CN106566894A - 用于人乳头瘤病毒高危型感染筛查的引物、探针及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于人乳头瘤病毒高危型E6/E7 mRNA筛查的引物和探针，上述引物和探针在制备用于筛查人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的药物中的用途，以及上述引物和探针在人乳头瘤病毒高危型E6/E7 mRNA筛查中的应用。使用本发明提供的用于人乳头瘤病毒(HPV)高危型感染筛查的引物、探针，通过一个PCR反应即可快速确定人乳头瘤病毒高危型E6/E7 mRNA的型别，同时所需检测时间短。因此使用本发明提供的用于人乳头瘤病毒(HPV)高危型感染筛查的引物、探针省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于人乳头瘤病毒(HPV)高危型感染筛查的引物、探针及其用途。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，严重威胁着广大妇女的身体健康。据世界范围内统计，每年约有50万宫颈癌新发病例，同时约有23万宫颈癌患者死于该病，其中超过80％的宫颈癌新发病例和死亡发生在发展中国家。而我国每年宫颈癌新发病例有13万人，高居世界第二位，且患者趋向年轻化，年龄在35岁以下的宫颈癌患者占到三分之一。目前国内外临床广泛使用巴氏涂片法(Pap)和液基细胞学检查(TCT)等基于细胞学的技术作为宫颈癌筛查的手段，但因为细胞学检测依赖于医生对细胞核异常状态的主观判断，且细胞核出现异常时宫颈病变已经进展至较晚期，因而限制了其用于宫颈癌早期诊断和预防的价值。
近年来大量流行病学和分子生物学研究已证实，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌及癌前病变的首要因素。HPV属于乳头多瘤空泡病毒科A亚群，是一种无包膜、小分子量的嗜上皮性双链环状DNA病毒，HPV颗粒呈球形，20面体对称，外壳由72个衣壳体组成，直径约45～55nm，分子量为5×106道尔顿，其基因组含有近8000个碱基对，包括8个开放阅读框(open reading frame，ORF)和1个上游调节区(upstreamregulatory region，URR)，其中ORF由早期转录区(E区)和晚期转录区(L区)组成。E区基因编码E1、E2、E4、E5、E6和E7蛋白，其功能与病毒基因组复制、转录、翻译、调控和细胞转化有关，主要在HPV感染的早期表达；L区基因则编码L1、L2等组成病毒衣壳的结构蛋白，在HPV感染的晚期表达；URR区位于E区和L区之间，又称长控制区(long control region，LCR)，为非编码区，含有HPV基因组DNA的复制起始点和基因表达所必须的控制元件，调控病毒基因的复制和转录。
目前根据HPV病毒L1、E6和E7基因序列的不同可将其分为100多种不同的亚型，其中40余种亚型感染与生殖道病变有关，约20种亚型感染可诱发宫颈癌。不同亚型HPV对宫颈上皮的致病性不同，临床上根据HPV不同亚型致癌危险性的高低将其分为低危型和高危型，其中6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、CP6108等低危型HPV主要引发局部外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变等皮肤黏膜的良性增生性病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINⅠ)，而l6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82等高危型HPV可导致CINⅡ、Ⅲ级病变和宫颈癌的发生。现有研究表明，HPV病毒可以两种状态存在于宿主细胞内，即游离状态和整合状态，HPV的致癌作用与HPV DNA的整合有关，HPV DNA在宫颈良性病变中主要以游离状态存在，而在恶性病变中则以整合状态为主。HPV病毒感染宿主细胞后首先以游离状态潜伏于基底细胞核内，利用宿主细胞内物质合成衣壳蛋白，以繁衍子代病毒。在妇女的一生中，大多数人感染过至少一种HPV亚型，但多数HPV感染为无症状和一过性的，绝大多数妇女都能依靠自身免疫力在1-2年内予以清除，从而避免发生宫颈病变。低危型HPV的DNA总是保持游离状态，很少整合到宿主细胞基因组中，但对于少数高危型HPV持续感染者(2年以上不能清除病毒)，HPV病毒DNA以单拷贝或多拷贝串联方式整合于宿主细胞DNA中，其结合位点多位于E2附近，从而破坏了E2基因的完整性，使HPV病毒E2基因对E6、E7基因启动的负相调节作用缺失，导致E6、E7基因表达异常，而E6和E7转录亚单位是HPV病毒的癌基因，其所编码的E6和E7蛋白对于病毒的复制起关键性作用，异常过表达的E6、E7蛋白可分别与人体细胞中存在的抑癌基因P53和Rb的表达产物结合，破坏其细胞周期调节功能，并且通过激活端粒酶活性、抑制细胞凋亡和逃逸正常免疫监视等机制，导致宿主细胞周期失控，进而引发细胞癌变。现有研究表明HPV的持续感染是宫颈癌前病变及宫颈癌发生发展的高危因素，HPV联合宫颈细胞学检查用于宫颈癌筛查，显著提高了宫颈癌与癌前病变的检出率，因此对高危型HPV进行早期筛查可以发现宫颈癌早期病变的患者或宫颈癌高危人群，有利于宫颈癌的早期发现和早期治疗，对于预防和减少宫颈癌的发病率和死亡率、有效降低社会医疗负担有着非常重要的意义，因而国际上很多发达国家都已将HPV检测列为宫颈癌筛查的必检项目，并已将其列入本国的宫颈癌诊断防治指南中。
目前对HPV感染的诊断主要依赖于HPV的DNA检测，临床常用的检测方法包括第二代杂交捕获技术(HC2)、原位杂交技术(ISH)、DNA印迹杂交技术、酶切信号放大法、微阵列芯片法、流式荧光技术、PCR-导流杂交法、荧光PCR法等，并已有20余种基于上述检测方法的HPV感染诊断试剂产品经国家食品药品监督管理总局(GFDA)批准投放市场，可用于对女性子宫颈脱落上皮细胞样本中的HPV进行定性分析。尽管HPV的DNA检测的敏感性较高，应用范围广泛，但其特异性不高，根本原因在于HPV感染具有普遍性(在妇女的一生中，大多数人感染过至少一种HPV亚型)、感染后HPV一般处于游离状态且绝大多数妇女可凭借自身免疫力清除HPV病毒的特点，导致HPV DNA检测阳性结果只能证明曾经有过HPV感染。但目前体内HPV病毒是否已清除，是否持续感染，这些并不能得到证实。即使HPV病毒依然存在于体内，其是否整合入宿主细胞基因组中，是否会导致宫颈上皮内病变，是否有活性的复制与转录，都无法从实验结果中判读出来，因而针对HPV的DNA的检测方法存在固有的局限性。
研究发现，从宫颈上皮细胞感染HPV进展为宫颈癌通常需要10年以上的时间，而近年来对宫颈癌细胞系及癌组织样本的研究结果也表明，宫颈病变的进展与HPV癌基因的过表达密切相关，HPV病毒E6、E7基因的持续性表达是宫颈上皮细胞发生恶性转化及持续进展为宫颈浸润癌的必要条件，E6和E7基因转录可作为病变进展的重要标志，即E6和E7癌蛋白表达过程中反映其转录活性的E6、E7 mRNA更能预测病情的进展。因此对HPV癌基因E6、E7mRNA表达进行检测可提供一种区别HPV瞬时感染和持续感染的有效方法，可通过检测HPVmRNA转录而发现HPV癌基因的活化。与DNA检测相比较，mRNA检测作为判断HPV感染与病变进展为宫颈癌的风险相关性的指标更有效，其诊断价值优于HPV DNA，也逐渐被越来越多的专家认可为新的检测靶标。目前常用的商业化HPV E6、E7 mRNA检测方法主要有美国Hologic公司的HPV检测技术、美国DiaCarta公司的HPV检测技术、法国bioMérieux公司的NucliSENSHPV检测技术以及挪威PreTectAS公司的PreTect HPV-Proofer HV检测技术。其中HPV检测技术基于转录介导等温扩增技术(TMA)原理，扩增后的靶序列RNA可用杂交保护试验(HPA)进行检测；HPV检测技术主要基于分支链DNA信号放大技术(bDNA)原理，无需提取纯化RNA，也无需进行反转录或PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大后即可迅速得到HPV mRNA的检测结果；NucliSENSHPV检测技术以及PreTect HPV-Proofer HV检测技术均基于实时多重核酸序列依赖性扩增技术(Real-Time NASBA)原理，采用针对高危型HPV的E6、E7 mRNA的分子信标探针进行分型特异性HPV检测。上述方法均可有效检测临床样本中存在的高危型HPV E6、E7 mRNA，但操作步骤较为繁琐，不利于高危型HPV筛查工作的大范围开展。因此有必要建立一种高通量、高效率、操作简便快捷的HPV mRNA检测方法，以满足临床快速检测或大规模的人群筛查需求。Real-Time PCR法在实时荧光定量PCR平台上进行闭管检测，能够有效克服PCR产物遗留污染的问题，且操作简便、快捷，根据引物和探针的优化设计，可同时定性或定量检测多个样品不同基因或同一基因的mRNA表达情况，是一种极具潜力的高危型HPV mRNA检测工具。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出了一种用于人乳头瘤病毒(HPV)高危型E6、E7mRNA筛查的引物、探针及其使用方法。
