CN109072283B - 用于检测生殖支原体的组合物和方法 - Google Patents

用于检测生殖支原体的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109072283B
CN109072283B CN201780024968.XA CN201780024968A CN109072283B CN 109072283 B CN109072283 B CN 109072283B CN 201780024968 A CN201780024968 A CN 201780024968A CN 109072283 B CN109072283 B CN 109072283B
Authority
CN
China
Prior art keywords
target
gene
primer
seq
nos
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780024968.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109072283A (zh
Inventor
J.哈里斯
K.曼吉普迪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN109072283A publication Critical patent/CN109072283A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109072283B publication Critical patent/CN109072283B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

描述了用于快速检测生物样品或非生物样品中生殖支原体（MG）的存在或不存在的方法。该方法可以包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了设计用于检测MG的靶向靶标MG基因的引物、探针以及试剂盒。

Description

用于检测生殖支原体的组合物和方法
发明领域
本发明涉及分子诊断领域，并且更具体地涉及生殖支原体（Mycoplasma genitalium）的检测。
发明背景
生殖支原体（MG）是一种革兰氏阴性细菌，其缺乏细胞壁并且生活在男性和女性的尿道和生殖道的上皮细胞表面和上皮细胞中。生殖支原体是男性非淋病性尿道炎（NGU）的常见病因，并且越来越多地被认为是女性子宫颈炎和盆腔炎（PID）的病因。近期的元分析已经显示生殖支原体感染使得女性患有子宫颈炎、盆腔炎、早产、自然流产和不孕的风险增加近两倍。已报道生殖支原体在低风险群体中（男性和女性）的患病率为约1%至3%。在高风险群体中，已报道患病率为在男性中10%至41%，和在女性中7.3%至14%。在高风险群体中生殖支原体的患病率通常超过淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）并且与沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的患病率相似。生殖支原体感染大多未被识别，并且受感染的个体是无症状的或具有与那些其他泌尿生殖道细菌感染有关的相似的症状。
生殖支原体感染的诊断传统上是培养泌尿生殖道样本，但是培养是不灵敏且缓慢的，并且可能需要长达6个月来回收生物体。用于诊断生殖支原体感染的的核酸扩增测试（NAAT）在美国和欧洲已经作为实验室开发程序（LDP）变得可以获得并且已经显示出相较培养具有优秀的灵敏性。
疾病控制中心（CDC）推荐在出现持续或复发的尿道炎的情况下怀疑生殖支原体感染，且可以在出现持续或复发的子宫颈炎和盆腔炎（PID）的情况下考虑生殖支原体感染。实际上生殖支原体是一种缓慢生长的生物，培养是不容易获得的，是缓慢且不灵敏的，NAAT是用于生殖支原体检测的优选方法。在研究环境下，通过尿、尿道、阴道和子宫颈拭子的NAAT测试和通过子宫内膜活组织检查来诊断生殖支原体，通常使用仅意图用于研究用途的内部PCR或测定。因此，本领域存在对于以灵敏方式特异性检测MG的快速且可靠的方法的需求。
发明概述
本发明的某些实施方案涉及用于快速检测生物样品或非生物样品中MG的存在或不存在的方法，例如通过在单个试管中的实时酶聚合酶链反应多路检测MG。实施方案包括检测MG的方法，其包括执行至少一个循环步骤，其可以包括扩增步骤和杂交步骤。此外，实施方案包括设计用于在单个管中检测MG的引物、探针和试剂盒。检测方法被设计为靶向生殖支原体中的特定基因，所述特定基因具有使之与最接近的物种，肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia），以及在人口腔或泌尿生殖道中发现的其他病原体或共生体区别的潜力。
提供了用于检测样品中的MG的方法，其包括执行扩增步骤，包括使样品与被设计为靶向特定MG基因的一组引物接触，以在样品中存在MG时产生扩增产物；执行杂交步骤，其包括使扩增产物与一种或多种靶标MG基因的可检测探针接触；并且检测扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中存在MG，并且其中所述扩增产物的不存在指示样品中不存在MG；其中所述靶标MG基因选自23s 核糖体RNA (23s)基因，MgPa黏附操纵子（mgpB）中mgpB基因的保守区域A，和mgpB部分重复序列（MgPar）的可变EF区域。图1显示了环状生殖支原体基因组的图片，以及mgpB基因以及九个MgPar部分重复序列的位置。
在一个方面，提供了检测样品中生殖支原体（MG）的方法，所述方法包括执行扩增步骤，其包括使样品与一组靶标MG基因引物接触，以在样品中存在靶标MG基因时产生扩增产物；执行杂交步骤，其包括使扩增产物与一种或多种可检测的靶标MG基因探针接触；并且检测扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中存在MG，并且其中所述扩增产物的不存在指示样品中不存在MG；其中所述靶标MG基因引物组包含含有选自SEQID NO: 1-7、29-35和47-56的第一寡核苷酸序列或其互补物的第一引物，和含有选自SEQID NO: 8-17、36-41和57-66的第二寡核苷酸序列或其互补物的第二引物；且其中所述一种或多种可检测的靶标MG基因探针包含选自SEQ ID NO: 18-28、42-46和67-89的第三寡核苷酸序列或其互补物。
在一个实施方案中，用于23s基因靶标扩增的引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6和7的第一寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，所述第二引物包含选自SEQ ID NO: 8、9、10、11、12、13、14、15、16和17的第二寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，且用于23s基因扩增产物的检测的可检测探针包括SEQID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28的核酸序列或其互补物，或由其组成。在某些实施方案中，用于23s基因靶标扩增的引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NO:3和4的第一寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，所述第二引物包含选自SEQ ID NO: 8和9的第二寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，且用于23s基因扩增产物的检测的可检测探针包括SEQ ID NO:24的核酸序列或其互补物，或由其组成。
在另一个实施方案中，用于mgpB基因靶标扩增的引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34和35的第一寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，所述第二引物包含选自SEQ ID NO:36、37、38、39、40和41的第二寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，且用于mgpB基因扩增产物的检测的可检测探针包括SEQID NO: 42、43、44、45和46的核酸序列或其互补物，或由其组成。在某些实施方案中，用于mgpB基因靶标扩增的引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NO:34和35的第一寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，所述第二引物包含选自SEQ ID NO:40和41的第二寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，且用于mgpB基因扩增产物的检测的可检测探针包括SEQ ID NO:45和46的核酸序列或其互补物，或由其组成。
在另一个实施方案中，用于MgPar基因靶标扩增的引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NO: 47、48、49、50、51、52、53、54、55和56的第一寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，所述第二引物包含选自SEQ ID NO: 57、58、59、60、61、62、63、64、65和66的第二寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，且用于MgPar基因扩增产物的检测的可检测探针包括SEQ ID NO:67, 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82, 83、84、85、86、87、88和89的核酸序列或其互补物，或由其组成。在某些实施方案中，用于MgPar基因靶标扩增的引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ IDNO:48和56的第一寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，所述第二引物包含选自SEQ IDNO: 65和66的第二寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成，且用于MgPar基因扩增产物的检测的可检测探针包括SEQ ID NO:80和89的核酸序列或其互补物，或由其组成。
在一些实施方案中，杂交步骤包括将扩增产物与可检测的靶标MG基因探针接触，所述探针使用供体荧光部分和相应的受体部分标记；且检测步骤包括检测探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移（FRET）的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示了样品中MG的存在或不存在。在一些实施方案中，扩增和杂交步骤是重复的。在本文中，重复次数取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，将需要更多的扩增和杂交步骤以扩增足够用于检测的靶标序列。在一些实施方案中，扩增和检测步骤重复至少20次，但是可以重复多达至少25、30、40、50、60或甚至100次。此外，检测扩增产物的存在或不存在可以在每次扩增和杂交步骤期间或之后、每隔一次扩增和杂交步骤期间或之后、特定的扩增和杂交步骤期间或之后、或在特定的扩增和杂交步骤期间或之后（在其中期望具有用于检测的足够的扩增产物（如果存在））执行。在一些实施方案中，扩增步骤采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，供体荧光部分和相应的受体部分在探针上彼此不超过8-20个核苷酸内。在一些实施方案中，受体部分是淬灭剂。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含选自SEQ ID NO: 1-89的核苷酸的序列或其互补物，或由其组成，其具有100个或更少核苷酸、50个或更少的核苷酸、40个或更少的核苷酸或30个或更少的核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二靶标MG基因引物和可检测靶标MG基因探针具有40个或更少的核苷酸（例如35个或更少的核苷酸，30个或更少的核苷酸等）。