ES2854049T3 - Composiciones y procedimientos para la detección de Mycoplasma genitalium - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de detección de Mycoplasma genitalium (MG) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: - realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores para el gen de MG diana para producir un producto de amplificación si un ácido nucleico del gen de MG diana está presente en la muestra; - realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas para el gen de MG diana detectables; y - detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia de MG en la muestra y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de MG en la muestra; en el que el conjunto de cebadores para el gen de MG diana y la una o más sondas para el gen de MG diana detectables amplifican y detectan la región EF variable de las repeticiones parciales de mgpB (MgPar); y en el que el conjunto de cebadores para el gen de MG diana comprende un primer cebador que comprende una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47-56 o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-66, o un complemento de las mismas; y en el que la una o más sondas para el gen de MG diana detectables comprende una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67-89, o el complemento de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la detección de Mycoplasma genitalium

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere al campo del diagnóstico molecular, y, más en particular, a la detección de Mycoplasma genitalium.

Antecedentes de la invención

Mycoplasma genitalium (MG) es una bacteria gramnegativa que carece de pared celular y vive en la superficie y en las células epiteliales de los aparatos urinario y genital de hombres y mujeres. M. genitalium es una causa común de uretritis no gonocócica (UNG) en hombres y una causa cada vez más reconocida de cervicitis e infección genital alta (IGA) en mujeres. Un metaanálisis reciente ha demostrado que la infección con M. genitalium se asoció con un incremento aproximadamente doble del riesgo de cervicitis, infección genital alta, parto prematuro, aborto espontáneo e infertilidad en mujeres. Se ha informado de que la prevalencia de M. genitalium en poblaciones de menor riesgo, tanto en hombres como en mujeres, es aproximadamente de un 1 % a un 3 %. En poblaciones de mayor riesgo, se ha informado de una prevalencia de un 10 % a un 41 % en hombres y de un 7,3 % a un 14 % en mujeres. La prevalencia de M. genitalium en poblaciones de mayor riesgo a menudo supera a la de Neisseria gonorrhoeae y es similar a la prevalencia de Chlamydia trachomatis. Las infecciones por M. genitalium en gran parte no se reconocen y los individuos infectados son asintomáticos o bien tienen síntomas similares a los asociados con otras infecciones bacterianas del aparato genitourinario.

El diagnóstico de la infección por M. genitalium tradicionalmente ha sido el cultivo de muestras genitourinarias, pero el cultivo es insensible y lento y puede llevar hasta 6 meses recuperar el organismo. Las pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT) para el diagnóstico de la infección por M. genitalium en las NAAT de Estados Unidos y Europa se han puesto a disposición como procedimientos desarrollados en el laboratorio (LDP) y se ha demostrado que tienen una sensibilidad superior en comparación con el cultivo.

El Centro para el Control de Enfermedades (CDC) recomienda que se sospeche de M. genitalium en los casos de uretritis crónica o recidivante y se puede considerar en los casos crónicos o recidivantes de cervicitis e infección genital alta (IGA). El hecho de que M. genitalium sea un organismo de crecimiento lento, el cultivo no esté fácilmente disponible y sea lento e insensible hace que las NAAT sean el procedimiento preferente para la detección de M. genitalium. En entornos de investigación, se diagnostica M. genitalium por pruebas NAAT de frotis de orina, uretral, vaginal y cervicouterino y a través de biopsias de endometrio, típicamente usando PCR interna o ensayos pretendidos únicamente para la investigación. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de obtener un procedimiento rápido y fiable para detectar específicamente MG de una manera sensible.

Sumario de la invención

Determinados modos de realización en la presente divulgación se refieren a procedimientos para la detección rápida de la presencia o ausencia de MG en una muestra biológica o no biológica, por ejemplo, detección múltiple de MG por reacción en cadena de la polimerasa ultrarrápida en un único tubo de ensayo. Los modos de realización incluyen procedimientos de detección de MG que comprenden realizar al menos una etapa de ciclado, que puede incluir una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. Además, los modos de realización incluyen cebadores, sondas y kits que se diseñan para la detección de MG en un único tubo. Los procedimientos de detección se diseñan para seleccionar genes específicos en el genoma de M. genitalium con un potencial para discriminar al vecino más cercano, Mycoplasma pneumonia, y también a otros patógenos o comensales encontrados en la boca humana o aparato genitourinario.

Se proporciona un procedimiento para detectar MG en una muestra, que incluye realizar una etapa de amplificación que incluye poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores diseñados para seleccionar un gen de MG específico para producir un producto de amplificación si MG está presente en la muestra; realizar una etapa de hibridación que incluye poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas detectables para el gen de MG diana; y detectar la presencia o ausencia del producto amplificado, en el que la presencia del producto amplificado es indicativa de la presencia de MG en la muestra y en el que la ausencia del producto amplificado es indicativa de la ausencia de Mg en la muestra; en el que el gen de MG diana es la región EF variable de las repeticiones parciales de mgpB (MgPar). La figura 1 muestra una imagen del genoma circular de M. genitalium y las localizaciones del gen mgpB y las nueve repeticiones parciales MgPar.

En un aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de Mycoplasma genitalium (MG) en una muestra, comprendiendo el procedimiento realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores para el gen de MG diana para producir un producto de amplificación si un ácido nucleico del gen de MG diana está presente en la muestra; realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas para el gen de MG diana detectables; y detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia de MG en la muestra y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de MG en la muestra; en el que el conjunto de cebadores para el gen de MG diana comprende un primer cebador que comprende una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47-56 o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-66, o un complemento de las mismas; y en el que la una o más sondas para el gen de MG diana detectables comprende una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67-89, o el complemento de las mismas.

