CN105755169A - 一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用 - Google Patents
一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用。揭示了一类特别适合于诊断高危型人乳头瘤病毒(HPV)以及对HPV16和HPV18进行分型的检测试剂,所述检测试剂经过合理的设计、优选而获得,用于PCR扩增时特异性良好、扩增效率高、灵敏度高,且可以同时检测多种高危型病毒,检测程序简单易操作。本发明人还优化了PCR扩增反应程序,进一步提高了扩增效率。
Description
技术领域
本发明涉及病毒诊断领域,更具体地,本发明涉及一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用。
背景技术
宫颈癌是全球妇女中发病率仅次于乳腺癌的最常见的恶性肿瘤,世界范围内每年约有50万的宫颈癌新发病例。通过宫颈筛查可以将宫颈癌的发病率大大降低。
大量的流行病学和分子生物学研究证明人乳头瘤病毒(HumanPapillomaVirus,HPV)感染是宫颈癌和癌前病变发生的主要因素:世界卫生组织曾经在22个国家进行的调查结果显示,有99.9%的宫颈癌患者可以检测到HPV感染;国际癌症研究协会(IARC)1995年宣布HPV感染是宫颈癌的主要病因。人乳头瘤病毒是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属,是球形DNA病毒。目前已分离出130多种,约有30多种可以感染人的生殖道黏膜。大量的科学研究发现,HPV基因型不同,其致癌力、宫颈癌病理分型以及宫颈癌的预后均有所不同。根据HPV感染人生殖道黏膜后的致癌性不同将其分为高危和低危两大类别,低危型包括6、11、54、40、42、43和44等,以6和11最为常见;高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和83等,其中以16和18最为常见。目前WHO及IRAC确认的14种致宫颈癌的高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68。
对HPV进行分型检测可以预测受检者的发病风险度,决定其筛查间隔;更可以区分持续感染和一过性感染,以便及早进行治疗,以降低发生率和死亡率;用于手术后的追踪,确定是否将病灶清除干净,便于治疗后的随访;指导HPV疫苗的研究及使用。
HPV的检测技术发展很快,出现了很多HPV检测技术,大致可分为以下几种:(1)细胞学检查,如传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学技术(TCT)、计算机辅助细胞检查系统,此类技术操作简单、价格低廉、适宜作初步筛查,但应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、且无法进行HPV分型检测;(2)感染组织中HPV蛋白的检测,针对HPV抗原(主要是衣壳蛋白制备抗体)通过免疫学方法进行检测,如ELISA、免疫沉淀法等,此类方法原理明确、操作简单,但由于HPV至今尚不能在体外培养,且其免疫原型较弱,导致血清学方法检测灵敏度低;(3)HPV基因组检测,如Southern杂交法、原位杂交法、杂交捕获法、以及PCR类检测方法。
Southern杂交法是应用酚氯仿提取纯化DNA,通过限制酶消化、电泳、变性、转膜和放射性标记探针杂交鉴定HPV亚型。此法是以杂交片段大小与杂交的严格性为基础,具有较好的灵敏度,但也具有耗费人力、试验步骤复杂和使用放射性探针等缺点。
原位杂交法应用组织或细胞在病理切片上和分子探针进行HPVDNA杂交,既可观察组织学形态变化,又可检测HPV表达的状况,是理想的病理学检测及研究方法。目前国内尚缺乏稳定的探针,只可分为高危、低危型,操作较复杂,不适于大规模普查。
杂交捕获法原理是利用对抗体捕获信号放大和化学发光的检测。此为经美国FDA认证后用于30岁以上女性宫颈癌的初筛方法,仅用于细胞学标本,是国内妇科学会指定的检查方法。第二代杂交捕获法可检测13种高危型HPV。此种方法具有良好的灵敏度和特异性,但其存在交叉污染、费用昂贵、且不便于HPV分型等缺点。
PCR类检测方法不仅可以对HPV阳性感染进行确诊,还可以进行HPV分型,不足之处是一次反应检测的型别相对较少,尚难做到高通量分型检测。此类方法还需要找到合适的引物和/或探针,当进行多种亚型病毒共同检测时,往往由于引物条数较多,易于发生非特异性结合导致灵敏度降低,因此其对于检测试剂要求很高。
