ES2784654T3 - Composiciones y procedimientos para la detección de Mycobacterium tuberculosis farmacorresistente - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistente a la rifampicina (MTB-RIF) y/o MTB resistente a la isoniazida (MTB-INH) en una muestra, comprendiendo el procedimiento un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa ultrarrápida múltiple que comprende: - realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con al menos un conjunto de cebadores para rpoB, un conjunto de cebadores para inhA y un conjunto de cebadores para katG para producir uno o más productos de amplificación si algún ácido nucleico diana de rpoB, inhA y katG está presente en la muestra; - realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto dicho uno o más productos de amplificación con una pluralidad de sondas detectables para rpoB, una pluralidad de sondas detectables para inhA y una pluralidad de sondas detectables para katG, que comprenden al menos: - 17 sondas para rpoB para la detección de uno o más de los 17 polimorfismos mononucleotídicos SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB; - 3 sondas para inhA para la detección de uno o más de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y - 4 sondas para katG para la detección de uno o más de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y detectar la presencia o ausencia de dichos uno o más productos de amplificación, en el que la presencia de dichos uno o más productos de amplificación es indicativa de la presencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra y en el que la ausencia de dichos uno o más productos de amplificación es indicativa de la ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra; en el que dicha pluralidad de sondas para rpoB comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB, que comprenden rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513P, rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R; en el que dicha pluralidad de sondas para inhA comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB, que comprenden inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C; en el que dicha pluralidad de sondas para katG comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB, que comprenden katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2; y en el que: - las sondas para rpoB comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-289 y 437-438, o un complemento de las mismas; - las sondas para inhA comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y - las sondas para katG comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434-435, o un complemento de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la detección de Mycobacterium tuberculosis farmacorresistente

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico de virus, y más en particular, a procedimientos de detección por PCR que utilizan sondas de hidrólisis para la detección de Mycobacterium tuberculosis farmacorresistente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La tuberculosis (TB) es una enfermedad bacteriana causada por diversas cepas de micobacterias, como Mycobacterium tuberculosis (MTB) que se encuentra con mayor frecuencia en los pulmones. Se transmite de persona a persona a través del aire cuando las personas con tuberculosis pulmonar o laríngea tosen, estornudan o escupen y lanzan MTB al aire. Se estima que un tercio de la población mundial está infectada por MTB y 9 millones de personas desarrollan TB cada año. La tuberculosis sigue siendo una de las causas principales de enfermedad infecciosa humana y las cepas de MTB farmacorresistentes están en aumento, especialmente en los países en desarrollo.

Dos fármacos comunes de primera línea para el tratamiento de la infección por MTB incluyen isoniazida (INH) y rifampicina (RIF), y los pacientes pueden adquirir infección por MTB farmacorresistente al vivir o visitar un lugar donde es prevalente la resistencia farmacológica. Los pacientes también pueden desarrollar infección por MTB farmacorresistente cuando se interrumpe su régimen de tratamiento con antibióticos. El cultivo en medios sólidos o líquidos todavía se considera el método de referencia para la detección de resistencia farmacológica de MTB, pero se puede tardar hasta ocho semanas en tener los resultados del cultivo. Muchas pruebas comerciales de ácido nucleico para la detección de la resistencia farmacológica de MTB tienen un tiempo de respuesta muy rápido, pero no pueden detectar una población con un pequeño porcentaje de especies mutantes en una infección mixta que contenga especies tanto naturales como mutantes. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de un procedimiento rápido y fiable para detectar específicamente MTB resistente a rifampicina (MTB-RIF) y/o MTB resistente a isoniazida (MTB-INH) de manera sensible.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los modos de realización descritos en el presente documento se refieren a procedimientos para la detección rápida de la presencia o ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en una muestra biológica o no biológica, por ejemplo, detección múltiple de MTB-RIF y/o MTB-INH por reacción en cadena de la polimerasa ultrarrápida en un único tubo de ensayo. Los modos de realización incluyen procedimientos de detección de MTB-RIF y/o MTB-INH que comprenden realizar al menos una etapa de ciclado, que puede incluir una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. Además, los modos de realización incluyen cebadores, sondas y kits que están diseñados para la detección de MTB-RIF y/o MTB-INH individual, o coinfecciones por MTB-RIF y m TB-INH en un único tubo. Los procedimientos de detección están diseñados para identificar específicamente el polimorfismo único (SNP) en los genes de MTB objetivo para rpoB (subunidad beta de ARN polimerasa procariota), inhA (proteína reductasa portadora de enoil-acilo) y katG (catalasaperoxidasa) simultáneamente, que permite la detección y diferenciación de infecciones por MTB-RIF y/o MTB-INH en una única prueba. Por ejemplo, hay 17 SNP en el gen rpoB que confieren resistencia a la rifampicina en MTB que incluyen rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513p , rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R; hay 3 Sn P en el gen inhA que confieren resistencia a la isoniazida en MTB que incluyen inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C; y hay 4 SNP en el gen katG que también confieren resistencia a la isoniazida en MTB que incluyen katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2.