本发明的第一个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型16型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：5所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第二个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型18型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：6或SEQ ID No：7所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：8或SEQ ID No：9所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：10所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第三个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型31型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：11或SEQ ID No：12所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：13所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：14所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第四个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型33型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：15或SEQ ID No：16所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：17或SEQ ID No：18所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：19所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第五个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型52型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：20或SEQ ID No：21所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：22或SEQ ID No：23所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：24所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第六个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型58型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：25或SEQ ID No：26所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：27所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：28所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
根据本发明的第一方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型16型E6mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表1所示。
根据本发明的第二方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型18型E6mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表1所示。
根据本发明的第三方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型31型E6mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表1所示。
根据本发明的第四方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型33型E6mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表1所示。
根据本发明的第五方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型52型E6mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表1所示。
根据本发明的第六方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型58型E6mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表1所示。
表1.用于人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查的引物和探针
本发明的第七个方面提供了上述第一至第六个方面的用于人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查的引物和探针在制备用于筛查人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的药物中的用途。
本发明的第八个方面提供了上述第一至第六个方面的用于人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查的引物和探针在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
根据本发明第八个方面所述的用于人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查的引物和探针在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用，包括如下步骤：
(1)提取样品的总RNA；
(2)荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
PCR反应条件如下：
42℃温育30分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
其中，所述的上游引物、下游引物和探针为根据本发明的第一至第六个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查的引物和探针的任意一种。
具体地，所述引物和探针的具体组成如表1中的组合1至组合20中的任意一个。
(3)检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号；
(4)结果判定：
要求HEX荧光信号有扩增曲线，且HEX荧光信号Ct值应小于30；HEX信号作为内控信号(IC)，每个样品的HEX信号都必须有扩增曲线，这是进行下一步判定的前提；
若样品只有HEX信号扩增曲线，而无FAM信号扩增曲线，表明未检测到HPV的E6mRNA，同时，样品并未受到HPV感染；若样品的HEX信号和FAM信号均有扩增曲线，表明样品受到HPV感染；若样品的HEX信号和FAM信号均无扩增曲线，表明实验结果不可信，需要重复进行实验。
本发明的第九个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型16型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：32或SEQ ID No：33所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：34或SEQ ID No：35所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：36所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第十个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型18型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：37或SEQ ID No：38所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：39所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：40所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第十一个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型31型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：41或SEQ ID No：42所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：43或SEQ ID No：44所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：45所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第十二个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型33型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：46或SEQ ID No：47所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：48或SEQ ID No：49所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：50所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第十三个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型52型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：51所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：52或SEQ ID No：53所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：54所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
本发明的第十四个方面提供了一种用于人乳头瘤病毒高危型58型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：55或SEQ ID No：56所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：57所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：58所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
根据本发明的第九方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型16型E7mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表2所示。
根据本发明的第十方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型18型E7mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表2所示。
根据本发明的第十一方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型31型E7mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表2所示。
根据本发明的第十二方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型33型E7mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表2所示。
根据本发明的第十三方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型52型E7mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表2所示。
根据本发明的第十四方面的具体实施方式，所述用于人乳头瘤病毒高危型58型E7mRNA筛查的引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物、下游引物和探针如表2所示。
表2.用于人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查的引物和探针
本发明的第十五个方面提供了上述第九至第十四个方面的用于人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查的引物和探针分别在制备用于筛查人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的药物中的用途。
本发明的第十六个方面提供了上述第九至第十四个方面的用于人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查的引物和探针或上述第十五个方面所述的药物在人乳头瘤病毒高危型E7mRNA筛查中的应用。
根据本发明第十六个方面所述的用于人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查的引物和探针在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用，包括如下步骤：
(1)提取样品的总RNA；
(2)荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
PCR反应条件如下：
42℃温育30分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
其中，所述的上游引物、下游引物和探针为根据本发明的第一至第六个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查的引物和探针的任意一种。
具体地，所述引物和探针的具体组成如表1中的组合21至组合38中的任意一个。
(3)检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号；
(4)结果判定：
要求HEX荧光信号有扩增曲线，且HEX荧光信号Ct值应小于30；HEX信号作为内控信号(IC)，每个样品的HEX信号都必须有扩增曲线，这是进行下一步判定的前提；
若样品只有HEX信号扩增曲线，而无FAM信号扩增曲线，表明未检测到HPV的E7mRNA，同时，样品并未受到HPV感染；若样品的HEX信号和FAM信号均有扩增曲线，表明样品受到HPV感染；若样品的HEX信号和FAM信号均无扩增曲线，表明实验结果不可信，需要重复进行实验。
表3：用于E6 mRNA筛查的引物和探针的序列组成
表4：用于E7 mRNA筛查的引物和探针的序列组成
使用本发明提供的用于人乳头瘤病毒(HPV)高危型感染筛查的引物、探针，通过一个PCR反应即可快速确定人乳头瘤病毒高危型E6/E7 mRNA的型别，同时所需检测时间短。因此使用本发明提供的用于人乳头瘤病毒(HPV)高危型感染筛查的引物、探针省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
图1示出了本发明实施例1中使用表1中的组合1对436例样本进行检测时获得的一个样本的16型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的阴性检测结果，从图中可以看出，该样本未检出HPV感染。
图2示出了本发明实施例7中使用表2中的组合21对436例样本进行检测时获得的一个样本的16型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA阴性检测结果，从图中可以看出，该样本未检出HPV感染。
图3示出了本发明实施例1中使用表1中的组合1对436例样本进行检测时获得的一个样本的16型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的阳性检测结果，从图中可以看出，该样本检出HPV感染。
图4示出了本发明实施例7中使用表2中的组合21对436例样本进行检测时获得的一个样本的16型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA阳性检测结果，从图中可以看出，该样本检出HPV感染。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下将通过具体的实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的样品均为分泌物拭子；使用的10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、AMV酶、Taq酶均购自中国大连宝生物公司。
下述实施例中使用的样品均来源于厦门某医院2014年4月至2015年3月间进行宫颈液基细胞学检查的标本，共计436例，其中未见上皮内病变或恶性病变(NILM)58例，未明确意义的非典型性鳞状上皮细胞(ASC-US)227例，低度鳞状上皮内病变(LSIL)73例，高度鳞状上皮内病变(HSIL)47例和非典型性腺上皮细胞(AGC)31例。
样品的采集方法和总RNA的提取方法为：
采用HPV采样刷置于宫颈口，逆时针转三圈，停留约10秒，将小刷子放于专用的样本储存管中反复涮洗，将毛刷上的细胞尽量洗涤下来。取2mL的细胞冲洗液于新的离心管中，全速离心5分钟，弃上清，得到底部的脱落细胞。然后采用RBC公司的Magcore total RNAcultured cells kit及核酸自动纯化系统进行总RNA的提取，具体的操作说明详见试剂盒说明书。
对比例1
