fusión, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia del ácido nucleico diana en la muestra. En algunos modos de realización, la concentración relativa del par de cebadores internos complementarios entre sí es igual a o menor que la concentración del par de cebadores externos. En algunos modos de realización, la etapa de amplificación comprende además poner en contacto la muestra que se sospecha que comprende un ácido nucleico diana fragmentado con un segundo par de cebadores internos complementarios entre sí. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además al menos un segundo par de cebadores internos complementarios entre sí (por ejemplo, segundo, tercer, cuarto par de cebadores internos complementarios entre sí). En algunos modos de realización, la muestra que se sospecha que comprende el ácido nucleico diana fragmentado es una muestra biológica. En determinados modos de realización, la muestra biológica se selecciona de muestras respiratorias, muestras fecales, muestras de sangre, hisopados dérmicos, hisopados nasales, hisopados en heridas, hemocultivos, piel o infecciones de partes blandas. En algunos modos de realización, la muestra que se sospecha que comprende el ácido nucleico diana fragmentado es una muestra clínica. En determinados modos de realización, la muestra clínica se selecciona de tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPET) o plasma.

También se divulga un kit para unir entre sí ácidos nucleicos diana fragmentados. El kit puede incluir un par de cebadores externos que incluyen una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico configuradas para hibridarse a la hebra sentido y la antisentido del ácido nucleico diana y para producir un primer producto de amplificación del ácido nucleico diana que incluye una primera hebra sentido y una primera hebra antisentido si alguno de los ácidos nucleicos diana está presente en la muestra; y un par de cebadores autocomplementarios internos que incluyen una tercera secuencia de ácido nucleico y una cuarta secuencia de ácido nucleico, la tercera secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra antisentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra sentido de un segundo producto de amplificación y la cuarta secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra sentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra antisentido del segundo producto de amplificación. También se divulga que el kit comprende además una quinta secuencia de ácido nucleico marcada de forma detectable que comprende un resto fluorescente donante y un resto aceptor correspondiente. También se divulga que el resto aceptor es un extintor.

También se divulga que el kit comprende además una ácido nucleico polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa). También se divulga que el kit comprende además nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa. También se divulga que al menos uno de los primer, segundo, tercer, cuarto y quinto oligonucleótidos comprende al menos un nucleótido modificado. También se divulga que los primer, segundo y tercer oligonucleótidos tienen 40 nucleótidos o menos. También se divulga que el par de cebadores externos y el par de cebadores autocomplementarios internos se proporcionan cada uno en un recipiente. También se divulga que el par de cebadores externos y el par de cebadores autocomplementarios internos se proporcionan comúnmente en un recipiente. En el presente documento, la concentración relativa del par de cebadores internos autocomplementarios puede ser igual a o menor que la concentración del par de cebadores externos. También se divulga que el kit comprende además un segundo par de cebadores internos autocomplementarios. También se divulga que el kit comprende además al menos un segundo par de cebadores internos autocomplementarios (por ejemplo, segundo, tercer, cuarto par de cebadores internos autocomplementarios). En el presente documento, las concentraciones relativas de los pares de cebadores internos autocomplementarios pueden ser iguales a o menores que la concentración del par de cebadores externos.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente materia objeto, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos solo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Los detalles de uno o más modos de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La FIGURA 1 muestra un diagrama esquemático de utilización de un par de cebadores externos y un par de cebadores internos autocomplementarios para generar diversos productos intermedios.

La FIGURA 2 muestra un diagrama esquemático de utilización de un par de cebadores externos y un par de cebadores internos autocomplementarios para generar diversos productos intermedios.

La FIGURA 3 muestra un diagrama esquemático de utilización de los productos de amplificación producidos por el par de cebadores externos y el par de cebadores internos autocomplementarios para generar el producto (cosido) de longitud completa por los dos productos intermedios de la reacción PCR.

La FIGURA 4 muestra un diagrama esquemático del exón 20 de EGFR y los reactivos usados en el ejemplo I.

La FIGURA 5 muestra una tabla del diseño experimental para diversas cantidades de moldes mezclados con diversas cantidades de cebadores externos.

La FIGURA 6 muestra una tabla del diseño experimental para la valoración de una amplia gama de cebadores internos autocomplementarios (cebadores de costura) y cebadores externos.

La FIGURA 7 muestra un gel de agarosa que incluye diversas reacciones PCR basadas en experimentos como se muestra en las figs. 4-6.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación proporciona procedimientos y kits para unir entre sí porciones fragmentadas de ácidos nucleicos, lo que también se denomina en el presente documento "coser" entre sí porciones fragmentadas de ácidos nucleicos. Los procedimientos y kits divulgados generan porciones más grandes de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, al juntar dos fragmentos cortos solapantes para formar uno más grande, y también preamplificar los fragmentos unidos para generar más moldes para la amplificación y detección por PCR.

