CN102108423A

CN102108423A - 快速检测16、18型人乳头瘤病毒的荧光定量pcr试剂盒

Info

Publication number: CN102108423A
Application number: CN2010105926677A
Authority: CN
Inventors: 唐景峰; 王业富; 杨敬镜; 王维旭; 汪晓莉
Original assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2011-06-29

Abstract

本发明公开了一种快速检测16、18型人乳头瘤病毒荧光定量PCR试剂盒，涉及一种引起人类宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的病原体基因检测技术。该试剂盒包括DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、HPV16&18标准阳性模板PMD18-T-HPV16&18和阴性质控标准品；所述的荧光定量PCR反应液含有16、18型人乳头瘤病毒特异性引物对和荧光探针。本发明定量准确；检测速度快；特异性好，灵敏度高；使用步骤简单，可重复性高；可同时进行高通量的样品检测。本试剂盒可对16、18型人乳头瘤病毒进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

Description

快速检测16、18型人乳头瘤病毒的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种引起人类宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测16、18型人乳头瘤病毒荧光定量PCR(聚合酶链式反应)试剂盒，适用于16、18型人乳头瘤病毒的定性定量检测。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一类严重危害人类健康、引起人类多种疾病的常见病原体。该病毒是一种双链的小DNA病毒，具有7900个碱基对，属于乳多空病毒科，目前已鉴定出超过200种亚型，有54种可以感染生殖道黏膜。HPV是乳头瘤病毒中最具多样性的一类，约30种不同型HPV可以感染生殖系统的上皮细胞，命名为“生殖型”的HPV。根据HPV致癌的危险性把HPV分为低危型和高危型，其中HPV16型和HPV18型是最常见的、具有代表性的高危型，60％以上的宫颈病变和宫颈癌中检测到HPV16或HPV18的感染。HPV主要通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类，病毒侵入人体后，停留于感染部位的皮肤和粘膜中，不产生病毒血症。

近年研究资料证明HPV与宫颈癌、喉癌、舌癌等发生有关。如HPV16、18等型与宫颈癌的发生关系密切。宫颈癌是世界范围女性第二大恶性肿瘤，也是目前为止最可靠的已知为病毒起源的恶性肿瘤之一，发展中国家的发生率是发达国家6倍。近年来，由于宫颈癌病因学研究的突破，研究已确认宫颈癌是感染性疾病，并确立人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要病因，99.7％的宫颈癌都可检测到高危HPV的DNA，HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌(99％NPV)。特别是近年由于HPV感染增加，现有的防治措施缺乏力度，患者明显年轻化。HPV感染持续存在最终致宫颈癌变，故宫颈癌是可预防的特殊癌症。因此建立有效的HPV核酸检测技术对该类患者监控和诊断，跟踪宫颈病变治疗的预后，对宫颈癌的预防和早期诊断治疗有着十分重要的意义。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Development and evaluation of a PCR and mass spectroscopy(PCR-MS)-based method for quantitative，type-specific detection of human papillomavirus[J].Journal of Virological Methods 160(2009)78-84；Comparison between the Hybrid Capture 2 and the hpVIR real-time PCR for detection of human papillomavirus in women with ASCUS or low grade dysplasia.[J].Journal of Clinical Virology 45(2009)85-89)和定量检测(Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR[J].Virology Journal 2010，7：194；Evaluation of a Prototype Real-Time PCR Assay for Carcinogenic Human Papillomavirus(HPV)Detection and Simultaneous HPV Genotype 16(HPV16)and HPV18 Genotyping.[J].journal of cl inicai microbiology OCT 2009，47：103344-3347)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、淋球菌、支原体、衣原体、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此焏待开发精确、灵敏、快速和无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测16、18型人乳头瘤病毒的荧光定量PCR试剂盒。

本发明采用以下技术方案：

一、PCR试剂盒

该试剂盒包括DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、HPV16&18标准阳性模板PMD18-T-HPV16&18和阴性质控标准品；

所述的荧光定量PCR反应液含有16、18型人乳头瘤病毒特异性引物对和荧光探针：

16、18型人乳头瘤病毒的正向引物为5′-SWGYWGCAGCAYTATATTGG-3′，

16、18型人乳头瘤病毒的反向引物为5′-ATGTTGTAWWAYWGTWWGTCTTTG-3′，

其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基；

荧光探针序列为5′-CAYTCWGGYGTGTCTCC-3′，该荧光探针序列可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰；

所述的HPV16&18标准阳性模板PMD18-T-HPV16&18是含有16、18型人乳头瘤病毒高度保守基因-E1基因的101个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

