CN103805713B - 一种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途。所述引物为SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2的序列；所述探针为SEQ？ID？NO:4的序列，其5’端单链碱基序列，其为与靶序列互补的5-10个碱基；中间13-20个碱基；3’端序列，为5-10个碱基序列；所述5’端单链碱基序列与3’端序列部分匹配成颈结构；所述探针为颈环结构，TM值=（颈环TM值+7）±1，5’端有18-25个碱基能够和靶基因完全匹配，共约23-32bp；其5’端和3’端分别标记荧光和非荧光淬灭基团。本发明的引物和探针具有稳定的线性结构，用于检测人巨细胞病毒核酸定量具有较低的荧光本底值、信噪比高和检测灵敏度高的优点。

Description

一种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂。尤其涉及一种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途。

背景技术

人巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus，HCMV)属疱疹病毒科乙组疱疹亚科。现有的人巨细胞病毒核酸定量检测方法有一系列的问题，比如电镜技术虽直接、客观，但对病毒滴度要求高，设备昂贵，并且需要熟练的技术人员，因此检测价值较低。病毒分离由于技术要求高，分离时间长，易污染的缺点也不易于大量开展。用常规PCR检测CMV-DNA，具有简便、快捷等特点。但是由于扩增后的产物需电泳检测，易造成交叉污染出现假阳性的结果。

荧光定量PCR是(realtimefluores-cencequantitativePCR，RTFQPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有稳定的线性结构的引物和探针，还在于提供一种具有较低的荧光本底值、信噪比高和检测灵敏度高的人巨细胞病毒核酸定量检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列；所述探针的序列为：从5’端起,与靶序列互补的5-10个碱基的单链碱基序列；中间13-20个碱基的环状结构序列；3’端的5-10个碱基序列；所述5’端的与靶序列互补的5-10个碱基与3’端的5-10个碱基序列部分匹配成颈结构；所述探针成颈环结构，同时探针TM值=（颈环TM值+7）±1，探针5’端有18-25个碱基能够和靶基因完全匹配，探针序列约23-32bp；所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记非荧光淬灭基团。

所述探针序列为SEQIDNO:4的序列。

所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记Dabcyl非荧光淬灭基团。

本发明还保护一种人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括上述的任一引物和探针。

还包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂、参考品试剂和HCMV定量标准品。

所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为二氧化硅、TritonX-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述洗涤液为TritonX-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为TritonX-100、EDTA·2Na；所述PCR扩增试剂为HCMVPCR反应管和HCMV反应缓冲液；所述参考品试剂为HCMV阴性对照、HCMV临界阳性对照，HCMV强阳性对照；优选的，所述裂解液为10mMPH7.01重量‰二氧化硅、1体积‰TritonX-100、10mMEDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.01体积‰TritonX-100、1mMEDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为10mMPH7.01体积‰TritonX-100、1mMEDTA·2Na；所述HCMVPCR反应管含有2UTaq酶、0.01UUNG酶、0.1mMEDTA·2Na、25微升石蜡油；HCMV反应缓冲液为10pMHCMV引物，5pMHCMV探针、20mMPH9.050mMKCl、1.5mMMgCl2、0.1mMEDTA·2Na、0.2mMdNtps。

本发明还提供一种应用所述引物和探针或所述试剂盒进行人巨细胞病毒核酸定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤，

样品制备；制备得到纯化的核酸；

PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1-3任一引物和探针或权利要求4的试剂盒；

结果判定。

所述样品制备为取0.5mL离心管加入裂解液100μL然后加入待测样本50μL，混悬，室温静置10分钟进行裂解；10000g离心25秒，去上清；加入150μL洗涤液对所得到的沉淀进行洗涤，混悬，10000g离心25秒，去上清；加入150μL重复洗涤液，混悬，10000g离心25秒，去上清备用，纯化得到的沉淀即为核酸；所述裂解液为10mMPH7.01重量‰二氧化硅、1体积‰TritonX-100、10mMEDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.01体积‰TritonX-100、1mMEDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为10mMPH7.01体积‰TritonX-100、1mMEDTA·2Na。

所述PCR扩增程序为，38℃5分钟，95℃10分钟；进入以下循环：95℃15秒，58℃50秒，共40循环；所述荧光值读取为在PCR扩增每个循环的58℃，30秒时。所述结果判定为：