Los procedimientos divulgados incluyen etapas para unir, o coser, entre sí una porción fragmentada de ácido nucleico para formar la secuencia diana de ácido nucleico diana deseada de longitud completa. Los procedimientos divulgados incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una o más porciones de un ácido nucleico diana fragmentado que se sospecha que está presente en una muestra, usando un par de cebadores externos y un par de cebadores internos completamente autocomplementarios o sustancialmente autocomplementarios. Más específicamente, en los modos de realización de un par de cebadores internos autocomplementarios, cada uno de los cebadores incluye un ácido nucleico con una secuencia seleccionada para emparejarse perfectamente con el cebador complementario y/o el ácido nucleico diana, mientras que en modos de realización de un par de cebadores sustancialmente autocomplementarios al menos uno de los cebadores puede incluir un ácido nucleico con una secuencia que sea una variante sustancialmente idéntica al cebador complementario y/o la secuencia diana en el que la variante tenga al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia. El par de cebadores externos, conjuntamente con el par de cebadores internos autocomplementarios, genera el ácido nucleico diana de longitud completa. El par de cebadores externos puede incluir una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico para producir un primer producto de amplificación que incluye una primera hebra sentido y una primera hebra antisentido si algún ácido nucleico diana está presente en la muestra. Los cebadores externos tienen la capacidad de, pero son insuficientes para generar un amplicón de longitud completa si el ácido nucleico diana está sustancialmente fragmentado o dañado. En una muestra donde está presente una diana de ácido nucleico fragmentado, uno cualquiera de los cebadores del par de cebadores externos puede producir un primer producto de amplificación derivado de la amplificación con su cebador externo asociado si el ADN diana está intacto, de tal manera que los sitios de unión a cebador estén presentes dentro de tramos contiguos de ADN de la muestra. En el caso de que existan tramos contiguos insuficientes de ADN en la muestra para soportar la amplificación exclusivamente por los cebadores externos, cada uno de los cebadores externos puede participar en la generación de segundos productos de amplificación más cortos por la incorporación de uno de los cebadores internos que por sí mismos son complementarios a las regiones internas del primer producto de amplificación de longitud completa deseado, si existe suficiente ADN contiguo entre los sitios de unión a cebador externo e interno. Los dos segundos productos de amplificación bicatenarios generados a partir de los dos conjuntos de cebadores externos e internos correspondientes se pueden desnaturalizar por desnaturalización térmica de PCR normal y las dos hebras únicas de amplicón derivadas por extensión de los cebadores externos se pueden hibridar entre sí de tal manera que los extremos 3' de estos productos de extensión se puedan extender para producir la secuencia de ácido nucleico diana de longitud completa (figs. 1,2 y 3).

El par de cebadores internos autocomplementarios incluyen una tercera secuencia de ácido nucleico y una cuarta secuencia de ácido nucleico, en los que la tercera secuencia de ácido nucleico está configurada para hibridarse a la primera hebra antisentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra sentido de un segundo producto de amplificación y la cuarta secuencia de ácido nucleico está configurada para hibridarse a la primera hebra sentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra antisentido del segundo producto de amplificación. El par de cebadores internos autocomplementarios se une y extiende tanto las secuencias de molde existentes (truncadas) como los amplicones generados por los cebadores externos. En una muestra donde está presente una diana de ácido nucleico fragmentado, el par de cebadores internos autocomplementarios amplifica los productos de amplificación más largos analizados anteriormente que se pueden cebar entre sí, lo que incrementa, por tanto, la producción de los productos de amplificación más largos que son lo suficientemente largos como para hibridarse entre sí y cebarse entre sí para producir la secuencia de ácido nucleico diana de longitud completa (figs. 1,2 y 3). En un modo de realización, la concentración relativa del par de cebadores internos autocomplementarios es igual a la concentración del par de cebadores externos. En otro modo de realización, la concentración relativa del par de cebadores internos autocomplementarios es menor que la concentración del par de cebadores externos.

En algunos modos de realización, los procedimientos divulgados pueden incluir un segundo, un tercer o más pares de cebadores internos autocomplementarios. En cada caso, el par adicional de cebadores internos autocomplementarios puede funcionar conjuntamente con los cebadores externos o el par contiguo de cebadores internos autocomplementarios para producir uno o más productos de amplificación.

Los procedimientos divulgados incluyen la etapa de generar un ácido nucleico diana de longitud completa, que se puede producir cuando los cebadores externos hayan generado los primeros productos de amplificación, incluyendo aquellos de suficiente tamaño en los que las hebras sentido y antisentido de los primer y segundo productos de amplificación incluyen regiones que se pueden hibridar entre sí, actuando cada una, de este modo, como cebador para la hebra complementaria (figs. 2 y 3). De esta manera, la molécula de ácido nucleico diana de longitud completa se puede producir y amplificar hibridando una primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido con una segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido, en la que la primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido ceba la extensión de la primera hebra sentido sobre la primera hebra antisentido, y la segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido ceba la extensión de la primera hebra antisentido sobre la primera hebra sentido. Además, el ácido nucleico diana de longitud completa también se puede generar cuando los cebadores internos autocomplementarios hayan generado los segundos productos de amplificación de suficiente tamaño, en los que las segunda hebra sentido y segunda antisentido del segundo producto de amplificación incluyen una región que se puede hibridar entre sí, que puede ser la región representada por los cebadores internos autocomplementarios, y cada hebra se extiende en dirección 5' a la región representada por los cebadores externos, actuando cada una, de este modo, como cebador para la hebra complementaria (figs.

2 y 3). De esta manera, la molécula de ácido nucleico diana de longitud completa se puede producir y amplificar hibridando una tercera región de extremo 3' de la segunda hebra sentido con una cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido, en la que la tercera región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido ceba la extensión de la segunda hebra sentido sobre la segunda hebra antisentido, y la cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido ceba la extensión de la segunda hebra antisentido sobre la segunda hebra sentido. En el presente documento, la tercera y la cuarta región de extremo 3' puede ser la región representada por los cebadores internos autocomplementarios. A medida que continúa el proceso de amplificación y se producen más de los fragmentos más grandes se da lugar a la producción de una cantidad cada vez mayor de la molécula de ácido nucleico diana de longitud completa.

El término "hebra sentido" como se usa en el presente documento se refiere a la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARNm, que toma la hebra antisentido como su molde durante la transcripción. Otros términos en la técnica que son sinónimos a "hebra sentido" son "hebra codificante", "hebra positiva (+)" y "hebra distinta de molde".

El término "hebra antisentido" como se usa en el presente documento se refiere a la hebra de ADN no codificante de un gen con bases complementarias a la hebra sentido de ADN y usada como molde para el ARNm. Otros términos en la técnica que son sinónimos a "hebra antisentido" son "hebra no codificante", "hebra negativa (-)" y "hebra molde".

