CN105441585A - 试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途 - Google Patents
试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105441585A CN105441585A CN201410615873.3A CN201410615873A CN105441585A CN 105441585 A CN105441585 A CN 105441585A CN 201410615873 A CN201410615873 A CN 201410615873A CN 105441585 A CN105441585 A CN 105441585A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seqidno
- pathogenic agent
- unit
- sample
- test kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种能够扩增和/或检测病原体的试剂盒及其用途、一种病原体检测方法及装置。本发明提供的试剂盒包括以下13对引物序列的至少2对：SEQIDNO：1和2，SEQIDNO：3和4，SEQIDNO：5和6，SEQIDNO：7和8，SEQIDNO：9和10，SEQIDNO：11和12，SEQIDNO：13和14，SEQIDNO：15和16，SEQIDNO：17和18，SEQIDNO：19和20，SEQIDNO：21和22，SEQIDNO：23和24以及SEQIDNO：25和26。利用本发明的试剂盒、方法和/或装置，能够同时进行多种病原体检测，结果准确，检测成本低、耗时短。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测，具体地，本发明涉及包含序列的试剂盒、病原体检测方法及装置。
背景技术
2000年卫生部在15个省开展的部分城市已婚妇女妇科病常见流行病学调查研究结果显示：生殖道感染患病率为妇科疾病之首,42.9％已婚妇女至少患有1种生殖道感染,19％生殖道感染患者存在2种或2种以上混合感染。慢性宫颈炎患病率最高，39.3％；细菌性阴道病(BV)，5.3％；假丝酵母菌性阴道炎(VVC)，4.8％；生殖道CT感染，4.4％；盆腔炎，4.1％；滴虫性阴道炎，2.6％。而生殖道病原体感染会导致以下病症：1)泌尿系统感染、盆腔炎等；2)增加男女不孕症、孕产妇的异位妊娠、流产、早产、死产的发生率；3)淋病、梅毒、AIDS/HIV传给孩子，影响出生孩子的素质和下一代的健康；4)生殖系统的慢性炎症增加HIV感染几率。
生殖道感染导致的不孕不育比较严重，加强对妇女生殖道感染的检测，将对指导和治疗不孕症有重大意义。
由于引起生殖道感染的病原体复杂、多样，为临床治疗带来困难，因此迫切需要寻求一种特异性强、敏感性高同时又快速、经济的病原学检测方法，为临床病原学治疗提供实验依据。
目前临床用于生殖道感染病原体检测的方法有培养技术、免疫技术和PCR技术等，这些技术在临床诊断中已发挥了巨大的作用，但仍存在一些缺点。培养技术繁琐而费时；免疫技术要有特异的抗血清。PCR技术本身的优越性是无可厚非的，但是使用不当很容易引起交叉污染，出现假阳性；如果反应条件控制不好可能也会出现假阴性。这些缺点需要应用新的技术去弥补。
近几年发展起来的基因芯片技术为生殖道感染的病原学诊断提供了一种强有力的手段,其快速、高效、高通量、并行化的检测特点在病原学诊断方面占有独特的优势。基于基因芯片技术的生殖道病原体试剂盒也在不断地别研发生产出来，广泛用于生殖道病原体的临床检测。这些试剂盒大都针对于单一的病原体设计，一次病原体检测需要用到不同的试剂盒，工作较繁琐且对于临床样本量的需求也比较大。
近来已有学者通过检索相关细菌的16S～23SrRNA间区基因序列，针对不同细菌的共同序列和特异序列,设计通用引物和特异寡核苷酸探针并制成可同时检测单一样品中多种病原体的复合基因芯片。但是由于生殖道感染的并不仅仅由于细菌而导致，这种检测方法会将巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒等比较重要的病毒类生殖道病原体忽略，进而对临床诊断及治疗造成一定的阻碍。
发明内容
依据本发明的一方面，提供一种试剂盒，其包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6，SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，SEQIDNO：9和SEQIDNO：10，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，SEQIDNO：15和SEQIDNO：16，SEQIDNO：17和SEQIDNO：18，SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，SEQIDNO：21和SEQIDNO：22，SEQIDNO：23和SEQIDNO：24以及SEQIDNO：25和SEQIDNO：26所示的13对引物序列中的至少2对。
依据本发明的另一方面提供上述试剂盒在病原体扩增和/或检测中的用途，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌。