En otro modo de realización, en combinación con cebadores para MgPar, las SEQ ID NO: 47-66 con el conjunto de cebadores para la amplificación de la diana del gen mgpB incluye un primer cebador que comprende o que consiste en una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35, o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende o que consiste en una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 36, 37, 38, 39, 40 y 41, o un complemento de las mismas, y la sonda detectable para la detección del producto de amplificación del gen mgpB incluye o consiste en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45 y 46, o un complemento de las mismas. En determinados modos de realización, el conjunto de cebadores para la amplificación de la diana del gen mgpB incluye un primer cebador que comprende o que consiste en una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34 y 35, o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende o que consiste en una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 40 y 41, o un complemento de las mismas, y la sonda detectable para la detección del producto de amplificación del gen mgpB incluye o consiste en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 45 y 46, o un complemento de las mismas.

En otro modo de realización, el conjunto de cebadores para la amplificación de la diana del gen MgPar incluye un primer cebador que comprende o que consiste en una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56, o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende o que consiste en una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 y 66, o un complemento de las mismas, y la sonda detectable para la detección del producto de amplificación del gen MgPar incluye o consiste en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 y 89, o un complemento de las mismas. En determinados modos de realización, el conjunto de cebadores para la amplificación de la diana del gen MgPar incluye un primer cebador que comprende o que consiste en una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48 y 56, o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende o que consiste en una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 65 y 66, o un complemento de las mismas, y la sonda detectable para la detección del producto de amplificación del gen MgPar incluye o consiste en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 80 y 89, o un complemento de las mismas.

En algunos modos de realización, la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación con la sonda para el gen de m G diana detectable que se marca con un resto fluorescente donante y un resto aceptor correspondiente; y la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donante y el resto aceptor de la sonda, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de Mg en la muestra. En algunos modos de realización, se repiten las etapas de amplificación y las de hibridación. En el presente documento, el número de repeticiones depende, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de amplificación e hibridación para amplificar lo suficiente la secuencia diana para la detección. En algunos modos de realización, se repiten las etapas de amplificación y las de hibridación al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tanto como al menos 25, 30, 40, 50, 60 o incluso 100 veces. Además, la detección de la presencia o ausencia del producto de amplificación se puede realizar durante o después de cada etapa de amplificación e hibridación, durante o después de cada etapa de amplificación e hibridación alterna, durante o después de etapas de amplificación e hibridación particulares o durante o después de etapas de amplificación e hibridación particulares, en las que, si está presente, se espera suficiente producto de amplificación para su detección. En algunos modos de realización, la etapa de amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'. En algunos modos de realización, el resto fluorescente donante y el resto aceptor correspondiente están separados en no más de 8-20 nucleótidos entre sí en la sonda. En algunos modos de realización el resto aceptor es un extintor.

En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 -89, o un complemento de las mismas tiene 100 nucleótidos o menos, 50 nucleótidos o menos, 40 nucleótidos o menos o 30 nucleótidos o menos. En algunos modos de realización, los primer y segundo cebadores para el gen de MG diana y la sonda para el gen de MG diana detectable tienen 40 nucleótidos o menos (por ejemplo, 35 nucleótidos o menos, 30 nucleótidos o menos, etc.). En otro modo de realización, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, etc.) con respecto a una de SEQ ID. NO: 1-89, o un complemento de las mismas, teniendo el oligonucleótido 100 nucleótidos o menos. En general, estos oligonucleótidos pueden ser ácidos nucleicos de cebador, ácidos nucleicos de sonda o similares en estos modos de realización. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación del ácido nucleico con respecto a los nucleótidos no modificados. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos incluyen al menos una variación modificada de forma conservadora. Las "variaciones modificadas de forma conservadora" o, simplemente, las "variaciones conservadoras" de una secuencia de ácido nucleico particular se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos de un 5 %, más típicamente menos de un 4 %, 2 % o 1 %) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de forma conservadora" donde las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. En algunos modos de realización, al menos uno de los primer y segundo cebadores para el gen de MG diana y la sonda para el gen de MG diana detectable comprende al menos un nucleótido modificado.

En algunos modos de realización, la amplificación (la etapa de amplificación) puede emplear una enzima polimerasa que tenga actividad nucleasa de 5' a 3'. Por tanto, el resto fluorescente donante y el resto aceptor, por ejemplo, un extintor, pueden estar separados en no más de 5 a 20 nucleótidos (por ejemplo, 8 o 10) entre sí a lo largo de la longitud de la sonda. En otro aspecto, la sonda detectable incluye una secuencia de ácido nucleico que permite la formación de estructuras secundarias. Dicha formación de estructuras secundarias, en general, da como resultado una proximidad espacial entre el primer y segundo resto fluorescente. De acuerdo con este procedimiento, el segundo resto fluorescente en la sonda puede ser un extintor.

La presente divulgación proporciona procedimientos de detección de la presencia o ausencia de MG en una muestra biológica de un individuo. Dichos procedimientos incluyen, en general, realizar al menos una etapa de ciclado, que incluye una etapa de amplificación y una etapa de unión a tinte. Típicamente, la etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con una pluralidad de pares de cebadores diseñados para seleccionar un gen de MG específico para producir uno o más productos de amplificación del gen de MG diana si la molécula de ácido nucleico del gen de Mg diana está presente en la muestra, y la etapa de unión a tinte incluye poner en contacto el producto de amplificación del gen de MG diana con un tinte de unión a ADN bicatenario. Dichos procedimientos también incluyen detectar la presencia o ausencia de unión del tinte de unión a ADN bicatenario en el producto de amplificación, en los que la presencia de unión es indicativa de la presencia de MG en la muestra, y en los que la ausencia de unión es indicativa de la ausencia de MG en la muestra. Un tinte de unión a ADN bicatenario representativo es bromuro de etidio. Además, dichos procedimientos también pueden incluir la determinación de la temperatura de fusión entre el producto de amplificación del gen de MG diana y el tinte de unión a ADN bicatenario, en los que la temperatura de fusión confirma la presencia o ausencia de mG. El gen de MG diana puede incluir el gen mgpB y las repeticiones parciales MgPar.