"Cebador(es)" como se usa en el presente documento se refiere(n) a cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica una diana de interés e inician la síntesis de ADN a partir de la misma en condiciones apropiadas que producen los productos de amplificación respectivos. Cada uno de los cebadores analizados se puede hibridar a una diana dentro de o contigua a la molécula de ácido nucleico diana respectiva de modo que al menos una porción de cada producto de amplificación contenga la secuencia de ácido nucleico correspondiente a la diana. El producto de amplificación debe contener las secuencias de ácido nucleico que sean complementarias a una o más sondas detectables para la diana de interés. "Sonda(s)" como se usa en el presente documento se refiere(n) a sondas oligonucleotídicas que se hibridan específicamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica la diana de interés.

Cada etapa de ciclado puede incluir una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección, en las que la muestra se pone en contacto con las una o más sondas detectables para la detección de la presencia o ausencia de la diana de interés en la muestra.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificar" se refiere al procedimiento de sintetizar moléculas de ácido nucleico que sean complementarias a una o ambas hebras de una molécula de ácido nucleico molde de interés. La amplificación de una molécula de ácido nucleico típicamente incluye desnaturalizar el ácido nucleico molde, hibridar cebadores al ácido nucleico molde a una temperatura que esté por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores y el alargamiento de forma enzimática a partir de los cebadores para generar un producto de amplificación. La amplificación típicamente requiere la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Taq Platinum®) y un tampón apropiado y/o cofactores para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCh y/o KCl).

El término "cebador" como se usa en el presente documento es conocido por los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3', por ejemplo, del oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre al que se pueden fijar otros "nucleótidos" por una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster de 3' a 5', con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato, y con lo que se libera pirofosfato. Por lo tanto, no existe ninguna diferencia fundamental entre un "cebador", un "oligonucleótido" o una "sonda" —salvo posiblemente en cuanto a la función pretendida— .

El término "hibridación" se refiere a la hibridación de una o más sondas a un producto de amplificación. Las condiciones de hibridación típicamente incluyen una temperatura que esté por debajo de la temperatura de fusión de las sondas, pero que evite la hibridación no específica de las sondas.

El término "actividad nucleasa de 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de las hebras de ácido nucleico, con lo que se retiran nucleótidos del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión del cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y prosigue en dirección de 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Se han aislado polimerasas termoestables a partir de Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no sean termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.

El término "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico que al mismo tiempo tiene la misma longitud que, y es exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.

El término "extensión" o "alargamiento" cuando se usa con respecto a ácidos nucleicos se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótidos, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo terminal 3' de un ácido nucleico.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o por inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud entre secuencias son los programas BLAST, que se describen, por ejemplo, en Altschul et al. (1990), "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993), "Identification of protein coding regions by database similarity search", Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996), "Applications of network BLAST server", Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul et al. (1997), "Gapped BlAs T and PSi-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 y Zhang et al. (1997), "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation", Genome Res. 7:649-656.

Un "nucleótido modificado" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia de oligonucleótidos se remplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, una C5-metil-dC, una C5-etil-dC, un C5-metil-dU, un C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, una C5-propinil-dC, un C5-propinil-dU, una C7-propinil-dA, una C7-propinil-dG, una C5-propargilamino-dC, un C5-propargilamino-dU, una C7-propargilamino-dA, una C7-propargilamino-dG, una 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, un seudo-dU, un nitropirrol, un nitroindol, 2'-0-metil-ribo-U, 2'-0-metil-ribo-C, una N4-etil-dC, una N6-metil-dA y similares. En el presente documento se hace referencia a muchos otros nucleótidos modificados que se pueden sustituir en los oligonucleótidos o de otro modo son conocidos en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tf) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos no modificados correspondientes. Para ilustrar además, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácidos nucleicos no específica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebadores o similar), incrementar el rendimiento de un amplicón diana pretendido y/o similares en algunos modos de realización. Se describen ejemplos de estos tipos de modificaciones de ácido nucleico, por ejemplo, en la pat. de EE. UU. n.° 6.001.611.

Detección de la secuencia de ácido nucleico diana

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la secuencia de ácido nucleico diana amplificando, por ejemplo, una porción de la secuencia de ácido nucleico diana. Las secuencias de ácido nucleico del ácido nucleico diana se deben conocer con especificidad. Específicamente, se proporcionan cebadores y sondas para amplificar y detectar dianas de moléculas de ácido nucleico diana por los modos de realización en la presente divulgación.

Para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana, se pueden proporcionar cebadores y sondas para amplificarla, y además, se pueden evaluar variantes funcionales para determinar la especificidad y/o sensibilidad por los expertos en la técnica usando procedimientos rutinarios. Las variantes funcionales representativas pueden incluir, por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones en los ácidos nucleicos diana. Más específicamente, los modos de realización de los oligonucleótidos incluyen cada uno un ácido nucleico con una secuencia seleccionada para emparejarse perfectamente con la diana, o puede incluir una variante sustancialmente idéntica de la misma en la que la variante tenga al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia, o un complemento de la variante.

En un modo de realización, los conjuntos de cebadores y sondas descritos anteriormente se usan para proporcionar la detección de la secuencia de ácido nucleico diana en una muestra biológica que se sospecha que contiene la diana. Los conjuntos de cebadores y sondas pueden comprender o consistir en cebadores y sondas específicos para las secuencias de ácido nucleico diana, o, en otro modo de realización, los cebadores y sondas para la secuencia de ácido nucleico diana pueden comprender o consistir en una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores y sondas.

Una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores y/o sondas se puede identificar usando los cebadores y/o sondas en los procedimientos divulgados. Una variante funcionalmente activa de un cebador y/o sonda alude a un cebador y/o sonda que proporciona una especificidad y sensibilidad similar o mayor en el procedimiento o kit descrito en comparación con la secuencia respectiva.