依据本发明的再一方面，提供一种病原体检测方法，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌中的至少一种，该法包括：(1)提取待测样本核酸；(2)对(1)中的核酸中的至少一部分进行扩增，获得扩增产物，所述扩增本发明一方面提供的试剂盒进行的；(3)对(2)中的扩增产物进行序列测定，获得测定序列；(4)利用(3)中的测定序列，确定待测样本中包含的病原体种类。该方法还可包括：(5)利用(4)中的结果，计算所述确定的各种病原体的丰度，将每种病原体的丰度与该种病原体的不致病丰度进行比较，两者有显著性差异则确定宿主感染该种病原体。
依据本发明的又一方面还提供一种病原体检测装置，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌中的至少一种，该装置包括：A.核酸提取单元，用于提取获得待测样本核酸；B.扩增单元，与A单元相连，用于对来自A的核酸的至少一部分进行扩增，获得扩增产物，所述扩增利用权利要求1的试剂盒中进行；C.序列测定单元，与B单元相连，用于对接收自B单元的扩增产物进行序列测定，获得测定序列；D.病原体种类确定单元，与C单元相连，用于利用接收自C单元的测定序列，确定待测样本包含的病原体种类。该装置进一步包括：E.病原体感染判定单元，与D单元相连，用于利用接收自D单元的结果，计算所述确定的各种病原体的丰度，将每种病原体的丰度与该种病原体的不致病丰度进行比较，两者有显著性差异则判定宿主感染该种病原体。
本发明的试剂盒、方法和/装置旨在开发一种基于新一代测序技术的用于辅助临床诊断的多种病原体感染筛查技术，能够一次性地将巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌13种可造成生殖系统等感染的病原体同时检出。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明的一个具体实施方式中的病原体检测流程；
图2是本发明的一个具体实施方式中的样本CMV检测结果示意图。
具体实施方式
依据本发明的一种实施方式，提供一种试剂盒，其包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6，SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，SEQIDNO：9和SEQIDNO：10，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，SEQIDNO：15和SEQIDNO：16，SEQIDNO：17和SEQIDNO：18，SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，SEQIDNO：21和SEQIDNO：22，SEQIDNO：23和SEQIDNO：24以及SEQIDNO：25和SEQIDNO：26所示的13对引物序列中的至少2对。根据本发明的一个具体的实施方式，该试剂盒包括上述13对引物序列中的至少4对。根据本发明的一个具体的实施方式，该试剂盒包括上述13对引物序列中的至少6对。根据本发明的一个具体的实施方式，该试剂盒包括上述13对引物序列中的至少8对。根据本发明的一个具体的实施方式，该试剂盒包括上述13对引物序列中的至少10对。根据本发明的一个具体的实施方式，该试剂盒包括上述13对引物序列中的至少12对。根据本发明的一个具体的实施方式，该试剂盒包括前述13对引物序列。利用该试剂盒能够多重扩增出样本包含的病原体，一次测定多种病原体检测多种病原体，多种病原体包括常见的生殖道感染病原体中的解脲脲原体(UU)、淋病奈瑟球菌(NG)、B族链球菌(GBS)、白假丝酵母(CA)、巨细胞病毒(CMV)、阴道加德纳菌(GV)、阴道毛滴虫(TV)、单纯疱疹病毒(HSV)、梅毒螺旋体(TP)、沙眼衣原体(CT)、生殖支原体(MG)、人型支原体(MH)和杜克嗜血杆菌(HD)。13对引物序列SEQIDNO：1-26如表1所示。13对引物分别能够特异性扩增出UU、NG、GBS、CA、CMV、GV、TV、HSV、TP、CT、MG、MH和HD核酸序列，而且13对引物中的任2对、任3对、任4对、任5对、任6对、任7对、任8对、任9对、任10对、任11对、任12对或者全部13对能够混合于一个反应体系中进行多重PCR，扩增出相应的病原体核酸序列。
表1
根据本发明的另一个实施方式，提供了上述试剂盒在病原体扩增和/或检测中的用途，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒阿螺旋体和B族链球菌。对本发明一个实施方式的试剂盒的优点及技术特征的描述，同样适用该试剂盒的用途。
根据本发明的再一个实施方式，提供一种病原体检测方法，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌中的至少一种，该方法包括：
(1)提取待测样本核酸。
在本发明的一个具体实施方式中，待测样本为血液、血清或血浆样本，血液/全血样通过离心等处理能够获得血浆或血清样本，提取血浆/血清中的游离核酸，该游离核酸是宿主和微生物的混合核酸，为DNA片段或RNA片段。这边的宿主可以是人也可以是其它哺乳动物。
(2)扩增。