在另一个实施方案中，本发明提供了寡核苷酸，其包括与SEQ ID NO：1-89之一具有至少70%序列同一性（例如，至少75%、80%、85%、90%或95%等）的核酸或其互补物，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。一般地，在这些实施方案中这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等等。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸，例如，以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一种保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简单地“保守变异”指那些核酸，其编码相同或基本上相同的氨基酸序列，或者，当核酸不编码氨基酸序列时，基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸（通常小于5%，更通常小于4%、2%或1%）的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸由化学上相似的氨基酸的取代。在一些实施方案中，第一和第二靶标MG基因引物和可检测的靶标MG基因探针中的至少一种包含至少一个经修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，扩增（扩增步骤）可以采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。因此，供体荧光部分和受体部分，例如猝灭剂，沿着探针的长度可以在彼此不超过5至20个核苷酸内（例如，8或10个）。在另一个方面，可检测探针包括允许二级结构形成的核酸序列。此类二级结构形成通常导致第一荧光部分和第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
本发明提供了检测来自个体的生物样品中MG的存在或不存在的方法。此类方法一般包括执行至少一个循环步骤，其包括扩增步骤和染料结合步骤。通常，扩增步骤包括使样品与多对设计为靶向特定MG基因的引物接触，以产生一种或多种靶标MG基因扩增产物（如果样品中存在所述靶标MG基因核酸分子），并且染料结合步骤包括使靶标MG基因扩增产物与双链DNA结合染料接触。这些方法还包括检测结合到扩增产物内的双链DNA结合染料的存在或不存在，其中所述结合的存在指示样品中MG的存在，并且其中所述结合的不存在指示样品中MG的不存在。代表性的双链DNA结合染料是溴化乙锭。另外，此类方法还可以包括确定靶标MG基因扩增产物和双链DNA结合染料之间的解链温度，其中所述解链温度证实MG的存在或不存在。靶标MG基因可以包括但不限于23s基因、mgpB基因和MgPar部分重复序列。
在另一个方面中，提供了用于检测MG的一种或多种核酸的试剂盒。该试剂盒可以包括对于靶标MG基因的扩增特异性的一组或多组引物；以及对于检测靶标MG基因扩增产物特异性的一种或多种可检测探针。靶标MG基因可以包括但不限于23s基因、mgpB基因和MgPar部分重复序列。具体地，上文公开的与根据本发明的方法有关的寡核苷酸引物和探针适合包括在根据本发明的试剂盒中。在本文中，提供了用于检测样品中生殖支原体的核酸的试剂盒，其包含第一引物和第二引物，所述第一引物含有选自SEQ ID NO: 1-7、29-35和47-56的第一寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成；所述第二引物含有选自SEQ ID NO:8-17、36-41和57-66的第二寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成；和荧光可检测标记的探针，其含有选自SEQ ID NO: 18-28、42-46和67-89的第三寡核苷酸或其互补物，或由其组成，所述可检测标记的探针被配置为杂交至由第一引物和第二引物产生的扩增子。在一个方面，试剂盒可以包括已经用供体和相应的受体部分，例如另一种荧光部分或暗猝灭剂标记的探针，或者可以包括用于标记探针的荧光部分。试剂盒还可以包括至少一种三磷酸核苷，核酸聚合酶和对于核酸聚合酶功能所必需的缓冲液。该试剂盒还可以包括使用引物、探针和荧光团部分来检测样品中MG的存在或不存在的包装插页和说明书。在一些实施方案中，第三可检测标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和相应的受体部分。在一些实施方案中，受体部分是淬灭剂。在一些实施方案中，第一、第二和第三寡核苷酸中的至少一种包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，第一、第二和第三寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。
在另一个方面，提供的组合物包含如上文公开的用于扩增靶标MG基因的寡核苷酸引物组。在一些实施方案中，所述靶标MG基因引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物含有选自SEQ ID NO: 1-7、29-35和47-56的第一寡核苷酸序列，或其互补物，所述第二引物含有选自SEQ ID NO: 8-17、36-41和57-66的第二寡核苷酸序列，或其互补物。在某些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种可检测的靶标MG基因探针，其包含选自SEQ IDNO: 18-28、42-46和67-89的第三寡核苷酸序列或其互补物，或由其组成。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于本主题的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和示例仅为了说明并且不是意图限定。在附图和下文描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其他特点、目的和优点根据附图和详细描述以及权利要求将是显而易见的。
附图简述
图1是生殖支原体菌株G37基因组的图示，其显示了mgpB基因和MgPar部分重复序列的位置。
图2显示了在存在不同浓度的基因组生殖支原体DNA模板下（每PCR反应中以1000[黑色]、100[淡灰色]和10[灰色]基因组当量浓度存在），实时PCR实验的PCR生长曲线。
发明详述
通过核酸扩增诊断MG感染提供了用于快速且准确地检测细菌感染的方法。本文描述了用于检测非生物样品或生物样品中的MG的实时PCR测定。提供了用于检测MG的引物和探针，以及含有这些引物和探针的制造物品或试剂盒。与其他方法相比，用于检测MG的实时PCR的灵敏度的增加，以及实时PCR的改善特点，包括样品容纳和扩增产物的实时检测，使得这种技术实施用于临床实验室中的MG感染的常规诊断成为可行。
本发明包括与MG基因组的特定基因座杂交的寡核苷酸引物和荧光标记的水解探针，以便使用TaqMan®扩增和检测技术特异性鉴定MG。对MG的靶标选择需要全面检索公共序列数据库，以及对于具有与最接近的物种肺炎支原体进行区分的潜力的MG靶标进行文献检索。针对包容性目的以及灵敏性目的选择的靶标。作为分析的结果，可能的MG基因靶标包括23s核糖体RNA基因（GenBank 登录号NR077054），MgPa黏附操纵子中mgpB基因的保守区域A（mgpB, GenBank 登录号FJ872586），和mgpB部分重复序列的可变EF区域（MgPar, GenBank登录号FJ872587）。在某些方面，可以使用非常保守的mgpB基因靶标实施双靶标方法。在本文中，可以选择mgpB的非常保守的区域A用于包容性目的，且可以选择mgpB部分重复序列多拷贝靶标的可变EF区域用于灵敏性目的。
所公开的方法可以包括执行至少一个循环步骤，其包括使用一对或多对引物从样品中扩增核酸分子基因靶标的一个或多个部分。如本文使用的，“引物”指寡核苷酸引物，其与MG中的靶标基因特异性退火，并且在适当条件下从其起始DNA合成，产生分别的扩增产物。所讨论的引物各自与相应靶标核酸分子中或邻近相应靶标核酸分子的靶标退火，使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。如果样品中存在一种或多种靶标MG基因核酸，则产生一种或多种扩增产物，因此一种或多种靶标MG基因扩增产物的存在指示样品中MG的存在。扩增产物应含有与用于靶标MG基因的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文使用的，“探针”指与编码MG基因的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测的探针接触，用于检测样品中MG的存在或不存在。
如本文使用的，术语“扩增”指合成核酸分子的过程，所述核酸分子与模板核酸分子的一条或两条链互补。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物的解链温度的温度下使引物与模板核酸退火，并且从引物酶促延伸以生成扩增产物。扩增通常需要存在三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶（例如，Platinum® Taq）和适当的缓冲液和/或辅因子（例如MgCl2和/或KCl）（为了聚合酶的最佳活性）。
如本文使用的，术语“引物”是本领域技术人员已知的，并且指寡聚化合物，主要是寡核苷酸，但也指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成的经修饰的寡核苷酸，即例如寡核苷酸的3’末端提供游离的3’-OH基团，其中进一步的“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶附接，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用三磷酸脱氧核苷，并且由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能的意图的功能，“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本差异。
术语“杂交”指一种或多种探针与扩增产物的退火。“杂交条件”通常包括低于探针的解链温度，但避免探针的非特异性杂交的温度。
术语“5’至3’核酸酶活性”指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，由此从核酸链的5’末端去除核苷酸。
术语“热稳定聚合酶”指热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物形成，并且当在实现双链模板核酸变性所需的时间下经受升高的温度时，不会不可逆地变性。一般地，合成在每个引物的3’末端处起始，并且沿着模板链在5’至3’方向上前进。热稳定聚合酶已从以下中分离：黄栖热菌（Thermus flavus）、红色栖热菌（T. ruber）、嗜热栖热菌（T. thermophilus）、水生栖热菌（T. aquaticus）、T. lacteus、T. rubens、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）和炽热甲烷嗜热菌（Methanothermus fervidus）。然而，如果补充酶，则并非热稳定的聚合酶也可以用于PCR测定中。
术语“其互补物”指与给定核酸相同长度且确切互补的核酸。
当关于核酸使用时，术语“延伸”或“延长”指将另外的核苷酸（或其他类似分子）掺入核酸内。例如，核酸任选地通过掺入核苷酸的生物催化剂，例如通常在核酸的3’末端处添加核苷酸的聚合酶延伸。
在两个或更多个核酸序列的上下文中，术语“等同”或“同一性”百分比指当就最大对应性比较且比对时，例如如使用本领域技术人员可用的序列比较算法之一或通过目视检查测量的，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸。适合于确定序列同一性和序列相似性百分比的示例性算法是BLAST程序，其在例如以下中描述：Altschul等人（1990）“Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410，Gish等人（1993）“Identification of protein coding regions by databasesimilarity search” Nature Genet. 3:266-272，Madden等人（1996）“Applications ofnetwork BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141，Altschul等人（1997）“GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，以及Zhang等人（1997）“PowerBLAST: A new networkBLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation” Genome Res. 7:649-656。
