CN101676408A - 6、11型人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和用于人乳头瘤病毒6、11型苷酸片段的PCR扩增引物和探针序列。引物序列包括：人乳头瘤病毒6、11型通用上游引物和通用下游引物组成的引物对，及上游引物互补序列或下游引物互补序列，还包括上游引物向5’端方向及下游引物向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括：荧光探针：SEQ ID NO：3及互补序列，以及向3’端和5’端延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。此方法可用于6、11型人乳头瘤病毒定量检测，具有实际的临床应用价值。

Description

6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测6、11型人类乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，HPV基因组是一闭环双股DNA，分子量5×10⁶道尔顿。按功能可分为早期区(E区)、晚期区(L区)和非编码区(ncr)三个区域。E区分为E1～E7开放阅读框架，主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。L区分L1和L2，分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。ncr是E区与L区间-6.4～1.0bp的DNA片段，可负责转录和复制的调控。

临床上，根据HPV亚型的致病力大小或致癌危险性大小不同，可将HPV分为低危型和高危型两类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道部位的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤，其病毒亚型中最常见的有HPV6、11型。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是可引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤，其病毒亚型中最常见的有HPV16、18、31、33型。

HPV(6，11)引起生殖器尖锐湿疣，组织学特征为棘层出现成片的空泡化细胞，棘层细胞及基底细胞增生，炎细胞浸润，但在慢性炎症及其它病毒感染，也出现空泡或空泡样变。尖锐湿疣病程较长者，空泡化细胞数量稀少或单个分散。因此在某些仅表现非典型病变的病例进行病毒检测显得尤为重要。

国外有不少学者报告，在尖锐湿疣中由HPV6、11型引起的尖锐湿疣感染占90％以上，，少数为HPV16、18型感染或HPV30、31，33、35型感染或与HPV11、16型等亚型混合感染。在我国，一些研究表明尖锐湿疣损害中HPV亚型所占百分比各有不同。朱学骏等对250例尖锐湿疣的HPV感染进行分型，结果表明尖锐湿疣感染亚型以HPV6型及HPV11型最为常见，感染率分别为84％和68％，但高危型HPV16、18型感染并不少见，分别为14％和16％，结果还表明尖锐湿疣复合感染常见，达66％，以HPV6、11型复合感染最常见。刘宝印等在206例宫颈尖锐湿疣患者HPV阳性的84例中，HPV6、11型检出率为33.5％，HPV16型为1.5％，HPV18型为0％，其他HPV亚型为5.8％。

目前检测病毒有多种方法，免疫组化法检测的是病毒抗原，由于病毒DNA在转录时部分丢失，蛋白水平降低，致使有些有典型组织学改变的病例也出现阴性。原位杂法是利用探针与组织中的DNA杂交，首先将探针和组织中的双链DNA变性为单链，然后使探针与组织杂交，而影响原位杂交的关键因素是杂交链的稳定性，在杂交过程中，部分探针单链复性，使杂交率降低，影响HPV2DNA的检出率。FQ PCR是近几年发展起来的新的核酸检测技术，该技术在常规PCR基础上添加了一条标记了2个荧光基因的荧光双标记探针。一个标记在探针的5’端，称为荧光报告基团；另一个标记在探针的3’端，称为荧光抑制基团。两者构成能量传递结构，即5’端荧光基团所发出的荧光可被3’端荧光基团吸收或抑制。实时荧光定量PCR技术在PCR过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增长到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出以99.7％的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值)时，循环次数(Ct值)就被记录下来。该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度标准品的Ct值，制成标准曲线，再根据样品的Ct值就可以准确定出起始DNA的数量。

FQPCR技术把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术从根本上解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题，并且通过探针杂交进一步提高了检测HPV DNA的特异性。

采用实时FQ-PCR方法检测HPV感染，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，既适用于大规模筛查也适用于临床日常工作中采用。

发明内容

本发明目的在于提供一种精确简便的用于定量6、11型人乳头瘤病毒的方法；本发明的另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

为了检测出临床样品中可能存在的6、11型人乳头瘤病毒，并能够准确有效的将其余亚型HPV病毒、单纯疱疹病毒2型、生殖支原体、巨细胞病毒、解脲脲原体、沙眼衣原体、淋病双球菌及其他常见泌尿生殖道感染病原体鉴别开来，设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件对一直HPV病毒型的基因组核苷酸序列及进行同源性比较，并在找出同源性区段的基础啊上，进一步使用适当的引物设计软件(如Primer premier5.0)选择并设计引物。本发明所涉及的引物所对应的扩增区段相当于HPV病毒L2基因编码序列的保守区，长度为108bp。所设计的这些引物和探针均具与其他型别HPV病毒及其他泌尿生殖道感染相关病原体的核苷酸序列没有同源性，大大减少甚至避免了HPV6、11型检测的假阳性和假阴性，提高了检测的可靠性和准确性。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测人乳头瘤病毒6、11型核苷酸片段的引物及探针序列包括：引物序列包括：由上游引物序列5’-GATTGACAATGGGACTGT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物序列为5’-TAAAGCAGGAGTTACAGG-3’(SEQ ID NO：2)组成的引物对，以及上游引物的互补序列5’-ACAGTTCCATTGTCAATT-3’、5’-ACAGTCCCATTGTCAATC-3’和下游引物的互补序列5’-CTGTAACTCCTGCTTTA-3’。还包括上游引物向5’端方向延伸10个碱基，下游引物向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。