对步骤(1)中的核酸中的至少一部分进行扩增，获得扩增产物，所述扩增利用本发明一方面的试剂盒进行。当在一个反应体系中，利用本发明一方面的试剂盒中的多对引物序列进行多重PCR，各对引物能够混合在同一个反应体系中同时扩增多种微生物核酸片段。
(3)序列测定。
对(2)中的扩增产物进行序列测定，获得测定序列。序列测定可以通过测序进行，比如可选用的测序方法根据来自的测序平台包括但不限于BGISEQ1000、BGISEQ100、Illumina/Solexa、ABI/SOLiD和Roche454，依据所选用的测序方法进行相应的文库制备，进行单端或双端测序，获得多条测序序列，即读段(reads)。根据本发明的一个具体实施方式，获得读段后，还对读段进行过滤，去除重复的、被接头污染(含接头序列)和质量值低于25的读段。
(4)确定待测样本包含的病原体种类。
利用(3)中的测定序列，确定待测样本中包含的病原体种类。具体地，可以将读段与病原体参考序列比对，基于获得的比对，确定待测样本中包含的病原体种类，病原体参考序列是病原体的已知序列，可以是自己测定的或者利用他人测定公开的病原体序列，这边病原体参考序列包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌的参考基因组。根据本发明的一个具体实施方式，某个病原体的参考基因组只要有读段能够比对上，更佳地，完全匹配，即确定该样本包含这种病原体。
根据本发明的一个具体实施方式，该检测方法还包括：
(5)确定宿主是否感染某种(些)病原体。
利用(4)中的比对结果，计算待测样本包含的各种病原体的丰度，将每种病原体的丰度与该种病原体的不致病丰度进行比较，两者有显著性差异则确定宿主感染该种病原体。这边的丰度反映病原体在该样本中的量。在本发明的一个具体实施方式中，某种病原体的不致病丰度的确定，即阈值的确定，阈值可以是具体数值也可以是个数值范围甚至是一个公式，包括：从多个阴性血液/血浆/血清样本中获得多个某种病原体的不致病丰度，这些基于多个阴性对照样本的不致病丰度的获得，可以参照待测样本的丰度的获得过程进行，同时或者预先进行(1)-(4)，获得多个阴性样本各自包含的一个或多个致病物种的多个丰度，取得自多个阴性样本的多个丰度的均值，利用z检验或t检验，设定置信度，比如95％，获得某种病原体的不致病丰度数值范围，数值范围的上限即为所说的阈值。将待测样本中包含的各种病原体的丰度与其各自的阈值比较，其丰度大于阈值，则判定取该待测样本的宿主感染这种病原体。丰度可以根据公式计算获得，i表示某种病原体，可进一步将利用该公式得到病原体i阈值换算成读段数目阈值，比如获得的读段长为100bp，读段数目阈值＝原阈值*物种i大小/100bp。根据本发明的一个具体实施方式，丰度的计算公式还可以为：j表示某种病原体。
根据本发明的又一个实施方式，提供一种病原体检测装置，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌中的至少一种，所述装置包括：A.核酸提取单元，用于提取获得待测样本核酸；B.扩增单元，与A单元相连，用于对来自A的核酸的至少一部分进行扩增，获得扩增产物，所述扩增利用本发明一个实施方式的试剂盒进行；C.序列测定单元，与B单元相连，用于对接收自B单元的扩增产物进行序列测定，获得测定序列；D.病原体种类确定单元，与C单元相连，用于利用接收自C单元的测定序列，确定待测样本包含的病原体种类。在本发明的一个具体实施方式中，将接收自C单元的测定序列与病原体参考序列比对，利用获得的比对结果，确定待测样本中包含的病原体种类，所述病原体参考序列包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌的参考基因组。在本发明的另一个实施方式中，该装置还包括：E.病原体感染判定单元，与D单元相连，用于利用接收自D单元的比对结果，计算所述确定的各种病原体的丰度，将每种病原体的丰度与该种病原体的不致病丰度进行比较，两者有显著性差异则判定宿主感染该种病原体。该装置能够用以执行完成本发明一方面的病原体检测方法，适用于本发明试剂盒、方法的技术特征和优点的描述，也同样适用于该装置，在此不再赘述。
与现有其他技术相比，利用本发明的试剂盒、方法和/或装置，利用特异性引物能够于同一反应体系种扩增各病原体的保守区域，应用高通量测序方法，通过一次实验获得UU、NG、GBS、CA、CMV、GV、TV、HSV、TP、CT、MG、MH和HD目的片段核酸序列信息，得出样本中包含的病原体种类以及是否已经感染某种(些)病原体。采用PCR的方法和成熟稳定的高通量测序技术，保证病原体载量较低的样品也可以检测出来。特异性引物的设计及PCR体系的优化，确保了检测结果的准确性。此外，本发明方法成本较低，耗时较短，适合广泛应用。
以下结合具体个体样本对依据本发明的具体检测方法的运行结果进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者公开的，比如购自Illumina公司的hiseq2000测序平台建库相关试剂盒等。如图1所示，以下实施例对女性样本病原体检测大致包括以下步骤：(1)针对13种病原体设计引物对，试验筛选获得能够在同一PCR反应体系中进行多重扩增的引物序列；(2)样本的DNA/RNA提取；(3)通过多重PCR，获得检测样本中可能含有的生殖道感染体的特异基因序列的扩增产物；(4)电泳检测；(5)DNA文库构建；(6)Hiseq高通量测序；(7)数据分析，确定样本包含的病原体，和/或是否感染某种(些)病原体。