如果检测样本中病毒载量为5.0×10²Copies/mL≤HCMVDNA≤5.0×10⁸Copies/mL判断为阳性，直接报告定量结果；

如果检测样本中病毒载量为＞5.0×10⁸Copies/mL，判断为阳性，报告为＞5.0×10⁸Copies/mL；

如果检测样本中病毒载量为0Copies/ml，判断为阴性，报告为0.0Copies/ml；

如果检测样本中病毒载量为＜5.0×10²Copies/mL，Copies数仅供参考，建议重新检测。

样本提纯试剂用于提取人巨细胞病毒样本中的核酸，所提取的核酸可以直接用于荧光定量PCR。

制备的核酸分别用反应缓冲液30μL融解，取25μL依次加入反应管中，混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内。扩增曲线通过连接于PCR扩增仪的终端电脑获取，用于分析是否感染人巨细胞病毒。

参考品用于检测核酸提取过程和PCR扩增过程是否正常进行。

本发明的试剂盒具体可以包括：

样本提纯试剂

裂解液1.1mL/支，2支；

洗涤液1.6mL/支，2支；

重复洗涤液，1.6mL/支，2支；

PCR扩增试剂：

HCMVPCR反应管，2μL/支，20支；

HCMV反应缓冲液，350μL/支，2支；

参考品试剂：

HCMV阴性对照，165μL/支，1支；

HCMV临界阳性对照，165μL/支，1支；

HCMV强阳性对照，165μL/支，1支。

HCMV定量标准品，165μL/支，共5支。

具体的：

HCMV阴性对照：生理盐水；

HCMV临界阳性对照：生理盐水、5.0×10³copies/mL的HCMV质粒；

HCMV强阳性对照：生理盐水、5.0×10⁷copies/mL的HCMV质粒。

HCMV定量标准品见表2

HCMV质粒制备：

以临床阳性标本的尿液的DNA作为模板（厦门市中医院，）利用HCMV特异性引物（引物分别为:LEFTPRIMER：TCACATCATGCAGCTCCTTA（SEQIDNO:1）；RIGHTPRIMER：TGCAGAGCATGTATGAGAACTAC（SEQIDNO:2））进行PCR扩增。将扩增所得到的的HCMV基因克隆入PGEM-T-EASY载体（Promega）所得到的的重组载体即为HCMV质粒。

裂解液中含有二氧化硅吸附颗粒，特异性吸附核酸，使用前应振摇混悬。

靶基因采用保守的AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因(GenBank:FJ491269.1)，设计的引物探针如下：

OLIGOstartlentmgc%any3'seq

LEFTPRIMER：TCACATCATGCAGCTCCTTA（SEQIDNO:1）

RIGHTPRIMER：TGCAGAGCATGTATGAGAACTAC（SEQIDNO:2）

HYBOLIGO：CAAGCCATCCACATCTCCCGC（SEQIDNO:3）

按照荧光定量PCR探针设计原则，探针温度大于设定退火温度8-10℃即可。本发明PCR扩增设计的退火温度设定为58℃，同时探针TM值为69.3，因此颈环探针的颈部TM值设计为61-63℃。评价颈环探针时选择的条件为：

表1：评价颈环探针时选择的条件表

条件	参数
		线性DNA折叠温度（Linear DNA folding）	58°C
单价离子（[Na+]）	100mM
		双价离子（[Mg++]）	2.5mM

颈环探针技术的应用在于HCMV（人巨细胞病毒）探针线性结构的改造，在探针（HYBOLIGO）的3’端人为的加上5-10个碱基，该探针包括：与靶序列互补的单链碱基序列；5’端和3’端成颈结构序列；中间13-20个碱基的环状结构；5’端区域与靶序列完全互补，与5’端区域成颈结构3’端是人为添加碱基，使探针成颈环结构同时保证颈结构的TM值处于一个合理的范围。探针的3’端是一个柔性调节区域，调整部分碱基不匹配，同时根据TM值情况调整GC含量，目的是减少发光基团和淬灭基团的空间距离，最终降低探针的荧光本底值，同时保证颈部结构的稳定性小于探针本身和靶基因的稳定性【探针TM值=（颈环TM值+7）±1】。由于探针5’端完全保守，保证探针5’端有18-25个碱基能够和靶基因完全匹配，加上3’端的柔性调节，形成的稳定二级线性结构能够很好的保证探针检测灵敏度和信噪比。

探针线性结构改造结果（见http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/dna-folding-form）

其中颈结构的ggctta碱基为人为在探针3’端加入的碱基。

经过改造后的探针序列为CAAGCCATCCACATCTCCCGCggctta(SEQIDNO:4)