En otro aspecto, se proporciona un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos de MG. El kit puede incluir uno o más conjuntos de cebadores específicos para la amplificación del gen de MG diana; y una o más sondas detectables específicas para la detección de los productos de amplificación del gen de MG diana. El gen de MG diana puede incluir el gen mgpB y las repeticiones parciales MgPar. En particular, los cebadores y sondas oligonucleotídicos divulgados anteriormente en conexión con el procedimiento de acuerdo con la invención son adecuados para incluirse en un kit de acuerdo con la invención. En el presente documento, se proporciona un kit para detectar un ácido nucleico de Mycoplasma genitalium (MG) en una muestra que comprende un primer cebador que comprende o que consiste en una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47-56 o un complemento de las mismas; un segundo cebador que comprende o que consiste en una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-66, o un complemento de las mismas; y una sonda marcada de forma detectable fluorescente que comprende o que consiste en una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67-89, o un complemento, la sonda marcada de forma detectable configurada para hibridarse a un amplicón generado por el primer cebador y el segundo cebador. En un aspecto, el kit puede incluir sondas ya marcadas con el resto donante y aceptor correspondiente, por ejemplo, otro resto fluorescente o un extintor oscuro, o puede incluir restos fluorofóricos para marcar las sondas. El kit también puede incluir al menos uno de nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa. El kit también puede incluir un prospecto del envase e instrucciones para usar los cebadores, sondas y restos fluorofóricos para detectar la presencia o ausencia de MG en una muestra. En algunos modos de realización, la tercera secuencia de oligonucleótidos marcada de forma detectable comprende un resto fluorescente donante y un resto aceptor correspondiente. En algunos modos de realización el resto aceptor es un extintor. En algunos modos de realización, al menos uno de los primer, segundo y tercer oligonucleótidos comprende al menos un nucleótido modificado. En algunos modos de realización, los primer, segundo y tercer oligonucleótidos tienen 40 nucleótidos o menos.

En otro aspecto, se proporcionan composiciones que comprenden un conjunto de cebadores oligonucleotídicos para amplificar un gen de MG diana como se divulga anteriormente. En algunos modos de realización, el conjunto de cebadores para el gen de MG diana comprende un primer cebador que comprende una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: y 47-56, o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-66, o un complemento de las mismas. En determinados modos de realización, la composición comprende además una o más sondas para el gen de MG diana detectables que comprenden o que consisten en una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 67­ 89, o el complemento de las mismas.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente materia objeto, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos solo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Los detalles de uno o más modos de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La FIGURA 1 es una representación gráfica del genoma de la cepa G37 de M. genitalium, mostrándose las localizaciones del gen mgpB y las repeticiones parciales MgPar.

La FIGURA 2 muestra las curvas de crecimiento de PCR de un experimento de PCR ultrarrápida en presencia de diversas concentraciones de molde de ADN de M. genitalium genómico (presente en concentraciones de 1000 [negro], 100 [gris claro] y 10 [gris] equivalentes genómicos por reacción de PCR).

Descripción detallada de la invención

El diagnóstico de la infección por MG por amplificación de ácido nucleico proporciona un procedimiento para detectar rápidamente y con exactitud la infección bacteriana. En el presente documento se describe un ensayo ultrarrápido para detectar MG en una muestra. Se proporcionan cebadores y sondas para detectar MG, así como artículos de fabricación o kits que contienen dichos cebadores y sondas. La sensibilidad incrementada de la PCR ultrarrápida por la detección de MG en comparación con otros procedimientos, así como los rasgos característicos mejorados de la PCR ultrarrápida que incluyen la contención de la muestra y la detección ultrarrápida del producto amplificado, hacen viable la implementación de esta tecnología para el diagnóstico rutinario de las infecciones por MG en el laboratorio clínico.

La presente divulgación incluye cebadores y sondas de hidrólisis marcadas fluorescentes oligonucleotídicas que se hibridan a un locus del gen específico del genoma de MG para identificar específicamente MG usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. La selección de dianas para Mg requirió una búsqueda exhaustiva de la base de datos de secuencias pública, así como una búsqueda en la literatura para determinar dianas para MG con un potencial para discriminar al vecino más cercano, Mycloplasma pneumonia. Las dianas se seleccionaron para propósitos de inclusividad, así como para propósitos de sensibilidad. Como resultado del análisis, los posibles genes de MG diana incluyen la región EF variable de las repeticiones parciales de mgpB (MgPar, número de acceso de GenBank FJ872587). En determinados aspectos, se puede implementar un enfoque de doble diana usando la diana del gen mgpB bien conservada. En el presente documento, se puede seleccionar la región A bien conservada del gen mgpB para propósitos de inclusividad, y la región EF variable de la diana de múltiples copias de repeticiones parciales de mgpB se puede seleccionar para propósitos de sensibilidad.

Los procedimientos divulgados pueden incluir realizar al menos una etapa de ciclado que incluya amplificar una o más porciones de la diana del gen de la molécula de ácido nucleico de una muestra usando uno o más pares de cebadores. "Cebador(es)", como se usa en el presente documento, se refiere(n) a cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente al gen diana en MG e inician la síntesis de ADN a partir del mismo bajo condiciones apropiadas que producen los productos de amplificación respectivos. Cada uno de los cebadores analizados se hibrida a una diana dentro o contigua a la molécula de ácido nucleico diana respectiva de modo que al menos una porción de cada producto de amplificación contenga la secuencia de ácido nucleico correspondiente a la diana. El uno o más productos de amplificación se producen siempre que uno o más del ácido nucleico del gen de MG diana esté presente en la muestra, por tanto, la presencia del uno o más de los productos de amplificación del gen de Mg diana es indicativa de la presencia de MG en la muestra. El producto de amplificación debe contener las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a una o más sondas detectables para el gen de MG diana. "Sonda(s)", como se usa en el presente documento, se refiere(n) a sondas oligonucleotídicas que se hibridan específicamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen de MG diana. Cada etapa de ciclado incluye una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección, en las que la muestra se pone en contacto con la una o más sondas detectables para la detección de la presencia o ausencia de MG en la muestra.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificar" se refiere al proceso de sintetizar moléculas de ácido nucleico que sean complementarias a una o ambas hebras de una molécula de ácido nucleico molde. La amplificación de una molécula de ácido nucleico típicamente incluye desnaturalizar el ácido nucleico molde, hibridar cebadores al ácido nucleico molde a una temperatura que esté por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores y alargarlo enzimáticamente a partir de los cebadores para generar un producto de amplificación. La amplificación típicamente requiere la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Taq Platinum®) y un tampón apropiado y/o cofactores para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCl2 y/o KCl).