实施例
病人尿液/阴道宫颈分泌物样本(拭子样品)来自内蒙古妇幼保健院。采用IlluminaHiseq高通量测序技术对病人样本中是否包含解脲脲原体(UU)、淋病奈瑟球菌(NG)、B族链球菌(GBS)、白假丝酵母(CA)、阴道加德纳菌(GV)、阴道毛滴虫(TV)、单纯疱疹病毒(HSV)、梅毒螺旋体(TP)、沙眼衣原体(CT)、生殖支原体(MG)、人型支原体(MH)、杜克嗜血杆菌(HD)和/或巨细胞病毒(CMV)进行检测，操作步骤如下：
1.引物设计
首先根据UU、NG、GBS、CA、GV、TV、HSV、TP、CT、MG、MH、HD、CMV的的基因组序列分别设设计PCR引物对，多次试验筛选获得能够在同一PCR反应体系中进行多重扩增的引物序列。
UU扩增引物为：
上游(ZJ-UU-2F)：5’-AGAATTTACCAGGTGAAACAGT-3’；
下游(ZJ-UU-1R)：5’-CCAGAAATTGTTCCAGTAGC-3’；
NG扩增引物为：
上游(ZJ-NG-1F)：5’-CGTTTGGCTGGTTGATTC-3’；
下游(ZJ-NG-2R)：5’-AGAGCTAGAGCAGGAAAACAC-3’；
GBS扩增引物为：
上游(ZJ-GBS-1F)：5’-TCTCTCAATACAATTTCGG-3’；
下游(ZJ-GBS-2R)：5’-TGACTAACAGCTTGCTCT-3’；
CA扩增引物为：
上游(CA-2F)：5’-GGAAGGATCATTACTGATT-3’；
下游(CA-2R)：5’-GAGATCCGTTGTTGAAAGTT-3’；
CMV扩增引物为：
上游(CMV-4F)：5’-CGCTGTGTATCTGGATTGT-3’；
下游(CMV-4R)：5’-AGAAGCTCTAAAAGCAGAGT-3’；
GV扩增引物为：
上游(GV-2F)：5’-TGCCACCAAGCAGCCATAAT-3’；
下游(GV-2R)：5’-CGACCACTTTCGCTTACAAT-3’；
TV扩增引物为：
上游(TV-3F)：5’-TGCCTTCAGGGCTTCCAGCT-3’；
下游(TV-3R)：5’-ACCTTTGGAGATGGGACGAT-3’；
HSV扩增引物为：
上游(ZJ-HSV-1F)：5’-CCATAAACTGGGAGTAGC-3’；
下游(ZJ-HSV-2R)：5’-GGTGGTCTTCAAGGAGAAC-3’；
TP扩增引物为：
上游(ZJ-TP-2F)：5’-TCCGGCATATGTCCAAGCTG-3’；
下游(ZJ-TP-1R)：5’-TAACAAGTGTGAGCGTCTCAT-3’；
CT扩增引物为：
上游(ZJ-CT-2F)：5’-GAGTACATCGGTCAACG-3’；
下游(ZJ-CT-1R)：5’-CAGCTTGTAGTCCTGCTTGA-3’；
MG扩增引物为：
上游(ZJ-MG-2F)：5’-TTGTTGTGAGCAGATAGTGG-3’；
下游(ZJ-MG-1R)：5’-TACCTATATATAGTAAAGTAGCAG-3’；
MH扩增引物为：
上游(ZJ-MH-1F)：5’-AACAGTCCACTCATATACAGC-3’；
下游(ZJ-MH-2R)：5’-AGCTGCTCTTGCTCTTCTT-3’；
HD扩增引物为：
上游(HD-3F)：5’-CAATGCTAGAAGAAAGTCCT-3’；
下游(HD-3R)：5’-ATCGTGAAACAGGTGAGGTT-3’；
2.检测样本DNA的提取
采用盐析法，按照标准的操作流程提取待检测样本的DNA。
3.多重PCR扩增反应
3.1多重PCR体系中引物情况
把要检测的13种病原体的特异引物随机分成3组，这样只需要3个PCR反应就可以一次性检测出一个样本中是否存在这13种病原体，每个50μLPCR反应TI体系中的引物及相应的加入量如下表：
3.2对提取的样本DNA进行PCR扩增反应，PCR扩增反应体系的试剂配置见表：
PCR反应的反应程序如下：
4.跑胶检测
加3μL的PCR产物与3μL的吖啶橙混匀，1.5％的琼脂糖凝胶浓度进行电泳检测，电压130伏，电泳30分钟。EB染胶15分钟，采用凝胶成像系统拍照检测。
5.DNA文库构建
5.1DNA检测：取1-2μL样品进行NanoDrop2000检测，并记录。
5.2产物纯化：144μLAmpureBeads进行产物纯化，回收的DNA溶于77μL的水中。
5.3末端修复
5.3.1预先从-20℃保存的试剂盒中取出10×PolynucleotideKinase(PNK)buffer、10mMdNTPsmix、KlenowFragment、T4PolynucleotideKinase(T4PNK)将其置于冰上融解并充分混匀。
5.3.2配置末端修复反应体系：
| 反应个数 | 1个反应(μL) |
| 10xPolynucleotide Kinase buffer | 10 |
| dNTP Solution Set | 4 |
| T4DNA Polymerase | 5 |
| Klenow Fragment | 1 |
| T4Polynucleotide Kinase(T4PNK) | 5 |
| Total volume | 25 |
5.3.3将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存，将配置好的mix使用vortex混匀后，每个反应加入25μL酶反应混合液。