En un aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar MTB-RIF y/o MTB-INH en una muestra, que incluye realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con al menos un conjunto de cebadores para rpoB, un conjunto de cebadores para inhA y un conjunto de cebadores para katG para producir uno o más productos de amplificación si cualquier ácido nucleico diana de rpoB, inhA y katG está presente en la muestra; realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto dichos uno o más productos de amplificación con una pluralidad de sondas detectables para rpoB, una pluralidad de sondas detectables para inhA y una pluralidad de sondas detectables para katG, que incluye: al menos 17 sondas para rpoB para la detección de uno o más de 17 de polimorfismos mononucleotídicos SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB; al menos 3 sondas para inhA para la detección de uno o más de 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y al menos 4 sondas para katG para la detección de uno o más de 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a m TB; y detectar la presencia o ausencia de dicho uno o más productos de amplificación, en el que la presencia de dicho uno o más productos de amplificación es indicativa de la presencia de MTB-RIF y/o MTB-INh en la muestra y en el que la ausencia de dicho uno o más más productos de amplificación es indicativa de la ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra; en el que dicha pluralidad de sondas para rpoB comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB, que comprende rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513P, rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R; en el que dicha pluralidad de sondas para inhA comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniacida a MTB, que comprende inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C; y en el que dicha pluralidad de sondas para katG comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB, que comprenden katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2. En determinados modos de realización, las sondas para rpoB comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-289 y 437-438, o un complemento de las mismas; las sondas para inhA comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y las sondas para katG comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434-435, o un complemento de las mismas. En algunos modos de realización, las sondas para rpoB se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-289 y 437-438, o un complemento de las mismas; las sondas para inhA se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y las sondas para katG se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434-435, o un complemento de las mismas. En algunos modos de realización, cada una de la pluralidad de sondas para rpoB, inhA y katG detectables está marcada con un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente, y la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donador y el resto fluorescente aceptador de una o más de las sondas para rpoB, inhA y katG, en el que la presencia o ausencia de emisión de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de MTB-RIF y/o Mt B-INh en la muestra. En algunos modos de realización, dicha amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene una actividad nucleasa 5' a 3'. En algunos modos de realización, dichos restos fluorescentes donador y aceptador están separados en no más de 8 nucleótidos entre sí en dicha sonda. En algunos modos de realización, dicho resto fluorescente aceptador es un extintor.

En otro aspecto, se proporciona un oligonucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438, o un complemento de las mismas, cuyo oligonucleótido tiene 100 nucleótidos o menos. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, etc.) con una de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438, o un complemento de las mismas, cuyo oligonucleótido tiene 100 o menos nucleótidos. En general, estos oligonucleótidos pueden ser ácidos nucleicos cebadores, ácidos nucleicos sonda o similares en estos modos de realización. En algunos de estos modos de realización, los oligonucleótidos tienen 40 o menos nucleótidos (por ejemplo, 35 o menos nucleótidos, 30 o menos nucleótidos, etc.). En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación de ácido nucleico con respecto a nucleótidos no modificados. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden uno o más marcadores detectables. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos incluyen al menos una variación modificada conservativamente. Las "variaciones modificadas conservativamente" o, simplemente, las "variaciones conservativas" de una secuencia de ácido nucleico particular se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un aminoácido 0 un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos de un 5 %, más típicamente menos de un 4 %, 2 % o 1 %) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas conservativamente" en las que las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. En un aspecto, la amplificación puede emplear una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3'. Por tanto, los primer y segundo restos fluorescentes pueden estar a no más de 8 nucleótidos entre sí a lo largo de la longitud de la sonda.

En otro aspecto, se proporciona un conjunto de oligonucleótidos que comprende una pluralidad de sondas detectables para rpoB, inhA y katG específicas para la detección de productos de amplificación de rpoB, inhA y katG, que comprende 17 sondas de rpoB para la detección de uno o más de 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB; 3 sondas para inhA para la detección de uno o más de 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y 4 sondas para katG para la detección de uno o más de 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; en el que dicha pluralidad de sondas para rpoB comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB, que comprenden rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513P, rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R; en el que dicha pluralidad de sondas para inhA comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniacida a MTB, que comprenden inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C; y en el que dicha pluralidad de sondas para katG comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB, que comprenden katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2. En el presente documento, el conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detectar un ácido nucleico de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistente a la rifampicina (MTB-RIF) y/o MTB resistente a la isoniacida (MTB-INH) en una muestra. En algunos modos de realización, las sondas para rpoB comprenden una secuencia de ácido nucleido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-289 y 437-438, o un complemento de las mismas; las sondas para inhA comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y las sondas para katG comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434­ 435, o un complemento de las mismas. En algunos modos de realización, dentro del conjunto los oligonucleótidos tienen 100 nucleótidos o menos. En algunos de estos modos de realización, los oligonucleótidos tienen 40 o menos nucleótidos (por ejemplo, 35 o menos nucleótidos, 30 o menos nucleótidos, etc.). En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación de ácido nucleico con respecto a nucleótidos no modificados. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos incluyen al menos una variación modificada conservativamente. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden el primer y segundo restos fluorescentes que pueden estar a no más de 8 nucleótidos entre sí a lo largo de la longitud de la sonda.