El término "cebador" como se usa en el presente documento es conocido por los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3', por ejemplo, del oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre al que se pueden fijar otros "nucleótidos" por una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster de 3' a 5', con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato, y con lo que se libera pirofosfato. Por lo tanto, no existe ninguna diferencia fundamental entre un "cebador", un "oligonucleótido" o una "sonda", salvo posiblemente en cuanto a la función pretendida.

El término "hibridación" se refiere a la hibridación de una o más sondas a un producto de amplificación. Las condiciones de hibridación típicamente incluyen una temperatura que está por debajo de la temperatura de fusión de las sondas, pero que evita la hibridación no específica de las sondas.

El término "actividad nucleasa de 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de hebras de ácido nucleico, con lo que se retiran nucleótidos del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión del cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y continúa en dirección de 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Se han aislado polimerasas termoestables de Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no sean termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.

El término "complemento de las mismas" se refiere a un ácido nucleico que al mismo tiempo tiene la misma longitud que, y es exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.

El término "extensión" o "alargamiento", cuando se usa con respecto a los ácidos nucleicos, se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótidos, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo 3' terminal de un ácido nucleico.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o por inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud entre secuencias son los programas BLAST, que se describen, por ejemplo, en Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search" Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSi-BLAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 y Zhang et al. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation", Genome Res. 7:649-656.

Un "nucleótido modificado" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia de oligonucleótidos se remplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, una C5-metil-dC, una C5-etil-dC, una C5-metil-dU, una C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, una C5-propinil-dC, una C5-propinil-dU, una C7-propinil-dA, una C7-propinil-dG, una C5-propargilamino-dC, una C5-propargilamino-dU, una C7-propargilamino-dA, una C7-propargilamino-dG, una 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, una seudo-dU, un nitropirrol, un nitroindol, 2'-0-metil-ribo-U, 2'-0-metil-ribo-C, una N4-etil-dC, una N6-metil-dA y similares. En el presente documento se hace referencia a muchos otros nucleótidos modificados que se pueden sustituir en los oligonucleótidos o de otro modo son conocidos en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tf) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos no modificados correspondientes. Para ilustrar adicionalmente, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácido nucleico no específica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebador o similar), incrementar el rendimiento de un amplicón diana pretendido, y/o similares, en algunos modos de realización. Se describen ejemplos de estos tipos de modificaciones de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la pat. de EE. UU. n.° 6.001.611.

Detección de MG

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar MG amplificando, por ejemplo, una porción de la secuencia de ácido nucleico del gen de MG diana. Las secuencias de ácido nucleico del gen mgpB y las repeticiones parciales MgPar están disponibles públicamente (por ejemplo, GenBank). Específicamente, se proporcionan cebadores y sondas para amplificar y detectar dianas de moléculas de ácido nucleico de MG específicas en los modos de realización en la presente divulgación.

Para la detección de MG, se proporcionan cebadores y sondas para amplificar el gen de MG diana. También se pueden usar ácidos nucleicos distintos de los ejemplificados en el presente documento para detectar MG en una muestra. Por ejemplo, se pueden evaluar variantes funcionales para determinar la especificidad y/o sensibilidad por los expertos en la técnica usando procedimientos rutinarios. Las variantes funcionales representativas pueden incluir, por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones en los ácidos nucleicos del gen de MG diana divulgados en el presente documento. Más específicamente, los modos de realización de los oligonucleótidos incluyen cada una un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 29-89, los cebadores para 23S a continuación son meramente ejemplos de referencia y no forman parte del alcance reivindicado. Además, cuando se mencionan cebadores y sondas para mgbP, solo entran dentro del alcance reivindicado en combinación con cebadores para MgPar

TABLA I: r ir r 2

TABLA II: cebadores inversos para 23s

TABLA III: sondas para 23s

TABLA IV: cebadores directos para mgpB

TABLA V: cebadores inversos para mgpB

TABLA VI: sondas para mgpB

TABLA VII: cebadores directos para MgPar

TABLA VIII: cebadores inversos para MgPar

TABLA IX: sondas para MgPar

En un modo de realización, los conjuntos de cebadores y sondas descritos anteriormente se usan para proporcionar la detección de MG en una muestra biológica que se sospecha que contiene MG. Los conjuntos de cebadores y sondas pueden comprender o consistir en cebadores y sondas específicos para las secuencias de ácido nucleico del gen mgpB, y las repeticiones parciales MgPar que comprenden o que consisten en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29-89.

Los cebadores y sondas de la solicitud pueden comprender un compuesto nucleotídico modificado o uno no nucleotídico. Una sonda (o un cebador) es, entonces, un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos de nucleótido") difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base o compuesto similar a base, un azúcar pentofuranosilo o un compuesto similar a azúcar pentofuranosilo, una porción fosfato o porción similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se puede fijar un "marcador" a la porción de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede remplazar, por ejemplo, por una 7-desazapurina, con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo de nucleótido" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo de nucleósido") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera como se explica anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo de nucleótido").

Los oligonucleótidos que incluyen oligonucleótidos modificados y análogos de oligonucleótido que amplifican una molécula de ácido nucleico que codifica el gen de MG diana, por ejemplo, el gen 23s, se pueden diseñar usando, por ejemplo, un programa informático como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores necesitan ser lo suficientemente largos para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis de oligonucleótidos). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos tienen de 8 a 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 nucleótidos de longitud).

Además de un conjunto de cebadores, los procedimientos pueden usar una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de MG. El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que por diseño o selección, contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridarse bajo restricciones predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) a los "ácidos nucleicos diana", en el presente caso a un ácido nucleico del gen de MG diana. Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", lo que significa que detecta el ácido nucleico diana.