5.3.4震荡混匀并离心后，置于在Thermomixer中20℃温浴30min。
5.3.5使用150μLAmpureBeads进行产物纯化，回收的DNA溶于34μL的水中。
5.4末端加“A”(A-Tailing)
5.4.1预先从-20℃保存的试剂盒中取出10×bluebuffer和5mMdATPs，将其置于冰上融解并使其充分混匀10×bluebuffer。
5.4.2配置末端加“A”反应体系：
| 反应个数 | 1个反应(μL) |
| 10×blue buffer | 5 |
| dATPs(5mM) | 10 |
| Klenow(3’-5’exo-) | 3 |
| Total volume | 18 |
5.4.3将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存，将配置好的mix震荡混匀后，每管加入18μL酶反应混合液。
5.4.4震荡混匀并离心后，置于在Thermomixer中37℃温浴30min。
5.5Adapter的连接(AdapterLigation)
5.5.1预先从-20℃保存的试剂盒中取出10×ligationbuffer、PEIndexAdapterOligoMix和ATP(10mM)将其置于冰上融解并充分混匀10×ligationbuffer。
5.5.2配置Adapter连接反应体系：
PEI文库:
| 反应个数 | 1个反应(μL) |
| 10×ligation buffer | 1.5 |
| Index PE Adapter | 1 |
| ATP(10mM) | 3.5 |
| T4 DNA Ligase | 3 |
| ddH2O | 6 |
| Total volume | 15 |
5.5.3将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存，将配置好的mix震荡混匀后，每管加入15μL酶反应混合液。
5.5.4震荡混匀并离心后，置于在Thermomixer中20℃温浴15min。
5.5.5使用75μLAmpureBeads进行产物纯化，回收的DNA溶于30μL的水中。
5.5.6纯化后，使用Nanodrop2000检测各样本OD值，并电泳检测样本DNA片段大小。
5.62100检测、QC检测浓度/富集度
使用Agilent2100Bioanalyzer检测加“Adaptor”产物的产量，使用QPCR检测加“Adaptor”产物的富集度。
6.Hiseq高通量测序。
7.数据分析，将Hiseq测定的数据用生物信息学的方法进行分析，确定样本感染病原体的种类。
将Hiseq测定的片段序列信息与NCBI中各种病原体的参考基因组比对，确定样本包含的病原体种类，和/或感染的病原体种类。先对获得的读段进行过滤，过滤掉长度小于50bp的reads。接着，将过滤后的reads数据用比对软件blat(TheBLAST-LikeAlignmentTool，类BLAST比对工具，http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？command＝start)与病原体参考序列做比对。只在该示例中经过过滤后只要有一条读段能够唯一比对到某种病原体的参考基因组，则认为该样本包含这种病原体。统计每种病原体的reads支持数目，如果某病原支持数目超出其设定的阈值(cutoff)，则认为感染。阈值的设定是为了将阳性样本(感染者)和阴性对照样本(正常人)区分开来，阈值范围根据多个阴性样本检出病原数的均值与标准差来确定的，然后在确定的数值范围中选择能够满足最高的阳性检出率和最高阴性检出率的值作为阈值，如图2中三条直线的上下两条直线之间代表确定出的阈值范围，是根据多个阴性样本检出病原数的均值与3倍标准差来确定出的，中间那条线代表选择确定的阈值，以确保检出结果的特异性和灵敏性。计算病原reads支持数目时，支持的每个read序列至少有40bp能与病原参考序列匹配。图2是CMV检测结果示例，图中下面的折线上的点表示检出样本为阴性，上面折线为感染CMV的阳性样本，该结果与电泳验证的结果相符。在该示例中，每个样本的测序量是10M，对于CMV检测来说，如果reads支持数目超过600条，则认为该样本感染CMV。
Claims (9)
1.试剂盒，其包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6，SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，SEQIDNO：9和SEQIDNO：10，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，SEQIDNO：15和SEQIDNO：16，SEQIDNO：17和SEQIDNO：18，SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，SEQIDNO：21和SEQIDNO：22，SEQIDNO：23和SEQIDNO：24以及SEQIDNO：25和SEQIDNO：26所示的13对引物序列中的至少2对；
任选地，所述试剂盒包括所述13对引物序列中的至少4对；
任选地，所述试剂盒包括所述13对引物序列中的至少6对；
任选地，所述试剂盒包括所述13对引物序列中的至少8对；