探针序列包括：由5’-GGTGTTCCCATAGATGCAGTA-3’(SEQ ID NO：3)，及其互补序列5’-ACTGCACCTATGGGAACACC-3’、5’-TACTGCATCTATGGGAACACC-3’。以及向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。

本发明在常规PCR检测技术的基础上，添加一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团(FAM)标记在探针的5’端，荧光淬灭基团(TAMRA)标记在3’端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在目的扩增片断上的荧光探针酶切降解，荧光淬灭基团(Q)的抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，从而进行人乳头瘤病毒6、11型的检测。

本发明的优点：

1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达500copies/ml，说明其具有良好的灵敏度。

2)本发明提供的引物和探针对于不含有人乳头瘤病毒(6、11型)的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。

3)由于本发明采用人乳头瘤病毒6、11型L2高度保守基因作为扩增的目的基因，避免了假阴性结果的产生。

4)由于本发明采用了荧光定量PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。

具体实施方式

1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的人乳头瘤病毒6、11型基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(人乳头瘤病毒6、11型L2基因，其序列见附录)，设计多对通用引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内尽量避免有互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

上游引物：5’-GATTGACAATGGGACTGT-3’(SEQ ID NO：1)

下游引物：5’-TAAAGCAGGAGTTACAGG-3’(SEQ ID NO：2)

荧光探针：5’-GGTGTTCCCATAGATGCAGTA-3’(SEQ ID NO：3)

2.反应体系的建立和优化：反应体系得建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：利用已确诊为人乳头瘤病毒6或11型的受试者的宫颈脱落细胞样本作为待检样品，利用碱热裂解法的提取方法提取人乳头瘤病毒(6或11型)DNA。

2.1引物浓度的优化  在反应体系中其他条件相同的情况下，将HPV6.11型的通用引物1、2浓度分别从0.1μmol/L至1.0μmol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2μmol/L。

2.2探针浓度的优化  在反应体系中其他条件相同的情况下，将HPV6.11型的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2μmol/L。

2.3镁离子浓度的优化  在反应体系中其他条件不变的前提下，将镁离子浓度从1.0mmol/L至4mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的镁离子浓度为3.5mmol/L。

2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化  通过比较Taq酶用量(以单位U计)的优化试验结果，选定2U为最佳Taq酶用量。

2.5dNTPs浓度的优化  在反应体系中，将dNTPs浓度从0.1mmol/L至1mmol/L以0.1mmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的dNTPs浓度为0.2mmol/L。

利用上述引物、探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光定量PCR反应体系为50μL，所需各组分及相应浓度见表1。

表1  优化后的PCR反应体系

组分	终浓度
		10×PCR反应缓冲液	1×
上游引物1.2浓度	0.2μmol/L
		下游引物3.4浓度	0.2μmol/L
探针5.6浓度	0.2μmol/L
		镁离子浓度	3.5mmol/L
dNTPs浓度	0.2mmol/L
		Taq酶用量	2U
模板	3μL
		补水至	50μL

注：1)在荧光PGR反应体积不同时，各试剂应按比例调整；

2)使用的仪器不同时，应将反应参数作适当调整。

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

4.PCR反应条件如下：

93℃→2分钟，1个循环

93℃ 40秒→56℃ 45秒，10个循环

93℃ 30秒→55℃ 40秒，35个循环。(采集荧光信号)

5.检测步骤

5.1选取引物和探针；

5.2制备待测模板，可采用碱热裂解方法提取人乳头瘤病毒DNA；

5.3反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定最佳探针浓度；c、确定最佳镁离子浓度；d、确定最佳Taq使用量；e、确定最佳dNTPs浓度；

5.4选择仪器的检测方式

5.5上机检测。

5.6结果判定：反应完成后，如果Ct值＜30，则实验样品的HPV6，11 DNA含量(基因拷贝数/ml)＝Qty-Copies/ml，结果为阳性；如果30＜Ct值＜35，建议重新检测。如果Ct值＝35，结果为阴性。