在寡核苷酸的上下文中的“经修饰的核苷酸”指这样的改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被替换为对寡核苷酸提供所需性质的不同核苷酸。可在本文所述的寡核苷酸中取代的示例性经修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2’-O-甲基核-U、2 ‘-O-甲基核-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等等。可以在寡核苷酸中被取代的许多其他经修饰的核苷酸在本文中提及或者是本领域另外已知的。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸取代相对于相应的未修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度（Tm）。为了进一步说明，在一些实施方案中，某些经修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增（例如，使引物二聚体形成最小化等等），增加预期靶扩增子的产率等等。这些类型的核酸修饰的实例在例如美国专利号6,001,611中描述。
MG的检测
本发明提供了通过扩增例如靶标MG基因核酸序列的一部分来检测MG的方法。23s核糖体RNA基因、mgpB基因和MgPar部分重复序列的核酸序列是公共可得的（例如，GenBank）。具体地，在本发明中通过实施方案提供了扩增和检测特定MG核酸分子靶的引物和探针。
为了检测MG，提供了扩增靶标MG基因的引物和探针。除了本文例示的那些以外的核酸也可以用于检测样品中的MG。例如，通过本领域技术人员使用常规方法可以评估功能变体的特异性和/或敏感性。代表性的功能变体可以包括例如本文公开的靶标MG基因核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
更具体地，寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自SEQ ID NO：1-89的序列的核酸，其基本上相同的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：1-89之一、或者SEQ ID NO：1-89的互补物和变体具有至少例如80%、90%或95%的序列同一性。
表I:23s正向引物
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表II:23s反向引物
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表III:23s探针
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表IV: mgpB 正向引物
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表V: mgpB反向引物
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表VI: mgpB探针
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表VII:MgPar正向引物
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表VIII:MgPar反向引物
Figure DEST_PATH_IMAGE008
表IX:MgPar探针
Figure DEST_PATH_IMAGE009
Figure DEST_PATH_IMAGE010
在一个实施方案中，使用上述的引物和探针组，以便在怀疑含有MG的生物样品中检测MG。引物和探针组可以包含对于23s基因、mgpB基因和MgPar部分重复序列的核酸序列特异性的引物和探针或由其组成，所述引物和探针包含SEQ ID NO：1-89的核酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，关于靶标MG基因的引物和探针包含SEQ ID NO：1-89的引物和探针中任一的功能活性变体或由其组成。
可以通过使用所公开方法中的引物和/或探针来鉴定SEQ ID NO：1-89的引物和/或探针中任一的功能活性变体。SEQ ID NO：1-89中任一的引物和/或探针的功能活性变体涉及引物和/或探针，其在所述方法或试剂盒中提供与SEQ ID NO：1-89的相应序列相比相似或更高的特异性和灵敏性。
变体可以例如通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，例如在SEQ ID NO：1-89的分别序列的5’末端和/或3’末端处的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，而不同于SEQID NO：1-89的序列。如上所述，引物（和/或探针）可以是化学修饰的，即引物和/或探针可以包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后探针（或引物）是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”（或“核苷酸类似物”）通过一些修饰与天然“核苷酸”不同，但仍然由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或其组合组成。例如，“标记”可以附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可以被替换为例如7-脱氮嘌呤，由此同样获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”（或“核苷类似物”）通过一些修饰而不同于天然核苷，其方式如上文对于“经修饰的核苷酸”（或“核苷酸类似物”）概述的。
使用例如计算机程序如OLIGO（Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.），可以设计寡核苷酸（包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物），其扩增编码靶标MG基因,例如23s基因的核酸分子。当设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特点包括但不限于，促进检测（例如通过电泳）的适当大小的扩增产物，关于一对引物的成员的类似解链温度，以及每个引物的长度（即，引物需要足够长用于以序列特异性退火并引发合成，但不能太长使得保真度在寡核苷酸合成期间降低）。通常，寡核苷酸引物为长度8至50个核苷酸（例如，长度8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸）。
除一组引物之外，该方法还可以使用一种或多种探针，以检测MG的存在或不存在。术语“探针”指在合成或生物上产生的核酸（DNA或RNA），所述核酸通过设计或选择含有特定的核苷酸序列，其允许他们在限定的预定严格性下与“靶核酸”杂交，在本文情况下与靶标MG基因核酸特异性（即，优先地）杂交。“探针”可以被称为“检测探针”，意指他检测靶核酸。
在一些实施方案中，所述靶标MG基因探针可以用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中，靶标MG基因探针可以用供体荧光部分例如荧光染料、以及相应的受体部分例如猝灭剂进行标记。在一个实施方案中，探针包含荧光部分或由荧光部分组成，并且核酸序列包含SEQ ID NO：18-28、42-46和67-89或由其组成。
设计待用作探针的寡核苷酸可以以与引物设计类似的方式执行。实施方案可以使用单个探针或一对探针用于检测扩增产物。取决于实施方案，探针使用可以包含至少一种标记和/或至少一种猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以用于序列特异性杂交发生，但不能太长使得保真度在合成期间降低。寡核苷酸探针一般为长度15至40（例如，16、18、20、21、22、23、24或25）个核苷酸。在一些实施方案中寡核苷酸引物长度为40个或更少的核苷酸。
构建体可以包括各自含有靶标MG基因引物和探针核酸分子之一的载体。例如，构建体可以用作对照模板核酸分子。适合使用的载体是商购可得的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法生产。靶标MG基因核酸分子可以通过例如化学合成，从MG直接克隆或通过PCR扩增获得。
除靶标MG基因核酸分子（例如，含有SEQ ID NO：1-89中的一个或多个序列的核酸分子）之外，适用于所述方法的构建体通常还包括编码可选择标记物（例如抗生素抗性基因）的序列，用于选择期望的构建体和/或转化体、以及复制起点。 载体系统的选择通常取决于几个因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、选择性、诱导性和回收的容易性。
含有靶标MG基因核酸分子的构建体可以在宿主细胞中繁殖。如本文使用的，术语宿主细胞意欲包括原核生物和真核生物，例如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌（E. coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。真核宿主包括酵母例如酿酒酵母（S.cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（S. pombe）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），哺乳动物细胞例如COS细胞或中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、昆虫细胞和植物细胞例如拟南芥（Arabidopsisthaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）。可以使用本领域普通技术人员通常已知的技术中的任一种将构建体引入宿主细胞内。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是用于将核酸引入宿主细胞内的通常方法。另外，裸露DNA可以直接递送至细胞（参见例如，美国专利号5,580,859和5,589,466）。
聚合酶链反应（PCR）
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规PCR技术。PCR通常采用两种寡核苷酸引物，其与选择的核酸模板（例如DNA或RNA）结合。在一些实施方案中可用的引物包括能够在所述靶标MG基因核酸序列（例如，SEQ ID NO：1-17、29-41和47-66）内充当核酸合成起始点的寡核苷酸。可以通过常规方法从限制性消化物中纯化引物，或者他可以合成产生。为了最大扩增效率，引物优选是单链的，但引物也可以是双链的。首先使双链引物变性，即处理以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的，则必须将两条链分开，然后他才可以用作PCR中的模板。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，所述方法包括物理、化学或酶促手段。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至他占优势地变性（例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性）。用于使模板核酸变性所必须的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及待变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常范围为在一段时间内为约90℃至约105℃，取决于反应的特点如温度和核酸长度。变性通常执行约30秒至4分钟（例如，1分钟至2分钟30秒、或1.5分钟）。