任选地，所述试剂盒包括所述13对引物序列中的至少10对；
任选地，所述试剂盒包括所述13对引物序列中的至少12对；
任选地，所述试剂盒包括所述13对引物序列。
2.权利要求1的试剂盒在病原体扩增和/或检测中的用途，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌。
3.病原体检测方法，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌中的至少一种，所述方法包括：
(1)提取待测样本核酸；
(2)对(1)中的核酸中的至少一部分进行扩增，获得扩增产物，所述扩增利用权利要求1的试剂盒进行；
(3)对(2)中的扩增产物进行序列测定，获得测定序列；
(4)利用(3)中的测定序列，确定待测样本中包含的病原体种类。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述样本为血液、血清或血浆样本。
5.权利要求3的方法，其特征在于，所述扩增为多重PCR。
6.权利要求3的方法，其特征在于，(4)包括：
将(3)中的测定序列与病原体参考序列比对，利用获得的比对结果，确定待测样本中包含的病原体种类，所述病原体参考序列包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌的参考基因组。
7.权利要求6的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(5)利用(4)中的比对结果，计算所述确定的各种病原体的丰度，将每种病原体的丰度与该种病原体的不致病丰度进行比较，两者有显著性差异则确定宿主感染该种病原体。
8.病原体检测装置，所述病原体包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌中的至少一种，所述装置包括：
A.核酸提取单元，用于提取获得待测样本核酸；
B.扩增单元，与A单元相连，用于对来自A的核酸的至少一部分进行扩增，获得扩增产物，所述扩增利用权利要求1的试剂盒中进行；
C.序列测定单元，与B单元相连，用于对接收自B单元的扩增产物进行序列测定，获得测定序列；
D.病原体种类确定单元，与C单元相连，用于利用接收自C单元的测定序列，确定待测样本包含的病原体种类；
任选地，D单元包括：
将接收自C单元的测定序列与病原体参考序列比对，利用获得的比对结果，确定待测样本中包含的病原体种类，所述病原体参考序列包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟球菌、阴道毛滴虫、解脲脲原体、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、人型支原体、生殖支原体、阴道加德纳菌、杜克嗜血杆菌、梅毒螺旋体和B族链球菌的参考基因组。
9.权利要求8的装置，其特征在于，所述装置还包括：
E.病原体感染判定单元，与D单元相连，用于利用接收自D单元的比对结果，计算所述确定的各种病原体的丰度，将每种病原体的丰度与该种病原体的不致病丰度进行比较，两者有显著性差异则判定宿主感染该种病原体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410615873.3A CN105441585A (zh) | 2014-09-29 | 2014-11-04 | 试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2014105148999 | 2014-09-29 | ||
| CN201410514899 | 2014-09-29 | ||
| CN201410615873.3A CN105441585A (zh) | 2014-09-29 | 2014-11-04 | 试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105441585A true CN105441585A (zh) | 2016-03-30 |
Family
ID=55552207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410615873.3A Pending CN105441585A (zh) | 2014-09-29 | 2014-11-04 | 试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105441585A (zh) |
| HK (1) | HK1218315A1 (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106282340A (zh) * | 2016-08-12 | 2017-01-04 | 吉林大学 | 鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒及制备方法 |
| CN107099618A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-08-29 | 上海速创诊断产品有限公司 | 一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的lamp引物组合物及其相关应用 |