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

Ct值的定义

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数（如图1所示）。

荧光阈值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15

Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

本发明的有益效果在于：

1.和现有加热法提取方法对比，本发明试剂盒应用固相吸附法提取纯化人巨细胞病毒样本中的核酸，有效去除蛋白、糖类等PCR反应抑制物，同时具有核酸提取富集作用，提纯结果稳定。

2.和普通探针相比，HCMV颈环探针在线性结构改造后形成形成稳定的颈环结构，有利于探针自身存放的稳定性。

3.和普通探针相比，HCMV颈环探针在线性结构改造后有效减少发光基团和淬灭基团的空间距离，能够取得更好的淬灭效果，具有更低的荧光本底值。

4.和普通探针相比，HCMV颈环探针在线性结构改造后形成稳定的颈环结构，探针只有在人巨细胞病毒IE1基因存在的情况下进行结合，增强了探针结合的特异性。

5.和普通探针相比，HCMV颈环探针是单一结构的探针，具有更高的线性灵敏度。

6.和普通分子信标探针相比，HCMV颈环探针5’端和靶基因序列完全互补，在反应过程能够很好的被taqDNA聚合酶水解，具有更高的信噪比。

附图说明

图1是所有检测检测材料的本底荧光值图；

图2是所有检测检测材料的荧光实验结果图；

图3是阴性参考品荧光实验结果图；

图4是阳性参考品荧光实验结果图；

图5是线性参考品荧光实验结果图；具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：试剂盒的制备

各种试剂的成分：

裂解液：(10mMPH7.0)、二氧化硅（1重量‰）、TritonX-100（1体积‰）、EDTA·2Na（10mM）、异硫氰酸胍（2M）；

洗涤液：(10mMPH7.0)（sigma）、TritonX-100（1体积‰）、EDTA·2Na（1mM）、异硫氰酸胍（2M）；

重复洗涤液：(10mMPH7.0)、TritonX-100（1体积‰）、EDTA·2Na（1mM）

HCMVPCR反应管：Taq酶（2U）、UNG酶（0.01U）、EDTA·2Na（0.1mM）、石蜡油（25微升）；

HCMV反应缓冲液：HCMV上下游引物（10pM）、HCMV探针（5pM）、(20mMPH9.0)、KCl（50mM）、MgCl2（1.5mM）、EDTA·2Na（0.1mM）、dNtps（0.2mM）；

HCMV定量标准品见表2

HCMV阴性对照：生理盐水；

HCMV临界阳性对照：生理盐水、5.0×10³copies/mL的HCMV质粒；

HCMV强阳性对照：生理盐水、5.0×10⁷copies/mL的HCMV质粒。

制备方法按照一般分子生物学方法即可。

HCMV质粒制备：

以临床阳性标本的尿液的DNA作为模板（厦门市中医院）利用HCMV特异性引物（引物分别为：LEFTPRIMERTCACATCATGCAGCTCCTTA(SEQIDNO:1)；RIGHTPRIMERTGCAGAGCATGTATGAGAACTAC(SEQIDNO:2)）进行PCR扩增。将扩增所得到的的HCMV基因克隆入PGEM-T-EASY载体（Promega）所得到的的重组载体即为HCMV质粒。

Invitrogen人工合成HCMV引物、HCMV探针：

上游引物LEFTPRIMER：TCACATCATGCAGCTCCTTA（SEQIDNO:1）

下游引物RIGHTPRIMER：TGCAGAGCATGTATGAGAACTAC（SEQIDNO:2）

探针OLIGO的序列为CAAGCCATCCACATCTCCCGCGGCTTG（SEQIDNO:3），在其5’端标记FAM基团，3’端标记Dabcyl非荧光淬灭基团。

实施例2：应用试剂盒进行样本的检测

（一）样本

1.待测样本阴性8份(厦门市中医院)临床收集HPV6型阴道分泌物样本、HPV11型阴道分泌物样本、HPV16型阴道分泌物样本、HPV18型阴道分泌物样本、沙眼衣原体分泌物样本、淋病奈瑟球菌分泌物样本、解脲脲原体分泌物样本，单纯疱疹病毒II型分泌物样本、按165μL/支分装到离心管中,依次标记为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8)