目前,本领域中存在一些用荧光PCR检测HPV病毒的试剂盒,如中山大学达安基因股份有限公司的高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒(可检测9种HPV基因型,HPV16、18、31、33、45、52、56、58、67)。但是,这些试剂盒的试剂均仅基于L1区序列进行引物设计,这与人们对HPV的认知是相符的,因为L1区具有高度特异性。然而正是由于L1区的高度特异性导致了这些试剂盒存在不足,若想用一次PCR反应同时检测多种基因型,则需多对引物和多条探针,然而一个PCR反应中若引物和探针过多则会影响PCR反应的效率,严重影响检测试剂盒的特异性和灵敏度。因此中山大学达安基因股份有限公司仅能检测9种HPV病毒。
综上,本领域还需要进一步开发检测效果更为理想的HPV检测和分型试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用。
在本发明的第一方面,提供一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒,所述的试剂盒中的引物序列如下:
特异性扩增人乳头瘤病毒16型的上游引物SEQIDNO:15,下游引物SEQIDNO:16;
特异性扩增人乳头瘤病毒18型的上游引物SEQIDNO:17,下游引物SEQIDNO:18;
特异性扩增人乳头瘤病毒31型的上游引物SEQIDNO:19,下游引物SEQIDNO:20;
特异性扩增人乳头瘤病毒33型的上游引物SEQIDNO:21,下游引物SEQIDNO:22;
特异性扩增人乳头瘤病毒35型的上游引物SEQIDNO:23,下游引物SEQIDNO:24;
特异性扩增人乳头瘤病毒39型的上游引物SEQIDNO:25,下游引物SEQIDNO:26;
特异性扩增人乳头瘤病毒45型的上游引物SEQIDNO:27,下游引物SEQIDNO:28;
特异性扩增人乳头瘤病毒51型的上游引物SEQIDNO:29,下游引物SEQIDNO:30;
特异性扩增人乳头瘤病毒52型的上游引物SEQIDNO:31,下游引物SEQIDNO:22;
特异性扩增人乳头瘤病毒56型的上游引物SEQIDNO:32,下游引物SEQIDNO:33;
特异性扩增人乳头瘤病毒58型的上游引物SEQIDNO:34,下游引物SEQIDNO:22;
特异性扩增人乳头瘤病毒59型的上游引物SEQIDNO:35,下游引物SEQIDNO:36;
特异性扩增人乳头瘤病毒66型的上游引物SEQIDNO:37,下游引物SEQIDNO:38;
特异性扩增人乳头瘤病毒68型的上游引物SEQIDNO:39,下游引物SEQIDNO:26;
特异性针对人乳头瘤病毒16型的探针SEQIDNO:42;
特异性针对人乳头瘤病毒18型的探针SEQIDNO:43;
特异性针对人乳头瘤病毒33、35、39、45、52、56、58、66、68型的探针SEQIDNO:44;
特异性针对人乳头瘤病毒31、51、59型的探针SEQIDNO:45;
所述的引物和探针所述的高危型人乳头瘤病毒(HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68)的L1区和L2区重叠区域的基因序列设计。
在一个优选例中,所述的试剂盒中包括:SEQIDNO:1~SEQIDNO:30的引物和SEQIDNO.31~35的探针。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:特异性扩增人基因组β-Globin(内参)基因的引物和特异性针对β-Globin(内参)的探针。
在另一优选例中,所述的特异性扩增β-Globin的引物是SEQIDNO:40和SEQIDNO:41的引物;所述的探针是SEQIDNO:46的探针。
在另一优选例中,所述的试剂盒中包含两管反应液,每管反应液均采用至少四种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示至少4种目的片段的存在情况;或者,以VIC作为特异性针对人乳头瘤病毒16型的探针的荧光基团,以MGB作为对应的猝灭基团;以ROX作为特异性针对人乳头瘤病毒18型的探针的荧光基团,以BHQ2作为对应的猝灭基团;以FAM作为特异性针对人乳头瘤病毒33、35、39、45、52、56、58、66、68型的探针和特异性针对人乳头瘤病毒31、51、59型探针的荧光基团,以MGB作为对应的猝灭基团;以Cy5作为特异性针对β-Globin的探针的荧光基团,以BHQ3作为对应的猝灭基团。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:PCR反应液,质控品,阴性对照和/或使用说明书;
较佳地,所述的试剂盒中PCR反应液中含有PCR预混液,所述的引物以及探针被混合于所述的PCR预混液中。
在另一优选例中,所述的质控品包括:HPV16参考品、HPV18参考品、HPV45参考品和人基因组。
在另一优选例中,所述的阴性对照为灭菌水。
在另一优选例中,所述的试剂盒包括盒体,以及装于盒体内的容器,所述的引物和探针以各自独立的形式或混合的形式装于容器中。
在另一优选例中,所述的检测是检测人乳头瘤病毒16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68;所述的分型是指对HPV16、18进行分型。
在本发明的另一方面,提供所述的试剂盒的用途,用于非诊断性地进行高危型人乳头瘤病毒的检测和分型。
在本发明的另一方面,提供一种非诊断性的高危型人乳头瘤病毒的检测和分型方法,所述方法包括:
利用所述的试剂盒中的试剂对待测样品进行PCR检测,从而确定待测样品中是否存在高危型人乳头瘤病毒及其亚型。
在一个优选例中,PCR扩增程序包括:(1)95℃10分钟;(2)95℃25秒,67℃20秒,进行10±1个循环;和(3)95℃20秒,60℃35秒并采集荧光,进行35±2个循环;其中,温度或时间能在2%,较佳地为1%,更佳地为0.5%的上下范围内浮动。
在另一优选例中,各引物在PCR反应体系中的终浓度如表2所示。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、PCR体系中酶浓度优化前后扩增结果对比。A.优化前结果;B.优化后结果。图上的数字为HPV基因型简称。
图2、PCR扩增程序优化结果。A.首次优化结果;B.最终优化结果。图上的数字为HPV基因型简称。
图3、PCR体系中引物和探针浓度的优化结果前后对比。A.优化前结果;B.优化后结果。图上的数字为HPV基因型简称。
图4A-B、高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型的试剂盒的特异性考察结果。图上的数字为HPV基因型简称。
图5、高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型的试剂盒的灵敏度考察结果。图上的数字为HPV基因型简称。
图6、本发明的试剂盒的灵敏度检测。A.Cy5通道的灵敏度。B.ROX通道的灵敏度。C.VIC通道的灵敏度。D.FAM通道的灵敏度。cp/tests:拷贝数(copies)/实验。横坐标:PCR的循环数。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,找到了一类特别适合于诊断高危型人乳头瘤病毒(HPV)以及对HPV16和HPV18进行分型的检测试剂,所述检测试剂经过合理的设计、优选而获得,用于PCR扩增时特异性良好、扩增效率高、灵敏度高,且可以同时检测多种高危型病毒,检测程序简单易操作。本发明人还优化了PCR扩增反应,进一步提高了扩增效率。
如本文所用,“待测样本”、“待测样品”或“待测核酸(如DNA)样品”是指待检测的核酸样本,其中含有一种核酸或多种核酸,需要了解其中是否存在目标核酸。
如本文所用,“目标核酸”是指感兴趣的核酸片段,其是一种高危型HPV特异性的。
如本文所用,“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸(本发明中优选RNA),其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构,可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如,标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。
本发明人在研究中发现,应用PCR检测HPV突变时,利用一般的引物进行PCR扩增时特异性较差,易于发生非特异性结合,灵敏度降低。因此,需要设计和筛选特异性且灵敏度好的检测试剂。并且,现有技术中人们一般局限于针对HPV的L1区来设计检测试剂,当针对多种HPV亚型时,往往引物、探针序列众多,导致扩增体系复杂。经过大量的实验和比较,本发明人将PCR扩增区域选定在L1区和L2区的交界处,这一部分区域的特点在于既有特异性,又有重叠性。基于此本发明人设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段,并用高度统一的探针来识别。