En algunos modos de realización, las sondas para el gen de MG diana descritas se pueden marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, las sondas para el gen de MG diana se pueden marcar con un resto fluorescente donante, por ejemplo, un tinte fluorescente, y un resto aceptor correspondiente, por ejemplo, un extintor. En un modo de realización, la sonda comprende o consiste en un resto fluorescente y las secuencias de ácido nucleico comprenden o consisten en SEQ ID NO: 67-89.

El diseño de oligonucleótidos que se van a usar como sondas se puede realizar de manera similar al diseño de cebadores. Los modos de realización pueden usar una única sonda o un par de sondas para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, el uso de la(s) sonda(s) puede comprender al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Al igual que con los cebadores, las sondas normalmente tienen temperaturas de fusión similares, y la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que se produzca la hibridación específica de secuencia, pero no tan larga como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas tienen, en general, de 15 a 40 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, los cebadores oligonucleotídicos tienen 40 nucleótidos o menos de longitud. Las construcciones pueden incluir vectores, conteniendo cada uno una de moléculas de ácido nucleico de cebadores y sondas para el gen de MG diana. Se pueden usar construcciones, por ejemplo, como moléculas de ácido nucleico molde de control. Los vectores adecuados para su uso están disponibles comercialmente y/o se producen mediante procedimientos de tecnología de ácido nucleico recombinante rutinarios en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico del gen de MG diana se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis química, clonación directa de MG o por amplificación por PCR.

Las construcciones adecuadas para su uso en los procedimientos típicamente incluyen, además de las moléculas de ácido nucleico del gen de MG diana (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una o más secuencias de SEQ ID NO: 29-89), secuencias que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) para seleccionar las construcciones y/o transformantes deseados, y un origen de replicación. La elección de los sistemas de vectores normalmente depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la elección de células huésped, eficacia de la replicación, selectividad, inducibilidad y la facilidad de recuperación.

Las construcciones que contienen moléculas de ácido nucleico del gen de MG diana se pueden propagar en una célula huésped. Como se usa en el presente documento, el término célula huésped pretende incluir procariotas y eucariotas, tales como células de levadura, vegetales y animales. Los huéspedes procarióticos pueden incluir E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, y Bacillus subtilis. Los huéspedes eucarióticos incluyen levaduras, tales como S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris, células de mamífero, tales como células COS o células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto y células vegetales, tales como Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum. Se puede introducir una construcción en una célula huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus son procedimientos comunes para introducir ácidos nucleicos en células huésped. Además, se puede suministrar ADN no marcado directamente a las células (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 5.580.859 y 5.589.466).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las pat. de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR típicamente emplea dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en algunos modos de realización incluyen oligonucleótidos que puedan actuar como puntos de inicio de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico del gen de MG diana descritas (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-17, 29-41 y 47-66). Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador es preferentemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan en primer lugar, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento de desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de hebras se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado que incluya medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento de separación de las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración salina de tampón y la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se desnaturalizan, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo dependiendo de los rasgos característicos de la reacción, tal como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización típicamente se realiza durante aproximadamente 30 s a 4 min (por ejemplo, de 1 min a 2 min 30 s, o 1,5 min).

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar a una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador a su secuencia diana en las moléculas de ácido nucleico del gen de MG diana descritas. La temperatura para la hibridación es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). A continuación, se ajusta la mezcla de reacción a una temperatura a la que se promueve u optimiza la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía, en general, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, de aproximadamente 30 s a aproximadamente 4 min; de aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min; de aproximadamente 1 min 30 s a aproximadamente 2 min).

Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico, tal como ARN o ADN (ADNc). No se necesita purificar el ácido nucleico molde; puede ser una fracción en menor cantidad de una mezcla compleja, tal como ácido nucleico contenido en células humanas. Las moléculas de ácido nucleico se pueden extraer de una muestra biológica por técnicas rutinarias, tales como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications (Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se pueden obtener ácidos nucleicos a partir de una serie de fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales, que incluyen bacterias, levaduras, virus, orgánulos u organismos superiores, tales como plantas o animales.

Los cebadores oligonucleotídicos se combinan con reactivos de PCR bajo condiciones de reacción que inducen la extensión del cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de la cadena incluyen, en general, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCh 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 0,5-1,0 pg de ADN molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de Taq polimerasa y DMSO al 10 %). Las reacciones contienen normalmente de 150 a 320 pM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP, dGTP o uno o más análogos de los mismos.

Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación, hibridación y alargamiento de hebras se pueden repetir tan a menudo como se necesite para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a las moléculas de ácido nucleico diana. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana lo suficiente para la detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tanto como 40, 60 o incluso 100 veces.

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

La tecnología de FRET (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en un concepto de que cuando un resto fluorescente donante y un resto fluorescente aceptor correspondiente se sitúan dentro de una determinada distancia entre sí, tiene lugar una transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o de otro modo detectar y/o cuantificar. El donante típicamente transfiere la energía al aceptor cuando se excita el donante por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptor típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. En determinados sistemas, se puede transferir energía no fluorescente entre restos donantes y aceptores, por medio de biomoléculas que incluyen restos donantes sustancialmente no fluorescentes (véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 7.741.467).

En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto fluorescente donante y un extintor correspondiente, que puede ser fluorescente o no, y que disipa la energía transferida en una forma distinta de la luz. Cuando la sonda está intacta, la transferencia de energía típicamente se produce entre los restos donantes y aceptores, de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante se extingue por el resto aceptor. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, se escinde una sonda unida a un producto de amplificación por la actividad nucleasa de 5' a 3', por ejemplo, de una Taq polimerasa de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante ya no se extinga. Se describen sondas ejemplares para este propósito, por ejemplo, en las pat. de EE. UU. n.os 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. Los pares donante-aceptor usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

En otro ejemplo, dos sondas oligonucleotídicas, que contienen cada una un resto fluorescente, se pueden hibridar a un producto de amplificación en posiciones particulares determinadas por la complementariedad de las sondas oligonucleotídicas con respecto a la secuencia de ácido nucleico diana. Tras la hibridación de las sondas oligonucleotídicas al ácido nucleico del producto de amplificación en las posiciones apropiadas, se genera una señal de FRET. Las temperaturas de hibridación pueden variar de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C durante de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min.

Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para realizar un seguimiento de la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. Se puede llevar a cabo la excitación para iniciar la transferencia de energía, o para permitir la detección directa de un fluoróforo, con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.

Como se usa en el presente documento con respecto a los restos donantes y aceptores correspondientes, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptor o un extintor oscuro que tiene un espectro de absorbancia que se solapa con el espectro de emisión del resto fluorescente donante. El máximo de longitud de onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptor debe ser al menos 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donante. En consecuencia, se puede producir una transferencia de energía no radioactiva eficaz entre ellos.

Los restos donantes y aceptores correspondientes fluorescentes se eligen, en general, para (a) la transferencia de energía de Forster de alta eficacia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) un desplazamiento de la emisión lo más lejos posible en la parte roja del espectro visible (>600 nm); y (d) un desplazamiento de la emisión a una mayor longitud de onda que la emisión fluorescente del agua de Raman producida por excitación a la longitud de onda de excitación del donante. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donante que tenga su máximo de excitación cercano a una línea láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y un buen solapamiento de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del resto fluorescente aceptor correspondiente. Se puede elegir un resto fluorescente aceptor correspondiente que tenga un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, un buen solapamiento de su excitación con la emisión del resto fluorescente donante y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm).

Los restos fluorescentes donantes representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptores en la tecnología de FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, 9-acridinisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenbutirato de succinimidilo y derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptores representativos, que dependen del resto fluorescente donante usado, incluyen LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonillisamina rodamina B, tetrametilrrodaminaisotiocianato, rodamina x-isotiocianato, eritrosina-isotiocianato, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donantes y aceptores, por ejemplo, a partir de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Los restos fluorescentes donantes y aceptores se pueden fijar al oligonucleótido de sonda apropiado por medio de un brazo conector. La longitud de cada brazo conector es importante, ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donantes y aceptores. La longitud de un brazo conector puede ser la distancia en Angstroms (A) desde la base nucleotídica hasta el resto fluorescente. En general, un brazo conector es de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. El brazo conector puede ser de la clase descrita en el documento WO 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para fijar brazos conectores a una base nucleotídica particular, y también para fijar restos fluorescentes a un brazo conector.

Se puede combinar un resto fluorescente aceptor, tal como un LC Red 640, con un oligonucleótido que contenga un conector de amino (por ejemplo, C6-aminofosforamiditas disponibles en ABI (Foster City, California) o Glen Research (Sterling, VA)) para producir, por ejemplo, un oligonucleótido marcado con LC Red 640. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donante, tal como fluoresceína, a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de fluoresceína-éster de NHS, tales como CX-fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramón, Calif.)) o 3'-amino-CPG, que requieren el acoplamiento de fluoresceína-éster de NHS después de la síntesis de oligonucleótidos.

Detección de MG

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de MG en una muestra biológica o no biológica. Los procedimientos proporcionados evitan problemas de contaminación de las muestras, negativos falsos y positivos falsos. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una porción de moléculas de ácido nucleico diana de una muestra usando uno o más pares de cebadores, y una etapa de detección por FRET. Se realizan múltiples etapas de ciclado, preferentemente en un termociclador. Se pueden realizar procedimientos usando los cebadores y sondas para detectar la presencia de MG, y la detección del gen de MG diana indica la presencia de MG en la muestra.

Como se describe en el presente documento, los productos de amplificación se pueden detectar usando sondas de hibridación marcadas que aprovechan la tecnología de FRET. Un formato de FRET utiliza la tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación y, de ahí, la presencia o ausencia de MG. La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada, por ejemplo, con un tinte fluorescente y un extintor, que puede ser fluorescente o no. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente o un extintor oscuro de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente es, en general, una molécula extintora. Durante la etapa de hibridación de la reacción PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad nucleasa de 5' a 3', por ejemplo, de la Taq polimerasa durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) usa la tecnología TaqMan®, y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de MG en la muestra. También se pueden usar balizas moleculares junto con FRET para detectar la presencia de un producto de amplificación usando los procedimientos de PCR ultrarrápida. La tecnología de balizas moleculares usa una sonda de hibridación marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente es, en general, un extintor, y los marcadores fluorescentes típicamente se localizan en cada extremo de la sonda. La tecnología de balizas moleculares usa un oligonucleótido de sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructuras secundarias (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de estructuras secundarias dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Después de la hibridación a los ácidos nucleicos diana (es decir, productos de amplificación), se perturba la estructura secundaria de la sonda y los restos fluorescentes se separan entre sí, de modo que, después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, se pueda detectar la emisión del primer resto fluorescente.

Otro formato común de la tecnología de FRET utiliza dos sondas de hibridación. Cada sonda se puede marcar con un resto fluorescente diferente y, en general, se diseñan para hibridarse en estrecha proximidad entre sí en una molécula de ADN diana (por ejemplo, un producto de amplificación). Un resto fluorescente donante, por ejemplo, fluoresceína, se excita a 470 nm por la fuente de luz del instrumento LightCycler®. Durante la FRET, la fluoresceína transfiere su energía a un resto fluorescente aceptor, tal como LightCycler®-Red 640 (LC Red 640) o LightCycler®-Red 705 (LC Red 705). A continuación, el resto fluorescente aceptor emite luz de una longitud de onda más larga, que se detecta por el sistema de detección óptica del instrumento LightCycler®. La FRET eficaz solo puede tener lugar cuando los restos fluorescentes están en proximidad local directa y cuando el espectro de emisión del resto fluorescente donante se solapa con el espectro de absorción del resto fluorescente aceptor. La intensidad de la señal emitida se puede correlacionar con el número de moléculas de ADN diana originales (por ejemplo, el número de genomas de MG). Si se produce la amplificación del ácido nucleico diana y se produce un producto de amplificación, la etapa de hibridación da como resultado una señal detectable basada en FRET entre los miembros del par de sondas.