| CN107686863A (zh) * | 2016-12-19 | 2018-02-13 | 天津医科大学 | 环介导等温扩增技术检测三种泌尿生殖道支原体的方法 |
| CN108950062A (zh) * | 2018-05-07 | 2018-12-07 | 北京大学第三医院 | 微量生物样本dna模板的制备方法及眼部hsv感染检测试剂盒 |
| CN109072283A (zh) * | 2016-05-27 | 2018-12-21 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测生殖支原体的组合物和方法 |
| CN109671467A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种病原体感染损伤机理解析方法及装置 |
| CN110283921A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-09-27 | 中生方政生物技术股份有限公司 | 加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法 |
| CN110349630A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-10-18 | 天津华大医学检验所有限公司 | 血液宏基因组测序数据的分析方法、装置及其应用 |
| WO2022121520A1 (zh) * | 2020-12-11 | 2022-06-16 | 厦门大学 | 一种评估用于检测病原体的试剂或试剂组合的有效性的方法及装置 |
-
2014
- 2014-11-04 CN CN201410615873.3A patent/CN105441585A/zh active Pending
-
2016
- 2016-06-02 HK HK16106293.3A patent/HK1218315A1/zh unknown
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109072283A (zh) * | 2016-05-27 | 2018-12-21 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测生殖支原体的组合物和方法 |
| CN109072283B (zh) * | 2016-05-27 | 2022-03-04 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测生殖支原体的组合物和方法 |
| CN106282340A (zh) * | 2016-08-12 | 2017-01-04 | 吉林大学 | 鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒及制备方法 |
| CN106282340B (zh) * | 2016-08-12 | 2022-11-18 | 吉林大学 | 鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒及制备方法 |
| CN107686863A (zh) * | 2016-12-19 | 2018-02-13 | 天津医科大学 | 环介导等温扩增技术检测三种泌尿生殖道支原体的方法 |
| CN107099618A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-08-29 | 上海速创诊断产品有限公司 | 一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的lamp引物组合物及其相关应用 |
| CN108950062A (zh) * | 2018-05-07 | 2018-12-07 | 北京大学第三医院 | 微量生物样本dna模板的制备方法及眼部hsv感染检测试剂盒 |
| CN109671467A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种病原体感染损伤机理解析方法及装置 |
| CN109671467B (zh) * | 2018-12-12 | 2023-03-24 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种病原体感染损伤机理解析方法及装置 |
| CN110349630B (zh) * | 2019-06-21 | 2023-03-14 | 深圳华大因源医药科技有限公司 | 血液宏基因组测序数据的分析方法、装置及其应用 |
| CN110349630A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-10-18 | 天津华大医学检验所有限公司 | 血液宏基因组测序数据的分析方法、装置及其应用 |
| CN110283921A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-09-27 | 中生方政生物技术股份有限公司 | 加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法 |