根据临床检测的需要,本发明人利用荧光定量PCR的技术进行HPV病毒定性检测,在设计时,应用同一条探针检测HPV35、39、45、51、56、66、68,并使得HPV31、51共用一条引物,如此设计使得需要合成的引物和探针数量尽可能少,扩增体系不至于过分复杂,但又能实现对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68进行检测,以及对HPV16、18进行分型,满足目前HPV检测方面的临床实际所需。
所述的探针连接有适合于甄别病毒亚型的荧光基团。探针的前端标记有荧光基团,另一端标记有淬灭基团,其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。当PCR扩增反应进行时,利用聚合酶的正向外切活性将带有荧光基团的碱基切离,游离后的荧光基团不再受淬灭基团的影响,在激发光的作用下可发射一定波长的荧光信号。随着PCR产物的不断积累,荧光信号不断地增强,从而可以检测到HPV病毒DNA的存在。作为本发明的优选方式,以VIC作为特异性针对人乳头瘤病毒16型的探针的荧光基团,以MGB作为对应的猝灭基团;以ROX作为特异性针对人乳头瘤病毒18型的探针的荧光基团,以BHQ2作为对应的猝灭基团;以FAM作为特异性针对人乳头瘤病毒33、35,39,45,52,56,58、66,68型的探针和特异性针对人乳头瘤病毒31、51、59型探针的荧光基团,以MGB作为对应的猝灭基团;以Cy5作为特异性针对人基因组β-Globin基因的探针的荧光基团,以BHQ3作为对应的猝灭基团。
本发明的检测试剂被置于试剂盒中,从而便于人们应用。除了引物和探针试剂,试剂盒中还可包含:PCR反应液,质控品,阴性对照和/或使用说明书。
本发明高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型的方法及试剂盒可供医疗机构定性检测人宫颈脱落细胞样本中的人乳头瘤病毒核酸,作辅助诊断宫颈癌用。本发明设计病毒核酸的检测技术,提供一种高灵敏度、高特异性、操作简便,检测周期短的人乳头瘤病毒核酸检测和分型方法。
本发明还优化了PCR检测流程,采用两步退火法进行PCR扩增,包括:(1)95℃10分钟;(2)95℃25秒,67℃20秒,进行10±1个循环;和(3)95℃20秒,60℃35秒,进行35±2个循环。采用两步退火法避免了检测过程中的非特异性反映,并使得扩增效果更为理想。
对于PCR反应体系,本发明人发现,由于涉及多对引物及探针同时检测,引物、探针的终浓度对PCR反应的影响是较为明显的。因此,本发明人个性化地优化了引物探针在PCR体系中的浓度,使得PCR反应后,Ct值相对集中,达到理想效果。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、特异性目的片段的筛选、引物和探针设计
为了开发适用于同时检测14种乳头瘤病毒基因型(HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68)的检测试剂,本发明人针对各病毒基因序列进行了深入研究,筛选适用于设计特异性引物和探针的区段。经过反复研究比对后,选定以HPV的L1区和L2区中间重叠部分的基因序列作为设计的主要区域,进一步地,确定了针对每一HPV基因型的特异性目的片段(即PCR扩增片段),如表1所示。
表1
根据表1所确定的区域,本发明人进一步设计了特异性引物和探针,同时考虑了两端的引物和探针具有兼并性,以减少多重PCR体系中的引物数量。所设计的引物和探针如表2所示。所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表2、引物序列
实施例2、PCR反应体系中Taq酶浓度的优化
目的:优化PCR预混液的添加量来达到的,优化反应体系中的Taq酶浓度,进而优化PCR反应体系。
通过对目前市场上的已有的较为成熟的荧光定量PCR预混液的筛选,筛选得到康为世纪生物科技有限公司的2×GoldStarTaqManMixture(Cat:CW0932)最适合本发明的试剂盒。因此采用的PCR预混液为康为世纪生物科技有限公司的2×GoldStarTaqManMixture,其中含有热启动Taq酶。
模板:用含有1ng/μL人基因组(抽提自正常人血液)的TE分别将14种HPV阳性参考品(包含HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68,选定各病毒的L1区和L2区序列,由上海翰宇生物科技有限公司合成质粒)稀释至104拷贝/μL作为本次实验的模板。