La variante puede variar, por ejemplo, de la secuencia en una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos, tales como una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la secuencia respectiva. Como se detalla anteriormente, un cebador (y/o sonda) se puede modificar químicamente, es decir, un cebador y/o sonda puede comprender un nucleótido modificado o un compuesto distinto de nucleótido. Una sonda (o un cebador) es, entonces, un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos de nucleótido") difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base o compuesto similar a base, un glúcido pentofuranosilo o un compuesto similar a glúcido pentofuranosilo, una porción fosfato o porción similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se puede fijar un "marcador" a la porción de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede remplazar, por ejemplo, por una 7-desazapurina, con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo de nucleótido" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo de nucleósido") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera como se explica anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo de nucleótido").

Se pueden diseñar oligonucleótidos, incluyendo oligonucleótidos modificados y análogos de oligonucleótido, que amplifiquen una molécula de ácido nucleico que codifica la diana, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican porciones alternativas de la secuencia de ácido nucleico diana, usando, por ejemplo, un programa informático, tal como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores necesitan ser lo suficientemente largos como para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis de oligonucleótidos). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos tienen de 8 a 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 nucleótidos de longitud).

Además de un conjunto de cebadores, los procedimientos pueden usar una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana. El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que, por diseño o selección, contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridarse en restricciones predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) a "ácidos nucleicos diana". Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", lo que significa que detecta el ácido nucleico diana.

En algunos modos de realización, las sondas descritas se pueden marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, las sondas se puede marcar con un resto fluorescente donante, por ejemplo, un tinte fluorescente, y un resto aceptor correspondiente, por ejemplo, un extintor. En un modo de realización, la sonda comprende o consiste en un resto fluorescente y las secuencias de ácido nucleico.

El diseño de oligonucleótidos que se van a usar como sondas se puede realizar de manera similar al diseño de cebadores. Los modos de realización pueden usar una sonda única o un par de sondas para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, el uso de la(s) sonda(s) puede comprender al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Como con los cebadores, las sondas normalmente tienen temperaturas de fusión similares, y la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que se produzca la hibridación específica de secuencia, pero no tan larga como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas tienen, en general, de 15 a 40 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) nucleótidos de longitud.

Las construcciones pueden incluir vectores, conteniendo cada uno una de moléculas de ácido nucleico de cebadores y sondas. Se pueden usar construcciones, por ejemplo, como moléculas de ácido nucleico molde de control. Los vectores adecuados para su uso están disponibles comercialmente y/o se producen por procedimientos de tecnología de ácido nucleico recombinante rutinarios en la técnica. Se pueden obtener moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, por síntesis química, clonación directa a partir de la diana o por amplificación por PCR.

Las construcciones adecuadas para su uso en los procedimientos típicamente incluyen, además de las moléculas de ácido nucleico diana, secuencias que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) para seleccionar las construcciones y/o transformantes deseados, y un origen de replicación. La elección de los sistemas de vectores normalmente depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la elección de células huésped, eficacia de la replicación, selectividad, inducibilidad y la facilidad de recuperación.

Las construcciones que contienen moléculas de ácido nucleico diana se pueden propagar en una célula huésped. Como se usa en el presente documento, el término célula huésped pretende incluir procariotas y eucariotas, tales como células de levadura, vegetales y de animal. Los huéspedes procariotas pueden incluir E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los huéspedes eucariotas incluyen levaduras, tales como S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris, células de mamífero, tales como células COS o células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto y células vegetales, tales como Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum. Se puede introducir una construcción en una célula huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus son procedimientos comunes para introducir ácidos nucleicos en células huésped. Además, se puede suministrar ADN no marcado directamente a las células (véanse, por ejemplo, las pat. de Ee . UU. n.os 5.580.859 y 5.589.466).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las pat. de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR típicamente emplea dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en algunos modos de realización incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como puntos de iniciación de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico diana descritas. Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado con restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador es preferentemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. En primer lugar, se desnaturalizan los cebadores bicatenarios, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento de desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de las hebras se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado que incluya medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento de separación de las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración salina de tampón y la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se desnaturalizan, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo dependiendo de rasgos característicos de la reacción, tales como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización típicamente se realiza durante de aproximadamente 30 s a 4 min (por ejemplo, de 1 min a 2 min 30 s, o 1,5 min).

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador a su secuencia diana en las moléculas de ácido nucleico diana descritas. La temperatura para la hibridación es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). A continuación, se ajusta la mezcla de reacción a una temperatura a la que se promueve u optimiza la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía, en general, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, de aproximadamente 30 s a aproximadamente 4 min; de aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min; de aproximadamente 1 min 30 s a aproximadamente 2 min).

Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico diana, tal como ARN o ADN (ADNc). No se necesita purificar el ácido nucleico molde; puede ser una fracción minoritaria de una mezcla compleja, tal como el ácido nucleico diana contenido en células humanas. Se pueden extraer moléculas de ácido nucleico diana de una muestra biológica por técnicas rutinarias, tales como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology. Principies and Applications (Persing et al. (eds.), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se pueden obtener ácidos nucleicos de una serie de fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales, incluyendo bacterias, levaduras, virus, orgánulos u organismos superiores, tales como plantas o animales.

Los cebadores oligonucleotídicos se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reacción que inducen la extensión del cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de la cadena incluyen, en general, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCh 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 1,0 ng-1,0 |jg de ADN molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de polimerasa Taq y DMSO al 10 %). Las reacciones normalmente contienen de 150 a 320 jM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP, dGTP o uno o más análogos de los mismos.

Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación de las hebras, hibridación y alargamiento se pueden repetir tan a menudo como se necesite para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a las moléculas de ácido nucleico diana. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar lo suficiente la secuencia diana para su detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tantas como 40, 60 o incluso 100 veces.