En otro aspecto, se proporciona un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos de MTB-RIF y/o MTB-INH. El kit puede incluir una pluralidad de conjuntos de cebadores para rpoB, inhA y katG específicos para la amplificación de una diana de los genes rpoB, inhA y katG; y una pluralidad de sondas para rpoB, inhA y katG detectables específicas para la detección de productos de amplificación de rpoB, inhA y katG. En algunos modos de realización, la pluralidad de sondas para rpoB, inhA y katG detectables específicas comprende al menos 17 sondas de rpoB para la detección de uno o más de 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB; 3 sondas para inhA para la detección de uno o más de 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y 4 sondas para katG para la detección de uno o más de 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; en el que dicha pluralidad de sondas para rpoB comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a m Tb , que comprenden rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513P, rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R; en el que dicha pluralidad de sondas para inhA comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniacida a m Tb , que comprenden inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C; y en el que dicha pluralidad de sondas para katG comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB, que comprenden katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2. En algunos modos de realización, las sondas para rpoB comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-289 y 437-438, o un complemento de las mismas; las sondas para inhA comprenden o consisten en un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y las sondas para katG comprenden o consisten en un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434-435, o un complemento de las mismas. En algunos modos de realización, las sondas para rpoB se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1­ 289 y 437-438, o un complemento de las mismas; las sondas para inhA se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y las sondas para katG se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434-435, o un complemento de las mismas. En algunos modos de realización, el kit puede incluir sondas ya marcadas con restos fluorescentes donadores y aceptadores correspondientes, o puede incluir restos de fluoróforo para marcar las sondas. En algunos modos de realización, cada sonda de dicha pluralidad de sondas detectables para rpoB, inhA y katG comprende un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente. En algunos modos de realización, el resto fluorescente aceptador es un extintor. El kit también puede incluir nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa. El kit también puede incluir un prospecto del envase e instrucciones para usar los cebadores, sondas y restos de fluoróforo para detectar la presencia o ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en una muestra.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en las pruebas de la presente materia objeto, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Los detalles de uno o más modos de realización se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La FIGURAS 1A y 1B muestran secuencias de amplicones naturales y mutantes para la diana del gen rpoB e indican cada uno de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB.

La FIGURAS 2A y 2B muestran secuencias de amplicones naturales y mutantes para la diana del gen inhA e indican cada uno de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB.

La FIGURAS 3A y 3B muestran secuencias de amplicones naturales y mutantes para la diana del gen katG e indican cada uno de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB.

Las FIGURAS 4 y 4B muestran el ensayo de la curva de crecimiento para la detección de sondas específicas de SNP por PCR simple usando una sonda no modificada para SNP 522L en comparación con el uso de una sonda modificada para SNP 522L (diana MT (~ 1 e6, 1 e2, 1 e310c/PCR) en comparación con WT).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El diagnóstico de las infecciones por MTB-RIF y/o MTB-INH por amplificación de ácidos nucleicos proporciona un procedimiento para detectar de forma rápida y con exactitud infecciones por MTB-RIF y/o MTB-INH. Se describe un ensayo ultrarrápido para detectar MTB-RIF y/o MTB-INH en una muestra en el presente documento. Se proporcionan cebadores y sondas para detectar los ácidos nucleicos diana de rpoB, inhA y katG de MTB-RIF y/o MTB-INH, al igual que artículos de fabricación o kits que contengan dichos cebadores y sondas. La mayor sensibilidad de la PCR ultrarrápida para la detección de m TB-RIF y/o MTB-INH en comparación con otros procedimientos, así como las características mejoradas de la PCR ultrarrápida, incluyendo la contención de la muestra y la detección ultrarrápida del producto amplificado, hacen factible la implementación de esta tecnología para el diagnóstico de rutina de infecciones por MTB-RIF y/o MTB-INH en el laboratorio clínico.

La identificación de MTB farmacorresistente requiere la detección de numerosos polimorfismos mononucleotídicos (SNP) en el genoma de MTB localizado en varios genes diferentes. Usando una novedosa variación del diseño de la sonda de hidrólisis (también conocida como sonda TaqMan), se creó una multiplexación de sondas TaqMan altamente discriminantes, en la que cada sonda TaqMan puede detectar un único SNP sin reactividad cruzada. Las sondas están diseñadas para ser muy cortas y estar altamente estabilizadas para que se unan y escindan con gran especificidad solo a una secuencia farmacorresistente (mutante) perfectamente compatible.

La presente divulgación proporciona sondas TaqMan para la detección de los diversos SNP que confieren resistencia a MTB-RIF y MTB-INH. Las sondas compatibles con TaqMan no pueden, en general, detectar emparejamientos incorrectos de pares de bases individuales. En general, las sondas TaqMan están diseñadas para que sean mucho más largas y tengan una temperatura de fusión significativamente mayor que los cebadores para PCR asociados para garantizar una unión adecuada de la sonda a la secuencia diana antes de los cebadores y lograr la máxima escisión de la sonda durante la PCR. Debido a la alta temperatura de fusión y la longitud de dichas sondas, en general son muy tolerantes a un emparejamiento erróneo de una única base debajo de la región de la sonda y, por tanto, no discriminan entre dos dianas que difieren en una única base. En las presentes divulgaciones, las sondas TaqMan de hidrólisis pueden detectar con éxito solo MTB farmacorresistente y no reaccionar de forma cruzada con MTB farmacosensible, que solo pueden diferir en una única base. La presente divulgación proporciona numerosas sondas cortas y altamente modificadas que pueden detectar un emparejamiento erróneo de un único par de bases debajo de la región de la sonda. Las bases modificadas que se pueden sustituir en los diseños de sonda incluyen propinil-dC, tbutil-bencil-dC, propinil-dU, abrazaderas de G, metil-dC, N6-metil-dA y 7-desaza-dG. Al diseñar las sondas, los autores de la presente invención colocaron estratégicamente varios pares de bases modificados dentro de las secuencias de la sonda para maximizar la capacidad de discriminación de la sonda. Se descubrió que algunas modificaciones funcionan mejor que otras, y que la capacidad de discriminación se ve afectada por la colocación de las modificaciones en la sonda.