引物探针混合液配方:将引物稀释到100μM,引物反应终浓度约为0.08μM,配制混合液时1个PCR反应中需要加入100μM的引物储存液量约为0.02μL。将探针稀释到100μM,探针反应终浓度为0.027μM,配制混合液时1个PCR反应中需要加入100μM的探针储存液量约为0.007uL。1个PCR反应中加入引物探针混合液的体积为10uL,加入体积不足部分补充纯化水。PCR反应体系如表3所示。
表3
PCR扩增程序:在ABI7500上进行PCR反应。PCR扩增程序见表4。
表4
PCR扩增的结果如图1A所示,虽然Ct值(荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)较为理想,然而,本发明人发现,存在非特异性扩增的情况,如图1A中箭头所指处。
为了克服上述非特异性扩增的情况,本发明人从多方尝试改进方案。最终确定调整PCR预混液的用量(也即减少Taq酶的添加量),调整后的PCR反应体系如表5所示。
表5
采用表5的体系的扩增结果如图1B所示,减少Taq酶的添加量后所有参考品Ct值明显往后推移,但明显消除了非特异性反应,扩增准确性提高。
实施例3、PCR扩增方法的优化
1、从退火温度来优化
模板:除实施例2中所述的14种阳性参考品,再增加2种阴性参考品(HPV6和HPV11,选定各病毒的L1区和L2区序列,由上海翰宇生物科技有限公司合成质粒),采用1ng/μL人基因组TE将上述参考品稀释至浓度为1000拷贝/μL。
引物探针混合液配方:将引物稀释到100μM,引物反应终浓度约为0.08μM,配制混合液时一个PCR反应需要加入100μM的引物储存液量约为0.02μL。将探针稀释到100μM,探针反应终浓度为0.027μM,配制混合液时一个PCR反应需要加入100μM的探针储存液量约为0.007uL。一个PCR反应加入引物探针混合液的体积为7.5uL,加入体积不足部分补充纯化水。
PCR反应体系如表6所示。
表6
PCR扩增程序:在ABI7500上进行PCR反应。PCR扩增程序见表7。
表7
实验结果如图2A所示,将退火温度提高至65℃后,阳性参考品HPV33的检测结果为阴性,而且阴性参考品HPV11检测结果为弱阳性,出现了非特异性条带,如图2A中箭头所指处。单纯提高反应退火温度是无益的。
2、通过PCR程序来优化
模板、引物探针混合液、以及PCR反应体系均与前面“1”相同。
PCR扩增程序:在ABI7500上进行PCR反应。PCR扩增程序见表8。
表8
实验结果如图2B所示。同图2A相比,采用两步退火法,采集第二次退火结束后的荧光,既消除了阴性参考品HPV11的非特异性反应,又使阳性参考品HPV33的扩增达到了理想的效果。
实施例4、引物浓度的优化
将引物稀释到100μM,首先将引物反应终浓度设定为0.08μM、探针反应终浓度为0.027μM。
所采用的PCR模板为用TE稀释的实施例3中所提及的14种阳性参考品和2种阴性参考品。
扩增程序为实施例3中“2”优化后的程序。
实验结果如图3A所示。虽然显示所有阳性样本的检测结果均为检测结果均为阳性,所有阴性样本的检测结果均为阴性,但可明显看出所有阳性参考品的Ct值相对有些分散。
因此,本发明人进一步进行了反应条件摸索,发现优化引物浓度有利于解决Ct值分散的问题。本发明人进行了反复实验,根据各次结果调整各对引物和探针的浓度。反应液中各引物的终浓度见表9。
表9、PCR反应液配置的最终方案
结果如图3B所示,所有阳性参考品的Ct值相对集中,达到理想效果。
实施例5、反应体系的特异性考察
阳性参考品:国家分型参考品(购自SDA,包括HPV16、18、31、33、35、45、56、58、59、66)和上海翰宇生物科技有限公司合成的HPV39、51、52、68参考品(如实施例2)的混合物。采用上述参考品对高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型试剂盒的检测范围内的14种HPV基因型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66)进行检测。
阴性参考品:国家分型参考品(购自SDA)对本发明的试剂盒的检测范围外的10种HPV基因型(HPV6、11、26、61、67、69、71、73、81、82)进行检测。
检测方法:用含有1ng/μL人基因组的TE溶液将上述国家分型的阴性和阳性参考品稀释至100拷贝/μL,以此作为模板检测反应体系特异性。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。