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

La tecnología de FRET (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en un concepto de que cuando un resto fluorescente donante y un resto fluorescente aceptor correspondiente se sitúan dentro de una determinada distancia entre sí, tiene lugar una transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o de otro modo detectar y/o cuantificar. El donante típicamente transfiere la energía al aceptor cuando se excita el donante por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptor típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. En determinados sistemas, se puede transferir energía no fluorescente entre restos donantes y aceptores, por medio de biomoléculas que incluyan restos donantes sustancialmente no fluorescentes (véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 7.741.467).

En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto fluorescente donante y un extintor correspondiente, que puede ser fluorescente o no, y que disipa la energía transferida en una forma distinta de la luz. Cuando la sonda está intacta, la transferencia de energía típicamente se produce entre los restos donantes y aceptores, de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante se extinga por el resto aceptor. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, se escinde una sonda unida a un producto de amplificación por la actividad nucleasa de 5' a 3', por ejemplo, de una polimerasa Taq de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante ya no se extinga. Se describen sondas ejemplares para este propósito, por ejemplo, en las pat. de EE. UU. n.os 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. Los pares donante-aceptor usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), (Berry y Assoc., Dexter, Mich.).

En otro ejemplo, dos sondas oligonucleotídicas, que contienen cada una un resto fluorescente, se pueden hibridar a un producto de amplificación en posiciones particulares determinadas por la complementariedad de las sondas oligonucleotídicas con respecto a la secuencia de ácido nucleico diana. Tras la hibridación de las sondas oligonucleotídicas al ácido nucleico del producto de amplificación en las posiciones apropiadas, se genera una señal de FRET. Las temperaturas de hibridación pueden variar de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C durante de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min.

Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para supervisar la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. Se puede llevar a cabo la excitación para iniciar la transferencia de energía, o para permitir la detección directa de un fluoróforo, con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.

Como se usa en el presente documento con respecto a los restos donantes y aceptores correspondientes, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptor o un extintor oscuro que tiene un espectro de absorbancia que se solapa con el espectro de emisión del resto fluorescente donante. El máximo de longitud de onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptor debe ser al menos 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donante. En consecuencia, se puede producir una transferencia de energía no radiativa eficaz entre los mismos.

Los restos donantes y aceptores correspondientes fluorescentes se eligen, en general, para (a) la transferencia de energía de Forster de alta eficacia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) un desplazamiento de la emisión lo más lejos posible en la parte roja del espectro visible (>600 nm); y (d) un desplazamiento de la emisión a una mayor longitud de onda que la emisión fluorescente del agua de Raman producida por excitación a la longitud de onda de excitación del donante. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donante que tenga su máximo de excitación cercano a una línea láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y un buen solapamiento de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del resto fluorescente aceptor correspondiente. Se puede elegir un resto fluorescente aceptor correspondiente que tenga un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, un buen solapamiento de su excitación con la emisión del resto fluorescente donante y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm).

Los restos fluorescentes donantes representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptores en la tecnología de FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, 9-acridinisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenbutirato de succinimidilo y derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptores representativos que dependen del resto fluorescente donante usado, incluyen LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonil lisamina rodamina B, tetrametilrrodaminaisotiocianato, rodamina x-isotiocianato, eritrosina-isotiocianato, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donantes y aceptores, por ejemplo, de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Los restos fluorescentes donantes y aceptores se pueden fijar al oligonucleótido de sonda apropiado por medio de un brazo conector. La longitud de cada brazo conector es importante, ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donantes y aceptores. La longitud de un brazo conector puede ser la distancia en Angstroms (A) desde la base nucleotídica al resto fluorescente. En general, un brazo conector es de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. El brazo conector puede ser de la clase descrita en el documento WO 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para fijar brazos conectores a una base nucleotídica particular, y también para fijar restos fluorescentes a un brazo conector.

Se puede combinar un resto fluorescente aceptor, tal como un LC Red 640, con un oligonucleótido que contenga un conector de amino (por ejemplo, C6-aminofosforamiditas disponibles de ABI (Foster City, Calif.) o Glen Research (Sterling, VA)) para producir, por ejemplo, un oligonucleótido marcado con LC Red 640. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donante, tal como fluoresceína, a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de fluoresceína-éster de NHS, tales como CX-fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramón, Calif.)) o 3'-amino-CPG, que requieren el acoplamiento de fluoresceína-éster de NHS después de la síntesis de oligonucleótidos.

Detección de la molécula de ácido nucleico diana

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de la molécula de ácido nucleico diana en una muestra biológica o no biológica. Los procedimientos proporcionados evitan problemas de contaminación de la muestra, negativos falsos y positivos falsos. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluya amplificar una porción de las moléculas de ácido nucleico diana de una muestra usando uno o más pares de cebadores y una etapa de detección de FRET. Se realizan múltiples etapas de ciclado, preferentemente en un termociclador. Se pueden realizar procedimientos usando los cebadores y sondas para detectar la presencia de la diana, y la detección de la diana indica la presencia de la diana en la muestra.

Como se describe en el presente documento, los productos de amplificación se pueden detectar usando sondas de hibridación marcadas que aprovechan la tecnología de FRET. Un formato de FRET utiliza la tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, y de ahí, la presencia o ausencia de la molécula de ácido nucleico diana. La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada, por ejemplo, con un tinte fluorescente y un extintor, que puede ser fluorescente o no. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente o un extintor oscuro de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente, en general, es una molécula extintora. Durante la etapa de hibridación de la reacción PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad nucleasa de 5' a 3', por ejemplo, de la polimerasa Taq durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) usa la tecnología TaqMan® y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra.

También se pueden usar balizas moleculares conjuntamente con FRET para detectar la presencia de un producto de amplificación usando los procedimientos de p Cr en tiempo real. La tecnología de balizas moleculares usa una sonda de hibridación marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente, en general, es un extintor, y los marcadores fluorescentes típicamente se localizan en cada extremo de la sonda. La tecnología de balizas moleculares usa un oligonucleótido de sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructuras secundarias (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de estructuras secundarias dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Después de la hibridación a los ácidos nucleicos diana (es decir, los productos de amplificación), la estructura secundaria de la sonda se altera y los restos fluorescentes se separan entre sí, de modo que, después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, se pueda detectar la emisión del primer resto fluorescente.