La presente divulgación proporciona procedimientos y kits para ensayos de multiplexación que pueden utilizar una pluralidad de sondas TaqMan altamente modificadas en los que cada sonda puede detectar un único SNP conocido por conferir farmacorresistencia a la rifampicina (RIF) y a la isoniazida (INH) en el genoma de MTB sin una reacción cruzada significativa con MTB farmacosensible (natural). La capacidad exclusiva de las sondas TaqMan divulgadas para detectar SNP mutantes sin una reactividad cruzada con WT significativa permite que el ensayo detecte una presencia menor de MTB farmacorresistente cuando se mezcla en un fondo de mutantes (WT). Se ha informado de la presencia de infección mixta, y se ha sugerido que la prevalencia de infección mixta está infranotificada debido a que los ensayos comerciales actuales no pueden detectar MTB farmacorresistente en presencia de MTB farmacosensible. El Centro para el Control de Enfermedades (CDC) informa de que un paciente que está infectado por tan solo un 1 % de MTB farmacorresistente en un contexto de WT puede presentar fracaso terapéutico con su régimen de tratamiento propuesto.

Los procedimientos pueden incluir realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una o más partes de dianas génicas de moléculas de ácido nucleico de rpoB, inhA y katG de una muestra usando una pluralidad de pares de cebadores, que incluyen cebadores específicos para rpoB, inhA y katG como se usan en el presente documento, que se refieren a cebadores oligonucleotídicos que específicamente se acopla a secuencias de ácido nucleico que codifican rpoB, inhA, y katG, respectivamente, e iniciar la síntesis de los mismos en condiciones apropiadas. Cada uno de los cebadores para rpoB, inhA y katG analizados se acopla a una diana dentro de o adyacente a la diana génica de la molécula de ácido nucleico de rpoB, inhA, y katG respectiva, de modo que al menos una parte de cada producto de amplificación contiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la diana respectiva. El uno o más productos de amplificación de rpoB, inhA y katG se producen siempre que uno o más del ácido nucleico de rpoB, inhA y katG está presente en la muestra, por tanto, la presencia del uno o más de los productos de amplificación de rpoB, inhA y katG son indicativos de la presencia de rpoB, inhA y katG en la muestra. El producto de amplificación debe contener las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a una o más sondas detectables para la detección de los SNP en rpoB, inhA y katG que confieren resistencia a la rifampicina y/o isoniacida a MTB. Cada etapa de ciclado incluye una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección, en la que la muestra se pone en contacto con una o más sondas detectables para rpoB, inhA y katG para la detección de la presencia o ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificación" se refiere al procedimiento de sintetizar moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una o ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico molde (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico de rpoB, inhA y katG). Amplificar una molécula de ácido nucleico típicamente incluye desnaturalizar el ácido nucleico molde, hibridar cebadores al ácido nucleico molde a una temperatura que esté por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores y alargar enzimáticamente a partir de los cebadores para generar un producto de amplificación. La amplificación requiere típicamente la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Taq Platinum®) y un tampón apropiado y/o cofactores para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCh y/o KCl).

El término "cebador" se usa en el presente documento como se conoce por los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3', por ejemplo, del oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre al que se pueden unir "nucleótidos" adicionales por una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster 3' a 5', con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato, y con lo que se libera pirofosfato. Por lo tanto, no existe una diferencia fundamental entre un "cebador", un "oligonucleótido" o una "sonda", excepto posiblemente para la función deseada.

El término "hibridación" se refiere a la hibridación de una o más sondas a un producto de amplificación. Las condiciones de hibridación típicamente incluyen una temperatura que está por debajo de la temperatura de fusión de las sondas, pero que evita la hibridación no específica de las sondas.

El término "actividad nucleasa en dirección 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada a la síntesis de la hebra de ácido nucleico, con lo que los nucleótidos se eliminan del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión del cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y continúa en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la cadena molde. Las polimerasas termoestables se han aislado de Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no son termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.

El término "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico que al mismo tiempo tiene la misma longitud que, y es exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.

El término "extensión" o "alargamiento" cuando se usa con respecto a ácidos nucleicos, se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótidos, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo terminal 3' de un ácido nucleico.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o por inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los programas BLAST, que se describen, por ejemplo, en Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search" Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol.

266:131-141, Altschul et al. (1997) "Gapped BLAs T and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, y Zhang et al. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation" Genome Res. 7:649-656.

Un "nucleótido modificado" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia de oligonucleótidos se remplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, una C5-metil-dC, una C5-etil-dC, una C5-metil-dU, una C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, una C5-propinil-dC, una C5-propinil-dU, una C7-propinil-dA, una C7-propinil-dG, una C5-propargilamino-dC, una C5-propargilamino-dU, una C7-propargilamino-dA, una C7-propargilamino-dG, una 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, una seudo-dU, un nitropirrol, un nitroindol, 2'-O-metilribo-U, 2'-O-metil-ribo-C, una N4-etil-dC, una N6-metil-dA y similares. Muchos otros nucleótidos modificados que se pueden estar sustituidos en los oligonucleótidos se mencionan en este documento o se conocen de otro modo en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tf) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos no modificados correspondientes. Para ilustrar adicionalmente, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácido nucleico inespecífica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebadores o similares), aumentar el rendimiento de un amplicón diana deseado y/o similares en algunos modos de realización. Los ejemplos de estos tipos de modificaciones en ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.001.611.

Ácidos nucleicos y oligonucleótidos de MTB-RIF y/o MTB-INH

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar MTB-RIF y/o MTB-INH mediante la amplificación, por ejemplo, de una parte de una o más de las secuencias de ácidos nucleicos de rpoB, inhA y katG. Secuencias de ácidos nucleicos para rpoB, inhA y katG están disponibles, por ejemplo, a través de GenBank. Específicamente, los cebadores y las sondas para amplificar y detectar dianas de moléculas de ácido nucleico de rpoB, inhA y katG se proporcionan por los modos de realización en la presente divulgación.