如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每种引物与其在靶标MG基因核酸分子上的靶序列退火的温度。关于退火的温度通常为约35℃至约65℃（例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃）。退火时间可以是约10秒至约1分钟（例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒）。然后将反应混合物调整至在其下聚合酶的活性得到促进或优化的温度，即对于延伸从退火的引物发生以生成与模板核酸互补的产物足够的温度。温度应该足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应该高至使得延伸产物从其互补模板变性（例如，用于延伸的温度一般范围为约40℃至约80℃（例如，约50℃至约70℃；约60℃）。延伸时间可以是约10秒至约5分钟（例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟）。
PCR测定可以采用核酸，例如RNA或DNA（cDNA）。模板核酸无需是纯化的；他可以是复杂混合物例如人细胞中含有的核酸的一小部分。核酸分子可以通过常规技术从生物样品中提取，所述常规技术例如Diagnostic Molecular Microbiology: Principles andApplications（Persing等人（编辑），1993, American Society for Microbiology,Washington D.C.）中所述的那些。核酸可以从许多来源获得，例如质粒，或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器、或高等生物例如植物或动物。
寡核苷酸引物在诱导引物延伸的反应条件下与PCR试剂组合。例如，链延伸反应一般包括50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、15 mM MgCl2、0.001%（w/v）明胶、0.5-1.0 μg变性模板DNA、50 pmole每种寡核苷酸引物、2.5 U Taq聚合酶和10% DMSO）。反应通常含有150至320 μM的每种 dATP、dCTP、dTTP、dGTP或者其一种或多种类似物。
新合成的链形成双链分子，其可以用于反应的后续步骤中。链分离、退火和延伸的步骤可以根据需要经常重复，以产生对应于靶标核酸分子的所需数量的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和三磷酸核苷的量。循环步骤（即变性、退火和延伸）优选重复至少一次。对于在检测中使用，循环步骤的数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则需要更多循环步骤以扩增足以用于检测的靶序列。一般地，循环步骤重复至少约20次，但可重复多达40、60或甚至100次。
荧光共振能量转移（FRET）
FRET技术（参见例如，美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603）基于以下概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分位于彼此的一定距离内时，能量转移在两个荧光部分之间发生，其可以目视观察到或以其他方式检测和/或定量。当供体通过具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移到受体。受体通常以具有不同波长的光辐射形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可以通过生物分子在供体部分和受体部分之间转移，所述生物分子包括基本上非荧光的供体部分（参见例如，美国专利号7,741,467）。
在一个实例中，寡核苷酸探针可以含有供体荧光部分和相应的猝灭剂，其可以是或不是荧光的，并且以除光外的形式消散转移的能量。当探针完整时，能量转移通常在供体部分和受体部分之间发生，使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针被例如Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性切割，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。通常使用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。通常使用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™（BHQ）（Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.）、Iowa Black™（Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa）、BlackBerry™ Quencher 650（BBQ- 650）（Berry & Assoc.，Dexter，Mich.）。
在另一个实例中，各自含有荧光部分的两个寡核苷酸探针可以在特定位置处与扩增产物杂交，所述特定位置由寡核苷酸探针与靶标核酸序列的互补性确定。在寡核苷酸探针在适当位置处与扩增产物核酸杂交后，生成FRET信号。杂交温度范围可以为约35℃至约65℃共约10秒至约1分钟。
荧光分析可以使用例如光子计数表面荧光显微镜系统（包含适当的二向色镜和滤波器用于监测在特定范围下的荧光发射）、光子计数光电倍增器系统或荧光计进行。可以用氩离子激光器、高强度汞（Hg）弧光灯、光纤光源或对于在所需范围内的激发适当地过滤的其他高强度光源进行激发，以起始能量转移或允许荧光团的直接检测。
如本文关于供体部分和相应的受体部分使用的，“相应的”指受体荧光部分或暗猝灭剂，其具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱。受体荧光部分的发射光谱的波长最大值应该比供体荧光部分的激发光谱的波长最大值大至少100 nm。相应地，可以在其间产生有效的非辐射能量转移。
一般就以下选择荧光供体和相应的受体部分：（a）高效Foerster能量转移；（b）大的最终斯托克斯位移（>100 nm）；（c）发射位移尽可能远地进入可见光谱的红色部分（> 600nm）内；以及（d）发射位移到比在供体激发波长下由激发产生的Raman水荧光发射更高的波长。例如，供体荧光部分可以选择为在激光线附近具有其激发最大值（例如，氦-镉442 nm或氩488 nm）、高消光系数、高量子产率、以及其荧光发射与相应受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。相应的受体荧光部分可以选择为具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠、以及在可见光谱的红色部分（> 600 nm）中的发射。
可以在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸、7-二乙氨基-3-（4’-异硫氰酸基苯基）-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯和4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸衍生物。取决于使用的供体荧光部分，代表性的受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸酯、或镧系离子（如铕或铽）的其他螯合物。供体荧光部分和受体荧光部分可以例如从Molecular Probes（Junction City，Oreg.）或Sigma Chemical Co.（St. Louis，Mo.）获得。
供体荧光部分和受体荧光部分可以经由连接臂附接至适当的探针寡核苷酸。每个连接臂的长度是重要的，因为连接臂将影响供体荧光部分和受体荧光部分之间的距离。连接臂的长度可以是从核苷酸碱基到荧光部分以埃（Å）计的距离。一般而言，连接臂为约10 Å至约25 Å。连接臂可以具有WO 84/03285中描述的种类。WO84/03285还公开了用于将连接臂附接至特定核苷酸碱基的方法，以及用于将荧光部分附接至连接臂的方法。
受体荧光部分，例如LC Red 640，可以与含有氨基接头的寡核苷酸（例如，可从ABI（Foster City，Calif.）或Glen Research（Sterling，VA）获得的C6-氨基亚磷酰胺）组合，以产生例如LC Red 640标记的寡核苷酸。将供体荧光部分（例如荧光素）偶联到寡核苷酸的经常使用的接头，包括硫脲接头（FITC衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene（Ashland，Mass.）的荧光素-CPG）、酰胺接头（荧光素-NHS-酯衍生的，例如来自BioGenex（San Ramon，Calif.）的CX-荧光素-CPG）、或3’-氨基-CPG，其在寡核苷酸合成后需要荧光素-NHS-酯的偶联。
MG的检测
本发明提供了用于检测生物样品或非生物样品中MG的存在或不存在的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。该方法包括执行至少一个循环步骤，其包括使用一对或多对引物从样品中扩增靶标核酸分子的一部分，和FRET检测步骤。优选在热循环仪中执行多重循环步骤。可以使用引物和探针执行方法，以检测MG的存在，并且靶标MG基因的检测指示样品中MG的存在。
如本文所述，可以使用利用FRET技术的标记杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用TaqMan®技术来检测扩增产物的存在或不存在，并且因此检测MG的存在或不存在。TaqMan®技术利用一种单链杂交探针，其用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记，所述猝灭剂可以是或不是荧光的。当用合适波长的光激发第一荧光部分时，根据FRET的原理，将吸收的能量转移到第二荧光部分或暗猝灭剂。第二部分一般是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA（即扩增产物）结合，并且在随后的延长期过程中被例如Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性降解。结果，荧光部分和猝灭剂部分在空间上彼此分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下激发第一荧光部分后，可以检测来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems）使用TaqMan®技术，并且适合于执行本文所述的用于检测样品中MG的存在或不存在的方法。
与FRET结合的分子信标也可以用于使用实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用由第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分一般是猝灭剂，并且荧光标记通常位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成（例如发夹）的序列的探针寡核苷酸。作为探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分均处于空间接近。在与靶核酸（即扩增产物）杂交后，探针的二级结构被破坏并且荧光部分变得彼此分离，使得在用合适波长的光激发后，第一荧光部分的发射可以被检测到。
FRET技术的另一种常见形式利用两种杂交探针。每种探针可以用不同的荧光部分标记，并且一般被设计为在靶DNA分子（例如扩增产物）中彼此紧密接近地杂交。供体荧光部分例如荧光素由LightCycler® Instrument的光源在470 nm处激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移至受体荧光部分，例如LightCycler®-Red 640（LC Red 640）或LightCycler®-Red 705（LC Red 705）。受体荧光部分然后发射更长波长的光，其由LightCycler®仪器的光学检测系统检测。有效的FRET可以仅在荧光部分处于直接局部接近时，以及在供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时发生。发射信号的强度可以与原始靶DNA分子的数目（例如，MG基因组的数目）相关联。如果发生靶标核酸的扩增并且产生扩增产物，则杂交步骤导致基于该探针对的成员之间的FRET的可检测信号。
一般地，FRET的存在指示样品中MG的存在，并且FRET的不存在指示样品中MG的不存在。然而，不充分的样本收集、运输延迟、不适当的运输条件或某些收集拭子（海藻酸钙或铝轴）的使用均是可以影响测试结果的成功和/或准确度的条件。使用本文所述的方法，在例如45个循环步骤内的FRET的检测指示了MG感染。