Otro formato común de la tecnología de FRET utiliza dos sondas de hibridación. Cada sonda se puede marcar con un resto fluorescente diferente y, en general, se diseñan para hibridarse en estrecha proximidad entre sí en una molécula de ADN diana (por ejemplo, un producto de amplificación). Un resto fluorescente donante, por ejemplo, fluoresceína, se excita a 470 nm por la fuente de luz del instrumento LightCycler®. Durante la FRET, la fluoresceína transfiere su energía a un resto fluorescente aceptor, tal como LightCycler®-Red 640 (LC Red 640) o LightCycler®-Red 705 (LC Red 705). A continuación, el resto fluorescente aceptor emite luz de una longitud de onda más larga, que se detecta por el sistema de detección óptica del instrumento LightCycler®. La FRET eficaz solo puede tener lugar cuando los restos fluorescentes están en proximidad local directa y cuando el espectro de emisión del resto fluorescente donante se solapa con el espectro de absorción del resto fluorescente aceptor. La intensidad de la señal emitida se puede correlacionar con el número de moléculas de ADN diana originales (por ejemplo, el número de genomas diana). Si se produce la amplificación del ácido nucleico diana y se produce un producto de amplificación, la etapa de hibridación da como resultado una señal detectable basada en FRET entre los miembros del par de sondas.

En general, la presencia de FRET indica la presencia de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra. Sin embargo, la inadecuada obtención de muestras, los retrasos por el transporte, las condiciones de transporte inapropiadas o el uso de determinados hisopados de obtención (varilla de alginato de calcio o de aluminio) son todas condiciones que pueden afectar al éxito y/o exactitud del resultado de una prueba. Usando los procedimientos divulgados en el presente documento, la detección de FRET dentro de, por ejemplo, 45 etapas de ciclado es indicativa de la presencia de la molécula de ácido nucleico diana.

Las muestras biológicas representativas que se pueden usar en la práctica de los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, muestras respiratorias, muestras fecales, muestras de sangre, hisopados dérmicos, hisopados nasales, hisopados en heridas, hemocultivos, piel e infecciones de partes blandas. Son conocidos procedimientos de obtención y almacenamiento de muestras biológicas para los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, por procedimientos y/o kits de extracción de ácido nucleico conocidos en la técnica) para liberar el ácido nucleico diana o, en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de la reacción PCR y los oligonucleótidos apropiados.

El análisis de la curva de fusión es una etapa adicional que se puede incluir en un perfil de ciclado. El análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que el a Dn se funde a una temperatura característica llamada temperatura de fusión (Tf), que se define como la temperatura a la que la mitad de las dobles hebras de ADN se han separado en hebras únicas. La temperatura de fusión de un ADN depende principalmente de su composición de nucleótidos. Por tanto, las moléculas de ADN ricas en nucleótidos G y C tienen una mayor Tf que las que tienen una abundancia de nucleótidos A y T. Al detectar la temperatura a la que se pierde la señal, se puede determinar la temperatura de fusión de las sondas. De forma similar, al detectar la temperatura a la que se genera la señal, se puede determinar la temperatura de hibridación de las sondas. La(s) temperatura(s) de fusión de las sondas de los productos de amplificación diana puede(n) confirmar la presencia o ausencia de la diana en la muestra.

Dentro de cada tanda de termociclador, también se pueden ciclar muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico diana (distinto de los productos de amplificación descritos de genes diana) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción plasmídica que contenga las moléculas de ácido nucleico diana. Dicho control plasmídico se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una tanda con muestra separada paralelamente con las muestras del paciente usando los mismos cebadores y sonda que los usados para la detección de la diana pretendida. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Cada tanda de termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carezca de ADN molde diana. El control negativo puede medir la contaminación. Esto garantiza que el sistema y los reactivos no dan lugar a una señal positiva falsa. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores de hibridarse con especificidad de secuencia y de iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas de hibridarse con especificidad de secuencia y para que se produzca la FRET.

En un modo de realización, los procedimientos incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa se describe en las pat. de EE. UU. n.os 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una tanda de termociclador y la siguiente.

Se pueden usar procedimientos de PCR convencionales conjuntamente con tecnología de FRET para poner en práctica los procedimientos. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR en tiempo real como se usa en la tecnología de LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.

El LightCycler® se puede hacer funcionar usando una estación de trabajo con PC y puede utilizar un sistema operativo Windows NT. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede presentar las señales de fluorescencia en tiempo real inmediatamente después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una representación cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclos para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para otro análisis.

Como alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificación usando un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de unión a ADN fluorescente (por ejemplo, SYBR® Green o SYBR® Gold (Molecular Probes)). Tras la interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos tintes de unión a ADN fluorescentes emiten una señal de fluorescencia después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de intercalación de ácido nucleico. Cuando se usan tintes de unión a ADN bicatenario, normalmente se realiza un análisis de la curva de fusión para confirmar la presencia del producto de amplificación.

Se entiende que los modos de realización de la presente divulgación no se limitan por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.

Artículos de fabricación/kits

Los modos de realización de la presente divulgación proporcionan además artículos de fabricación o kits para detectar la secuencia de ácido nucleico diana. Un artículo de fabricación puede incluir cebadores y sondas usados para detectar la diana del gen, conjuntamente con materiales de envasado adecuados. Los cebadores y sondas representativos para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana se pueden hibridar a las moléculas de ácido nucleico diana. Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. En el presente documento se divulgan procedimientos de diseño de cebadores y sondas, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores y sondas que amplifican y se hibridan a las moléculas de ácido nucleico diana.