Más específicamente, los modos de realización de los oligonucleótidos incluyen, cada uno, un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438, una variante sustancialmente idéntica de la misma en la que la variante tiene al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con una de las SEQ ID No : 1-409 y 434-438, o un complemento de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438 y la variante.

TABLA I: Sonda para dianas de moléculas de ácido nucleico de rpoB, inhA y katG

En un modo de realización, lo anterior describe una pluralidad de conjuntos de cebadores y sondas para rpoB, inhA y katG para proporcionar la detección de MTB-RIF y/o MTB-INH en una muestra biológica sospechosa de contener MTB-RIF y/o MTB-INH. Los conjuntos de cebadores y sondas pueden comprender o consistir en los cebadores y las sondas específicos para las secuencias de ácido nucleico de rpoB, inhA y katG, que comprenden o consisten en las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438. En otro modo de realización, los cebadores y las sondas para las dianas de rpoB, inhA y katG comprenden o consisten en una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438.

Una variante funcionalmente activa de cualquiera de las sondas de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438 se puede identificar usando las sondas en el procedimiento divulgado. Una variante funcionalmente activa de una sonda de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438 se refiere a un cebador que proporciona una especificidad y sensibilidad similares o mayores en el procedimiento o kit descrito en el presente documento en comparación con la secuencia respectiva de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438.

La variante puede variar, por ejemplo, de la secuencia de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438 en una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos, tal como una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la secuencia respectiva de las SEQ ID NO: 1-409 y 434-438. Como se detalla anteriormente, un cebador (y/o sonda) se puede modificar químicamente, es decir, un cebador y/o sonda pueden comprender un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. Una sonda (o un cebador) es, entonces, un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos nucleotídicos") difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base o compuesto similar a base, un azúcar pentofuranosilo o un compuesto similar a azúcar pentofuranosilo, una parte fosfato o parte similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un "marcador" se puede unir a la parte de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede remplazar por, por ejemplo, una 7-desazapurina, con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo nucleotídico" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo nucleosídico") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera como se explica anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo nucleotídico").

Los oligonucleótidos, incluyendo los oligonucleótidos modificados y los análogos de oligonucleótidos que amplifican una molécula de ácido nucleico que codifica las secuencias de ácido nucleico de rpoB, inhA y katG, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican partes alternativas de rpoB, inhA y katG se pueden diseñar usando, por ejemplo, un programa de ordenador como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores necesitan ser lo suficientemente largos para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis oligonucleotídica). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos tienen una longitud de 8 a 50, en particular de 10 a 40 o de 12 a 40 nucleótidos (por ejemplo, una longitud de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 nucleótidos).

Además de un conjunto de cebadores, los procedimientos divulgados pueden usar una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH. El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que por diseño o selección contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridar en rigurosidades predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) con "ácidos nucleicos diana", en el presente caso con un ácido nucleico (diana) de MTB-RIF y/o MTB-INH. Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", lo que significa que detecta el ácido nucleico diana.

En algunos modos de realización, las sondas para rpoB, inhA y katG descritas se pueden marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, las sondas para rpoB, inhA y katG se pueden marcar con un resto fluorescente donador, por ejemplo, un tinte fluorescente, y un resto fluorescente aceptador correspondiente, por ejemplo, un extintor.

En un modo de realización, las sondas comprenden o consisten en un resto fluorescente y las secuencias de ácido nucleico comprenden o consisten en las Se Q ID NO: 1-409 y 434-438.

El diseño de los oligonucleótidos que se van a usar como sondas de hibridación se puede realizar de manera similar al diseño de los cebadores. Los modos de realización pueden usar una única sonda o un par de sondas para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, el uso de la(s) sonda(s) puede comprender al menos un marcador y/o al menos un resto de extintor. Como sucede con los cebadores, las sondas normalmente tienen temperaturas de fusión similares, y la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que se produzca la hibridación específica de secuencia, pero no tan larga como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas en general tienen 40 nucleótidos o menos y en particular tienen una longitud entre 12 a 40, 15 a 40 y 15 a 30 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) nucleótidos.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las patentes de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR típicamente emplea dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en algunos modos de realización incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como puntos de iniciación de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico diana de rpoB, inhA y katG descritas. Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir de forma sintética. El cebador es preferentemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan en primer lugar, es decir, se tratan para separar las cadenas. Un procedimiento de desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos cadenas antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de las cadenas se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento de separación de las cadenas de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal tampón y de la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se desnaturalizan, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo que depende de los rasgos característicos de la reacción, tal como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización típicamente se realiza durante aproximadamente 30 s a 4 min (por ejemplo, de 1 min a 2 min 30 s, o 1,5 min).

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza con calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueve el apareamiento de cada cebador con su secuencia diana en las moléculas de ácido nucleico de rpoB, inhA y katG descritas. La temperatura para la hibridación es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). A continuación, se ajusta la mezcla de reacción a una temperatura a la que se promueve u optimiza la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para extensión varía, en general, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, de aproximadamente 30 s a aproximadamente 4 min; de aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min; de aproximadamente 1 min 30 s a aproximadamente 2 min).

Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico de MTB-RIF y/o MTB-INH, tal como ARN o ADN (ADNc). El ácido nucleico molde no tiene que estar purificado; puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, tal como ácido nucleico de MTB-RIF y/o MTB-INH contenido en células humanas. Las moléculas de ácido nucleico de MTB-RIF y/o MTB-INH se pueden extraer de una muestra biológica por técnicas rutinarias, tales como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications (Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se pueden obtener ácidos nucleicos a partir de una serie de fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales, incluyendo bacterias, levaduras, virus, orgánulos u organismos superiores, tales como plantas o animales.