可以用于实践该方法的代表性生物样品包括但不限于呼吸道样本、粪便样本、血液样本、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血液培养物、皮肤和软组织感染。生物样品的收集和贮存方法是本领域技术人员已知的。可以处理（例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒）生物样品，以释放MG核酸，或者在一些情况下，可以使生物样品与PCR反应组分和适当的寡核苷酸直接接触。
解链曲线分析是可以包括在循环概况中的另外步骤。解链曲线分析基于以下事实：DNA在称为解链温度（Tm）的特征温度下解链，所述解链温度被定义为在其下一半DNA双链体已分离成单链的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有比具有丰富的A和T核苷酸的那些更高的Tm。通过检测在其下信号丢失的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测在其下信号生成的温度，可以确定探针的退火温度。来自扩增产物的探针的解链温度可以证实样品中MG的存在或不存在。
在每个热循环仪运行内，对照样品同样可以循环。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板（除靶基因的所述扩增产物外）。阳性对照样品也可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可以在内部（例如，在样品内）或在与患者的样品并排运行的分开样品中进行扩增，其使用与用于检测预期靶相同的引物和探针。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指示剂。每个热循环仪运行还可以包括阴性对照，其例如缺少靶模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保了系统和试剂不产生假阳性信号。因此，对照反应可以容易地确定例如引物以序列特异性退火且起始延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交和用于FRET发生的能力。
在一个实施方案中，该方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一个热循环仪运行和下一个之间的污染。
与FRET技术结合的常规PCR方法可以用于实践该方法。在一个实施方案中，使用LightCycler®仪器。下述专利申请描述了如LightCycler®技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
LightCycler®可以使用PC工作站进行操作，并且可以利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管序贯地定位在光学单元上时，获得来自样品的信号。该软件可在每次测量后立即实时展示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒（msec）。在每个循环步骤之后，对于所有样品可以连续更新荧光相对于循环数的定量展示。所生成的数据可以存储用于进一步分析。
作为FRET的替代方案，可以使用双链DNA结合染料，例如荧光DNA结合染料（例如，SYBR® Green或SYBR® Gold（Molecular Probes））检测扩增产物。在与双链核酸相互作用后，这种荧光DNA结合染料在用以合适波长的光激发后发射荧光信号。也可以使用双链DNA结合染料，例如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常执行解链曲线分析用于确认扩增产物的存在。
应理解，本发明的实施例不受一种或多种商购可得仪器的配置的限制。
制造物品/试剂盒
本发明的实施方案进一步提供了检测MG的制造物品、组合物或试剂盒。制造物品可以包括用于检测MG基因的引物和探针，连同合适的包装材料。组合物可以包括用于扩增靶标MG基因的引物。在某些实施方案中，组合物还可以包含用于检测靶标MG基因的探针。用于检测MG的代表性引物和探针能够与靶标核酸分子杂交。另外，试剂盒还可以包括对于DNA固定、杂交和检测所需的适当包装的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准。本文公开了设计引物和探针的方法，并且提供了扩增靶标核酸分子且与靶标核酸分子杂交的引物和探针的代表性实例。
制造物品还可以包括用于标记探针的一个或多个荧光部分，或可替代地，可以标记随试剂盒提供的探针。例如，制造物品可以包括用于标记探针的供体荧光部分和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和相应的受体荧光部分的实例。
制造物品还可以含有包装插页或包装标签，在其上具有关于使用引物和探针来检测样品中的MG的说明。制造物品和组合物可以另外包括用于进行本文公开的方法的试剂（例如，缓冲液、聚合酶、辅因子或防止污染的试剂）。这些试剂可以对于本文所述的商购可得仪器之一是特异性的。
将在下述实施例中进一步描述本发明的实施方案，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
提供下述实施例、表格和附图以帮助理解主题，其实际范围在所附权利要求中阐述。应理解，可以在所述程序中做出修改，而不背离本发明的精神。
实施例1
MG的靶标选择是公共序列数据库的全面检索的结果。使用多种方法检索生殖支原体序列和他的最接近的物种，肺炎支原体，以设计用于测定排他性。选择的MG靶标具有公共数据库中最大的覆盖范围（mgpB 120个序列, MgPar 5个全基因组集合）。MG具有小的紧凑基因组，其限制了NAT设计可靶向的区域。由于其多拷贝数，选择mgpB表面蛋白基因（被称为MgPar靶标）用于测定。已知表面蛋白经历重组，其可以导致失败的测定。为了缓解相关的风险，使用非常保守的靶标（被称为mgpB靶标）实施双靶标方法。
MgPa操纵子编码三个基因：mgpA、mgpB和mgpC（在图1中mgpB 221kb标记为黑色圆圈）。mgpB（4335bp）存在于完整操纵子中，但是在操纵子外存在9个部分重复序列(MgPar的)。重复序列是mgpB的部分拷贝（图1）。选择mgpB基因的非常保守的A区域（被称为mgpB靶标）用于包容性目的，并且选择可变区域EF（被称为MgPar靶标）多拷贝靶标用于灵敏性目的（图1）。
使用cobas® 4800系统或cobas® 6800/8800系统平台（Roche MolecularSystems, Inc., Pleasanton, CA）执行MG的实时PCR。扩增试剂的终浓度如下所示：
表X PCR扩增试剂
Figure DEST_PATH_IMAGE011
以下图表显示了用于PCR扩增反应的典型热概况。
表XVII PCR热概况
Figure DEST_PATH_IMAGE012
Pre-PCR项目包括初始变性和在55℃、60℃和65℃温育，用于RNA模板的反转录。在三个温度温育组合了这样的有利效果：还转录了在较低温度轻微错配的靶标序列（诸如生物的遗传变体），而抑制了在较高温度RNA二级结构的形成，因此导致了更有效的转录。将PCR循环分为两个测量，其中两个测量均采用一步构建（one-step setup）（组合了退火和延伸）。第一个5次循环在55℃，允许通过预扩增轻微错配的靶标序列而增加的包容性，而第二测量的45个循环提供了通过使用58℃的温度退火/延伸而增加的特异性。图2示出了典型的扩增实验，其中显示了不同浓度的基因组MG模板DNA的PCR生长曲线。
使用上文所述的条件执行靶标MG基因、23s rRNA、mgpB和MaPar的扩增和检测。使用针对以1000基因组当量/PCR存在的基因组MG DNA的几种选择的寡核苷酸引物和探针的实验结果如下文以扩增反应的Ct值（阈值循环）显示。
表XVIII 靶标MG基因的扩增和检测
Figure DEST_PATH_IMAGE013
虽然前述发明已相当详细地描述用于清楚和理解的目的，但通过本发明的阅读对于本领域技术人员明确的是，可以做出在形式和细节中的各种改变。例如，上述所有技术和仪器都可以以各种组合使用。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
Roche Molecular Systems, Inc.
<120> 用于检测生殖支原体的组合物和方法
<130> P33594-WO-HS
<150> US 62/342519
<151> 2016-05-27
<160> 89
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 1
ggggtggatc acctcctttc a 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 2
caatgtttgg tctcacaact aacac 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 3
tccagttctg aaagaatgtt tttgaa 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 4
aaacgacaat ctttctagtt ccaaaa 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 5
atgtttggtc tcacaactaa cac 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 6
cagttctgaa agaatgtttt tgaa 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 7
cgacaatctt tctagttcca aaa 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 8
cggatctcag gtttttacca cctc 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 9
cagattgctc cattcggaca 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 10
cagattgctc cattcggaca c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 11
agattgctcc attcggacac 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 12
cacgtccttc atcgcctttt a 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 13
gatctcaggt ttttaccacc tc 22
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 14
attgctccat tcggaca 17
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 15
attgctccat tcggacac 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 16
attgctccat tcggacac 18
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 17
cgtccttcat cgcctttta 19
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 18
ggtcagtttg tatccagttc tgaaagaatg tttttgaac 39
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 19
gttcaaaaac attctttcag aactggatac aaactgacc 39
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 20
gaatgttttt gaacagttct ttcaaaactg aaaacgaca 39
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 21
tcagtttgta tccagttctg aaagaatgtt tttgaaccag 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 22