6.实施例1----6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

选取引物对和探针，将待检的已确诊为人乳头瘤病毒6或11型的受试者的宫颈脱落细胞样本用碱热裂解方法提取基因组DNA。具体步骤如下：

1)充分混匀上述标本，取全部液体转移至1.5ml离心管中；

2)12,000rpm离心5分钟，弃上清(勿碰及下面沉淀)；

3)沉淀加50ul核酸提取液，充分混匀(提取液用前需室温溶解并充分混匀)；

4)100℃10分钟，后12,000rpm离心3分钟；

5)取上清液3ul做PCR反应。

在50μl荧光PCR反应体系中，加入以上提取的人乳头瘤病毒基因组DNA 3μl，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待测样本中含有人乳头瘤病毒6或11型则显示阳性扩增曲线(见图1)，其检测灵敏度可达5×10²copies/ml。若待检样本中不含人乳头瘤病毒6或11型则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度及特异性(灵敏度试验结果见图2、3，特异性试验结果见图4)。

实施例2----临床检测

用上述方法对115例临床样本进行检测，其中人乳头瘤病毒6、11型患者42例，检出阳性率99％，准确率98.6％，并且能够对人乳头瘤病毒6、11型进行准确定量分析，远远优于酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对6、11型人乳头瘤病毒进行快速定量检测。此外，6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是人乳头瘤病毒6或11型阳性扩增曲线图

图2是灵敏度试验结果图

图3是灵敏度试验结果图

图4是特异性试验结果图

附录

人乳头瘤病毒6型L2高度保守基因

   1    ATGGCACATA GTAGGGCCCG ACGACGCAAG CGTGCGTCAG CTACACAGCT

  51    ATATCAAACA TGTAAACTCA CTGGAACATG CCCCCCAGAT GTAATTCCTA

 101    AGGTGGAACA CAACACCATT GCAGATCAAA TATTAAAATG GGGGAGTTTG

 151    GGGGTGTTTT TTGGAGGGTT GGGTATAGGC ACCGGTTCCG GCACTGGGGG

 201    TCGTACTGGC TATGTTCCCT TAGGAACTTC TGCAAAACCT TCTATTACTA

 251    GTGGGCCTAT GGCTCGTCCT CCTGTGGTGG TGGAGCCTGT GGCCCCTTCG

 301    GATCCATCCA TTGTGTCTTT AATTGAAGAA TCGGCAATCA TTAACGCAGG

 351    GGCGCCTGAA ATTGTGCCCC CTGCACACGG TGGGTTTACA ATTACATCCT

 401    CTGAAACAAC TACCCCTGCA ATATTGGATG TATCAGTTAC TAGTCATACT

 451    ACTACTAGTA TATTTAGAAA TCCTGTCTTT ACAGAACCTT CTGTAACACA

 501    ACCCCAACCA CCCGTGGAGG CTAATGGACA TATATTAATT TCTGCACCCA

 551    CTATAACGTC ACACCCTATA GAGGAAATTC CTTTAGATAC TTTTGTGATA

 601    TCCTCTAGTG ATAGCGGTCC TACATCCAGT ACCCCTGTTC CTGGTACTGC

 651    ACCTCGGCCT CGTGTGGGCC TATATAGTCG TGCATTGCAC CAGGTGCAGG

 701    TTACAGACCC TGCATTTCTT TCCACTCCTC AACGCTTAAT TACATATGAT

 751    AACCCTGTAT ATGAAGGGGA GGATGTTAGT GTACAATTTA GTCATGATTC

 801    TATACACAAT GCACCTGATG AGGCTTTTAT GGACATAATT CGTTTGCACA

 851    GACCTGCTAT TGCGTCCCGA CGTGGCCTTG TGCGGTACAG TCGCATTGGA

 901    CAACGGGGGT CTATGCACAC TCGCAGCGGA AAGCACATAG GGGCCCGCAT

 951    TCATTATTTT TATGATATTT CACCTATTGC ACAAGCTGCA GAAGAAATAG

1001    AAATGCACCC TCTTGTGGCT GCACAGGAAG ATACATTTGA TATTTATGCT

1051    GAATCTTTTG AACCTGACAT TAACCCTACC CAACACCCTG TTACAAATAT

1101    ATCAGATACA TATTTAACTT CCACACCTAA TACAGTTACA CAACCGTGGG

1151    GTAACACCAC AGTTCCATTG TCAATTCCTA ATGACCTGTT TTTACAGTCT

1201    GGCCCTGATA TAACTTTTCC TACTGCACCT ATGGGAACAC CCTTTAGTCC

1251    TGTAACTCCT GCTTTACCTA CAGGCCCTGT TTTCATTACA GGTTCTGGAT

1301    TTTATTTGCA TCCTGCATGG TATTTTGCAC GTAAACGCCG TAAACGTATT

1351    CCCTTATTTT TTTCAGATGT GGCGGCCTAG

人乳头瘤病毒11型L2高度保守基因

  1    ATGAAACCTA GGGCACGCAG ACGTAAACGT GCGTCAGCCA CACAACTATA

 51    TCAAACATGC AAGGCCACTG GTACATGTCC CCCAGATGTA ATTCCTAAAG

101    TTGAACATAC TACTATTGCA GATCAAATAT TAAAATGGGG AAGCTTAGGG

151    GTTTTTTTTG GTGGGTTAGG TATTGGTACA GGGGCTGGTA GTGGCGGTCG

201    TGCAGGGTAT ATACCCTTGG GAAGCTCTCC CAAGCCTGCT ATTACTGGGG

251    GGCCAGCAGC ACGTCCGCCA GTGCTTGTGG AGCCTGTTGC CCCTTCCGAT

301    CCCTCCATTG TGTCCTTAAT TGAGGAGTCT GCTATTATTA ATGCTGGTGC

351    ACCTGAGGTG GTACCCCCTA CACAGGGTGG CTTTACTATA ACATCATCTG

401    AATCGACTAC ACCTGCTATT TTAGATGTGT CTGTTACCAA TCACACTACC

451    ACTAGTGTGT TTCAAAATCC CCTGTTTACA GAACCGTCTG TAATACAGCC

501    CCAACCACCT GTGGAGGCCA GTGGTCACAT ACTTATATCT GCCCCAACAA

 551    TAACATCCCA ACATGTAGAA GACATTCCAC TAGACACTTT TGTTGTATCC

 601    TCTAGTGATA GTGGACCTAC ATCCAGTACT CCTCTTCCTC GTGCTTTTCC

 651    TCGGCCTCGG GTGGGTTTGT ATAGTCGTGC CTTACAGCAG GTACAGGTTA

 701    CGGACCCCGC GTTTTTGTCC ACGCCACAGC GATTGGTAAC TTATGACAAC

 751    CCTGTCTATG AAGGAGAAGA TGTAAGTTTA CAATTTACCC ATGAGTCTAT

 801    CCACAATGCA CCTGATGAAG CATTTATGGA TATTATTAGA CTACATAGAC

 851    CAGCTATAAC GTCCAGACGG GGTCTTGTGC GTTTTAGTCG CATTGGGCAA

 901    CGGGGGTCCA TGTACACACG CAGTGGACAA CATATAGGTG CCCGCATACA

 951    TTATTTTCAG GACATTTCAC CAGTTACACA AGCTGCAGAG GAAATAGAAC

1001    TGCACCCTCT AGTGGCTGCA GAAAATGACA CGTTTGATAT TTATGCTGAA

1051    CCATTTGACC CTATCCCTGA CCCTGTCCAA CATTCTGTTA CACAGTCTTA

1101    TCTTACCTCC ACACCTAATA CCCTTTCACA ATCGTGGGGT AATACCACAG

1151    TCCCATTGTC AATCCCTAGT GACTGGTTTG TGCAGTCTGG GCCTGACATA

1201    ACTTTTCCTA CTGCATCTAT GGGAACACCC TTTAGTCCTG TAACTCCTGC

1251    TTTACCTACA GGCCCTGTTT TTATTACAGG TTCTGACTTC TATTTGCATC

1301    CTACATGGTA CTTTGCACGC AGACGCCGTA AACGTATTCC CTTATTTTTT

1351    ACAGATGTGG CGGCCTAG

序列表

<110>扬子江药业集团北京海燕药业有限公司

<120>6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<400>1

gattgacaat gggactgt                                            18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<400>2

taaagcagga gt tacagg                                           18

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>5’端连有荧光报告基团FAM，3’端连有荧光淬灭基团TAMRA

<400>3

ggtgttccca tagatgcagt a                                        21

Claims (5)

1.用于6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和实时荧光PCR的引物对及探针。其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物序列5’-GATTGACAATGGGACTGT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物序列为5’-TAAAGCAGGAGTTACAGG-3’(SEQ ID NO：2)组成的引物对，以及上游引物的互补序列5’-ACAGTTCCATTGTCAATT-3’、5’-ACAGTCCCATTGTCAATC-3’和下游引物的互补序列5’-CTGTAACTCCTGCTTTA-3’。

2.根据权利要求1所述的用于6、11型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物向5’端方向延伸10个碱基，下游引物向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。

3.一种用于6、11型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列为5’-GGTGTTCCCATAGATGCAGTA-3’(SEQ ID NO：3)，以及其互补序列5’-ACTGCACCTATGGGAACACC-3’、5’-TACTGCATCTATGGGAACACC-3’。

4.根据权利要求3所述的用于6、11型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列由探针向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。

5.根据权利要求3所述的用于于6、11型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的探针序列，在5’端标记的荧光报告基团为FAM，在3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

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