Los artículos de fabricación también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas o, de forma alternativa, se pueden marcar las sondas suministradas con el kit. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donante y/o uno aceptor para marcar las sondas. Anteriormente se proporcionan ejemplos de restos fluorescentes donantes y restos fluorescentes aceptores correspondientes para FRET adecuados.

Los artículos de fabricación también pueden contener un prospecto del envase o ficha técnica del envase que tenga instrucciones en el mismo para usar los cebadores y sondas para detectar la secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. Los artículos de fabricación pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasa, cofactores o agentes para prevenir la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento.

En los siguientes ejemplos se describirán además modos de realización de la presente divulgación, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Se proporcionan los siguientes ejemplos y figuras para ayudar al entendimiento de la materia objeto, exponiéndose su verdadero alcance en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos expuestos.

Ejemplo I

En referencia a la fig. 4, existen tres mutaciones principales del exón 20 de EGFR. En el carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), T790M es una mutación resistente dominante que es detectable después del tratamiento de primera línea con inhibidores de tirosina cinasa. Se encuentran S768I y pequeñas inserciones en muchos pacientes de CPNM sin tratamiento previo.

Estas 3 mutaciones están dentro de una región de alrededor de 200-300 pb en el exón 20 de EGFR. Los ácidos nucleicos obtenidos de muestras clínicas de plasma (ADNlc) o bien de FFPET típicamente son difíciles de amplificar y detectar debido a la reticulación o a la baja abundancia natural de la secuencia diana de longitud completa. Para enriquecer esta diana de longitud completa, se usaron inicialmente dos cebadores (externos) flanqueantes, EX20I F y EX20_R01, con un minigen de 500 pb, lo que dio resultados satisfactorios. Sin embargo, el tamaño de este amplicón, 225 pb, no está presente en las muestras de ADN libre de células (ADNlc) debido a la distribución de tamaños del ADN en este tipo de muestra. Por lo tanto, se aplicó la técnica de unión de ADN fragmentado (costura) a esta imprescindible diana como prueba de concepto.

Se diseñaron dos minigenes de 180 pb, S768S de pEGFR y T790T de pEGFR, para imitar el ADNlc fragmentado, se diseñaron dos cebadores internos autocomplementarios (cebadores de costura), R11FOR1 y R11, para emparejarse con un motivo de secuencia común en cada uno de los dos minigenes. Las PCR simples que usan estos cebadores se analizaron usando análisis en gel. Adicionalmente, se usó una sonda TaqMan®, P5, para construir un ensayo de qPCR con EX20I F y EX20_R01 usados como los cebadores (externos) flanqueantes, este ensayo de qPCR se usa como un procedimiento sensible para detectar el producto cosido de longitud completa deseado a 225 pb por análisis de la curva de crecimiento de PCR en tiempo real.

Ejemplo II

En referencia a la fig. 5, la tabla muestra que se mezclaron diversas cantidades de moldes con diversas cantidades de cebadores (externos) flanqueantes. El objetivo era una reacción satisfactoria y óptima con dos amplicones grandes intermedios (véase la fig. 3). Existieron muchos intentos y combinaciones diferentes sometidos a prueba para encontrar el mejor para generar el producto de longitud completa.

El procedimiento de detección fue un ensayo con TaqMan® de qPCR que suministra una lectura sensible y cuantitativa. Se usó un |jl de las reacciones descritas en la fig. 5 como la entrada para la qPCR.

De las cuatro condiciones de prueba, solo la n.° 6 dio un buen Ct. Son 17,7 para 35 ciclos y 10,1 para 50 ciclos. En un gel de agarosa al 4 % con una carga de producto de 10 jl, se puede ver una banda tenue con el tamaño correcto a alrededor de 225 pb, aunque solo para la reacción de 50 ciclos (datos no mostrados). Este resultado positivo sirvió de base para el próximo experimento.

Ejemplo III

En referencia a la fig. 6, la tabla muestra un experimento diseñado para valorar una amplia gama de cebadores internos autocomplementarios (cebadores de costura).

La n.° 1 es idéntica a la condición n.° 6 descrita en la fig. 5, que sirve como control positivo.

A la n.° 2 y la n.° 3 se les añadió un cebador de costura, R11, a dos concentraciones respectivamente. Una era baja a 40 nM y la otra regular a 100 nM.

A la n.° 4 y la n.° 5 se les añadió el otro cebador de costura, R11FOR1, a dos concentraciones respectivamente. Una era baja a 40 nM y la otra regular a 100 nM.

De la n.° 6 a la n.° 9 a ambos cebadores de costura se les añadieron diversas concentraciones combinadas conjuntamente con los cebadores flanqueantes. En la n.° 7, los cuatro cebadores tenían la misma concentración regular a 100 nM, mientras que la n.° 8 y la n.° 9 tenían una mayor concentración para el par flanqueante.

El motivo de las diferentes combinaciones es someter a prueba los límites de este nuevo procedimiento. La unión de fragmentos de ADN (costura) requiere que ocurran tres reacciones PCR diferentes en el mismo tubo para generar el producto de longitud completa final.

Ejemplo IV

En referencia a la fig. 7 y las tablas 1 y tabla 2 a continuación, se usaron dos procedimientos de detección, qPCR y gel de agarosa al 4 %. Un j l de dilución 1:10 de las reacciones descritas en la fig. 6 fue la entrada para la qPCR. El valor de Ct se muestra a continuación en la tabla 1.

Tabla 1

*Estimación debido a la identificación de Ct temprana

De la n.° 6 a la n.° 9 claramente se generó mucho más producto de longitud completa que usando las condiciones de un cebador de costura (del n.° 2 al n.° 5). Pero la qPCR en este caso no puede diferenciar productos de tamaño diferente, mientras que el gel de agarosa sí puede (véanse la fig. 7 y la tabla 2).