| WO2022121520A1 (zh) * | 2020-12-11 | 2022-06-16 | 厦门大学 | 一种评估用于检测病原体的试剂或试剂组合的有效性的方法及装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1218315A1 (zh) | 2017-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105441585A (zh) | 试剂盒及其在生殖道病原体扩增检测中的用途 | |
| Li et al. | High‐throughput metagenomics for identification of pathogens in the clinical settings | |
| Lee et al. | Genome-wide methylation profiling and a multiplex construction for the identification of body fluids using epigenetic markers | |
| US20240026456A1 (en) | Methods of detecting cell-free dna in biological samples | |
| TW201718874A (zh) | 血漿ｄｎａ之單分子定序 | |
| CN102154450B (zh) | 一种检测肠炎致病菌的方法 | |
| CN105624329A (zh) | 单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| WO2019085546A1 (zh) | 微生物 16S rDNA 单分子水平测序文库的构建方法 | |
| Giampaoli et al. | Forensic interlaboratory evaluation of the ForFLUID kit for vaginal fluids identification | |
| Wang et al. | An overview of nucleic acid testing for the novel coronavirus SARS-CoV-2 | |
| CN104017909A (zh) | 用于鉴定病原体的寡核苷酸微阵列 | |
| CN104726566A (zh) | 多重pcr检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法 | |
| CN104131006A (zh) | 一种人腺病毒快速检测试剂盒 | |
| Lyu et al. | CRISPR-based biosensing is prospective for rapid and sensitive diagnosis of pediatric tuberculosis | |
| CN103276099A (zh) | 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒 | |
| CN102994641A (zh) | 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 | |
| US20220136046A1 (en) | Detection and antibiotic resistance profiling of microorganisms | |
| CN113249517A (zh) | 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒 | |
| CN103045717A (zh) | 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法 | |
| CN111549109A (zh) | 一种高通量的病原体微生物基因检测筛查方法 | |
| CN103937806A (zh) | 一种Rh血型DEL型RHD838G>A等位基因及其检测方法 | |
| CN106191319A (zh) | 一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法 | |
| CN116377095A (zh) | 检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库、试剂盒及检测方法 | |
| CN113801963B (zh) | 一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法 | |
| CN109022556A (zh) | 一种dna甲基化程度的定量方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1218315 Country of ref document: HK |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160330 |
|
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1218315 Country of ref document: HK |