Los cebadores oligonucleotídicos se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reacción que inducen la extensión del cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de la cadena incluyen, en general, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCh 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 0,5-1,0 pg de ADN molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de Taq polimerasa y DMSO al 10 %). Las reacciones contienen normalmente de 150 a 320 pM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP, dGTP o uno o más análogos de los mismos.

Las cadenas recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación, apareamiento y alargamiento de la hebra se pueden repetir con tanta frecuencia como sea necesario para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a las moléculas de ácido nucleico diana de MTB-RIF y/o MTB-INH. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclo (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclo dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclo para amplificar la secuencia diana lo suficiente para la detección. En general, las etapas de ciclo se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir hasta 40, 60 o incluso 100 veces.

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

La tecnología de FRET (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en el concepto de que cuando un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente se sitúan a una determinada distancia entre sí, tiene lugar una transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o de otro modo detectar y/o cuantificar. El donador típicamente transfiere la energía al aceptador cuando se excita el donador por radiación luminosa con una longitud de onda adecuada. El aceptador típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación luminosa con una longitud de onda diferente.

En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto fluorescente donador y un extintor correspondiente, que puede ser fluorescente o no, y que disipa la energía transferida en una forma diferente a la luz. Cuando la sonda está intacta, la transferencia de energía se produce típicamente entre los dos restos fluorescentes, de modo que la emisión fluorescente desde el resto fluorescente donador se extingue. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, se escinde una sonda unida a un producto de amplificación mediante la actividad nucleasa en dirección 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq de manera que la emisión fluorescente del resto fluorescente donador ya no se extingue. Las sondas ejemplares para este propósito se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. Los pares donador-aceptador usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

En otro ejemplo, dos sondas oligonucleotídicas, que contienen, cada una, un resto fluorescente, pueden hibridar con un producto de amplificación en posiciones particulares determinadas por la complementariedad de las sondas oligonucleotídicas con la secuencia de ácido nucleico diana de MTB-RIF y/o MTB-INH. Tras la hibridación de las sondas oligonucleotídicas con el ácido nucleico del producto de amplificación en las posiciones apropiadas, se genera una señal de FRET. Las temperaturas de hibridación pueden variar de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C durante de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min.

Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para controlar la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. La excitación para iniciar la transferencia de energía se puede llevar a cabo con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.

Como se usa en el presente documento con respecto a los restos fluorescentes donador y aceptador correspondientes, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptador que tiene un espectro de emisión que se superpone al espectro de excitación del resto fluorescente donador. El máximo de longitud de onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptador debe ser al menos 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donador. En consecuencia, se puede producir una transferencia de energía no radiativa eficaz entre los mismos.

Los restos fluorescentes donador y aceptador correspondientes se eligen, en general, para (a) la transferencia de energía de Forster de alta eficacia; (b) una gran variación de Stokes final (>100 nm); (c) una variación de la emisión lo más lejos posible en la parte roja del espectro visible (>600 nm); y (d) una variación de la emisión a una mayor longitud de onda que la emisión fluorescente del agua de Raman producida por excitación en la longitud de onda de excitación del donador. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donador que tenga su máximo de excitación cerca de una línea láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y una buena superposición de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del resto fluorescente aceptador correspondiente. Se puede elegir un resto fluorescente aceptador correspondiente que tenga un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, una buena superposición de su excitación con la emisión del resto fluorescente donador y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm).

Los restos fluorescentes donadores representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptadores en la tecnología de FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, 9-acridinisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenbutirato de succinimidilo y derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptadores representativos, que dependen del resto fluorescente donador usado, incluyen LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonil lisamina rodamina B, tetrametilrodaminaisotiocianato, rodamina x-isotiocianato, eritrosina-isotiocianato, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donador y aceptador, por ejemplo, de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Los restos fluorescentes donador y aceptador se pueden unir al oligonucleótido de sonda apropiado por medio de un brazo conector. La longitud de cada brazo conector es importante, ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donador y aceptador. La longitud de una sección conectora es la distancia en Angstroms (A) desde la base de nucleótido hasta el resto fluorescente. En general, un brazo de conector es de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. El brazo de conector puede ser de la clase descrita en el documento Wo 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para unir brazos de conector a una base nucleotídica particular, y también para unir restos fluorescentes a un brazo de conector.

Un resto fluorescente aceptador, como un LC Red 640, se puede combinar con un oligonucleótido que contiene un conector amino (por ejemplo, C6-aminofosforamiditas disponibles en ABI (Foster City, California) o Glen Research (Sterling, VA)) para producir, por ejemplo, oligonucleótido marcado con LC Red 640. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donador, tal como fluoresceína, a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de éster de NHS de fluoresceína, tal como CX-fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, Calif.)) o 3'-amino-CPG que requieren el acoplamiento de un éster de NHS de fluoresceína después de la síntesis de los oligonucleótidos.

Detección de MTB-RIF y/o MTB-INH

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en una muestra biológica o no biológica. Los procedimientos proporcionados en el presente documento evitan problemas de contaminación de la muestra, falsos negativos y falsos positivos. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una parte de moléculas de ácido nucleico diana de rpoB, inhA y katG de una muestra usando una pluralidad de pares de cebadores para rpoB, inhA y katG, y una etapa de detección de FRET. Se realizan múltiples etapas de ciclo, preferentemente en un termociclador. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar usando cebadores y sondas para rpoB, inhA y katG para detectar la presencia de dianas de rpoB, inhA y katG, y la detección de los SNP descritos en las dianas de rpoB, inhA y katG indica la presencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra.

Como se describe en el presente documento, los productos de amplificación se pueden detectar usando sondas de hibridación marcadas que aprovechan la tecnología FRET. Un formato de FRET utiliza la tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación y, por consiguiente, la presencia o ausencia del ácido nucleico diana. La tecnología TaqMan® utiliza una sonda monocatenaria de hibridación marcada con, por ejemplo, un tinte fluorescente y un extintor, que puede ser o no ser fluorescente. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente es, en general, una molécula de extintor. Durante la etapa de apareamiento de la reacción de PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada mediante la actividad nucleasa en dirección 5' a 3' de, por ejemplo, la polimerasa Taq durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente y el resto extintor se separan espacialmente uno del otro. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) usa la tecnología TaqMan® y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia del ácido nucleico diana en la muestra.

En general, la presencia de FRET indica la presencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra. Sin embargo, la recogida inadecuada de muestras, los retrasos en el transporte, las condiciones de transporte inapropiadas o el uso de determinados hisopos de recogida (alginato de calcio o varilla de aluminio) son todas condiciones que pueden afectar al éxito y/o la exactitud del resultado de una prueba. Usando los procedimientos divulgados en el presente documento, la detección de FRET en, por ejemplo, 45 etapas de ciclado es indicativa de una infección por MTB-RIF y/o MTB-INH.

Las muestras biológicas representativas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, hisopos dérmicos, hisopos nasales, hisopos para heridas, hemocultivos, piel e infecciones de partes blandas. Son conocidos procedimientos de recogida y almacenamiento de muestras biológicas por los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, por procedimientos y/o kits de extracción de ácido nucleico conocidos en la técnica) para liberar el ácido nucleico de MTB-RIF y/o MTB-INH o, en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de la reacción PCR y los oligonucleótidos apropiados.

Dentro de cada serie del termociclador, también se pueden realizar ciclos de muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico diana (distinto de los productos de amplificación descritos de genes diana) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción de plásmido que contiene las moléculas de ácido nucleico diana. Dicho control plasmídico se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una muestra separada que se realiza paralelamente con las muestras del paciente usando los mismos cebadores y la misma sonda que los usados para la detección de la diana deseada. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Cada serie del termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carece de ADN molde diana. El control negativo puede medir la contaminación. Esto garantiza que el sistema y los reactivos no den lugar a una señal positiva falsa. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores de hibridarse con especificidad de secuencia y de iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas de hibridarse con especificidad de secuencia y para que se produzca la FRET.

En un modo de realización, los procedimientos incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa se describe en las patentes de EE. UU. n.os 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una serie del termociclador y la siguiente.

Se pueden usar procedimientos de PCR convencionales junto con la tecnología FRET. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR ultrarrápida como se usa en la tecnología LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.

El LightCycler® se puede hacer funcionar usando una estación de trabajo para PC y puede utilizar un sistema operativo Windows NT. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede visualizar las señales de fluorescencia ultrarrápidas inmediatamente después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una visualización cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclo para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para un análisis posterior.

Se entiende que los modos de realización descritos en el presente documento no se limitan por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.

Artículos de fabricación/kits

Los modos de realización de la presente divulgación proporcionan además artículos de fabricación o kits para detectar MTB-RIF y/o MTB-INH. Un artículo de fabricación puede incluir cebadores y sondas usados para detectar rpoB, inhA y katG, conjuntamente con materiales de embalaje adecuados. Los cebadores y sondas representativos para la detección de MTB-RIF y/o MTB-INH pueden hibridar con moléculas de ácido nucleico diana de rpoB, inhA y katG. Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. Los procedimientos de diseño de cebadores y sondas se divulgan en el presente documento, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores y sondas que amplifican e hibridan con moléculas de ácido nucleico diana de rpoB, inhA y katG.

Los artículos de fabricación también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas o, alternativamente, las sondas suministradas con el kit pueden estar marcadas. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donador y/o aceptador para marcar las sondas para rpoB, inhA y katG. Anteriormente se proporcionan ejemplos de restos fluorescentes donadores de FRET adecuados y restos fluorescentes aceptadores correspondientes.

Los artículos de fabricación también pueden contener un prospecto o ficha técnica que contiene instrucciones para usar los cebadores y sondas para rpoB, inhA y katG para detectar MTB-RIF y/o MTB-INH en una muestra. Los artículos de fabricación pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasa, cofactores o agentes para prevenir la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento.

Los modos de realización de la presente divulgación se describirán adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

EJEMPLO

Detección de SNP específicos usando sondas ejemplares para rpoB, inhA y katG

Se examinaron sondas ejemplares para determinar su capacidad para detectar 17 SNP en el gen rpoB que confieren resistencia a la rifampicina en MTB, que incluyen rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513P, rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R, 3 SNP en el gen inhA que confieren resistencia a la isoniazida en MTB que incluyen inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C y 4 SNP en el gen katG que también confieren resistencia a isoniazida en MTB que incluyen katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2.