Tabla 2

La fig. 7 muestra un gel de agarosa que incluye diversas reacciones de costura. Se cargaron 10 j l de las reacciones descritas en la fig. 6 más 10 j l de tinte de carga en cada pocillo. Pocillo 2: control positivo de tamaño 157 pb; los pocillos 3-11 son las reacciones n.° 1 - n.° 9 descritas en la fig. 6 respectivamente; el pocillo 12 es un marcador de 25 pb de Invitrogen. Los resultados se resumen a continuación:

Existe un aspecto claramente cuantitativo y dinámico de la reacción de costura, como se muestra en la fig.7. El Ct = 26,4 en la reacción n.° 1 / pocillo 3, por lo que claramente están presentes productos de longitud completa. Pero la concentración es de alrededor de 32 veces menor que la de la reacción n.° 2 (Ct = 21,3), por eso no se ve la banda.

Reacción n.° 2 y n.° 3 (pocillo 4 y 5): con la presencia de dos concentraciones de R11, el producto a 157 pb claramente se ve con un efecto de dosificación. Pero no se ve ningún producto de longitud completa a 225 pb en el gel (Ct=21,3 y 20,4). No gran parte del producto a 225 pb de longitud completa generado supuestamente se debe a que la concentración de los dos amplicones grandes intermedios requeridos está sesgada y no está dentro del límite óptimo.

Reacción n.° 4 y n.° 5 (pocillo 6 y 7): con la presencia de dos concentraciones de R11FOR1, el producto a 88 pb claramente se ve con un efecto de dosificación. Pero tampoco se ve ningún producto de longitud completa en el gel (Ct=19,5 y 20,1). Podría ser el mismo motivo que anteriormente.

Reacción de n.° 6 a n.° 9 (pocillo 8-11): con la presencia de ambos cebadores de costura en la misma reacción, el producto de longitud completa a 225 pb claramente se ve con un efecto de dosificación. Con una concentración de cebadores flanqueantes fija, cuantos más cebadores de costura haya, mayor es la longitud completa (pocillo 8 frente al pocillo 9). Con una concentración de cebadores de costura fija, cuantos más cebadores flanqueantes haya no parece incrementar adicionalmente el producto de longitud completa (pocillo 10 frente al pocillo 11), lo que sugiere que alcanza la meseta.

Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle para propósitos de claridad y entendimiento, quedará claro para un experto en la técnica, a partir de una lectura de la presente divulgación, que se pueden realizar diversos cambios de forma y detalle. Por ejemplo, se pueden usar todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente en diversas combinaciones.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento homogéneo para unir entre sí ácidos nucleicos fragmentados, que comprende las etapas de: - realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha que comprende un ácido nucleico diana fragmentado con:

- un par de cebadores externos que comprenden una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico para producir un primer producto de amplificación que comprende una primera hebra sentido y una primera hebra antisentido si algún ácido nucleico diana está presente en la muestra; y

- un par de cebadores internos complementarios entre sí que comprenden una tercera secuencia de ácido nucleico y una cuarta secuencia de ácido nucleico, la tercera secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra antisentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra sentido de un segundo producto de amplificación y la cuarta secuencia de ácido nucleico configurada para hibridarse a la primera hebra sentido del primer producto de amplificación para producir una segunda hebra antisentido del segundo producto de amplificación; y

- generar un ácido nucleico diana de longitud completa:

- hibridando una primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido con una segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido, en el que la primera región de extremo 3' de la primera hebra sentido ceba la extensión de la primera hebra sentido sobre la primera hebra antisentido, y la segunda región de extremo 3' de la primera hebra antisentido ceba la extensión de la primera hebra antisentido sobre la primera hebra sentido; e - hibridando una tercera región de extremo 3' de la segunda hebra sentido con una cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido, en el que la tercera región de extremo 3' de la segunda hebra sentido ceba la extensión de la segunda hebra sentido sobre la segunda hebra antisentido, y la cuarta región de extremo 3' de la segunda hebra antisentido ceba la extensión de la segunda hebra antisentido sobre la segunda hebra sentido, en el que todas las etapas se realizan de manera homogénea.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:

- realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación de longitud completa con una o más sondas detectables; y

- detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación de longitud completa, en la que la presencia del producto de amplificación de longitud completa es indicativa de la presencia del ácido nucleico diana en la muestra y en la que la ausencia del producto de amplificación de longitud completa es indicativa de la ausencia del ácido nucleico diana en la muestra.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que:

- la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación de longitud completa con una de las una o más sondas detectables que comprenden una quinta secuencia de ácido nucleico que está marcada con un resto fluorescente donante y un resto aceptor correspondiente, y

- la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donante y el resto aceptor de la sonda, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia del ácido nucleico diana en la muestra.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa de amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el resto fluorescente donante y el resto aceptor correspondiente están separados en no más de 8 nucleótidos entre sí en la sonda.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el resto aceptor es un extintor.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación de longitud completa con una de las una o más sondas detectables que comprenden una sonda molecular que comprende un tinte de unión a ADN bicatenario que tras la interacción con un ácido nucleico bicatenario del producto de amplificación de longitud completa emite una señal de fluorescencia; y

la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de resonancia de fluorescencia por un análisis de la curva de fusión, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia del ácido nucleico diana en la muestra.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración relativa del par de cebadores internos complementarios entre sí es igual a o menor que la concentración del par de cebadores externos.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa de amplificación comprende además poner en contacto la muestra que se sospecha que comprende un ácido nucleico diana fragmentado con un segundo par de cebadores internos complementarios entre sí.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra que se sospecha que comprende el ácido nucleico diana fragmentado es una muestra biológica.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la muestra biológica se selecciona de muestras respiratorias, muestras fecales, muestras de sangre, hisopados dérmicos, hisopados nasales, hisopados en heridas, hemocultivos, piel o infecciones de partes blandas.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra que se sospecha que comprende el ácido nucleico diana fragmentado es una muestra clínica.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la muestra clínica se selecciona de tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPET) o plasma.