检测结果如图4所示。如图4A,所有阳性参考品的Ct值均小于30,β-Globin的Ct值小于32(箭头所指区域)。如图4B,所有阴性参考品检测结果显示为阴性,且β-GlobinCt值小于32检测结果有效。本发明的反应体系无假阴性和假阳性现象,能够准确而明确地区分14种致宫颈癌的高危型HPV基因型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。
实施例6、反应体系的灵敏度考察
1.灵敏度的整体考察
灵敏度采用如实施例5的阳性参考品对本发明的试剂盒的检测范围内的14种HPV基因型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)进行检测。
检测方法:用含有1ng/μL人基因组的TE溶液将阳性参考品稀释至20拷贝/μL,以此作为模板检测反应体系特异性。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。每个样本重复检测5次。
检测结果如图5所示所有阳性参考品的Ct值均小于30,β-Globin的Ct值小于32。结果显示,本发明的反应体系对14种致宫颈癌的高危型HPV基因型灵敏度均可达到100拷贝/实验。
2.分别考察四个通道的灵敏度
为了进一步考察本发明的试剂盒的灵敏度,基于1中的实验结果,本发明对四个荧光通道分别进行检测。
首先考察Cy5通道的灵敏度。用TE将人基因组分别稀释至100拷贝/实验、200拷贝/实验、500拷贝/实验、1000拷贝/实验(之前用的1ng/μL人基因组相当于1700拷贝/实验)作为本次实验的模板。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。为了准确验证灵敏度,每个实验重复24次。实验结果如图6A所示,当人基因组浓度为100拷贝/实验时,β-Globin的Ct值在29至31之间,接近临界值,因此,可判定本发明的试剂盒对于β-Globin的灵敏度可达到100拷贝/实验。
考察ROX通道的灵敏度。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV18稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。为了准确验证灵敏度,每个实验重复24次。实验结果如图6B所示当HPV18参考品浓度为25拷贝/实验时,24次的实验结果中ROX通道的Ct值在26至29之间,小于30。因此,可判定本发明的试剂盒对于HPV18敏度可达到25拷贝/实验。
考察VIC通道的灵敏度。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV16稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。为了准确验证灵敏度,每个实验重复24次。实验结果如图6C所示当HPV16参考品浓度为25拷贝/实验时,24次的实验结果中ROX通道的Ct值在26至29之间,小于30。因此,可判定本发明的试剂盒对于HPV16敏度可达到25拷贝/实验。
考察FAM通道的灵敏度。根据1中实验,HPV31的Ct值最大,因此Fam通道的灵敏度检测针对HPV31进行。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV31稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。为了准确验证灵敏度,每个实验重复24次。实验结果如图6D所示当HPV31参考品浓度为25拷贝/实验时,24次的实验结果中ROX通道的Ct值在26至30之间。HPV31参考品浓度为50拷贝/实验时,24次的实验结果中ROX通道的Ct值在26至30之间小于30。因此,可判定本发明的试剂盒对于HPV31敏度可达到25拷贝/实验。
综上所述,本发明的试剂盒对于β-Globin敏度均可达到100拷贝/实验。对于HPV18和HPV16敏度均可达到25拷贝/实验。对于其它12种HPV基因型敏度均可达到50拷贝/实验。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中含有扩增高危型人乳头瘤病毒核酸的引物和对应的检测探针,所述的引物和探针序列如下:
特异性扩增人乳头瘤病毒16型的上游引物SEQIDNO:15,下游引物SEQIDNO:16;