采用DiaCarta公司生产的HPV E6/E7 RNA 3.0Assay(bDNA)检测试剂盒对上述所有的样品进行验证。按照试剂盒中的操作说明，经过漂洗、裂解、布板、杂交捕获mRNA、信号放大、添加底物、化学发光、读取数据、结果判定等步骤，得出人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测结果。上述436例样本中共有320例人乳头瘤病毒高危型E6/E7 mRNA结果为阳性，占73.4％(320/436)。
实施例1
本实施例用来说明本发明的第一个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型16型E6mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
使用按照上述样品的采集方法和总RNA的提取方法获得的总RNA进行如下操作：
(1)PCR扩增：
PCR体系如下：
PCR反应条件如下：
42℃温育30分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
其中，在上述的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合1至组合4中的任意一种。
(2)检测：
采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号。一次可检测96份样品(包括阴、阳对照)。
(3)结果判定：
要求HEX荧光信号有扩增曲线，且HEX荧光信号Ct值应小于30；HEX信号作为内控信号(IC)，每个样品的HEX信号都必须有扩增曲线，这是进行下一步判定的前提。若样品只有HEX信号扩增曲线，而无FAM信号扩增曲线，表明样品并未受到HPV感染；若样品的HEX信号和FAM信号均有扩增曲线，表明样品受到HPV感染；若样品的HEX信号和FAM信号均无扩增曲线，表明实验结果不可信，需要重复进行实验。
结果显示：
前述436例样本中共有193例16型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA结果为阳性，占44.3％(193/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出193例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对16型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对127例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述127例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、24例18型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例2
本实施例用来说明本发明的第二个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型18型E6mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合5至组合8中的任意一种。
结果发现，436例样本中共有24例18型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA结果为阳性，占5.5％(24/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出24例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对18型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对296例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述296例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、193例16型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例3
本实施例用来说明本发明的第三个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型31型E6mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合9或组合10。
结果发现，436例样本中共有7例31型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA结果为阳性，占1.6％(7/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出7例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对31型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对313例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述313例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、24例18型、193例16型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例4
本实施例用来说明本发明的第四个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型33型E6mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合11至组合14中的任意一种。
结果发现，436例样本中共有4例33型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA结果为阳性，占0.92％(4/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出4例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对33型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对316例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述316例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、24例18型、7例31型、193例16型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例5
本实施例用来说明本发明的第五个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型52型E6mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合15至组合18中的任意一种。
结果发现，436例样本中共有39例52型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA结果为阳性，占8.9％(39/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出39例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对52型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对281例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述281例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是193例16型、31例58型、24例18型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例6
本实施例用来说明本发明的第六个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型58型E6mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合15或组合20。
结果发现，436例样本中共有31例58型人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA结果为阳性，占7.1％(31/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出31例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对58型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对289例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述289例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、193例16型、24例18型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例7