具体地说：

a)DNA裂解液

DNA裂解液包含：50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，体积分数为1％Triton X-100，体积分数为1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。

b)荧光定量PCR反应液

荧光定量PCR反应液包含：PCR 10×buffer 5.0μl，10μmol/L的正向引物和反向引物各1.5μl，5μmol/L的荧光探针1.5μl，25mmol/L的MgCl₂12.5μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，2.5U/μl的Taq DNA聚合酶1.0μl，无菌双蒸水26μl。

c)HPV16&18标准阳性模板

HPV16&18标准阳性模板PMD18-T-HPV16&18是含有16、18型人乳头瘤病毒高度保守基因-E1基因的101个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-TCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至10⁹拷贝/ml，-20℃保存。贮存浓度为10⁹拷贝/ml，使用前进行10倍梯度的系列稀释。

d)阴性质控标准品

阴性质控标准品为无菌双蒸水。

本试剂盒的工作原理：

在本发明提供的快速定量检测16、18型人乳头瘤病毒荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对16、18型人乳头瘤病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供的检测16、18型人乳头瘤病毒荧光定量PCR试剂盒中，针对16、18型人乳头瘤病毒检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于16、18型人乳头瘤病毒定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测16、18型人乳头瘤病毒荧光定量PCR方法，并研制出检测16、18型人乳头瘤病毒荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速诊断16、18型人乳头瘤病毒的要求。

二、本发明的使用方法包括下列步骤：

①对贮存浓度为10⁹拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-HPV16&18进行10倍的系列稀释，制备阳性标准品，用紫外分光光度计测定A260对标准品定量；

②用DNA裂解液从待测标本中提取HPV16&18DNA；

③分别取②步中的DNA和同样量的系列稀释的①步中的两种阳性标准品加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；

④通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅1.5小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；

3、特异性好，灵敏度高；

4、使用步骤简单，可重复性高；

5、可同时进行高通量的样品检测。

本试剂盒可对16、18型人乳头瘤病毒进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：

J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；

D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；

吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

1、实施例一：试剂盒组成与配制

a、DNA提取试剂(裂解液)

50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，体积分数为1％TritonX-100，体积分数为1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。

b、荧光PCR 10×Buffer组成

500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.025℃)、1.0％Triton X-100。

c、荧光定量PCR反应液包含：PCR 10×buffer 5.0μl，10μmol/L的正向引物和反向引物各1.5μl，5μmol/L的荧光探针1.5μl，25mmol/L的MgCl₂12.5μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，2.5U/μl的Taq DNA聚合酶1.0μl，无菌双蒸水26μl。

d、标准阳性模板贮存液：浓度为10⁹拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-HPV16&18。

e、阴性质控标准品：为无菌双蒸水。

实施例2：使用试剂盒快速检测16、18型人乳头瘤病毒

a、在标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，转至1.5ml离心管中，10000rpm离心10min，再重复洗涤1次。沉淀直接加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，10000rpm离心2min，取上清液5μl做PCR反应；

b、将阳性标准模板(试剂d)系列稀释为10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml；

c、分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各45μl，取第a)步所得HPV16&18DNA和第b)步稀释的HPV16&18阳性标准模板各5μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测；循环条件为：94℃预变性300s；94℃10s，58℃40s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，所用荧光为FAM，其吸收波长494nm，发射波长522nm。

循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：HPV16&18标准阳性模板10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml的Ct值分别为17.52，20.64，24.43，27.88，30.69和34.42；阴性对照为0或40；

反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左右才能完成，因此使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。

Claims

1.一种快速检测16、18型人乳头瘤病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

16、18型人乳头瘤病毒的正向引物为5′-SWGYWGCAGCAYTATATTGG-3′，反向引物为5′-ATGTTGTAWWAYWGTWWGTCTTTG-3′，其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基；

2.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于DNA裂解液包含：

50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，体积分数为1％Triton X-100，体积分数为1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。

3.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应液包含：

PCR 10×buffer 5.0μl，10μmol/L的正向引物和反向引物各1.5μl，5μmol/L的荧光探针1.5μl，25mmol/L的MgCl₂12.5μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，2.5U/μl的Taq DNA聚合酶1.0μl，无菌双蒸水26μl。

4.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于HPV16&18标准阳性模板PMD18-T-HPV16&18包含的E1基因的核苷酸序列为：

SWGYWGCAGCAYTATATTGGTATARAACAGGWATATCAAATATTAGTGAAGTRWWKGGAGACACRCCWGARTGGATACAAAGACWWACWRTWWTACAACAT；

S：C或G；W：A或T；Y：C或T；R：A或G；K：T或G。

5.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于阴性质控标准品为：无菌双蒸水。