2.待测样本阳性8份（厦门市中医院）（P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8）（临床收集尿液阳性样本，浓度依次为P11.0×10⁷copies/mL、P21.0×10⁶copies/mL、P31.0×10⁵copies/mL、P41.0×10⁵copies/mL、P51.0×10⁴copies/mL、P61.0×10⁴copies/mL、p71.0×10³copies/mL）、p81.0×10³copies/mL）。

3.线性参考品6支（取8个100mL容量瓶，量取生理盐水80mL至第一支容量瓶中，加入5.0×10⁸copies/mLHCMV质粒母液10mL，用生理盐水补足体积至100mL，颠倒使之充分混匀，为5.0×10⁷copies/mL灵敏度参考品。梯度稀释使HCMV质粒浓度分别为5.0×10⁶copies/mL、5.0×10⁵copies/mL、5.0×10⁴copies/mL、5.0×10³copies/mL、5.0×10²copies/mL、1.0×10²copies/mL。将上述溶液分别移入100mL烧杯中，按165μL/支分装到离心管中；做好标记）

线性参考品的L1～L6理论浓度和检测浓度的双对数曲线线性相关系数r值应不小于0.9800。

表2

线性参考品	质量标准（Copies/mL）	理论浓度对数值
			L1	1.0×107～9.0×107	7.69
L2	1.0×106～9.0×106	6.69
			L3	1.0×105～9.0×105	5.69
L4	1.0×104～9.0×104	4.69

L5	1.0×103～9.0×103	3.69
			L6	1.0×102～9.0×102	2.69

4.重复性参考品

用浓度为5.0×10⁵Copies/mLHCMV的重复性参考品（J1-J10）进行测定，浓度对数值的变异系数（CV）应不高于5.0%（n=10）。

（二）实验过程

1.试剂准备（试剂准备区）

（1）取出试剂盒中的裂解液、洗涤液、重复洗涤液和HCMV反应缓冲液室温放置，使其充分溶解。

（2）按照待测样本（阴性和阳性）、HCMV阴性对照，HCMV临界阳性对照，HCMV强阳性对照和定量标准品、线性参考品和重复性参考品数量，从试剂盒中取出HCMVPCR反应管，稍微离心备用。

2.标本处理（标本处理区）

按待测样本（阴性和阳性）、HCMV阴性对照，HCMV临界阳性对照，HCMV强阳性对照和定量标准品、线性参考品和重复性参考品数量，取0.5mL离心管做好标记，分别加入裂解液100μL，裂解液使用前应振摇混悬，然后分别加入待测样本（阴性和阳性）、HCMV阴性对照，HCMV临界阳性对照，HCMV强阳性对照或定量标准品50μL，混悬，室温静置10分钟；10000g离心25秒，去上清；加入150μL洗涤液，混悬，10000g离心25秒，去上清；加入150μL重复洗涤液，混悬，10000g离心25秒，去上清备用。

3.加样（标本处理区）

步骤2制备的沉淀分别用HCMV反应缓冲液30μL混悬，取25μL依次加入反应管中，混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内。

4.上机检测（扩增检测区）

1）循环条件设置

38℃5分钟，95℃10分钟；进入以下循环：95℃15秒，58℃50秒（30秒后读荧光），40循环。

2）仪器检测通道选择

荧光素设定为FAM；荧光信号采集设在58℃30秒；具体设置方法请参考仪器使用说明书。

5.结果分析条件设定

使用全自动医用PCR分析系统（GeneLight9800）或者全自动医用PCR分析系统（GeneLight2400）进行分析时，基线取5～15个循环的荧光信号，阈值可以根据仪器噪音情况调整，设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值＝0.0为准。

（三）检验结果的解释

1.HCMV阴性对照定量结果应为小于5.0×10²Copies/mL，HCMV临界阳性对照定量结果应符合定量范围1.0×10³Copies/mL～9.0×10³Copies/mL，HCMV强阳性对照定量结果应符合定量范围1.0×10⁷Copies/mL～9.0×10⁷Copies/mL，否则该次实验视为无效，建议样本重新测定。

2.将定量标准品1#～5#的浓度输入，仪器将自动以定量标准品载荷量的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线相关系数绝对值应大于等于0.980，否则该次实验视为无效，建议样本重新测定。