Se usaron diversos plásmidos que comprenden los ácidos nucleicos respectivos, cada uno de los cuales representa uno, dos o tres SNP. En el presente documento, en cada pocillo, la mezcla maestra (MMX) que comprende tampón, ADN polimerasa ZO5, nucleótidos trifosfato, pares de cebadores que pueden amplificar las regiones diana rpoB, inhA y katG y las sondas ejemplares mostradas en la Tabla II se enriqueció con un tipo de ADN plasmídico, cada uno de los cuales comprende uno, dos o tres SNP particulares como se muestra en la Tabla II. Se usó un plásmido que comprende una secuencia 16S como control positivo usando un par de cebadores y una sonda específicos de 16s . Posteriormente, se cargaron las placas de múltiples pocillos en el sistema cobas® 6800 (Roche Molecular Systems) y se sometieron a una reacción de amplificación y detección. Los resultados se indican en la Tabla II.

TABLA II: Resultados para sondas ejemplares para rpoB, inhA y katG

Aunque la divulgación precedente se ha descrito con algún detalle con propósitos de claridad y entendimiento, será evidente para un experto en la técnica, a partir de una lectura de esta divulgación, que se pueden realizar diversos cambios en forma y detalle sin apartarse del verdadero alcance de la divulgación. Por ejemplo, se pueden usar todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente en diversas combinaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistente a la rifampicina (MTB-RIF) y/o MTB resistente a la isoniazida (MTB-INH) en una muestra, comprendiendo el procedimiento un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa ultrarrápida múltiple que comprende:

- realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con al menos un conjunto de cebadores para rpoB, un conjunto de cebadores para inhA y un conjunto de cebadores para katG para producir uno o más productos de amplificación si algún ácido nucleico diana de rpoB, inhA y katG está presente en la muestra; - realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto dicho uno o más productos de amplificación con una pluralidad de sondas detectables para rpoB, una pluralidad de sondas detectables para inhA y una pluralidad de sondas detectables para katG, que comprenden al menos:

- 17 sondas para rpoB para la detección de uno o más de los 17 polimorfismos mononucleotídicos SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB;

- 3 sondas para inhA para la detección de uno o más de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y

- 4 sondas para katG para la detección de uno o más de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y

detectar la presencia o ausencia de dichos uno o más productos de amplificación, en el que la presencia de dichos uno o más productos de amplificación es indicativa de la presencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra y en el que la ausencia de dichos uno o más productos de amplificación es indicativa de la ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra;

en el que dicha pluralidad de sondas para rpoB comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB, que comprenden rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513P, rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R;

en el que dicha pluralidad de sondas para inhA comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a m Tb , que comprenden inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C;

en el que dicha pluralidad de sondas para katG comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB, que comprenden katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2; y

en el que:

- las sondas para rpoB comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-289 y 437-438, o un complemento de las mismas;

- las sondas para inhA comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y

- las sondas para katG comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434-435, o un complemento de las mismas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que cada una de la pluralidad de sondas detectables para rpoB, inhA y katG se marca con un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente; y en el que la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donador y el resto fluorescente aceptador de una o más de las sondas para rpoB, inhA y katG,

en el que la presencia o ausencia de emisión de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de MTB-RIF y/o MTB-INH en la muestra.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3'.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dichos restos fluorescentes donador y aceptador están a no más de 8 nucleótidos entre sí en dicha sonda.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho resto fluorescente aceptador es un extintor.

6. Un kit para detectar un ácido nucleico de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistente a la rifampicina (MTB-RIF) y/o MTB resistente a la isoniacida (MTB-INH), que comprende:

- una pluralidad de conjuntos de cebadores para rpoB, inhA y katG específicos para la amplificación de dianas génicas de rpoB, inhA y katG; y

- una pluralidad de sondas detectables para rpoB, inhA y katG específicas para la detección de productos de amplificación de rpoB, inhA y katG, que comprenden:

- 17 sondas para rpoB para la detección de uno o más de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB; - 3 sondas para inhA para la detección de uno o más de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; y - 4 sondas para katG para la detección de uno o más de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB; en el que dicha pluralidad de sondas para rpoB comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 17 SNP que confieren resistencia a la rifampicina a MTB, que comprenden rpoB 531L, rpoB 531W, rpoB 526L, rpoB 526Y, rpoB 526D, rpoB 526N, rpoB 513L, rpoB 513K, rpoB 513P, rpoB 522L, rpoB 522Q, rpoB 522W, rpoB 516V, rpoB 516Y, rpoB 533P, rpoB 511P y rpoB 526R;

en el que dicha pluralidad de sondas para inhA comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 3 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a m Tb , que comprenden inhA-15T, inhA-8A e inhA-8C;

en el que dicha pluralidad de sondas para katG comprende sondas de hidrólisis para la detección de cada uno de los 4 SNP que confieren resistencia a la isoniazida a MTB, que comprenden katG 315I, katG 315N, katG 315T y katG 315T2; y

en el que:

- las sondas para rpoB comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-289 y 437-438, o un complemento de las mismas;

- las sondas para inhA comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 344-409 y 436, o un complemento de las mismas; y

- las sondas para katG comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 290-343 y 434-435, o un complemento de las mismas.

7. El kit de la reivindicación 6, en el que cada sonda de dicha pluralidad de sondas detectables para rpoB, inhA y katG comprende un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente.

8. El kit de la reivindicación 7, en el que el resto fluorescente aceptador es un extintor.

9. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende además nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa.

10. Una sonda oligonucleotídica que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 -409 y 434-438, o un complemento de la misma y que comprende además uno o más marcadores detectables.

11. El oligonucleótido de la reivindicación 10, en el que el oligonucleótido comprende al menos un nucleótido modificado.

12. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, en el que el oligonucleótido comprende al menos una variación conservativamente modificada.

13. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que el oligonucleótido tiene 40 o menos nucleótidos.

14. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el oligonucleótido comprende al menos un resto marcador y/o al menos un resto extintor.