tgttcaaaaa cattctttca gaactggata caaactgacc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 23
agaatgtttt tgaacagttc tttcaaaact gaaaacgaca 40
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 24
ctaaaaggcg atgaaggacg tgttaacctg 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 25
ggtcagtttg tatccagttc tgaaagaatg 30
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 26
gttcaaaaac attctttcag aactggatac a 31
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 27
gaatgttttt gaacagttct ttcaaaactg a 31
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23s探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 28
ctaaaaggcg atgaaggacg tgttaac 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 29
gacttgaaac aataacaact tctcttc 27
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 30
gacttgaaac aataacaact tctcttca 28
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 31
aacaataaca acttctcttc actaaaga 28
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 32
caataacaac ttctcttcac taaagatta 29
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 33
accccttgga cttgaaacaa taacaa 26
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 34
agagaaccca ggatcatttg ga 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 35
ctggagagaa cccaggatca 20
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 36
gttgttatca taccttctga ttgcaa 26
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 37
ctaccgttgt tatcatacct tctga 25
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 38
catataaagc tctaccgttg ttatcata 28
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 39
aatatcatat aaagctctac cgttgtta 28
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (32)..(32)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 40
ttttccattt ttgctaagtt aatatcatat aa 32
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 41
ggggttttcc atttttgcta agttaa 26
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 42
ggagagaacc caggatcatt tggattagta agaagc 36
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 43
aagattactg gagagaaccc aggatcattt ggattagtaa g 41
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 44
ctggagagaa cccaggatca tttggattag taagaag 37
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 45
cagcaaaact ttgcaatcag aaggtatgat aacaacg 37
<210> 46
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mgpB探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 46
cgttgttatc ataccttctg attgcaaagt tttgctg 37
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 47
tttctcccct gaatcggcaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 48
caactccccc tccccttcaa 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 49
tccccctccc cttcaacttc 20
<210> 50
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 50
atcccaattc agatgataat aaagtcac 28
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 51
atcccaattc agatgataat aaagtca 27
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 52
tcccaccagt gactggatca a 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 53
caactcccac actgcttccc 20
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 54
tccaactccc acactgcttc ccc 23
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 55
tccaactccc acactgcttc c 21
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar正向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 56
caactcccac actgcttcc 19
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 57
ggtgaaaagt taggtataaa caccca 26
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 58
ctgctcctgt tcagatgtca 20
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 59
tgctcactat ccttgttaaa ttga 24
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 60
cacctcccca aacccaggta aa 22
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基dA
<400> 61
acctccccaa acccaggtaa a 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 62
cctgctcccg ttcagatgtc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 9-(氨基乙氧基)-吩噁嗪-2`-dC
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 63
cctgctcccg ttcaaatgtc 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 64
cctgctcccg ttcaratgtc 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 65
cctgctcccg ttcaaatgtc 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar反向引物
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基dC
<400> 66
cctgctcccg ttcagatgtc 20
<210> 67
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 67
ctccccactt tttctaacat caatgttggg gttaaatcaa 40
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 68
ttgatttaac cccaacattg atgttagaaa aagtggggag 40
<210> 69
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 69
cgcaatcaac tgttgctcag aagcttacta ggaa 34
<210> 70
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 70
agttcctagt aagcttctga gcaacagttg attgc 35
<210> 71
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 71
gatttaaccc caacattgat gttagaaaaa gtggggag 38
<210> 72
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (3)..(5)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (16)..(17)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (32)..(32)
<223> 丙炔基dU
<400> 72
gatttaaccc caacattgat gttagaaaaa gtggggag 38
<210> 73
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 73
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 74
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(4)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (31)..(31)
<223> 丙炔基dU
<400> 74
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 75
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 75
gatttaaccc caacattgat gttagaaaaa gtggtgag 38
<210> 76