3.当HCMV阴性对照、HCMV临界阳性对照、HCMV强阳性对照和定量标准品的检验结果满足上述结果要求1和2时：

1）如果检测样本中病毒载量为5.0×10²Copies/mL≤HCMVDNA≤5.0×10⁸Copies/mL判断为阳性，直接报告定量结果；

2）如果检测样本中病毒载量为＞5.0×10⁸Copies/mL，判断为阳性，报告为＞5.0×10⁸Copies/mL；

3）如果检测样本中病毒载量为0Copies/ml，判断为阴性，报告为0.0Copies/ml；

4）如果检测样本中病毒载量为＜5.0×10²Copies/mL，Copies数仅供参考，建议重新检测

（四）检测结果

1.荧光值分析

1）见图1，本底荧光值均在225-375之间，说明本发明方法具有较低的荧光本底；

2）见图2，从图中可以看出，本发明能够达到4倍的扩增效率，具有较高的信噪比；

3）没有出现假阳性和假阴性结果，具有良好的特异性。

2.实验数据分析

1）待测样本阴性8份检测结果均为阴性；

2）待测样本阳性8份检测结果均为阳性；

3）线性参考品的L1～L6理论浓度和检测浓度的双对数曲线线性相关系数r值=0.992（r值经过荧光定量PCR软件直接算出，算法利用以下公式）：

$\left[\begin{array}{c}r=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}(x_i-\stackrel{\‾}{x})(y_i-\stackrel{\‾}{y})}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2\·\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(y_i-\stackrel{\‾}{y})}^2}}\\ =\frac{n\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x}_i{y}_i-\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x}_i\·\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{y}_i}{\sqrt{n\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x_i}^2-{\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x}_i\right)}^2}\·\sqrt{n\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{y_i}^2-{\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{y}_i\right)}^2}}\end{array}\right]$

其中x_i为理论结果对数值；y_i为检测结果对数值；为理论结果对数值均值；为检测结果对数值均值。

最低检出量为50copies/mL。

4）重复性参考品

浓度对数值的变异系数（CV）=0.77%，满足实验设计要求。

测定并计算各个重复性参考品的浓度对数值，利用下列公式计算CV（%）值。

$\stackrel{\‾}{X}=\frac{\underset{i=1}{\overset{10}{\mathrm{\Σ}}}x}{10}$

$S=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{X}_i^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}{X}_i\right)}^2}{10}}{10-1}}$

$\mathrm{CV}(\%)=S/\stackrel{\‾}{X}\×{100}_{\%}$

式中：

----平均值；

S----标准差；

X--各个重复性参考品的浓度值

实验结果汇总（copies/mL）

表3：实验结果汇总表

结果说明

（1）:8份阴性参考品检测结果均为阴性，符合率8/8，与实际结果完全一致；

（2）:8份阳性参考品检测结果均为阳性，符合率8/8，与实际结果完全一致；

（3）:线性参考品检测结果均为阳性，且定值范围符合要求；，与实际结果完全一致。

（4）:10份重复性参考品检测结果均为阳性，与实际结果完全一致。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列；所述探针的序列从5’端起,与靶序列互补的5-10个碱基的单链碱基序列；中间13-20个碱基的环状结构序列；3’端的5-10个碱基序列；所述5’端的与靶序列互补的5-10个碱基的单链碱基序列与3’端的5-10个碱基序列部分匹配成颈结构；所述探针成颈环结构，同时探针TM值＝(颈环TM值+7)±1，探针5’端有18-25个碱基能够和靶基因完全匹配，探针序列约23-32bp；所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记非荧光淬灭基团。

2.权利要求1的人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针序列为SEQIDNO:4的序列。

3.权利要求1或2的人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记Dabcyl非荧光淬灭基团。

4.一种人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3的任一引物和探针。

5.权利要求4的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，还包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂、参考品试剂。

6.权利要求5的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为二氧化硅、TritonX-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述洗涤液为TritonX-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为TritonX-100、EDTA·2Na；所述PCR扩增试剂为HCMVPCR反应管和HCMV反应缓冲液；所述参考品试剂为HCMV阴性对照、HCMV临界阳性对照，HCMV强阳性对照和HCMV定量标准品。

7.权利要求6的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述裂解液为10mMPH7.01重量‰二氧化硅、1体积‰TritonX-100、10mMEDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.01体积‰TritonX-100、1mMEDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为10mMPH7.01体积‰TritonX-100、1mMEDTA·2Na；所述HCMVPCR反应管含有2UTaq酶、0.01UUNG酶、0.1mMEDTA·2Na、25微升石蜡油；HCMV反应缓冲液为10pMHCMV引物，5pMHCMV探针、20mMPH9.050mMKCl、1.5mMMgCl2、0.1mMEDTA·2Na、0.2mMdNtps。