本实施例用来说明本发明的第九个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型16型E7mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表2中所列举的组合21至组合24中的任意一种。
结果发现，436例样本中共有193例16型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA结果为阳性，占44.3％(193/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出193例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对16型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对127例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述127例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、24例18型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例8
本实施例用来说明本发明的第十个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型18型E7mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表2中所列举的组合25或组合26。
结果发现，436例样本中共有24例18型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA结果为阳性，占5.5％(24/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出24例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对18型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对296例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述296例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、193例16型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例9
本实施例用来说明本发明的第十一个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型31型E7 mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合27至组合31中的任意一种。
结果发现，436例样本中共有7例31型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA结果为阳性，占1.6％(7/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出7例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对31型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对313例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述313例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、24例18型、193例16型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例10
本实施例用来说明本发明的第十二个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型33型E6 mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合31至组合34中的任意一种。
结果发现，436例样本中共有4例33型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA结果为阳性，占0.92％(4/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出4例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对33型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对316例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述316例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、31例58型、24例18型、7例31型、193例16型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例11
本实施例用来说明本发明的第十三个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型52型E7 mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合35或组合36。
结果发现，436例样本中共有39例52型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA结果为阳性，占8.9％(39/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出39例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对52型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对281例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述281例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是193例16型、31例58型、24例18型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例12
本实施例用来说明本发明的第十四个方面提供的用于人乳头瘤病毒高危型58型E7 mRNA筛查的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用。
除了以下条件外，其他操作条件同实施例1。
在实施例1的PCR体系中，上游引物、下游引物和探针为上述表1中所列举的组合37或组合38。
结果发现，436例样本中共有31例58型人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA结果为阳性，占7.1％(31/436)。
与对比例1比较可知，本实施例提供的方法与对比例1的结果并不完全一致，其中的差异在于本实施例共检出31例阳性样本，而DiaCarta共检出320例阳性样本。其主要的原因在于本实例只针对58型高危型人乳头瘤病毒的检测，而DiaCarta是针对14种高危型人乳头瘤病毒(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测。
为了验证该实验结果，我们进一步采用了测序法作为第三方验证方法，对289例结果不同的样品进行mRNA逆转录，逆转得到的cDNA送至上海生工进行测序，测得的序列通过NCBI网站在线分析工具BLASTN分析比对，判定序列属于人乳头瘤病毒的具体型别。
鉴定结果表明，上述289例结果不同的样品中，检测到的人乳头瘤病毒的型别和数量分别是39例52型、193例16型、24例18型、7例31型、4例33型、11例为45型、8例为56型及3例为35型，因这8个型别的人乳头瘤病毒并不在本实例的检测范围内，故认为本实例的准确率与DiaCarta公司出品的试剂盒准确率一致，说明本实施例提供的方法准确率很高。
由上述内容可见，与对比例1相比，本实施例通过PCR反应即可判断检体是否感染了人乳头瘤病毒，而且可以确定人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的型别，同时检测时间仅需120分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (16)
1.一种用于人乳头瘤病毒高危型16型E6 mRNA筛查的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：5所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
2.一种用于人乳头瘤病毒高危型18型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：6或SEQ ID No：7所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：8或SEQ ID No：9所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：10所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
3.一种用于人乳头瘤病毒高危型31型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：11或SEQ ID No：12所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：13所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：14所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
4.一种用于人乳头瘤病毒高危型33型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：15或SEQ ID No：16所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：17或SEQ ID No：18所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：19所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
5.一种用于人乳头瘤病毒高危型52型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：20或SEQ ID No：21所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：22或SEQ ID No：23所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：24所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
6.一种用于人乳头瘤病毒高危型58型E6 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E6-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E6-F引物具有序列表中SEQ ID No：25或SEQ ID No：26所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E6-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E6-R引物具有序列表中SEQ ID No：27所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E6-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E6-P探针具有序列表中SEQ ID No：28所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
7.权利要求1-6中任意一项所述的用于人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查的引物和探针在制备用于筛查人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA的药物中的用途。
8.权利要求1-6中任意一项所述的用于人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查的引物和探针在人乳头瘤病毒高危型E6 mRNA筛查中的应用。
9.一种用于人乳头瘤病毒高危型16型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：32或SEQ ID No：33所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：34或SEQ ID No：35所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：36所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
10.一种用于人乳头瘤病毒高危型18型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：37或SEQ ID No：38所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：39所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：40所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
11.一种用于人乳头瘤病毒高危型31型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：41或SEQ ID No：42所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：43或SEQ ID No：44所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：45所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
12.一种用于人乳头瘤病毒高危型33型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：46或SEQ ID No：47所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：48或SEQ ID No：49所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：50所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
13.一种用于人乳头瘤病毒高危型52型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：51所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：52或SEQ ID No：53所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：54所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
14.一种用于人乳头瘤病毒高危型58型E7 mRNA筛查的引物和探针，所述引物和探针包括上游引物、下游引物和探针；其中，
所述上游引物包括E7-F引物和Actin-F引物，其中，
所述E7-F引物具有序列表中SEQ ID No：55或SEQ ID No：56所述的核苷酸序列；
所述Actin-F引物具有序列表中SEQ ID No：29所述的核苷酸序列；
所述下游引物包括E7-R引物和Actin-R引物，其中，
所述E7-R引物具有序列表中SEQ ID No：57所述的核苷酸序列；
所述Actin-R引物具有序列表中SEQ ID No：30所述的核苷酸序列；
所述探针包括E7-P探针和Actin-P探针，其中，
所述E7-P探针具有序列表中SEQ ID No：58所述的核苷酸序列；
所述Actin-P探针具有序列表中SEQ ID No：31所述的核苷酸序列。
15.权利要求9-14中任意一项所述的用于人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查的引物和探针在制备用于筛查人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA的药物中的用途。
16.权利要求9-14中任意一项所述的用于人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查的引物和探针在人乳头瘤病毒高危型E7 mRNA筛查中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107267663A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-10-20 | 常州金麦格生物技术有限公司 | Hpv检测方法和试剂盒 |
| CN109161544A (zh) * | 2018-09-19 | 2019-01-08 | 迈克生物股份有限公司 | 探针和引物组合物及其试剂盒和应用 |
-
2016
- 2016-10-21 CN CN201610918337.XA patent/CN106566894A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107267663A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-10-20 | 常州金麦格生物技术有限公司 | Hpv检测方法和试剂盒 |
| CN109161544A (zh) * | 2018-09-19 | 2019-01-08 | 迈克生物股份有限公司 | 探针和引物组合物及其试剂盒和应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20170419 |
|
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