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (16)..(17)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (32)..(32)
<223> 丙炔基dU
<400> 76
gatttaaccc caacattgat gttagaaaaa gtggtgag 38
<210> 77
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 77
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggtgag 37
<210> 78
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (31)..(31)
<223> 丙炔基dU
<400> 78
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggtgag 37
<210> 79
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (32)..(32)
<223> 7`脱氮dG
<400> 79
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 80
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (33)..(33)
<223> 7`脱氮dG
<400> 80
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 81
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (34)..(34)
<223> 7`脱氮dG
<400> 81
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 82
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (35)..(35)
<223> 7`脱氮dG
<400> 82
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 83
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(4)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (31)..(31)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (32)..(32)
<223> 7`脱氮dG
<400> 83
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 84
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(4)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (31)..(31)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (33)..(33)
<223> 7`脱氮dG
<400> 84
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 85
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(4)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (31)..(31)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (34)..(34)
<223> 7`脱氮dG
<400> 85
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggggag 37
<210> 86
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (33)..(33)
<223> 7`脱氮dG
<400> 86
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggg 34
<210> 87
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<400> 87
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggg 34
<210> 88
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(4)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 丙炔基dU
<400> 88
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggg 34
<210> 89
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MgPar探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3`磷酸
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(4)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 丙炔基dC
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 丙炔基dC
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 丙炔基dC
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 丙炔基dU
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 丙炔基dU
<400> 89
atttaacccc aacattgatg ttagaaaaag tggg 34

Claims (16)

1.一组靶标MG基因引物和一种或多种可检测的靶标MG基因探针在制备用于执行检测样品中生殖支原体（MG）的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：
- 执行扩增步骤，其包括使样品与一组靶标MG基因引物接触，如果所述样品中存在靶标MG基因核酸，则产生扩增产物；
- 执行杂交步骤，其包括使扩增产物与一种或多种可检测的靶标MG基因探针接触；和
- 检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中MG的存在，并且其中所述扩增产物的不存在指示所述样品中MG的不存在；
其中所述靶标MG基因引物组和所述一种或多种可检测的靶标MG基因探针扩增和检测mgpB部分重复序列（MgPar）的可变EF区域；且
其中所述靶标MG基因引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物含有选自SEQ IDNO: 47-56的第一寡核苷酸序列，或其互补物，所述第二引物含有选自SEQ ID NO: 57-66的第二寡核苷酸序列，或其互补物；和
其中一种或多种可检测的靶标MG基因探针包含选自SEQ ID NO: 67-89的第三寡核苷酸序列或其互补物。
2.权利要求1的用途，其中
- 所述杂交步骤包括使扩增产物与可检测的靶标MG基因探针接触，所述可检测的靶标MG基因探针使用供体荧光部分和相应的受体部分标记；和
- 所述检测步骤包括检测所述探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移（FRET）的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示了样品中MG的存在或不存在。
3.权利要求1-2中任一项的用途，其中所述扩增步骤采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。
4.权利要求2-3中任一项的用途，其中所述供体荧光部分和相应的受体部分在探针上彼此不超过8-20个核苷酸内。
5.权利要求2-4中任一项的用途，其中所述受体部分是猝灭剂。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其进一步包括用于扩增和检测MgPa黏附操纵子中mgpB基因的保守区域A的靶标MG mgpB基因引物组和一种或多种可检测的靶标MG mgpB基因探针。
7.权利要求6的用途，其中所述靶标MG mgpB基因引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物含有选自SEQ ID NO: 29-35的第一寡核苷酸序列，或其互补物，所述第二引物含有选自SEQ ID NO: 36-41的第二寡核苷酸序列，或其互补物；和其中所述一种或多种可检测的靶标MG mgpB基因探针包含选自SEQ ID NO: 42-46的第三寡核苷酸序列或其互补物。
8.一种用于检测生殖支原体（MG）的核酸的试剂盒，其包括：
- 第一引物，其包含选自SEQ ID NO: 47-56的第一寡核苷酸序列，或其互补物；
- 第二引物，其包含选自SEQ ID NO: 57-66的第二寡核苷酸序列，或其互补物；和
- 荧光可检测标记探针，其包含选自SEQ ID NO: 67-89的第三寡核苷酸序列，或其互补物，所述可检测标记探针被配置为与由第一引物和第二引物生成的扩增子杂交。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述荧光可检测标记探针包含供体荧光部分和相应的受体部分。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述受体部分是猝灭剂。
11.权利要求8-10中任一项的试剂盒，其进一步包括至少一种三磷酸核苷、核酸聚合酶和对于核酸聚合酶功能所必需的缓冲液。
12.权利要求8-11中任一项的试剂盒，其进一步包括用于扩增和检测MgPa黏附操纵子中mgpB基因的保守区域A的靶标MG mgpB基因引物组和一种或多种可检测的靶标MG mgpB基因探针。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述靶标MG mgpB基因引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物含有选自SEQ ID NO: 29-35的第一寡核苷酸序列，或其互补物，所述第二引物含有选自SEQ ID NO: 36-41的第二寡核苷酸序列，或其互补物；和其中所述一种或多种可检测的靶标MG mgpB基因探针包含选自SEQ ID NO: 42-46的第三寡核苷酸序列或其互补物。
14.权利要求8-13中任一项的试剂盒，其中所述第一引物、第二引物和荧光可检测标记探针中的至少一种包含至少一个经修饰的核苷酸。
15.权利要求8-14中任一项的试剂盒，其中所述第一引物、第二引物和荧光可检测标记探针具有40个或更少的核苷酸。
16.一种用于非诊断目的的检测样品中生殖支原体（MG）的方法，所述方法包括：
- 执行扩增步骤，其包括使样品与一组靶标MG基因引物接触，如果所述样品中存在靶标MG基因核酸，则产生扩增产物；
- 执行杂交步骤，其包括使扩增产物与一种或多种可检测的靶标MG基因探针接触；和
- 检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中MG的存在，并且其中所述扩增产物的不存在指示所述样品中MG的不存在；
其中所述靶标MG基因引物组和所述一种或多种可检测的靶标MG基因探针扩增和检测mgpB部分重复序列（MgPar）的可变EF区域；且
其中所述靶标MG基因引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物含有选自SEQ IDNO: 47-56的第一寡核苷酸序列，或其互补物，所述第二引物含有选自SEQ ID NO: 57-66的第二寡核苷酸序列，或其互补物；和
其中一种或多种可检测的靶标MG基因探针包含选自SEQ ID NO: 67-89的第三寡核苷酸序列或其互补物。