特异性扩增人乳头瘤病毒18型的上游引物SEQIDNO:17,下游引物SEQIDNO:18;
特异性扩增人乳头瘤病毒31型的上游引物SEQIDNO:19,下游引物SEQIDNO:20;
特异性扩增人乳头瘤病毒33型的上游引物SEQIDNO:21,下游引物SEQIDNO:22;
特异性扩增人乳头瘤病毒35型的上游引物SEQIDNO:23,下游引物SEQIDNO:24;
特异性扩增人乳头瘤病毒39型的上游引物SEQIDNO:25,下游引物SEQIDNO:26;
特异性扩增人乳头瘤病毒45型的上游引物SEQIDNO:27,下游引物SEQIDNO:28;
特异性扩增人乳头瘤病毒51型的上游引物SEQIDNO:29,下游引物SEQIDNO:30;
特异性扩增人乳头瘤病毒52型的上游引物SEQIDNO:31,下游引物SEQIDNO:22;
特异性扩增人乳头瘤病毒56型的上游引物SEQIDNO:32,下游引物SEQIDNO:33;
特异性扩增人乳头瘤病毒58型的上游引物SEQIDNO:34,下游引物SEQIDNO:22;
特异性扩增人乳头瘤病毒59型的上游引物SEQIDNO:35,下游引物SEQIDNO:36;
特异性扩增人乳头瘤病毒66型的上游引物SEQIDNO:37,下游引物SEQIDNO:38;
特异性扩增人乳头瘤病毒68型的上游引物SEQIDNO:39,下游引物SEQIDNO:26;
特异性针对人乳头瘤病毒16型的探针SEQIDNO:42;
特异性针对人乳头瘤病毒18型的探针SEQIDNO:43;
特异性针对人乳头瘤病毒33、35、39、45、52、56、58、66、68型的探针SEQIDNO:44;
特异性针对人乳头瘤病毒31、51、59型的探针SEQIDNO:45;
所述的引物和探针所述的高危型人乳头瘤病毒的L1区和L2区重叠区域的基因序列设计。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括:特异性扩增人基因组β-Globin基因的引物和特异性针对β-Globin的探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的特异性扩增β-Globin的引物是SEQIDNO:40和SEQIDNO:41的引物;所述的探针是SEQIDNO:46的探针。
4.如权利要求1-3任一所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒以VIC作为特异性针对人乳头瘤病毒16型的探针的荧光基团,以MGB作为对应的猝灭基团;以ROX作为特异性针对人乳头瘤病毒18型的探针的荧光基团,以BHQ2作为对应的猝灭基团;以FAM作为特异性针对人乳头瘤病毒33、35、39、45、52、56、58、66、68型的探针和特异性针对人乳头瘤病毒31、51、59型探针的荧光基团,以MGB作为对应的猝灭基团;以Cy5作为特异性针对β-Globin的探针的荧光基团,以BHQ3作为对应的猝灭基团。
5.如权利要求1-3任一所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括:PCR反应液,质控品,阴性对照和/或使用说明书。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中,PCR反应液主要由PCR预混液、引物以及探针组成;较佳地,所述的PCR预混液中含有实时荧光PCR反应所需的试剂,包括MgCl2、热启动Taq酶、dNTP和PCR反应缓冲液。
7.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述的质控品包括:HPV16参考品、HPV18参考品、HPV45参考品和人基因组;和/或所述的阴性对照为灭菌水。
8.权利要求1-7任一所述的试剂盒的用途,用于非诊断性地进行高危型人乳头瘤病毒的检测和分型。
9.一种非诊断性的高危型人乳头瘤病毒的检测和分型方法,其特征在于,所述方法包括:
利用权利要求1-7任一所述的试剂盒中的试剂对待测样品进行荧光PCR检测,从而确定待测样品中是否存在高危型人乳头瘤病毒。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,PCR扩增程序包括:
(1)95℃10分钟;
(2)95℃25秒,67℃20秒,进行10±1个循环;和
(3)95℃20秒,60℃35秒(在此步进行荧光采集),进行35±2个循环;
其中,温度或时间能在2%的上下范围内浮动。
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