En general, la presencia de FRET indica la presencia de MG en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia de MG en la muestra. Sin embargo, la inadecuada obtención de muestras, los retrasos por el transporte, las condiciones de transporte inapropiadas o el uso de determinados hisopos de obtención (varilla de alginato de calcio o de aluminio) son todas las condiciones que pueden afectar al éxito y/o exactitud del resultado de la prueba. Usando los procedimientos divulgados en el presente documento, la detección de FRET, por ejemplo, dentro de 45 etapas de ciclado es indicativa de una infección por MG.

Las muestras biológicas representativas que se pueden usar en la práctica de los procedimientos incluyen, pero no se limitan a muestras respiratorias, muestras fecales, muestras de sangre, frotis dérmicos, frotis nasales, frotis en heridas, hemocultivos, piel e infecciones de partes blandas. Son conocidos procedimientos de obtención y almacenamiento de muestras biológicas para los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, por procedimientos y/o kits de extracción de ácido nucleico conocidos en la técnica) para liberar el ácido nucleico de Mg o, en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de la reacción PCR y los oligonucleótidos apropiados.

El análisis de la curva de fusión es una etapa adicional que se puede incluir en un perfil de ciclado. El análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que el a Dn se funde a una temperatura característica llamada temperatura de fusión (Tf), que se define como la temperatura a la que la mitad de las dobles hebras de ADN se han separado en hebras individuales. La temperatura de fusión de un ADN depende principalmente de su composición de nucleótidos. Por tanto, las moléculas de ADN ricas en nucleótidos G y C tienen una mayor Tf que las que tienen una abundancia de nucleótidos A y T. Al detectar la temperatura a la que se pierde la señal, se puede determinar la temperatura de fusión de las sondas. De forma similar, al detectar la temperatura a la que se genera la señal, se puede determinar la temperatura de hibridación de las sondas. La(s) temperatura(s) de fusión de las sondas de los productos de amplificación pueden confirmar la presencia o ausencia de MG en la muestra.

Dentro de cada tanda de termociclador, también se pueden ciclar muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico diana (distinto de los productos de amplificación descritos de genes diana) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción plasmídica que contenga las moléculas de ácido nucleico diana. Dicho control plasmídico se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una tanda con muestra separada paralelamente con las muestras del paciente usando los mismos cebadores y sonda que los usados para la detección de la diana pretendida. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Cada tanda de termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carezca de ADN molde diana. El control negativo puede medir la contaminación. Esto garantiza que el sistema y los reactivos no den lugar a una señal positiva falsa. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores de hibridarse con especificidad de secuencia y de iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas de hibridarse con especificidad de secuencia y para que se produzca la FRET.

En un modo de realización, los procedimientos incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa se describe en las pat. de EE. UU. n.os 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una tanda de termociclador y la siguiente.

Se pueden usar procedimientos de PCR convencionales junto con la tecnología de FRET para poner en práctica los procedimientos. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR ultrarrápida como se usa en la tecnología LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.

Se puede hacer funcionar el LightCycler® usando una estación de trabajo para PC y puede utilizar un sistema operativo Windows NT. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede presentar las señales de fluorescencia en tiempo real inmediatamente después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una representación cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclos para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para otro análisis.

Como una alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificación usando un tinte de unión a ADN bicatenario tal como un tinte de unión a ADN fluorescente (por ejemplo, SYBR® verde o SYBR® oro (Molecular Probes)). Tras la interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos tintes de unión a ADN fluorescentes emiten una señal de fluorescencia después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de intercalación de ácido nucleico. Cuando se usan tintes de unión a ADN bicatenario, normalmente se realiza un análisis de la curva de fusión para confirmar la presencia del producto de amplificación.

Se entiende que los modos de realización de la presente divulgación no se limitan por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.

Artículos de fabricación/kits

Los modos de realización de la presente divulgación proporcionan además artículos de fabricación, composiciones o kits para detectar MG. Un artículo de fabricación puede incluir cebadores y sondas usados para detectar el gen de MG diana, conjuntamente con materiales de envasado adecuados. Las composiciones pueden incluir cebadores usados para amplificar el gen de MG diana. En determinados modos de realización, las composiciones también pueden comprender sondas para detectar el gen de MG diana. Los cebadores y sondas representativos para la detección de MG se pueden hibridar a moléculas de ácido nucleico diana. Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. En el presente documento se divulgan procedimientos de diseño de cebadores y sondas, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores y sondas que amplifican y se hibridan a moléculas de ácido nucleico diana.

Los artículos de fabricación también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas o, de forma alternativa, las sondas suministradas con el kit se pueden marcar. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donante y/o uno aceptor para marcar las sondas. Anteriormente se proporcionan ejemplos de restos fluorescentes donantes y restos fluorescentes aceptores correspondientes para FRET adecuados.

Los artículos de fabricación también pueden contener un prospecto del envase o ficha técnica del envase que tenga instrucciones en el mismo para usar los cebadores y sondas para detectar MG en una muestra. Los artículos de fabricación y las composiciones pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasa, cofactores o agentes para prevenir la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento. En los siguientes ejemplos se describirán además modos de realización de la presente divulgación, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

EJEMPLOS

Se proporcionan los siguientes ejemplos y figuras para ayudar al entendimiento de la materia objeto, exponiéndose se verdadero alcance en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos expuestos sin apartarse del espíritu de la invención.

EJEMPLO I

La selección de dianas para MG fue el resultado de una búsqueda exhaustiva en la base de datos de secuencias pública. Se usaron múltiples procedimientos para buscar secuencias de Mycoplasma genitalium y su vecino más cercano, Mycoplasma pneumoniae, para diseñar la exclusividad del ensayo. Las dianas para m G seleccionadas tenían la mayor cobertura en la base de datos pública (120 secuencias de mgpB, ensamblajes hologenómicos de MgPar 5). MG tiene un pequeño genoma compacto, en el que sus limitadas regiones seleccionan el diseño de NAT. El gen de la proteína de superficie mgpB (llamado diana de MgPar) se seleccionó para el ensayo debido a su número de múltiples copias. Se sabe que las proteínas de superficie experimentan recombinación, lo que puede dar como resultado un ensayo fallido. Para mitigar los riesgos asociados, se implementó un enfoque de doble diana usando una diana bien conservada (llamada diana de mgpB).

El operón MgPa codifica tres genes: mgpA, mgpB y mgpC (círculo negro marcado como mgpB de 221 kb en la figura 1). mgpB (4335 pb) está presente en el operón completo pero existen nueve repeticiones parciales (MgPar) fuera del operón. Las repeticiones son copias parciales de mgpB (figura 1). La región A bien conservada del gen mgpB (llamada diana de mgpB) se seleccionó para propósitos de inclusividad, y la diana de múltiples copias (llamada diana de MgPar) con la región EF variable se seleccionó para propósitos de sensibilidad (figura 1).

Se realizó la detección por PCR ultrarrápida de MG usando las plataformas del sistema cobas® 4800 o bien de los sistemas cobas® 6800/8800 (Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA). Las concentraciones finales de los reactivos de amplificación se muestran a continuación:

TABLA X Reactivos de amplificación por PCR

La siguiente tabla muestra el termoperfil típico usado para la reacción de amplificación por PCR:

TABLA XVII Termoperfil para PCR

El programa Pre-PCR comprendió la desnaturalización inicial y la incubación a 55 °C, 60 °C y 65 °C para la retrotranscripción de moldes de ARN. La incubación a tres temperaturas combina los efectos ventajosos de que a menores temperaturas también se transcriben secuencias diana ligeramente emparejadas erróneamente (tales como las variantes genéticas de un organismo), mientras que a mayores temperaturas se suprime la formación de estructuras secundarias de ARN, dando lugar así a una transcripción más eficaz. El ciclado de PCR se dividió en dos mediciones, en el que ambas mediciones aplican una configuración de una etapa (combinando hibridación y extensión). Los primeros 5 ciclos a 55 °C permiten una inclusividad incrementada al preamplificar las secuencias diana ligeramente emparejadas erróneamente, mientras que los 45 ciclos de la segunda medición proporcionan una especificidad incrementada al usar una temperatura de hibridación/extensión de 58 °C. La figura 2 representa un experimento de amplificación típico donde se muestran curvas de crecimiento de PCR en diversas concentraciones de ADN molde de MG genómico.

La amplificación y detección de los genes de MG diana, ARNr de 23s, mgpB y MgPar se realizaron usando las condiciones descritas anteriormente. Los resultados de los experimentos que usan varios cebadores y sondas oligonucleotídicos seleccionados frente al ADN de MG genómico presente a una concentración de 1000 equivalentes genómicos/PCR se muestran a continuación como valores de Ct (ciclo umbral) para las reacciones de amplificación.

TABLA XVIII Amplificación y detección de genes de MG diana

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de detección de Mycoplasma genitalium (MG) en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

- realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores para el gen de MG diana para producir un producto de amplificación si un ácido nucleico del gen de MG diana está presente en la muestra;

- realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas para el gen de MG diana detectables; y

- detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia de MG en la muestra y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de MG en la muestra;

en el que el conjunto de cebadores para el gen de MG diana y la una o más sondas para el gen de MG diana detectables amplifican y detectan la región EF variable de las repeticiones parciales de mgpB (MgPar); y en el que el conjunto de cebadores para el gen de MG diana comprende un primer cebador que comprende una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47-56 o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-66, o un complemento de las mismas; y en el que la una o más sondas para el gen de MG diana detectables comprende una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67-89, o el complemento de las mismas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

- la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación con la sonda para el gen de MG diana detectable que se marca con un resto fluorescente donante y un resto aceptor correspondiente; y

- la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donante y el resto aceptor de la sonda, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de MG en la muestra.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha etapa de amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que el resto fluorescente donante y el resto aceptor correspondiente están separados en no más de 8-20 nucleótidos entre sí en la sonda.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el resto aceptor es un extintor.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un conjunto de cebadores para el gen mgpB de MG diana y una o más sondas para el gen mgpB de MG diana detectables para amplificar y detectar la región A conservada del gen mgpB dentro del operón de adhesión MgPa.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el conjunto de cebadores para el gen mgpB de MG diana comprende un primer cebador que comprende una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-35 o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36-41, o un complemento de las mismas; y en el que la una o más sondas para el gen mgpB de MG diana detectables comprende una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42-46, o el complemento de las mismas.

8. Un kit para detectar un ácido nucleico de Mycoplasma genitalium (MG) que comprende:

- un primer cebador que comprende una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47-56, o un complemento de las mismas;

- un segundo cebador que comprende una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-66, o un complemento de las mismas; y

- una sonda marcada de forma detectable fluorescente que comprende una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67-89, o un complemento, la sonda marcada de forma detectable configurada para hibridarse a un amplicón generado por el primer cebador y el segundo cebador.

9. El kit de la reivindicación 8, en el que la tercera secuencia de oligonucleótidos marcada de forma detectable comprende un resto fluorescente donante y un resto aceptor correspondiente.

10. El kit de la reivindicación 9, en el que el resto aceptor es un extintor.

11. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende además al menos uno de nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa.

12. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende además un conjunto de cebadores para el gen mgpB de MG diana y una o más sondas para el gen mgpB de MG diana detectables para amplificar y detectar la región A conservada del gen mgpB dentro del operón de adhesión MgPa.

13. El kit de la reivindicación 12, en el que el conjunto de cebadores para el gen mgpB de MG diana comprende un primer cebador que comprende una primera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-35 o un complemento de las mismas, y un segundo cebador que comprende una segunda secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36-41, o un complemento de las mismas; y en el que la una o más sondas para el gen mgpB de MG diana detectables comprende una tercera secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42-46, o el complemento de las mismas.

14. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que al menos uno de los primer, segundo y tercer oligonucleótidos comprende al menos un nucleótido modificado.

15. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que los primer, segundo y tercer oligonucleótidos tienen 40 nucleótidos o menos.