CN201780024968.XA 2016-05-27 2017-05-24 用于检测生殖支原体的组合物和方法 Active CN109072283B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662342519P 2016-05-27 2016-05-27
US62/342519 2016-05-27
PCT/EP2017/062510 WO2017202895A1 (en) 2016-05-27 2017-05-24 Compositions and methods for detection of mycoplasma genitalium

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109072283A CN109072283A (zh) 2018-12-21
CN109072283B true CN109072283B (zh) 2022-03-04

Family

ID=59009673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780024968.XA Active CN109072283B (zh) 2016-05-27 2017-05-24 用于检测生殖支原体的组合物和方法

Country Status (7)

Country Link
US (3) US10612101B2 (zh)
EP (1) EP3464618B1 (zh)
JP (2) JP6959257B2 (zh)
CN (1) CN109072283B (zh)
CA (1) CA3019725C (zh)
ES (1) ES2854049T3 (zh)
WO (1) WO2017202895A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017202894A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Roche Diagnostics Gmbh Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis
WO2019063661A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Roche Diagnostics Gmbh COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS
US11015228B2 (en) * 2018-01-09 2021-05-25 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, and Mycoplasma genitalium
CN108410957B (zh) * 2018-05-28 2021-07-06 西安博睿康宁生物科技有限公司 用于检测生殖支原体的荧光pcr引物、探针及检测试剂盒
EP3841223A1 (en) * 2018-08-08 2021-06-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
CN113046488A (zh) * 2021-05-17 2021-06-29 四川华汉三创生物科技有限公司 检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法
CN113186316A (zh) * 2021-05-26 2021-07-30 北京华诺奥美基因生物科技有限公司 一种生殖支原体核酸实时荧光pcr检测引物、探针及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001611A (en) * 1997-03-20 1999-12-14 Roche Molecular Systems, Inc. Modified nucleic acid amplification primers
CN105441585A (zh) * 2014-09-29 2016-03-30 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU596068B2 (en) 1983-02-22 1990-04-26 Syngene, Inc. Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4996143A (en) 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5683896A (en) 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5035996A (en) 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5843667A (en) 1991-03-22 1998-12-01 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection for genital mycoplasmas
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
JP3509859B2 (ja) 1991-11-07 2004-03-22 ナノトロニクス，インコーポレイテッド 供与体−供与体エネルギー転移系を創製するための発色団および蛍光団でコンジュゲート化されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション
EP1033411B1 (en) 1996-06-04 2006-02-22 University of Utah Research Foundation Fluorescent donor-acceptor pair
ATE260988T1 (de) 1996-06-04 2004-03-15 Univ Utah Res Found Vorrichtung und verfahren zur durchführung und überwachung von polymerase kettenreaktionen
ES2371088T3 (es) 2005-10-05 2011-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Transferencia de energía no fluorescente.
ES2366798T3 (es) * 2006-05-29 2011-10-25 Bio-Rad Pasteur Detección múltiple en tiempo real de tres especies bacterianas responsables de enfermedades de transmisión sexual.
IT1405994B1 (it) * 2010-06-22 2014-02-06 Euroclone Spa Metodo ad elevata sensibilita' per rilevare un acido nucleico target in un campione
US20140114215A1 (en) 2012-10-20 2014-04-24 Medtronic Ardian Luxembourg S.A.R.L. Methods for Renal Neuromodulation and Associated Systems and Devices
WO2014060604A2 (en) * 2012-10-20 2014-04-24 Selfdiagnostics OÜ Method and its compositions for detection of nucleic acid target from biological samples and body fluids

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001611A (en) * 1997-03-20 1999-12-14 Roche Molecular Systems, Inc. Modified nucleic acid amplification primers
CN105441585A (zh) * 2014-09-29 2016-03-30 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jørgen Skov Jensen.Protocol for the detection of Mycoplasma genitalium by PCR from clinical specimens and subsequent detection of macrolide resistance-mediating mutations in region V of the 23S rRNA gene.《Methods Mol Biol.》.2012,第903卷 *
Quantitative Detection of Mycoplasma genitalium from First-Pass Urine of Men with Urethritis and Asymptomatic Men by Real-Time PCR;Takashi Yoshida et,al.;《J Clin Microbiol.》;20020430;第40卷(第4期);摘要、第1452页左栏最后一段、右栏倒数第二段-第一段、讨论 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170342468A1 (en) 2017-11-30
JP2019519203A (ja) 2019-07-11
CN109072283A (zh) 2018-12-21
JP2021118716A (ja) 2021-08-12
US20230143647A1 (en) 2023-05-11
CA3019725C (en) 2023-02-28
CA3019725A1 (en) 2017-11-30
ES2854049T3 (es) 2021-09-20
JP7141488B2 (ja) 2022-09-22
EP3464618A1 (en) 2019-04-10
US20200181691A1 (en) 2020-06-11
US11591659B2 (en) 2023-02-28
WO2017202895A1 (en) 2017-11-30
US10612101B2 (en) 2020-04-07
EP3464618B1 (en) 2020-12-16
JP6959257B2 (ja) 2021-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109072283B (zh) 用于检测生殖支原体的组合物和方法
US20210147949A1 (en) Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis
US9816143B2 (en) Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus
CA2883066C (en) Compositions and methods for detection of clostridium difficile
CN113166802A (zh) 用于检测耳道假丝酵母菌的组合物和方法
CN109983138B (zh) 用于检测bk病毒的组合物和方法
CN109154023B (zh) 用于检测阴道毛滴虫的组合物和方法
US10370731B2 (en) Compositions and methods for detection of hepatitis C virus genotype 3
US11028451B2 (en) Compositions and methods for detection of Mycobacterium tuberculosis
WO2024003260A1 (en) Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis
US20190100787A1 (en) Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis
EP3966351A1 (en) Compositions and methods for detection of neisseria gonorroheae
CN117858960A (zh) 用于通过双靶标测定来检测丁型肝炎病毒的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant