CN108474030A - 核酸扩增方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于扩增和分析核酸样品的方法和系统。

Description

核酸扩增方法和系统
交叉引用
本申请要求于2015年11月27日提交的PCT/CN2015/095763的优先权，该PCT申请通过引用而全文并入本文。
背景技术
核酸扩增方法允许从复杂混合物如生物样品中有选择地扩增和鉴定感兴趣的核酸。为了检测生物样品中的核酸，通常对生物样品进行处理，以从生物样品的其他组分和其他可能干扰核酸和/或扩增的物质中分离出核酸。在从生物样品中分离出感兴趣的核酸之后，可通过例如扩增方法，如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(PCR))，对感兴趣的核酸进行扩增。在扩增感兴趣的核酸之后，可以检测扩增产物，并由最终用户解读检测结果。然而，在核酸扩增之前从生物样品中提取核酸可能是费时的，从而导致该过程在整体上的时间效率降低。
重点照护(POC)检测具有在实验室基础设施较差的资源受限的条件下或者在接收实验室结果延迟及对患者进行随访可能较复杂的偏远地区提升感染(例如，传染病、食物污染、土壤污染等)的检测和处置的潜力。POC检测也能够使现有水平的卫生保健设施更加能够在单次访视期间为患者提供样品-回馈(sample-to-answer)结果。然而，POC方法和装置的低效限制了能够实现的目标。例如，从复杂样品类型(例如，生物样品)制备核酸(例如，病原体的核酸)需要熟练技术人员在专门的实验室空间中手动执行多个处理步骤及后续的检测，因此往往在几小时甚至几天之后才能出具结果报告。
因此，需要用于分析来自复杂样品类型的核酸的快速、准确的方法和装置。此类方法和装置例如可用于实现可经由其核酸而检测的疾病的快速样品-回馈检测和处置。
发明内容
本发明提供了用于核酸如RNA和DNA分子的高效扩增的方法和系统。可快速且高灵敏度地检测所扩增的核酸产物。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶核酸分子。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在(a)之前将生物样品悬浮于溶液中，以获得包含该生物样品的匀质化(homogenized)制品。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在(a)之前使生物样品经历离心，以产生沉淀(pellet)和包含该生物样品的溶液。在一些实施方案中，该方法进一步包括在(a)之前使生物样品经历离心，以产生溶液和包含该生物样品的沉淀。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在(b)与(c)之间使混合物经历离心，以产生包含生物样品的上清液。
在一些实施方案中，该生物样品在没有预培养、非选择性富集、选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下直接从其来源获得。
该生物样品可来自受试者的组织或流体。在一些实施方案中，该组织或流体为粪便。该生物样品可通过口腔拭子或直肠拭子获得。
在一些实施方案中，该生物样品包括土壤或食物样品。该食物样品可为乳制品样品。例如，该乳制品样品可包括奶。
在一些实施方案中，所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)提取的情况下添加至(c)中的反应容器中。在一些实施方案中，该混合物在没有经历纯化的情况下添加至(c)中的反应容器中。在一些实施方案中，该混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)浓缩的情况下添加至(c)中的反应容器中。
在一些实施方案中，(b)中的温度为约20℃至40℃。在一些实施方案中，(b)中的时间段不超过约10分钟。例如，(b)中的时间段不超过约1分钟。
在一些实施方案中，所述生物样品未用去污剂处理。
在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含NaOH。该裂解缓冲液可具有约8至13的pH。
在一些实施方案中，在(a)中，生物样品与裂解缓冲液的比例在约1:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)之间。
在一些实施方案中，(c)中的试剂包括进行逆转录扩增和脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂。例如，该试剂可包括逆转录酶。
在一些实施方案中，(c)中的试剂包括产生指示存在扩增产物的可检测信号的报告剂。例如，该可检测信号的强度可与扩增产物或靶核酸分子的量成比例。例如，该报告剂可为染料。
靶核酸分子可为DNA和/或核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，该RNA为病毒RNA。
在一些实施方案中，变性温度为约90℃至100℃。例如，该变性温度可为约92℃至95℃。在一些实施方案中，延伸温度为约35℃至72℃。例如，该延伸温度可为约45℃至65℃。变性持续时间可少于或等于约30秒。延伸持续时间可少于或等于约30秒。
在一些实施方案中，所述扩增以小于30的循环阈值(Ct)产生指示生物样品中存在靶核酸分子的可检测量的扩增产物。在一些实施方案中，所述扩增在10分钟或更短的时间段内产生指示样品中存在靶核酸分子的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测扩增产物的量。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向接收者输出指示扩增产物的量的信息。该接收者可为治疗医师、制药公司或所述受试者。该信息可作为报告输出。
在一些实施方案中，操作(d)在35个或更少的循环内进行。
在一些实施方案中，所述靶核酸分子与疾病相关。所述疾病可与病毒相关。该病毒可为RNA病毒或DNA病毒。例如，该病毒可选自人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒(hepevirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒、水痘病毒、肠病毒和诺如病毒。该流感病毒可选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。该腺病毒可为55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。该丙型肝炎病毒可为具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。该肠病毒可为柯萨奇病毒。该柯萨奇病毒可为柯萨奇病毒A16。该肠病毒可为肠病毒71。该诺如病毒可为诺如病毒GI或诺如病毒GII。
在一些实施方案中，所述疾病与致病细菌或致病原生动物相关。该致病细菌可为革兰氏阳性致病细菌或革兰氏阴性致病细菌。该致病细菌可选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)和志贺氏菌(Shigella spp.)。例如，该致病细菌可为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。该致病原生动物可为疟原虫(Plasmodium)。在一些实施方案中，该致病细菌为沙门氏菌(Salmonella)。
在一些实施方案中，(d)中的扩增产物为扩增的DNA产物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(d)之前使靶核酸分子经受一种或多种变性条件。所述一种或多种变性条件可选自变性温度分布和变性剂。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使靶核酸分子在多个系列的引物延伸反应的第一系列与第二系列之间经受一种或多种变性条件。就变性温度与延伸温度之间的斜变速率(ramping rate)、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个而言，单个系列可以是不同的。在一些实施方案中，就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意两个而言，单个系列是不同的。
在一些实施方案中，所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，该第一系列包括超过十个循环，该第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃至65℃下孵育不超过1分钟，该第二系列包括超过十个循环，该第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃至60℃下孵育不超过1分钟。
在一些实施方案中，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(d)之前将生物样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。例如，该预加热持续时间可不超过1分钟。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统。该系统可包括：输入单元，其接收来自用户的处理生物样品以检测靶核酸分子的请求；以及与该输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，从而：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶核酸分子。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统。该系统可包括：输入单元，其接收来自用户的处理生物样品以检测靶核酸分子的请求；以及与该输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，从而：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)在不超过约15分钟的时间段内在约15℃至70℃的温度下孵育该混合物；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在一些实施方案中，所述系统进一步包括将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物的生物样品处理模块。该生物样品处理模块可孵育该混合物。
在一些实施方案中，所述系统进一步包括与生物样品处理模块可操作地耦合的扩增模块。该扩增模块可(i)将一定量的混合物从生物样品处理模块添加至反应容器中，并且(ii)使反应容器中的反应混合物经历引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物。
在一些实施方案中，所述系统进一步包括与一个或多个计算机处理器可操作地耦合的输出模块。该输出模块可以向接收者输出关于靶核酸分子或扩增的DNA产物的信息。
所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计以在(a)之前将生物样品悬浮于溶液中，从而获得包含该生物样品的匀质化制品。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(a)之前使生物样品经历离心，从而产生沉淀和包含该生物样品的溶液。在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(a)之前使生物样品经历离心，从而产生溶液和包含该生物样品的沉淀。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(b)与(c)之间使混合物经历离心，从而产生包含生物样品的上清液。
该生物样品可在没有预培养、非选择性富集、选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下直接从其来源获得。
在一些实施方案中，该生物样品来自受试者的组织或流体。该组织或流体可为粪便。该生物样品可通过口腔拭子或直肠拭子获得。
在一些实施方案中，该生物样品包括土壤或食物样品。该食物样品可为乳制品样品。在一些实施方案中，该乳制品样品包括奶。
在一些实施方案中，所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)提取的情况下添加至(c)中的反应容器中。在一些实施方案中，该混合物在没有经历纯化的情况下添加至(c)中的反应容器中。在一些实施方案中，该混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)浓缩的情况下添加至(c)中的反应容器中。
(b)中的温度可为约20℃至40℃。
(b)中的时间段可不超过约10分钟。在一些实施方案中，(b)中的时间段不超过约1分钟。
在一些实施方案中，所述生物样品未用去污剂处理。
在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含NaOH。该裂解缓冲液可具有约8至13的pH。
在一些实施方案中，在(a)中，生物样品与裂解缓冲液的比例在约1:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)之间。
(c)中的试剂可包括进行逆转录扩增和脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂。例如，该试剂可包括逆转录酶。、
在一些实施方案中，(c)中的试剂包括产生指示存在扩增产物的可检测信号的报告剂。该可检测信号的强度可与扩增产物或靶核酸分子的量成比例。该报告剂可为染料。
靶核酸分子可为DNA。在一些实施方案中，靶核酸分子为核糖核酸(RNA)。该RNA可为病毒RNA。
变性温度可为约90℃至100℃。例如，该变性温度可为约92℃至95℃。
延伸温度可为约35℃至72℃。例如，该延伸温度可为约45℃至65℃。
变性持续时间可少于或等于约30秒。延伸持续时间可少于或等于约30秒。
在一些实施方案中，所述扩增以小于30的循环阈值(Ct)产生指示生物样品中存在靶核酸分子的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述扩增在10分钟或更短的时间段内产生指示样品中存在靶核酸分子的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以检测扩增产物的量。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以向接收者输出指示扩增产物的量的信息。该接收者可为治疗医师、制药公司或所述受试者。该信息可作为报告而输出。
在一些实施方案中，(d)在35个或更少的循环内进行。
靶核酸分子可与疾病相关。
在一些实施方案中，该疾病与病毒相关。该病毒可为RNA病毒或DNA病毒。例如，该病毒可选自人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒、水痘病毒、肠病毒和诺如病毒。该流感病毒可选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。该腺病毒可为55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。该丙型肝炎病毒可为具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。该肠病毒可为柯萨奇病毒。该柯萨奇病毒可为柯萨奇病毒A16。该诺如病毒可为诺如病毒GI或诺如病毒GII。
在一些实施方案中，所述疾病与致病细菌或致病原生动物相关。该致病细菌可为革兰氏阳性致病细菌或革兰氏阴性致病细菌。该致病细菌可选自金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌和志贺氏菌。在一些实施方案中，该致病细菌为结核分枝杆菌。在一些实施方案中，该致病细菌为沙门氏菌。该致病原生动物可为疟原虫。
在一些实施方案中，(d)中的扩增产物为扩增的DNA产物。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(d)之前使靶核酸分子经受一种或多种变性条件。所述一种或多种变性条件可选自变性温度分布和变性剂。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，以使靶核酸分子在所述多个系列的引物延伸反应的第一系列与第二系列之间经受一种或多种变性条件。就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个而言，单个系列可以是不同的。在一些实施方案中，就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意两个而言，单个系列是不同的。
在一些实施方案中，所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，第一系列包括超过十个循环，第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃-65℃下孵育不超过1分钟，第二系列包括超过十个循环，第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃-60℃下孵育不超过1分钟。
在一些实施方案中，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，以在(d)之前将生物样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。该预加热持续时间可不超过1分钟。
在一个方面，本发明提供了一种计算机可读介质，其包含机器可执行代码，该代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶核酸分子。
在一个方面，本发明提供了一种计算机可读介质，其包含机器可执行代码，该代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物，其中该生物样品包括粪便样品或奶样品；(b)将该混合物在孵育温度下孵育一个孵育时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶，和(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶核酸分子。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物，其中该生物样品包括粪便样品或奶样品；(b)将该混合物在孵育温度下孵育一个孵育时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的方法。该方法可包括：(a)将粪便样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在一些实施方案中，所述裂解缓冲液是碱性的。
在一些实施方案中，所述裂解缓冲液具有约8至13的pH。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(b)与(c)之间使混合物经历离心，以产生用作后续步骤中的混合物的上清液。
在一些实施方案中，已对粪便样品进行了培养以供微生物增殖。
在一些实施方案中，用于微生物增殖的培养包括使粪便样品在富集培养条件下经历一个培养时间段。
在一些实施方案中，所述粪便样品在没有预培养、非选择性富集、选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下直接从其来源获得。
在一些实施方案中，所述粪便样品为固体粪便样品。
在一些实施方案中，所述粪便样品为液体粪便样品。
在一些实施方案中，所述液体粪便样品为水样腹泻粪便。
在一些实施方案中，所述粪便样品通过拭子获得。
在一些实施方案中，所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)提取的情况下添加至(c)中的反应容器中。
在一些实施方案中，所述混合物在没有经历纯化的情况下添加至(c)中的反应容器中。
在一些实施方案中，所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)浓缩的情况下添加至(c)中的反应容器中。
在一些实施方案中，(b)中的温度为约80℃至100℃。
在一些实施方案中，(b)中的孵育时间段不少于约2分钟。
在一些实施方案中，(b)中的孵育时间段约为10分钟。
在一些实施方案中，所述粪便样品未用去污剂处理。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(a)之前将悬浮缓冲液添加至粪便，以获得该粪便样品的匀质化制品。
在一些实施方案中，所述悬浮缓冲液包含NaCl、PBS和/或HEPES。
在一些实施方案中，粪便样品与悬浮缓冲液的比例为约1:1(wt/vol)至约1:100(wt/vol)。
在一些实施方案中，在(a)中，粪便样品的匀质化制品与裂解缓冲液的比例为约5:1(vol/vol)至约1:5(vol/vol)。
在一些实施方案中，(c)中的试剂包括进行逆转录扩增和脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂包括逆转录酶。
在一些实施方案中，(c)中的试剂包括产生指示存在扩增产物的可检测信号的报告剂。
在一些实施方案中，所述可检测信号的强度与扩增产物或靶核酸的量成比例。
在一些实施方案中，所述报告剂是在与扩增产物杂交时具有光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。
在一些实施方案中，所述序列特异性寡核苷酸探针与光学活性报告剂和可选的猝灭剂连接。
在一些实施方案中，所述报告剂是在与扩增产物杂交时具有阻断的光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针在断裂时具有光学活性。
在一些实施方案中，所述报告剂为染料。
在一些实施方案中，所述序列特异性寡核苷酸探针与能够特异性结合靶核酸的引物组中的引物之间的靶核酸上的区域杂交。
在一些实施方案中，所述引物组包括能够与来自沙门氏菌基因组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组和能够与来自沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组。
在一些实施方案中，每个靶核酸独立地为DNA或RNA。
在一些实施方案中，所述RNA为mRNA。
在一些实施方案中，所述变性温度为约90℃至100℃。
在一些实施方案中，所述延伸温度为约35℃至72℃。
在一些实施方案中，所述变性持续时间少于或等于约30秒。
在一些实施方案中，所述延伸持续时间少于或等于约30秒。
在一些实施方案中，所述扩增以小于30的循环阈值(Ct)产生指示粪便样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述扩增在30分钟或更短的时间段内产生指示粪便样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测扩增产物的量和/或存在。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向接收者输出指示扩增产物的量和/或存在的信息。
在一些实施方案中，所述信息作为报告而输出。
在一些实施方案中，(d)中的每个系列在35个或更少的循环内进行。
在一些实施方案中，(d)中的扩增产物为扩增的DNA产物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(d)之前使靶核酸经受一种或多种变性条件。
在一些实施方案中，所述一种或多种变性条件选自变性温度分布和变性剂。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使靶核酸分子在多个系列的引物延伸反应中的任意两个连续系列之间经受一种或多种变性条件。
在一些实施方案中，就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个而言，单个系列是不同的。
在一些实施方案中，就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意两个而言，单个系列是不同的。
在一些实施方案中，所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，第一系列包括十个或更多个循环，第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃-65℃下孵育不超过1分钟，第二系列包括十个或更多个循环，第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃-60℃下孵育不超过1分钟。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在第一系列与第二系列之间将反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过120秒。
在一些实施方案中，与在相若的变性和延伸条件下的一个系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在粪便样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(d)之前将粪便样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。
在一些实施方案中，所述预加热持续时间不超过1分钟。
在一些实施方案中，所述靶核酸为invA mRNA。
在一些实施方案中，所述引物组包含如SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物。
在一些实施方案中，所述序列特异性寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)所示的核酸序列。
在一些实施方案中，所述引物组包含如SEQ ID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物。
在一些实施方案中，所述序列特异性寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)所示的核酸序列。
在一些实施方案中，所述靶核酸为ttr基因。
在一些实施方案中，所述引物组包含如SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物。
在一些实施方案中，所述序列特异性寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)所示的核酸序列。
在一些实施方案中，所述试剂进一步包含MgCl2。
在一些实施方案中，所述试剂进一步包含约1.5mM MgCl2。
在一些实施方案中，所述试剂进一步包含约0.1至0.5mM dNTP。
在一些实施方案中，所述试剂包含约0.1-1.0μM正向引物和反向引物。
在一些实施方案中，所述试剂包含约0.1-0.5μM序列特异性寡核苷酸探针。
在另一个方面，本发明提供了试剂在制备用于检测粪便样品中的沙门氏菌的试剂盒中的用途。该检测可包括：(a)将粪便样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该试剂可以是引物组。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的计算机辅助方法。该方法可包括：(a)输入步骤，用于接收来自用户的处理粪便样品以检测该粪便样品中的沙门氏菌的请求；(b)混合步骤，用于将该粪便样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(c)孵育步骤，用于将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(d)添加步骤，用于将来自(c)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(e)反应步骤，用于使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的计算机辅助系统。该方法可包括：(a)输入装置，用于接收来自用户的处理粪便样品以检测该粪便样品中的沙门氏菌的请求；(b)混合装置，用于将该粪便样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(c)孵育装置，用于将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(d)添加装置，用于将来自(c)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(e)反应装置，用于使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的系统。该方法可包括：输入单元，其接收来自用户的处理粪便样品以检测该粪便样品中的沙门氏菌的请求；以及与该输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，从而：(a)将该粪便样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在另一个方面，本发明提供了一种反应混合物。该反应混合物可包含沙门氏菌、沙门氏菌裂解物或沙门氏菌核酸；一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合，以供在扩增反应中扩增靶核酸序列以获得扩增产物；脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶；能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物，以及可选的产生指示存在扩增产物的可检测信号的报告剂。
在一些实施方案中，所述沙门氏菌核酸选自基因组DNA、cDNA、非编码DNA、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、shRNA、miRNA及其组合。
在一些实施方案中，能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物为dNTP。
在一些实施方案中，所述一个或多个引物组包括包含如SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物的引物组。
在一些实施方案中，所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
在一些实施方案中，所述一个或多个引物组包括包含如SEQ ID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物的引物组。
在一些实施方案中，所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
在一些实施方案中，所述一个或多个引物组包括包含如SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物的引物组。
在一些实施方案中，所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的试剂盒。该试剂盒可包含：一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合，以供在扩增反应中扩增靶核酸序列以获得扩增产物；脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶；用于核酸扩增的缓冲液；能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物；可选的产生指示存在扩增产物的可检测信号的报告剂，以及可选的关于使用一个或多个引物组、DNA聚合酶和dNTP进行核酸扩增以检测粪便样品中的沙门氏菌的说明书。
所述试剂盒可进一步包含可提取关于用于进行引物延伸反应的一个或多个相关参数的信息的独特标识符。
在一些实施方案中，所述参数选自引物延伸反应的系列数目、每个系列中的循环数、变性条件、延伸条件、一个或多个引物组、报告剂、寡核苷酸探针及其组合。
在一些实施方案中，所述独特标识符为条形码。
在一些实施方案中，所述独特标识符为RFID标签。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的系统，该系统可包括：(a)识别模块，用于识别关于用于进行引物延伸反应的一个或多个相关参数的信息，该信息包含在与该系统结合使用的试剂盒中；(b)扩增模块，在识别所述信息时，其自动地使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在该样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列，其中所述反应混合物通过将来源于该粪便样品的裂解物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中而获得，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合。
所述系统可进一步包括用于向接收者输出指示扩增产物的量和/或存在的信息的输出模块。
在一些实施方案中，所述识别模块包含用于扫描所述试剂盒上的条形码以提取信息的条形码扫描模块。
在一些实施方案中，所述识别模块包含用于识别所述试剂盒上的RFID标签以提取信息的RFID识别模块。
在一些实施方案中，所述参数选自引物延伸反应的系列数目、每个系列中的循环数、变性条件、延伸条件、一个或多个引物组、报告剂、寡核苷酸探针。
在一些实施方案中，在识别信息时，所述识别模块与扩增模块进行通信，从而将所述一个或多个相关参数传送至扩增模块，以供进行多个系列的引物延伸反应。
所述系统可进一步包括用于检测扩增产物的量和/或存在的检测模块。
基于仅示出和描述了本发明的说明性实施方案的以下详述，本发明的其他方面和优点将变得对本领域技术人员而言显而易见。将会认识到，本发明能够包括其他不同的实施方案，并且能够在各个明显的方面对其若干细节进行更改，所有这些均不背离本公开内容。相应地，附图和说明书将被视为在本质上是说明性的而非限制性的。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详述和附图(本文中也称为“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1为描绘了示例性系统的示意图。
图2A和2B为描绘了实施例1所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图3A和3B为描绘了实施例1所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图4A和4B为描绘了实施例2所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图5为描绘了实施例3所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图6A和6B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图7A和7B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图8A和8B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图9A和9B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图10A和10B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图11为描绘了实施例5所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图12为描绘了实施例5所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图13为描绘了实施例7所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图14为描绘了实施例9所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图15A和15B为描绘了实施例10所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图16A和16B为描绘了实施例10所述的示例性核酸扩增反应的结果的曲线图。
图17为描绘了实施例11所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图18为描绘了实施例12所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图19A和图19B为描绘了实施例13所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图20为描绘了实施例14所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图21为描绘了实施例15所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图22A和图22B为描绘了实施例17所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图23A、图23B和图23C为描绘了实施例18所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图24A和图24B为描绘了实施例19所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图25A和图25B为描绘了实施例19所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图26A和图26B为描绘了实施例20所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图27为描绘了实施例21所述的核酸扩增反应的结果的曲线图。
图28A为具有示例性用户界面的示例性电子显示的示意图。
图28B为具有示例性用户界面的示例性电子显示的示意图。
图29为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图30A和图30B为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图31A和图31B为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图32A和图32B为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图33为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图34为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图35A和图35B为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图36A和图36B为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
图37A和图37B为描绘了多种核酸扩增反应的结果的曲线图。
具体实施方式
尽管本文中已经示出并描述了本发明的多个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可想到多种变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。
如在本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数的引用物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
除非上下文另有明确说明，否则如在本说明书和权利要求书中所使用的，术语“约”是指大于或小于所述数值不超过10％的范围。例如，该范围可以是大于或小于所述数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。
如本文所用的，术语“扩增(amplifying)”和“扩增(amplification)”可互换使用，并且通常指生成核酸的一个或多个拷贝或“扩增产物”。术语“DNA扩增”通常指生成DNA分子的一个或多个拷贝或“扩增的DNA产物”。术语“逆转录扩增”通常指经逆转录酶的作用从核糖核酸(RNA)模板生成脱氧核糖核酸(DNA)。
如本文所使用的，术语“循环阈值”或“Ct”通常指热循环过程中的循环，在该循环中由于扩增产物而导致的可检测信号的增加达到统计学显著的高于背景信号的水平。
如本文所使用的，术语“孵育”和“温育”可互换使用，并且通常指在具有或没有振摇或搅拌的情况下将样品、混合物或溶液在某个温度下保持某段时间。“孵育温度”通常指允许发生孵育的温度。“孵育时间段”通常指为发生孵育而分配的时间量。
如本文所用的，术语“变性(denaturing)”和“变性(denaturation)”可互换使用，并且通常指双链核酸的螺旋结构的完全或部分解旋，并且在一些情况下指单链核酸的二级结构的解旋。变性可包括病原体细胞壁或病毒外壳的失活，以及抑制剂蛋白质的失活。可发生变性的条件包括“变性温度”和“变性持续时间”，“变性温度”通常指允许发生变性的温度，“变性持续时间”通常指为发生变性而分配的时间量。
如本文所用的，术语“延伸(elongation)”通常指以模板引导的方式将核苷酸掺入核酸。延伸可借助于诸如聚合酶或逆转录酶的酶而发生。可发生延伸的条件包括“延伸温度”和“延伸持续时间”，“延伸温度”通常指允许发生延伸的温度，“延伸持续时间”通常指为发生延伸而分配的时间量。
如本文所用的，术语“核酸”通常指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。核酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。核酸的非限制性实例包括DNA、RNA、基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析确定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、分离的任意序列的DNA、分离的任意序列的RNA、核酸探针和引物。核酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在核酸组装之前或之后进行。核酸的核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。核酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与报告剂偶联或结合。
如本文所用的，术语“引物延伸反应”通常指双链核酸变性，引物与变性的核酸的一条或两条链结合，随后引物延长。在一些情况下，模板核酸可以是单链的(例如，部分单链的)而没有变性，并且引物可与该单链核酸结合，随后引物延伸。
如本文所使用的，术语“反应混合物”通常指包含对于完成核酸扩增(例如，DNA扩增、RNA扩增)所必需的试剂的组合物，此类试剂的非限制性实例包括对靶RNA或靶DNA具有特异性的引物组、由RNA的逆转录产生的DNA、DNA聚合酶、逆转录酶(例如，用于RNA的逆转录)、合适的缓冲液(包括两性离子缓冲液)、辅因子(例如，二价和一价阳离子)、dNTP和其他酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)等)。在一些情况下，反应混合物还可包含一种或多种报告剂。
如本文所用的，“报告剂”通常指产生可检测信号的组合物，该信号的存在或不存在可用于检测扩增产物是否存在。
如本文所用的，术语“靶核酸”通常指在核酸分子的起始群体中的、具有某种核苷酸序列的核酸分子，其存在、量和/或序列或者其中一项或多项的变化需要进行测定。靶核酸可以是任何类型的核酸，包括DNA、RNA和它们的类似物。如本文所用的，“靶核糖核酸(RNA)”通常指作为RNA的靶核酸。如本文所用的，“靶脱氧核糖核酸(DNA)”通常指作为DNA的靶核酸。
如本文所用的，术语“受试者”通常指具有可测试或可检测的遗传信息的实体或介质。受试者可以是人或个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括鼠、猿猴、人、家畜、竞技动物(sport animal)和宠物。受试者的其他实例包括食物、植物、土壤和水。
沙门氏菌是属于肠杆菌科的革兰氏阴性细菌属的属名。沙门氏菌属包含两种沙门氏细菌，即肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)。肠沙门氏菌可被分类为6种亚种和超过2,500种血清型。如本文所用的，术语“沙门氏菌”通常指属于沙门氏菌属的所有细菌。沙门氏菌属包括多个种，包括但不限于伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyph)、亚利桑那沙门氏菌(Salmonella arizonae)等。除非另有特别说明，否则所有这些沙门氏菌均包含在本文记载的术语“沙门氏菌”中。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。该扩增产物可为DNA产物。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该扩增产物可为DNA产物。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物，其中所述生物样品包括粪便样品或奶样品；(b)将所述混合物在孵育温度下孵育一个孵育时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。该扩增产物可为DNA产物。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物，其中所述生物样品包括粪便样品或奶样品；(b)将所述混合物在孵育温度下孵育一个孵育时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该扩增产物可为DNA产物。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的沙门氏菌的方法。该方法可包括：(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该生物样品可为粪便样品。该生物样品可为细胞培养样品。该扩增产物可为DNA产物。
在本发明的多个方面的任何方面，“孵育温度”可为约10℃至75℃，例如，约10℃至70℃、约15℃至65℃、约15℃至60℃、约15℃至55℃、约20℃至50℃、约20℃至45℃、约20℃至40℃、约20℃至35℃、约20℃至30℃、约20℃至25℃或约25℃至30℃的温度。
或者，所述孵育温度可以高于15℃，例如，是高于约20℃、高于约25℃、高于约30℃、高于约35℃、高于约40℃、高于约45℃、高于约50℃、高于约55℃、高于约60℃、高于约65℃、高于约70℃、高于约75℃、高于约80℃、高于约85℃、高于约90℃、高于约91℃、高于约92℃、高于约93℃、高于约94℃、高于约95℃、高于约96℃、高于约97℃、高于约98℃、高于约99℃、高于约100℃的温度，或者是约15℃至95℃的温度，例如，约20℃至90℃、约25℃至85℃、约30℃至80℃、约40℃至70℃、约40℃至95℃、约45℃至90℃、约50℃至85℃、约55℃至80℃、约60℃至75℃、约65℃至75℃或约65℃至70℃的温度。
在本发明的多个方面的任何方面，“孵育时间段”可以不超过约20分钟。例如，“孵育时间段”可以不超过约19分钟，不超过约18分钟、不超过约17分钟、不超过约16分钟、不超过约15分钟、不超过约14分钟、不超过约13分钟、不超过约12分钟、不超过约11分钟、不超过约10分钟、不超过约9分钟、不超过约8分钟、不超过约7分钟、不超过约6分钟、不超过约5分钟、不超过约4分钟、不超过约3分钟、不超过约2分钟、不超过约1分钟、不超过约50秒、不超过约40秒、不超过约30秒、不超过约20秒、不超过约15秒，或不超过约10秒。
在本发明的多个方面的任何方面，在将生物样品与裂解缓冲液混合之前，可将该生物样品悬浮于溶液中以获得包含该生物样品的匀质化制品。该溶液可为悬浮缓冲液。该悬浮缓冲液可包含NaCl、PBS和/或HEPES。根据本发明可使用的悬浮缓冲液包括但不限于约0.9％的氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液、乳酸林格氏(Ringer)溶液、醋酸林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、N-甘氨酰甘氨酸缓冲液及其组合。
在本发明的多个方面的任何方面，所述匀质化制品可在高于约40℃的温度，例如，高于约45℃、高于约50℃、高于约55℃、高于约60℃、高于约65℃、高于约70℃、高于约75℃、高于约80℃、高于约85℃、高于约90℃、高于约91℃、高于约92℃、高于约93℃、高于约94℃、高于约95℃、高于约96℃、高于约97℃、高于约98℃、高于约99℃或高于约100℃的温度下孵育。
在本发明的多个方面的任何方面，可将匀质化制品孵育不超过约20分钟的时间段，例如不超过约19分钟，不超过约18分钟、不超过约17分钟、不超过约16分钟、不超过约15分钟、不超过约14分钟、不超过约13分钟、不超过约12分钟、不超过约11分钟、不超过约10分钟、不超过约9分钟、不超过约8分钟、不超过约7分钟、不超过约6分钟、不超过约5分钟、不超过约4分钟、不超过约3分钟、不超过约2分钟、不超过约1分钟、不超过约50秒、不超过约40秒、不超过约30秒、不超过约20秒、不超过约15秒或不超过约10秒的时间段。
在一些实施方案中，在与裂解缓冲液混合之前，使生物样品经历离心，以产生沉淀和包含该生物样品的溶液。在一些实施方案中，在与裂解缓冲液混合之前，使生物样品经历离心，以产生上清液和包含该生物样品的沉淀。
在一些实施方案中，在将生物样品与裂解缓冲液的混合物孵育后，可使该混合物经历离心，以产生包含该生物样品的上清液。然后，该上清液可作为后续步骤中的混合物。例如，可将该上清液添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中。
在一些情况下，在进行引物延伸反应前，可使靶核酸分子经受一种或多种变性条件。所述一种或多种变性条件可选自变性温度分布和变性剂。
在一些情况下，在进行引物延伸反应前，可将生物样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。在一些实施方案中，预加热持续时间不超过1分钟。
在本发明的多个方面的任何方面，可在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)提取的情况下，将生物样品与裂解缓冲液的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中。在一些情况下，可将混合物在未经历纯化的情况下添加至反应容器中。在某些情况下，可将混合物在未经历DNA或RNA浓缩的情况下添加至反应容器中。
在本发明的多个方面的任何方面，可将生物样品与裂解缓冲液的混合物在约10℃至75℃的温度下，例如，在约10℃至70℃、约15℃至65℃、约15℃至60℃、约15℃至55℃、约20℃至50℃、约20℃至45℃、约20℃至40℃、约20℃至35℃、约20℃至30℃、约20℃至25℃或约25℃至30℃的温度下孵育。
在本发明的多个方面的任何方面，可将生物样品与裂解缓冲液的混合物孵育不超过约20分钟的时间段。例如，(b)中的时间段可以不超过约19分钟，不超过约18分钟、不超过约17分钟、不超过约16分钟、不超过约15分钟、不超过约14分钟、不超过约13分钟、不超过约12分钟、不超过约11分钟、不超过约10分钟、不超过约9分钟、不超过约8分钟、不超过约7分钟、不超过约6分钟、不超过约5分钟、不超过约4分钟、不超过约3分钟、不超过约2分钟、不超过约1分钟、不超过约50秒、不超过约40秒、不超过约30秒、不超过约20秒、不超过约15秒，或不超过约10秒。
在本发明的多个方面的任何方面，扩增来自从受试者获得的生物样品的核酸。该生物样品可直接从其来源获得。例如，该生物样品可在没有预培养、非选择性富集、选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下直接从其来源获得。“预培养”通常指用于在进行本发明的方法之前扩增样品中的一种或多种靶物质(例如，微生物)或增加其数目的过程。“非选择性富集”通常指非选择性地使混合群体中的全部或大部分物质(例如，微生物)的量增加的过程。“选择性富集”通常指使混合群体中的一种或多种特定物质(例如，微生物)的比例和/或量增加，同时抑制其他物质的过程。这样的抑制可由培养基组分如具有选择性毒性的化合物，以及使用培养基组分的生物体产生的微生物代谢终产物造成。“鉴别培养基”通常指包含一种或多种添加的指示剂的培养基，该指示剂允许区分在生长期间发生的具体化学反应。“推断性生物医学鉴定”通常是指基于诸如菌落特征、于初级分离培养基上的生长、革兰氏染色结果等的观察而对微生物的初步鉴定。
在一些实施方案中，对生物样品进行培养以供微生物增殖。在一些实施方案中，在与裂解缓冲液混合之前，使生物样品经受富集培养条件，持续一个培养时间段。该富集培养条件可包括在振摇或不振摇的情况下，在合适的温度(例如，23℃至40℃，如25℃、30℃、35℃或37℃)下，在合适的培养基(例如，胰蛋白酶大豆培养液、改良的胰蛋白酶大豆培养液、胰蛋白胨、营养培养液、L-培养液、革兰氏阴性培养液、蛋白胨，具有酵母的胰蛋白胨大豆培养液或沙门氏菌培养基)中培养生物样品。在一些实施方案中，该培养基为与其他细菌相比更有利于沙门氏菌增殖的沙门氏菌培养基。示例性沙门氏菌培养基包括亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(XLD)、亚硒酸盐亮绿磺胺培养基(SBG)，但不限于此。培养时间段可为约0.5小时至10小时，例如，约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时或约10小时。在一些实施方案中，培养时间段不超过约7小时，例如，不超过约6.5小时、不超过约6小时、不超过约5.5小时、不超过约5小时、不超过约4.5小时、不超过约4小时、不超过约3.5小时、不超过约3小时、不超过约2.5小时、不超过约2小时、不超过约1.5小时、不超过约1小时或不超过约0.5小时。
在一些实施方案中，在经受富集培养条件持续一个培养时间段之前和/或之后，使生物样品经历离心，以产生沉淀和包含该生物样品的溶液。在一些实施方案中，在经受富集培养条件持续一个培养时间段之前和/或之后，使生物样品经历离心，以产生上清液和包含该生物样品的沉淀。
在一些实施方案中，在经受富集培养条件持续一个培养时间段之后，在没有选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下，将生物样品与裂解缓冲液混合。
在一些实施方案中，在生物样品经受富集培养条件持续一个培养时间段之后，可将裂解缓冲液添加至混合物。该裂解缓冲液可以是碱性的。例如，该裂解缓冲液包含NaOH。该裂解缓冲液可具有约7至14，如约8至13、约9至12、约10至11的pH。例如，该裂解缓冲液可具有约7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5或14的pH。
在所述多个方面的任何方面，本发明涉及获得生物样品。在一些情况下，生物样品直接从受试者获得。直接从受试者获得的生物样品通常指这样的生物样品：其从受试者获得后，除了用于从受试者采集生物样品以供进一步处理的任意途径之外未进行进一步处理。例如，通过以下步骤直接从受试者获得血液：访问(access)受试者的循环系统，从受试者中取出血液(例如，通过针)，并使取出的血液进入贮器中。该贮器可包含试剂(例如，抗凝血剂)，以使得血液样品可用于进一步的分析。在另一实例中，可使用拭子获取受试者的口咽表面上的上皮细胞。在进一步的实例中，可使用拭子获取受试者的粪便样品。在从受试者获得生物样品后，可使含有生物样品的拭子与流体(例如，缓冲液)接触，以从拭子上收集生物流体。
在一些实施方案中，所述生物样品为粪便样品。在一些实施方案中，该粪便样品为固体粪便样品。在一些实施方案中，该粪便样品为液体粪便样品。在一些实施方案中，该固体粪便样品可悬浮于合适的缓冲液中作为悬浮的粪便样品。在一些实施方案中，该液体粪便样品可为水样腹泻样品。
在一些实施方案中，所述粪便样品通过拭子获得。例如，可利用拭子刮擦固体粪便样品的表面以获得粪便样品。或者，可将拭子浸入液体粪便样品或悬浮粪便样品中以获得粪便样品。该拭子可以是无菌拭子。该拭子可以是无菌植绒拭子。
可能存在获得粪便样品的其他方式。例如，可通过移液管、微量移液器、注射器等获得液体粪便样品或悬浮粪便样品。例如，可通过使用药匙、移液管端头、镊子等获得固体粪便样品。
在本发明的多个方面的任何方面，生物样品的重量可为约50mg至约5g。例如，生物样品的重量可为约50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1.0g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g或5.0g，或者可为任意两个上述数值之间的任意值或范围。
在本发明的多个方面的任何方面，所述生物样品可为液体或悬浮液。液体生物样品或悬浮生物样品的体积可为约50μl至约5ml，例如，生物样品的体积可为约50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl、500μl、550μl、600μl、650μl、700μl、750μl、800μl、850μl、900μl、950μl、1.0ml、1.1ml、1.2ml、1.3ml、1.4ml、1.5ml、1.6ml、1.7ml、1.8ml、1.9ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml或5.0ml，或者可为任意两个上述数值之间的任意值或范围。
在另一实例中，可通过接近来源中的食物、从容器中取出食物(例如，通过移液)以及将取出的食物放入器皿中，从食物来源(例如，包含该食物的容器)直接获得该食物(例如，奶)。
在一些实施方案中，生物样品在提供于反应容器中时尚未纯化。在一些实施方案中，当生物样品提供至反应容器中时，生物样品的核酸尚未提取。例如，当将生物样品提供至反应容器中时，生物样品中的RNA或DNA可能未从生物样品中提取。此外，在一些实施方案中，在将生物样品提供至反应容器中之前，存在于生物样品中的靶核酸(例如，靶RNA或靶DNA)可能未经浓缩。
在本发明的多个方面的任何方面，可将生物样品与裂解缓冲液的混合物在没有经历DNA或RNA提取的情况下添加至反应容器中。在一些情况下，可将该混合物在未经纯化的情况下添加至反应容器中。在一些情况下，可将该混合物在未经历DNA或RNA浓缩的情况下添加至反应容器中。该反应容器可以是包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器。
例如，如本文其他地方所述将生物样品与裂解缓冲液的混合物孵育之后，将该混合物在未经纯化的情况下添加至反应容器中。例如，将该混合物在没有经历DNA或RNA提取的情况下添加至反应容器中。例如，将该混合物在没有经历DNA或RNA浓缩的情况下添加至反应容器中。该反应容器可以是包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器。
例如，如本文其他地方所述将生物样品与裂解缓冲液的混合物离心而获得上清液之后，将该上清液在未经纯化的情况下添加至反应容器中。例如，将该上清液在没有经历DNA或RNA提取的情况下添加至反应容器中。例如，将该上清液在没有经历DNA或RNA浓缩的情况下添加至反应容器中。该反应容器可以是包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器。
可以从受试者获得包含核酸的任何合适的生物样品。生物样品可以是固体物质(例如，生物组织)，或者可以是流体(例如，生物流体)。通常，生物流体可包括与活生物体相关的任何流体。生物样品的非限制性实例包括从受试者的任何解剖学位置(例如，组织、循环系统、骨髓)获得的血液(或血液的成分—例如，白细胞、红细胞、血小板)、从受试者的任何解剖学位置获得的细胞、皮肤、心脏、肺、肾脏、呼出气、骨髓、粪便、精液、阴道液、来源于肿瘤组织的组织液、乳腺、胰腺、脑脊液、组织、咽拭子、活检物、胎盘液、羊水、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、腔液、痰、脓、微生物群(microbiota)、胎粪、乳汁、前列腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、泪液、眼部液体、汗液、粘液、耳垢、油、腺体分泌物、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脐带血、淋巴液和/或其他排泄物或身体组织。在一个实例中，生物样品为粪便样品。
在其他情况下，生物样品可来自土壤或食物样品。例如，该食物样品可为乳制品样品，并且在一些情况下，该乳制品样品可包括奶。
可采用各种途径从受试者获得生物样品。用于直接从受试者获得生物样品的途径的非限制性实例包括：访问循环系统(例如，经注射器或其他针静脉内或动脉内访问)、收集分泌的生物样品(例如，粪便、尿液、痰、唾液等)、外科手术(例如，活检)、擦拭(例如，口腔拭子、口咽拭子、直肠拭子)、移液和呼吸。此外，可从受试者中期望的生物样品所处的任何解剖部位获得生物样品。在一些实施方案中，生物样品可从其容器，例如包含食物(例如，奶)或土壤的容器(例如，包、盒或瓶)获得。土壤可以是矿物、有机物质、气体、液体以及在一些情况下的生物体的混合物。
在所述多个方面的任何方面，对靶核酸进行扩增以生成扩增产物。靶核酸可以是靶RNA或靶DNA。靶核酸分子可以与疾病相关。在靶核酸为靶RNA的情况下，靶RNA可以是任何类型的RNA，包括本文其他地方所述的RNA类型。在一些实施方案中，靶RNA是病毒RNA。在一些实施方案中，病毒RNA可能对于受试者是致病性的。致病病毒RNA的非限制性实例包括人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，H1N1、H3N2、H7N9或H5N1)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，具甲的RNA-HCV病毒)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、肠病毒(如柯萨奇病毒，例如柯萨奇病毒A16)和诺如病毒(例如，诺如病毒GI或诺如病毒GII)。
在一些实施方案中，靶RNA为沙门氏菌mRNA。在一些实施方案中，靶RNA可选自在沙门氏菌中具有高表达丰度的mRNA。在一些实施方案中，靶RNA选自ttr mRNA、invA mRNA、prgK mRNA、RpoS mRNA、RpoD mRNA或其组合。在一些实施方案中，靶RNA为invA mRNA。
在靶核酸为靶DNA的情况下，靶DNA可以是任何类型的DNA，包括本文其他地方所述的DNA类型。在一些实施方案中，靶DNA是病毒DNA。在一些实施方案中，病毒DNA可能对于受试者是致病性的。DNA病毒的非限制性实例包括单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒、7型腺病毒)和水痘病毒(例如，禽痘)。
在一些情况下，靶DNA可为细菌DNA。该细菌DNA可来自对受试者为致病性的细菌。该致病细菌可为革兰氏阳性致病细菌或革兰氏阴性致病细菌。例如，该致病细菌可选自金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、志贺氏菌和结核分枝杆菌(已知会引起肺结核的细菌)。在一些实施方案中，该致病细菌为沙门氏菌。在一些情况下，靶DNA可为来自致病原生动物，例如可引起疟疾的疟原虫类型的一种或多种原生动物的DNA。
在一些实施方案中，靶DNA为沙门氏菌DNA。在一些实施方案中，靶DNA可选自对沙门氏菌特异和/或在沙门氏菌之间保守的基因。在一些实施方案中，靶DNA选自ttr基因、invA基因、prgK基因、RpoS基因、RpoD基因或其组合。在一些实施方案中，靶DNA为ttr基因。
在本发明的多个方面的任何方面，当将生物样品悬浮于悬浮缓冲液中以产生匀质化制品时，该生物样品与悬浮缓冲液的比例可为约5:1(wt/vol)至约1:500(wt/vol)，如约1:1(wt/vol)至约1:100(wt/vol)。例如，生物样品与悬浮缓冲液的比例可为约5:1(wt/vol)、约4:1(wt/vol)、约3:1(wt/vol)、约2:1(wt/vol)、约1:1(wt/vol)、约1:2(wt/vol)、约1:3(wt/vol)、约1:4(wt/vol)、约1:5(wt/vol)、约1:6(wt/vol)、约1:7(wt/vol)、约1:8(wt/vol)、约1:9(wt/vol)、约1:10(wt/vol)、约1:20(wt/vol)、约1:30(wt/vol)、约1:40(wt/vol)、约1:50(wt/vol)、约1:60(wt/vol)、约1:70(wt/vol)、约1:80(wt/vol)、约1:90(wt/vol)、约1:100(wt/vol)、约1:110(wt/vol)、约1:120(wt/vol)、约1:130(wt/vol)、约1:140(wt/vol)、约1:150(wt/vol)、约1:160(wt/vol)、约1:170(wt/vol)、约1:180(wt/vol)、约1:190(wt/vol)、约1:200(wt/vol)、约1:250(wt/vol)、约1:300(wt/vol)、约1:350(wt/vol)、约1:400(wt/vol)、约1:450(wt/vol)或约1:500(wt/vol)。
在本发明的多个方面的任何方面，当将裂解缓冲液添加至匀质化制品时，该裂解缓冲液与匀质化制品的比例可为约50:1(vol/vol)至约1:50(wt/vol)，如约5:1(wt/vol)至约1:5(vol/vol)。例如，裂解缓冲液与匀质化制品的比例可为约50:1(vol/vol)、40:1(vol/vol)、30:1(vol/vol)、20:1(vol/vol)、10:1(vol/vol)、9:1(vol/vol)、8:1(vol/vol)、7:1(vol/vol)、6:1(vol/vol)、5:1(vol/vol)、约4:1(vol/vol)、约3:1(vol/vol)、约2:1(vol/vol)、约1:1(vol/vol)、约1:2(vol/vol)、约1:3(vol/vol)、约1:4(vol/vol)、约1:5(vol/vol)、约1:6(vol/vol)、约1:7(vol/vol)、约1:8(vol/vol)、约1:9(vol/vol)、约1:10(vol/vol)、约1:20(vol/vol)、约1:30(vol/vol)、约1:40(vol/vol)或约1:50(vol/vol)。
在本发明的多个方面的任何方面，将从受试者获得的生物样品或如本文其他地方所述的从该生物样品衍生的混合物、上清液或匀质化制品与核酸扩增所必需的试剂一起提供至反应容器中以获得反应混合物。备选地或者附加地，可将从生物样品获得的任何混合物、上清液或悬浮液与核酸扩增所必需的试剂一起提供至反应容器中以获得反应混合物。可使用任何合适的反应容器。在一些实施方案中，反应容器包括主体，该主体可包括内表面、外表面、开口端和相对的封闭端。在一些实施方案中，反应容器可包括盖。所述盖可被配置为在其开口端与主体接触，使得当进行接触时该反应容器的开口端封闭。在一些情况下，所述盖永久地与反应容器相关联，使得其在打开和闭合配置下保持附接至反应容器。在一些情况下，所述盖是可移除的，以便在反应容器打开时，盖与反应容器分离。在一些实施方案中，反应容器可被密封，在一些情况下被气密密封。
反应容器可具有不同的大小、形状、重量和配置。在一些实例中，反应容器可以是圆形或椭圆形的管状。在一些实施方案中，反应容器可以是矩形、正方形、菱形、圆形、椭圆形或三角形。反应容器可以是规则形状或不规则形状。在一些实施方案中，反应容器的封闭端可具有锥形、圆形或平的表面。反应容器类型的非限制性实例包括管、孔、毛细管、筒、皿、离心管或移液管头。反应容器可由任何合适的材料构造，此类材料的非限制性实例包括玻璃、金属、塑料及其组合。
在一些实施方案中，反应容器是反应容器数组的一部分。反应容器数组尤其可用于自动化方法和/或同时处理多个样品。例如，反应容器可以是由许多孔构成的微孔板的孔。在另一实例中，反应容器可容纳在热循环仪的热块的孔中，其中热循环块包括各自能够接纳样品容器的多个孔。由反应容器组成的数组可包括任何适当数目的反应容器。例如，数组可包括至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、35、48、96、144、384个或更多个反应容器。反应容器数组的反应容器部分也可以由流体处理装置单独寻址，使得该流体处理装置可正确识别反应容器，并将适当的流体材料分配到反应容器中。流体处理装置可用于将流体材料向反应容器中的添加自动化。
在一些实施方案中，反应容器可包含多个热区。反应容器内的热区可通过使反应容器的不同区域暴露于不同的温度循环条件来实现。例如，反应容器可包括上部热区和下部热区。上部热区能够接收生物样品和对于获得用于核酸扩增的反应混合物所必需的试剂。该反应混合物随后可经历第一热循环方案。在期望数目的循环之后，例如，反应混合物可缓慢地但连续地从上部热区泄漏到下部热区。在下部热区，反应混合物随后经历与上部热区的方案不同的第二热循环方案的期望数目的循环。此等策略在采用巢式PCR扩增DNA时可能特别有用。在一些实施方案中，热区可在反应容器内的热敏分层材料的辅助下在反应容器内产生。在这样的情况下，可利用热敏分层材料的加热将反应混合物从一个热区释放到下一个热区中。在一些实施方案中，反应容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个热区。
在一些实施方案中，包含热区的反应容器可用于在核酸扩增前处理生物样品。例如，可在添加生物样品和对于核酸扩增所必需的试剂之前将裂解剂添加到反应容器的第一热区。当将生物样品和试剂添加到包含裂解剂的反应容器中时，获得能够裂解该生物样品内的种类(例如，细胞或病毒颗粒)的反应混合物。或者，可将裂解剂与生物样品和试剂同时添加到反应混合物的第一热区中。使第一热区经受适合于裂解剂作用的温度条件可用来在第一热区中裂解生物样品中的细胞和病毒颗粒，使得该生物样品中的核酸释放到反应混合物中。裂解之后，随后可使反应混合物进入反应容器的第二热区，以供使用本文所述的扩增方法对释放的核酸进行扩增。
裂解缓冲液可包含任何合适的裂解剂，包括可商购的裂解剂。裂解剂的非限制性实例包括Tris-HCl、EDTA、去污剂(例如，Triton X-100、SDS)、溶菌酶、葡萄糖酶(glucolase)、蛋白酶E、病毒内溶素、外溶素(exolysin)、消解酶(zymolose)、溶细胞酶(Iyticase)、蛋白酶K、来自噬菌体的内溶素和外溶素、来自噬菌体PM2的内溶素、来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)噬菌体PBSX的内溶素、来自乳杆菌原噬菌体Lj928、Lj965、噬菌体15Phiadh的内溶素、来自肺炎链球菌噬菌体Cp-I的内溶素、无乳链球菌噬菌体B30的双功能肽聚糖溶素、来自原噬菌体细菌的内溶素和外溶素、来自李斯特菌(Listeria)噬菌体的内溶素、穴蛋白(holin)-内溶素、细胞20裂解基因、holWMY沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswameri)M噬菌体varphiWMY、沃氏葡萄球菌M噬菌体varphiWMY的Iy5WMY、吐温20、PEG、KOH、NaCl及其组合。裂解缓冲液的一个实例是氢氧化钠(NaOH)。在一些实施方案中，所述生物样品未用去污剂处理。例如，该裂解缓冲液可以不含任何去污剂。
裂解缓冲液可具有约7至14，如约8至13、约9至12、约10至11的pH。例如，裂解缓冲液可具有约7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5或14的pH。
在本发明的多个方面的任何方面，当生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物时，生物样品与裂解缓冲液的比例可在约5:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)之间，例如，约1:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)。例如，生物样品与裂解缓冲液的比例可为约5:1(wt/vol)、约4:1(wt/vol)、约3:1(wt/vol)、约2:1(wt/vol)、约1:1(wt/vol)、约1:2(wt/vol)、约1:3(wt/vol)、约1:4(wt/vol)、约1:5(wt/vol)、约1:6(wt/vol)、约1:7(wt/vol)、约1:8(wt/vol)、约1:9(wt/vol)或约1:10(wt/vol)。
在一些实施方案中，反应容器含有核酸扩增所必需的试剂。例如，该试剂包括逆转录扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶)或DNA扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶)。
任何类型的核酸扩增反应均可用于扩增靶核酸并生成扩增产物。此外，核酸的扩增可以是线性的、指数式的或其组合。扩增可以是基于乳液的或可以是非基于乳液的。核酸扩增方法的非限制性实例包括逆转录、引物延伸、聚合酶链反应、连接酶链反应、解旋酶依赖的扩增、非对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增(MDA)。在一些实施方案中，扩增产物可以是DNA。在对靶RNA进行扩增的情况下，可通过RNA的逆转录来获得DNA并且可利用随后的DNA扩增来生成扩增的DNA产物。扩增的DNA产物可以指示在生物样品中存在靶RNA。在对DNA进行扩增的情况下，可以采用各种DNA扩增方案。DNA扩增方法的非限制性实例包括聚合酶链反应(PCR)、PCR的变型(例如，实时PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、非对称PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR(dial-out PCR)、解旋酶依赖的PCR、巢式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR(miniprimer PCR)、多重PCR、巢式PCR、重叠-延伸PCR、热非对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)、递降PCR)以及连接酶链反应(LCR)。在一些情况下，DNA扩增是线性的。在一些情况下，DNA扩增是指数式的。在一些情况下，DNA扩增采用巢式PCR来实现，其可改善检测扩增的DNA产物的灵敏度。在一些实施方案中，如本文所述的扩增可以指引物延伸反应。
在多个方面，本文所述的核酸扩增反应可平行进行。通常，平行的扩增反应是同时在同一反应容器内发生的扩增反应。平行的核酸扩增反应可以如下进行：例如，在反应容器中包括对于各个核酸扩增反应所必需的试剂以获得反应混合物，并且使该反应混合物经受对于各个核酸扩增反应所必需的条件。例如，逆转录扩增和DNA扩增可如下平行地进行：在反应容器中提供对于这两种扩增方法所必需的试剂以形成并获得反应混合物，并使该反应混合物经受适于进行这两个扩增反应的条件。由RNA的逆转录产生的DNA可以平行地进行扩增以产生扩增的DNA产物。任何合适数目的核酸扩增反应可以平行地进行。在一些情况下，平行地进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核酸扩增反应。
平行进行核酸扩增反应的优点可包括耦合的核酸扩增反应之间的快速转换。例如，可在平行核酸扩增的加热阶段从生物样品中提取或释放靶核酸(例如，靶RNA、靶DNA)。在靶RNA的情况下，例如，可加热包含靶RNA的生物样品并使靶RNA从生物样品中释放。所释放的靶RNA可以立即开始逆转录(经由逆转录扩增)以产生互补DNA。然后可立即扩增该互补DNA，通常在数秒的量级上。靶RNA从生物样品中释放与靶RNA逆转录为互补DNA之间的短时间间隔可有助于使生物样品中可能妨碍逆转录和/或DNA扩增的抑制剂的影响最小化。
在所述多个方面的任何方面，可使用针对靶核酸的引物组来进行核酸扩增反应。例如，进行核酸扩增反应所必需的试剂可包括一个或多个引物组。引物组通常包含一种或多种引物。例如，引物组可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种引物。在一些情况下，引物组可包含针对不同的扩增产物或不同的核酸扩增反应的引物。例如，引物组可包含第一引物和与核酸链产物互补的第二引物，第一引物是生成与靶核酸的至少一部分互补的核酸产物的第一链所必需的，第二引物是生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物的第二链所必需的。
例如，引物组可针对靶RNA。引物组可包含可用于生成与靶RNA的至少一部分互补的核酸产物第一链的第一引物。在逆转录反应的情况下，核酸产物的第一链可以是DNA。引物组还可包含可用于生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物第二链的第二引物。在与DNA扩增平行进行的逆转录反应的情况下，核酸产物的第二链可以是与自RNA模板产生的DNA链互补的核酸(例如，DNA)产物的一条链。
如有需要，可使用任何合适数目的引物组。例如，可使用约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个引物组。当使用多个引物组时，一个或多个引物组可各自对应于特定的核酸扩增反应或扩增产物。
在一些实施方案中，所述一个或多个引物组中的每个引物组均能够与来自微生物基因组或微生物转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合。在一些情况下，该微生物基因组为沙门氏菌基因组。在一些情况下，该微生物转录物组为沙门氏菌转录物组。靶核酸可为靶RNA或靶DNA。例如，靶核酸可为来自沙门氏菌基因组的靶DNA序列。例如，靶核酸可为来自沙门氏菌转录物组的靶RNA序列。例如，靶核酸可为其他类型的靶RNA序列，如rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微小RNA、dsRNA，但不限于此。
在靶核酸为靶RNA的情况下，靶RNA可为任何类型的RNA，包括如本文其他地方所述的RNA类型。在一些实施方案中，靶RNA为mRNA。在一些实施方案中，靶RNA为沙门氏菌mRNA。在一些实施方案中，靶RNA可选自在沙门氏菌中具有高表达丰度的mRNA。在一些实施方案中，靶RNA选自ttr mRNA、invA mRNA、prgK mRNA、RpoS mRNA、RpoD mRNA及其组合。在一些实施方案中，靶RNA为invA mRNA。
在一些实施方案中，所述一个或多个引物组包括能够与invA mRNA特异性结合的引物组。例如，所述一个或多个引物组可包括包含如SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物的引物组。备选地或者附加地，所述一个或多个引物组可包括包含如SEQ IDNO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物的引物组。
在靶核酸为靶DNA的情况下，靶DNA可为任何类型的DNA，包括如本文其他地方所述的DNA类型。在一些实施方案中，靶DNA为基因组DNA。在一些实施方案中，靶DNA为沙门氏菌基因组DNA。在一些实施方案中，靶DNA可选自对沙门氏菌特异和/或在沙门氏菌之间保守的基因。在一些实施方案中，靶DNA选自ttr基因、invA基因、prgK基因、RpoS基因、RpoD基因及其组合。在一些实施方案中，靶DNA为ttr基因。
在一些实施方案中，所述一个或多个引物组包括能够与ttr基因特异性结合的引物组。例如，所述一个或多个引物组可包括包含如SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物的引物组。
在一些实施方案中，所述一个或多个引物组可包括能够与来自细菌基因组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组。在一些实施方案中，所述一个或多个引物组可包括能够与来自细菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组。在一些实施方案中，所述一个或多个引物组可既包括能够与来自细菌基因组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组又包括能够与来自细菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组。该细菌基因组可为沙门氏菌基因组。该细菌转录物组可为沙门氏菌转录物组。例如，所述一个或多个引物组可包括能够与来自沙门氏菌基因组的ttr基因或其变体特异性结合的引物组。例如，所述一个或多个引物组可包括能够与来自沙门氏菌转录物组的invA mRNA或其变体特异性结合的引物组。例如，所述一个或多个引物组可既包括能够与来自沙门氏菌基因组的ttr基因或其变体特异性结合的引物组又包括能够与来自沙门氏菌转录物组的invA mRNA或其变体特异性结合的引物组。
在本发明的多个方面的任何方面，所述试剂可包含正向引物。所述试剂可包含适用于进行核酸扩增的任意量的正向引物。例如，所述试剂可包含少于0.01μM、0.01μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM、6.0μM、7.0μM、8.0μM、9.0μM、10.0μM、11.0μM、12.0μM、13.0μM、14.0μM、15.0μM，多于15.0μM的正向引物，或者上述数值之间的任意浓度范围，如约0.01至10.0μM、0.05至5.0μM、0.05至4.0μM、0.05至3.0μM、0.05至2.0μM、0.05至1.0μM、0.05至0.5μM、0.1至5.0μM、0.1至4.0μM、0.1至3.0μM、0.1至2.0μM、0.1至1.0μM、0.1至0.9μM、0.1至0.8μM、0.1至0.7μM、0.1至0.6μM、0.1至0.5μM的正向引物。在一个方面，所述试剂可包含约0.1至1.0μM正向引物。
在本发明的多个方面的任何方面，所述试剂可包含反向引物。所述试剂可包含适用于进行核酸扩增的任意量的反向引物。例如，所述试剂可包含少于0.01μM、0.01μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM、6.0μM、7.0μM、8.0μM、9.0μM、10.0μM、11.0μM、12.0μM、13.0μM、14.0μM、15.0μM，多于15.0μM的反向引物，或者上述数值之间的任意浓度范围，如约0.01至10.0μM、0.05至5.0μM、0.05至4.0μM、0.05至3.0μM、0.05至2.0μM、0.05至1.0μM、0.05至0.5μM、0.1至5.0μM、0.1至4.0μM、0.1至3.0μM、0.1至2.0μM、0.1至1.0μM、0.1至0.9μM、0.1至0.8μM、0.1至0.7μM、0.1至0.6μM、0.1至0.5μM的反向引物。在一个方面，所述试剂可包含约0.1至1.0μM反向引物。
在一些实施方案中，使用DNA聚合酶。可以使用任何合适的DNA聚合酶，包括可商购的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常指能够以模板结合的方式将核苷酸掺入到DNA链中的酶。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热分布。
在一些实施方案中，进行核酸扩增所必需的试剂可包括逆转录酶。在一些实施方案中，如本文所述的试剂可包括逆转录酶。例如，可使用任何合适的逆转录酶。逆转录酶通常是指在与RNA模板结合时能够将核苷酸掺入到DNA链中的酶。逆转录酶的非限制性实例包括HIV-1逆转录酶、M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、端粒酶逆转录酶，以及它们的变体、修饰产物和衍生物。本文公开的或以其他方式在本领域中已知的多种DNA和RNA聚合酶能够在模板引导的引物延伸反应中使用核苷酸类似物。多种核苷酸类似物在本领域中是已知的。核苷酸类似物的非限制性实例包括核糖核苷酸类似物和脱氧核糖核苷酸类似物。通常，这样的类似物包括腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿嘧啶和这些碱基的类似物。该类似物可包含核苷三磷酸，或可包含另外的磷酸基团，例如四磷酸、五磷酸、六磷酸、七磷酸或更高级的磷酸基团。这些类似物中一些的实例例如在公开的美国专利申请号2003-0124576和2007-0072196以及美国专利号7,223,541和7,052,839中描述，其全部公开内容通过引用以其全文并入本文用于所有目的。
在多个方面，使用引物延伸反应来生成扩增产物。引物延伸反应通常包括以下的循环：将反应混合物在变性温度下孵育一段变性持续时间，以及将反应混合物在延伸温度下孵育一段延伸持续时间。
在一些情况下，在引物延伸反应前，可使靶核酸分子经受一种或多种变性条件。所述一种或多种变性条件可选自变性温度分布和变性剂。
在一些情况下，在引物延伸反应前，将生物样品在约90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过约10分钟的预加热持续时间。在一些实施方案中，预加热持续时间不超过1分钟。
变性温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性温度可为约80℃至约110℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约100℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约97℃。在一些实例中，变性温度可为约92℃至约95℃。在另外其他的实例中，变性温度可为约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。
变性持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，变性持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。
延伸温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸温度可为约30℃至约80℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约72℃。在一些实例中，延伸温度可为约45℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约40℃至约60℃。在一些实例中，延伸温度可为约50℃至约60℃。在另外其他的实例中，延伸温度可为约35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。
延伸持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，延伸持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。
在所述多个方面的任何方面，可以进行多个循环的引物延伸反应。可进行任何适当数目的循环。例如，进行的循环数可以少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。进行的循环数可取决于，例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物)所必需的循环数(例如，循环阈值(Ct))。例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物)所必需的循环数可以少于约或为约100个循环、75个循环、70个循环、65个循环、60个循环、55个循环、50个循环、40个循环、35个循环、30个循环、25个循环、20个循环、15个循环、10个循环或5个循环。此外，在一些实施方案中，可检测量的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物)可以以小于100、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5的循环阈值(Ct)获得。
扩增产生指示存在所扩增的靶核酸的可检测量的扩增产物所需的时间可根据从中获得靶核酸的生物样品、将要进行的特定核酸扩增反应和所期望的扩增反应的特定循环数而变化。例如，靶核酸的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时间段内产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物。
在一些实施方案中，靶RNA的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时间段内产生指示存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物。
在一些实施方案中，可使反应混合物经历多个系列的引物延伸反应。所述多个系列中的单个系列可包括多个循环的特定引物延伸反应，该反应的特征在于，例如，如本文其他地方所述的特定的变性和延伸条件。通常，例如，就变性条件和/或延伸条件而言，每个单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。例如，就斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的任意一个、两个、三个、四个或全部五个而言，单个系列可不同于所述多个系列中的另一个单个系列。此外，多个系列可包括任何数目的单个系列，例如，至少约或约为2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个单个系列。
例如，多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。第一系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃至约65℃下孵育不超过约一分钟。第二系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃至约60℃下孵育不超过约1分钟。在这一具体实例中，第一和第二系列在它们的延伸温度条件上不同。然而，该实例并非意在限制，因为可以使用不同延伸和变性条件的任意组合。
可在多个系列的引物延伸反应的每个系列中进行任何合适数目的循环。例如，在多个系列的引物延伸反应的每个系列中进行的循环数可少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。
进行多个系列的引物延伸反应的优点可能在于，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，多个系列的方法以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。与在相若的变性和延伸条件下的单一系列相比，使用多个系列的引物延伸反应可将此等循环阈值减少至少约或大约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些实施方案中，斜变时间(即，热循环仪从一个温度转变至另一温度所花的时间)和/或斜变速率是扩增中的重要因素。例如，扩增产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物所需的温度和时间可根据斜变速率和/或斜变时间而变化。斜变速率可影响用于扩增的温度和时间。
在一些情况下，斜变时间和/或斜变速率在循环之间可以是不同的。然而在一些情况下，循环之间的斜变时间和/或斜变速率可以是相同的。斜变时间和/或斜变速率可基于正在处理的样品进行调整。
在一些情况下，例如可以根据样品的性质和反应条件来确定不同温度之间的斜变时间。也可根据样品的性质和反应条件来确定精确的温度和孵育时间。在一些实施方案中，可使用多个热循环将单个样品处理(例如，使之经受扩增条件)多次，各个热循环在例如斜变时间、温度和/或孵育时间上不同。随后可为该特定样品选择最好或最佳的热循环。这提供了针对被测试的特定样品或样品组合裁量热循环的稳健而高效的方法。
在一些实施方案中，靶核酸可在引物延伸反应启动之前经受变性条件。在多个系列的引物延伸反应的情况下，靶核酸可在执行所述多个系列之前经受变性条件，或者可在所述多个系列之间经受变性条件。例如，靶核酸可在多个系列中的第一系列与第二系列之间经受变性条件。此类变性条件的非限制性实例包括变性温度分布(例如，一个或多个变性温度)和变性剂。
在一些实施方案中，可在进行引物延伸反应之前预加热生物样品。预加热生物样品的温度(例如，预加热温度)和持续时间(例如，预加热持续时间)可根据例如所分析的特定生物样品而变化。在一些实例中，可将生物样品预加热不超过约60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、15秒、10秒或5秒。在一些实例中，可在约80℃至约110℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约100℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约97℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约92℃至约95℃的温度下预加热生物样品。在另外其他的实例中，可在约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃的温度下预加热生物样品。
在一些实施方案中，对于进行核酸扩增所必需的试剂，包括对于进行平行核酸扩增所必需的试剂，还可包括报告剂。报告剂可产生可检测信号。可检测信号可指示扩增产物是否存在。例如，可检测信号的存在或不存在可指示扩增产物是否存在。可检测信号的强度可与扩增产物的量成比例。在一些情况下，当扩增产物由与最初扩增的靶核酸不同类型的核酸所生成时，可检测信号的强度可与最初扩增的靶核酸的量成比例。例如，在通过平行的逆转录和扩增从逆转录获得的DNA来扩增靶RNA的情况下，对于这两个反应所必需的试剂还可包括可产生可检测信号的报告剂，该可检测信号指示扩增的DNA产物和/或扩增的靶RNA的存在。可检测信号的强度可与扩增的DNA产物和/或扩增的原始靶RNA的量成比例。报告剂的使用还使得实时扩增方法成为可能，包括用于DNA扩增的实时PCR。
报告剂可通过共价或非共价相互作用与包括扩增产物在内的核酸相连接。非共价相互作用的非限制性实例包括离子相互作用、范德华力、疏水相互作用、氢键键合及其组合。在一些实施方案中，报告剂可与初始反应物结合，并且报告剂水平的变化可用于检测扩增产物。在一些实施方案中，报告剂可以仅在核酸扩增进行时是可检测的(或不可检测的)。在一些实施方案中，光学活性染料(例如，荧光染料)可用作报告剂。染料的非限制性实例包括SYBR绿，SYBR蓝，DAPI，碘化丙锭(propidium iodine)，Hoeste，SYBR金，溴化乙锭，吖啶，原黄素、吖啶橙，吖啶黄，荧光香豆素(fluorcoumanin)，玫瑰树碱，道诺霉素，氯喹，偏端霉素D，色霉素，胡米溴铵(homidium)，光辉霉素，多吡啶钌(ruthenium polypyridyl)，安曲霉素(anthramycin)，菲啶和吖啶，溴化乙锭，碘化丙锭，碘化己锭(hexidium iodide)，二氢乙锭，乙锭同型二聚体-1和乙锭同型二聚体-2，单叠氮化乙锭(ethidium monoazide)和ACMA，Hoechst 33258，Hoechst 33342，Hoechst 34580，DAPI，吖啶橙，7-AAD，放线菌素D，LDS751，羟茋巴脒(hydroxystilbamidine)，SYTOX蓝，SYTOX绿，SYTOX橙，POPO-1，POPO-3，YOYO-1，YOYO-3，TOTO-1，TOTO-3，JOJO-1，LOLO-1，BOBO-1，BOBO-3，PO-PRO-1，PO-PRO-3，BO-PRO-1，BO-PRO-3，TO-PRO-1，TO-PRO-3，TO-PRO-5，JO-PRO-1，LO-PRO-1，YO-PRO-1，YO-PRO-3，PicoGreen，OliGreen，RiboGreen，SYBR金，SYBR绿I，SYBR绿II，SYBR DX，SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)，SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)，SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)，SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)，罗丹明，四甲基罗丹明，R-藻红蛋白，VIC，NED，PET，Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7，德克萨斯红(Texas Red)，Phar-Red，别藻蓝蛋白(APC)，Sybr绿I，Sybr绿II，Sybr金，CellTracker绿，7-AAD，乙锭同型二聚体I，乙锭同型二聚体II，乙锭同型二聚体III，溴化乙锭，伞形酮，曙红，绿色荧光蛋白，赤藓红，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀绿，茋，荧光黄，级联蓝(cascade blue)，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯，荧光镧系络合物(如那些包括铕和铽的络合物)，羧基四氯荧光素(TET)，5和/或6-羧基荧光素(FAM)，5-(或6-)碘乙酰胺基荧光素，5-{[2(和3)-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)，丽丝胺罗丹明B磺酰氯，5-和/或6-羧基罗丹明(ROX)，5-和/或6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)，6-羧基-2’,4,4’,5’,7,7’-六氯荧光素(HEX)，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，BODIPY荧光团，8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺，藻胆蛋白，AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料，DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料，或其他荧光团。
在一些实施方案中，报告剂可以是在与扩增产物杂交时具有光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。由于探针与扩增产物的序列特异性结合，寡核苷酸探针的使用可提高检测的特异性和灵敏度。探针可连接至本文所述的任何光学活性报告剂(例如，染料)，并且还可包括能够阻断相关联的染料的光学活性的猝灭剂。可用作报告剂的探针的非限制性实例包括TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针或Lion探针。
在一些实施方案中，报告剂可以是在与扩增产物杂交时具有阻断的光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。在一些实施方案中，该寡核苷酸探针在其断裂时具有光学活性。例如，该报告剂可以是寡核苷酸探针，其包含相邻地位于探针上的光学活性染料(例如，荧光染料)和猝灭剂。染料与猝灭剂的紧密靠近可阻断染料的光学活性。探针可与待扩增的靶序列结合。一旦在扩增期间DNA聚合酶的外切核酸酶活性使探针断裂，则猝灭剂与染料分离，而游离的染料重新获得其光学活性，该活性随后可被检测到。该寡核苷酸探针可为RNA寡核苷酸探针或DNA寡核苷酸探针。
在一些实施方案中，报告剂可以是分子信标(molecular beacon)。分子信标包括，例如，在发夹构象的寡核苷酸的一端上连接的猝灭剂。在该寡核苷酸的另一端是光学活性染料，例如，荧光染料。在发夹构型中，光学活性染料和猝灭剂足够紧密地接近，使得猝灭剂能够阻断染料的光学活性。然而，一旦与扩增产物杂交，该寡核苷酸即呈线性构象并与该扩增产物上的靶序列杂交。寡核苷酸的线性化导致光学活性染料与猝灭剂的分离，从而使得光学活性恢复，并且可被检测到。分子信标对扩增产物上的靶序列的序列特异性可改善检测的特异性和灵敏度。
在一些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸探针或分子信标可为序列特异性寡核苷酸探针或序列特异性分子信标。在一些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸探针或分子信标与在能够特异性结合靶核酸的引物组中的引物之间的靶核酸上的区域杂交。当引物组用于扩增时，产生与引物(包括所述引物)之间的靶核酸上的区域相对应的扩增产物。因此，如本文所述的寡核苷酸探针或分子信标可与扩增产物杂交。例如，如本文所述的寡核苷酸探针或分子信标可与由靶核酸的扩增所产生的扩增产物杂交。
靶核酸可为靶RNA或靶DNA。在靶核酸为靶RNA的情况下，靶RNA可为任何类型的RNA，包括如本文其他地方所述的RNA类型。在一些实施方案中，靶RNA为mRNA。在一些实施方案中，靶RNA为沙门氏菌mRNA。在一些实施方案中，靶RNA可选自在沙门氏菌中具有高表达丰度的mRNA。在一些实施方案中，靶RNA选自ttr mRNA、invA mRNA、prgK mRNA、RpoS mRNA、RpoD mRNA及其组合。在一些实施方案中，靶RNA为invA mRNA。在靶核酸为靶DNA的情况下，靶DNA可为任何类型的DNA，包括如本文其他地方所述的DNA类型。在一些实施方案中，靶DNA为基因组DNA。在一些实施方案中，靶DNA为沙门氏菌基因组DNA。在一些实施方案中，靶DNA可选自对沙门氏菌特异和/或在沙门氏菌之间保守的基因。在一些实施方案中，靶DNA选自ttr基因、invA基因、prgK基因、RpoS基因、RpoD基因及其组合。在一些实施方案中，靶DNA为ttr基因。
在一些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸探针或分子信标可与由invA mRNA扩增所产生的扩增产物杂交。例如，该寡核苷酸探针或分子信标可包含如SEQ ID NO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)和/或SEQ ID NO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)所示的核酸序列。备选地或者附加地，如本文所述的寡核苷酸探针或分子信标可与由ttr基因扩增所产生的扩增产物杂交。例如，该寡核苷酸探针或分子信标可包含如SEQ ID NO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)所示的核酸序列。
在本发明的多个方面的任何方面，所述试剂可包含一种或多种寡核苷酸探针或分子信标。所述试剂可包含适用于进行核酸扩增的任意量的一种或多种寡核苷酸探针或分子信标。例如，所述试剂可包含少于0.01μM、0.01μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM、6.0μM、7.0μM、8.0μM、9.0μM、10.0μM、11.0μM、12.0μM、13.0μM、14.0μM、15.0μM，大于15.0μM的一种或多种寡核苷酸探针或分子信标，或者上述数值之间的任意浓度范围，如约0.01至10.0μM、0.05至5.0μM、0.05至4.0μM、0.05至3.0μM、0.05至2.0μM、0.05至1.0μM、0.05至0.5μM、0.1至5.0μM、0.1至4.0μM、0.1至3.0μM、0.1至2.0μM、0.1至1.0μM、0.1至0.9μM、0.1至0.8μM、0.1至0.7μM、0.1至0.6μM、0.1至0.5μM的一种或多字寡核苷酸探针或分子信标。在一个方面，所述试剂可包含约0.1至0.5μM的一种或多种寡核苷酸探针或分子信标。
在一些实施方案中，报告剂可以是放射性种类。放射性种类的非限制性实例包括14C、123I、124I、125I、131I、Tc99m、35S或3H。
在一些实施方案中，报告剂可以是能够产生可检测信号的酶。可检测信号可通过酶对其底物，或在酶具有多个底物的情况下对特定底物的活性来产生。可用作报告剂的酶的非限制性实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和萤光素酶。
在平行进行的扩增反应中，可采用多种报告剂来检测多种扩增产物。所述多种报告剂中的每一种均可产生可检测信号，而由所述多种报告剂所产生的多个可检测信号彼此互不相同。所述多个可检测信号中的每一个均可指示相应扩增产物的存在或不存在。所述多个可检测信号中的每一个的强度均可与相应扩增产物的量成比例。例如，对应于一种扩增产物的可检测信号可以是FAM荧光，而对应于另一种扩增产物的可检测信号可以是ROX荧光。平行地检测不同的可检测信号可允许比较不同扩增产物的存在和/或量。备选地或者附加地，平行地检测不同的可检测信号可允许确定扩增产物相对于内部参照物的量。
在本发明的多个方面的任何方面，所述试剂可进一步包含MgCl2。所述试剂可包含适用于进行核酸扩增的任意量的MgCl2。例如，所述试剂可包含少于约0.01mM、0.01mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、6.0mM、7.0mM、8.0mM、9.0mM、10.0mM、11.0mM、12.0mM、13.0mM、14.0mM、15.0mM，多于15.0mM的MgCl2，或者上述数值之间的任意浓度范围，如约0.01至15.0mM、0.05至14.0mM、0.1至13.0mM、0.2至12.0mM、0.3至11.0mM、0.4至10.0mM、0.5至9.0mM、0.6至8.0mM、0.7至7.0mM、0.8至6.0mM、0.9至5.0mM、1.0至4.0mM、1.1至3.0mM、1.2至2.5mM、1.3至2.0mM或1.4至1.6mM的MgCl2。在一个方面，所述试剂可包含约1.5mM MgCl2。
在本发明的多个方面的任何方面，所述试剂可进一步包含dNTP。所述试剂可包含适用于进行核酸扩增的任意量的dNTP。例如，所述试剂可包含少于约0.01mM、0.01mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、6.0mM、7.0mM、8.0mM、9.0mM、10.0mM、11.0mM、12.0mM、13.0mM、14.0mM、15.0mM，多于15.0mM的dNTP，或者上述数值之间的任意浓度范围，如约0.01至10.0mM、0.05至5.0mM、0.05至4.0mM、0.05至3.0mM、0.05至2.0mM、0.05至1.0mM、0.05至0.5mM、0.1至5.0mM、0.1至4.0mM、0.1至3.0mM、0.1至2.0mM、0.1至1.0mM、0.1至0.9mM、0.1至0.8mM、0.1至0.7mM、0.1至0.6mM、0.1至0.5mM的dNTP。在一个方面，所述试剂可包含约1.5mM dNTP。
在多个方面，可以检测扩增产物(例如，扩增的DNA产物、扩增的RNA产物)。扩增产物(包括扩增的DNA)的检测可采用任何合适的检测方法来实现。所使用的检测方法的具体类型可取决于，例如，具体的扩增产物，用于扩增的反应容器的类型，反应混合物中的其他试剂，报告剂是否包括在反应混合物中，以及在使用报告剂时所使用的报告剂的具体类型。检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测、电化学检测等。光学检测方法包括但不限于荧光测定法和紫外-可见光吸收。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(NMR)波谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳。电化学检测方法包括但不限于在扩增产物的高效液相色谱分离后对扩增产物的电化学检测。
在一些实施方案中，可在引物延伸反应中检测到扩增产物。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应中检测到扩增产物。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应的每个单个系列中检测到扩增产物。在一些实施方案中，可能在多个系列的引物延伸反应的一些单个系列中检测到扩增产物，而在其他单个系列中未检测到。例如，所述多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。可能在第一系列中未检测到扩增产物，而在第二系列中检测到。或者，可能在第二系列中未检测到扩增产物，而在第一系列中检测到。或者，可能在第一系列和第二系列中都检测到扩增产物，或者可能在第一系列或第二系列中均未检测到扩增产物。
在一些实施方案中，由报告剂产生的可检测信号可在引物延伸反应中检测到。在一些实施方案中，由报告剂产生的可检测信号可在多个系列的引物延伸反应中检测到。在一些实施方案中，由报告剂产生的可检测信号可在多个系列的引物延伸反应的每个单个系列中检测到。在一些实施方案中，由报告剂产生的可检测信号可能在多个系列的引物延伸反应的一些单个系列中检测到，而在其他单个系列中未检测到。例如，所述多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。由报告剂产生的可检测信号可能在第一系列中未检测到，而在第二系列中检测到。或者，由报告剂产生的可检测信号可能在第二系列中未检测到，而在第一系列中检测到。或者，由报告剂产生的可检测信号可能在第一系列和第二系列中都检测到，或者可能在第一系列或第二系列中均未检测到。
在所述多个方面的任何方面，完成方法的要素所需的时间可根据该方法的具体步骤而变化。例如，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟至约120分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟至约60分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟至约30分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可以小于或等于120分钟、小于或等于90分钟、小于或等于75分钟、小于或等于60分钟、小于或等于45分钟、小于或等于40分钟、小于或等于35分钟、小于或等于30分钟、小于或等于25分钟、小于或等于20分钟、小于或等于15分钟、小于或等于10分钟或者小于或等于5分钟。
在一些实施方案中，可将关于扩增产物(例如，扩增的DNA产物)的存在和/或量的信息输出至接收者。关于扩增产物的信息可经由各种途径输出。在一些实施方案中，此类信息可口头提供给接收者。在一些实施方案中，此类信息可在报告中提供。报告可包括任何数目的所需元素，该元素的非限制性实例包括关于受试者(例如，性别、年龄、种族、健康状况等)的原始数据、经处理的数据(例如，图形显示(例如，图、图表、数据表、数据汇总)、确定的循环阈值、靶多核苷酸起始量的计算值)的信息，关于是否存在靶核酸的结论，诊断信息，预后信息，疾病信息，等等，及其组合。该报告可作为打印的报告(例如，硬拷贝)提供，或者可作为电子报告提供。在一些实施方案(包括其中提供电子报告的情况)中，此类信息可经由诸如监视器或电视、可操作地与用于获得扩增产物的单元连接的屏、平板计算机屏、移动装置屏等电子显示器(例如，电子显示屏)输出。打印的报告和电子报告均可分别存储于文件或数据库中，使得它们可被访问以供与以后的报告进行比较。
此外，可使用任何合适的通信介质(包括，例如，网络连接、无线连接或因特网连接)将报告传送至本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，可将报告发送至接收者的装置，诸如个人计算机、电话、平板或其他装置。该报告可在线观看、保存在接收者的装置上或打印。还可通过用于传送信息的任何其他途径传送报告，该手段的非限制性实例包括邮寄硬拷贝报告供接收和/或接收者查看。
此外，可将此类信息输出至各种不同类型的接收者。此类接收者的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医师、治疗受试者的医师、用于临床试验的临床监视者、护士、研究人员、实验室技术员、制药公司的代表、医疗保健公司、生物技术公司、医院、人道援助组织、医疗保健管理者、电子系统(例如，存储例如受试者的医疗记录的一台或多台计算机和/或一台或多台计算机服务器)、公共卫生工作者、其他医务人员和其他医疗设施。
在多个方面，本发明进一步提供了用于执行如本文所述的方法的计算机辅助方法和系统。在所述多个方面的一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的计算机辅助方法。该计算机辅助方法可包括：(a)输入步骤，用于接收来自用户的处理生物样品以检测靶核酸分子的请求；(b)混合步骤，用于将该生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(c)孵育步骤，用于将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(d)添加步骤，用于将来自(c)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(e)反应步骤，用于使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在所述多个方面的一个方面，本发明提供了用于检测生物样品中的沙门氏菌的计算机辅助方法。该计算机辅助方法可包括：(a)输入步骤，用于接收来自用户的处理生物样品以检测该生物样品中的沙门氏菌的请求；(b)混合步骤，用于将该生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(c)孵育步骤，用于将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(d)添加步骤，用于将来自(c)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(e)反应步骤，用于使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该生物样品可为粪便样品。
除非明显与上述计算机辅助方法相矛盾，否则如本文所述的任何特征、实施方案、定义和限制都将适用于上述方法。
在所述多个方面的一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的计算机辅助系统。该计算机辅助系统可包括：(a)输入装置，用于接收来自用户的处理生物样品以检测靶核酸分子的请求；(b)混合装置，用于将该生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(c)孵育装置，用于将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(d)添加装置，用于将来自(c)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(e)反应装置，用于使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在所述多个方面的一个方面，本发明提供了用于检测生物样品中的沙门氏菌的计算机辅助系统。该计算机辅助系统可包括：(a)输入装置，用于接收来自用户的处理生物样品以检测该生物样品中的沙门氏菌的请求；(b)混合装置，用于将该生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(c)孵育装置，用于将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(d)添加装置，用于将来自(c)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(e)反应装置，用于使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该生物样品可为粪便样品。
除非明显与上述计算机辅助系统相矛盾，否则如本文所述的任何特征、实施方案、定义和限制都将适用于上述系统。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统。该系统可包括：输入单元，其接收来自用户的处理生物样品以检测靶核酸分子的请求；以及与该输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计以进行如本文所述的任何方法。在一个方面，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，从而：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将该混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶核酸分子。
在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统。该系统可包括：输入单元，其接收来自用户的处理生物样品以检测靶核酸分子的请求；以及与该输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，从而：(a)将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)在不超过约15分钟的时间段内在约15℃至70℃的温度下孵育该混合物；(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(在一些情况下)逆转录酶，以及(ii)针对靶核酸分子的引物组；以及(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在一个方面，本发明提供了用于检测粪便样品中的沙门氏菌的系统。该系统可包括：输入单元，其接收来自用户的处理所述生物样品以检测所述生物样品中的沙门氏菌的请求；以及与所述输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，从而：(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该生物样品可为粪便样品。
除非明显与上述系统相矛盾，否则如本文所述的任何特征、实施方案、定义和限制都将适用于所述系统。
本发明的系统可进一步包括将生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物的生物样品处理模块。该生物样品处理模块可孵育该混合物。例如，该生物样品处理模块可包括能够将生物样品与裂解缓冲液的混合物在约10℃至75℃的温度下(例如，在约10℃至70℃、约15℃至65℃、约15℃至60℃、约15℃至55℃、约20℃至50℃、约20℃至45℃、约20℃至40℃、约20℃至35℃、约20℃至30℃、约20℃至25℃或约25℃至30℃的温度下)孵育的加热块或培养箱。
或者，所述生物样品处理模块可包括加热块或培养箱，该加热块或培养箱能够在高于15℃的温度下，例如在高于约20℃、高于约25℃、高于约30℃、高于约35℃、高于约40℃、高于约45℃、高于约50℃、高于约55℃、高于约60℃、高于约65℃、高于约70℃、高于约75℃、高于约80℃、高于约85℃、高于约90℃、高于约91℃、高于约92℃、高于约93℃、高于约94℃、高于约95℃、高于约96℃、高于约97℃、高于约98℃、高于约99℃、高于约100℃的温度下，或在约15℃至95℃的温度下，例如在约20℃至90℃、约25℃至85℃、约30℃至80℃、约40℃至70℃、约40℃至95℃、约45℃至90℃、约50℃至85℃、约55℃至80℃、约60℃至75℃、约65℃至75℃或约65℃至70℃的温度下孵育生物样品与裂解缓冲液的混合物。
所述生物样品处理模块可以能够将生物样品与裂解缓冲液的混合物孵育不超过约20分钟的时间段。例如，(b)中的时间段可以不超过约19分钟，不超过约18分钟、不超过约17分钟、不超过约16分钟、不超过约15分钟、不超过约14分钟、不超过约13分钟、不超过约12分钟、不超过约11分钟、不超过约10分钟、不超过约9分钟、不超过约8分钟、不超过约7分钟、不超过约6分钟、不超过约5分钟、不超过约4分钟、不超过约3分钟、不超过约2分钟、不超过约1分钟、不超过约50秒、不超过约40秒、不超过约30秒、不超过约20秒、不超过约15秒，或不超过约10秒。
所述生物样品处理模块可以能够在高于约40℃的温度，例如，高于约45℃、高于约50℃、高于约55℃、高于约60℃、高于约65℃、高于约70℃、高于约75℃、高于约80℃、高于约85℃、高于约90℃、高于约91℃、高于约92℃、高于约93℃、高于约94℃、高于约95℃、高于约96℃、高于约97℃、高于约98℃、高于约99℃或高于约100℃的温度下孵育匀质化制品。
本发明的系统可进一步包括与生物样品处理模块可操作地耦合的扩增模块，其中该扩增模块(i)将一定量的混合物从生物样品处理模块添加至反应容器中，并且(ii)使反应容器中的反应混合物经历引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物。
或者，可将混合物手动添加至反应容器中，并且所述扩增模块可使反应容器中的反应混合物经历引物延伸反应，以生成指示存在靶核酸分子的扩增产物。
在一些实施方案中，一旦识别关于用于进行引物延伸反应的一个或多个相关参数的信息，所述扩增模块可自动地使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在样品中存在靶核酸的扩增产物，所述信息包含在与所述系统结合使用的试剂盒中。如本文其他地方所述，该信息可被与扩增模块进行通信的识别模块识别。
本发明的系统可进一步包括与一个或多个计算机处理器可操作地耦合的输出模块，其中该输出模块将关于靶核酸分子或扩增的DNA产物的信息输出至接收者。
在本发明的系统中，在将生物样品与裂解缓冲液混合之前，可将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计以将该生物样品悬浮于溶液中，从而获得包含该生物样品的匀质化制品。在一些实施方案中，可将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计以使生物样品经历离心，从而产生沉淀和包含该生物样品的溶液，或者产生上清液和包含该生物样品的沉淀。
在一些实施方案中，在将生物样品与裂解缓冲液的混合物孵育后，可将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计以使该混合物经历离心，从而产生包含该生物样品的上清液。然后，该上清液可作为后续步骤中的混合物。例如，可将该上清液添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中。
在本发明的系统中，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计以培养生物样品以供微生物增殖。在一些实施方案中，在将生物样品与裂解缓冲液混合之前，可将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计以使该生物样品经受富集培养条件，持续一个培养时间段。该富集培养条件可包括在振摇或不振摇的情况下，在合适的温度(例如，23℃至40℃，如25℃、30℃、35℃或37℃)下，在合适的培养基(例如，胰蛋白酶大豆培养液、改良的胰蛋白酶大豆培养液、胰蛋白胨、营养培养液、L-培养液、革兰氏阴性培养液、蛋白胨、具有酵母的胰蛋白胨大豆培养液或沙门氏菌培养基)中培养生物样品。在一些实施方案中，该培养基为与其他细菌相比更有利于沙门氏菌增殖的沙门氏菌培养基。示例性沙门氏菌培养基包括亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(XLD)、亚硒酸盐亮绿磺胺培养基(SBG)，但不限于此。培养时间段可为约0.5小时至5小时，例如，约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时或约10小时。在一些实施方案中，培养时间段不超过约7小时，例如，不超过约6.5小时、不超过约6小时、不超过约5.5小时、不超过约5小时、不超过约4.5小时、不超过约4小时、不超过约3.5小时、不超过约3小时、不超过约2.5小时、不超过约2小时、不超过约1.5小时、不超过约1小时或不超过约0.5小时。
在一些实施方案中，在使生物样品经受富集培养条件持续一个培养时间段之前和/或之后，将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计以使生物样品经历离心，从而产生沉淀和包含该生物样品的溶液，或者产生上清液和包含该生物样品的沉淀。
在一些实施方案中，在使生物样品经受富集培养条件持续一个培养时间段之后，将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计，以在没有选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下将该生物样品与裂解缓冲液混合。
在一些实施方案中，在生物样品经受富集培养条件持续一个培养时间段之后，可将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计，以将裂解缓冲液添加至混合物。该裂解缓冲液可以是碱性的。例如，该裂解缓冲液包含NaOH。该裂解缓冲液可具有约7至14，如约8至13、约9至12、约10至11的pH。例如，该裂解缓冲液可具有约7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5或14的pH。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以将生物样品与裂解缓冲液的混合物在未经历DNA或RNA提取的情况下添加至反应容器中。在一些情况下，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以将生物样品与裂解缓冲液的混合物在未经纯化的情况下添加至反应容器中。在一些情况下，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以将生物样品与裂解缓冲液的混合物在未经历DNA或RNA浓缩的情况下添加至反应容器中。该反应容器可以是包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以将从受试者获得的生物样品或如本文其他地方所述的从该生物样品衍生的混合物、上清液或匀质化制品与进行核酸扩增所必需的试剂一起提供至反应容器中以获得反应混合物。该反应容器可以是如本文所述的任何反应容器。
本发明的系统可进一步包括用于识别信息的识别模块，该信息包含在与根据本发明的系统结合使用的试剂盒中。例如，该试剂盒可用独特标识符进行标记。该独特标识符可以是条形码。该条形码可以是一维或二维条形码。该条形码可允许通过扫描从试剂盒提取信息。该独特标识符可涉及非接触式技术。非接触式技术允许通过将试剂盒放置在非接触式检测器附近来提取试剂盒上的信息。非接触式检测器可使用RFID(射频识别)技术来从试剂盒提取信息。在一些实施方案中，该独特标识符可以是RFID标签。
在一些实施方案中，所述识别模块可包含用于扫描试剂盒上的条形码以提取信息的条形码扫描模块。在一些实施方案中，该识别模块可包含用于使用RFID技术从试剂盒提取信息的RFID模块(例如，非接触式检测器)。在一些实施方案中，该识别模块包含条形码扫描模块和RFID模块二者。
所述识别模块可以与如本文所述的一个或多个其他模块可操作地连接或通信，从而将提取到的信息传送至一个或多个其他模块。该信息可以是关于进行引物延伸反应的相关参数。例如，该识别模块可与扩增模块进行通信，从而将相关参数传送至扩增模块，以供进行引物延伸反应。一旦接收该参数，该扩增模块可自动地根据该参数进行引物延伸反应。该参数可以是例如引物延伸反应的系列数目、每个系列中的循环数、变性条件、延伸条件、一个或多个引物组、报告剂、寡核苷酸探针，等等，但不限于此。
在本发明的系统中，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计以检测扩增产物的量和/或存在。在一些情况下，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计以向接收者输出指示所述扩增产物的量和/或存在的信息。
本发明的系统可进一步包括用于检测扩增产物的量和/或存在的检测模块。该检测模块可使用如本文所述的任何检测方法来检测扩增产物的量和/或存在。例如，该检测模块可检测在扩增期间产生的可检测信号。例如，该检测模块可检测由如本文所述的报告剂产生的可检测信号。可检测信号可指示扩增产物是否存在。例如，可检测信号的存在或不存在可指示扩增产物是否存在。可检测信号的强度可与扩增产物的量成比例。在一些情况下，当扩增产物由与最初扩增的靶核酸不同类型的核酸所生成时，可检测信号的强度可与最初扩增的靶核酸的量成比例。
在一些实施方案中，所述检测模块可以是光学检测模块。该光学检测模块可检测在扩增期间产生的光学信号。该光学信号可以是由如本文所述的任何光学活性染料产生的光学信号。例如，该光学信号可以是伴随产生扩增产物的光学信号。例如，该光学信号可以是寡核苷酸探针在断裂时所产生的光学信号。例如，该光学信号可以是分子信标与扩增产物杂交时所产生的光学信号。
在一些实施方案中，所述光学信号可以是荧光信号，而所述检测模块可以是荧光检测模块。例如，该荧光检测模块可检测由如本文所述的任何荧光染料产生的荧光信号。例如，该荧光检测模块可检测由选自FAM、TET、ROX、JOE、HEX、TAMRA、VIC、NET、PET、德克萨斯红等的一种或多种荧光染料所产生的荧光信号。
在一些实施方案中，所述检测模块可平行地检测多个可检测信号。例如，所述多个可检测信号由多种报告剂产生，而由所述多种报告剂产生的多个可检测信号彼此互不相同。所述多个可检测信号中的每一个均可指示相应扩增产物的存在或不存在。所述多个可检测信号中的每一个的强度可与相应扩增产物的量成比例。例如，所述检测模块可平行地检测FAM荧光和ROX荧光。在这样的情况下，对应于一种扩增产物的可检测信号可以是FAM荧光，而对应于另一种扩增产物的可检测信号可以是ROX荧光，从而能够平行地检测不同的可检测信号。平行地检测不同的可检测信号可允许比较不同扩增产物的存在和/或量。备选地或者附加地，平行地检测不同的可检测信号可允许确定扩增产物相对于内部参照物的量。
在一些情况下，在进行引物延伸反应之前，可将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计，以使靶核酸分子经受一种或多种变性条件。所述一种或多种变性条件可选自变性温度分布和变性剂。
在一些情况下，在进行引物延伸反应之前，可将所述一个或多个计算机处理器单独或共同地程序设计，以将生物样品在约90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过约10分钟的预加热持续时间。在一些实施方案中，预加热持续时间不超过1分钟。
在所述多个方面的任何方面，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以进行多个循环的引物延伸反应。可进行任何合适数目的循环。例如，进行的循环数可少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以使反应混合物经历多个系列的引物延伸反应。所述多个系列中的单个系列可包括例如以如本文其他地方所述的特定变性和延伸条件为特征的多个循环的特定引物延伸反应。通常，例如，就变性条件和/或延伸条件而言，每个单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。例如，就斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的任意一个、两个、三个、四个或全部五个而言，单个系列可不同于所述多个系列中的另一个单个系列。此外，多个系列可包括任何数目的单个系列，例如，至少约或约为2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个单个系列。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，以使靶核酸分子在所述多个系列的引物延伸反应的第一系列与第二系列之间经受一种或多种变性条件。就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个(例如，至少任意两个)而言，单个系列可以是不同的。此外，所述多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。例如，该第一系列可包括超过十个循环，其中该第一系列的每个循环均包括(i)将反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃-65℃下孵育不超过1分钟。该第二系列可包括超过十个循环，其中该第二系列的每个循环均包括(i)将反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃-60℃下孵育不超过1分钟。
例如，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以进行包括第一系列和第二系列的多个系列的引物延伸反应。第一系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃至约65℃下孵育不超过约一分钟。第二系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃至约60℃下孵育不超过约1分钟。在这一具体实例中，第一和第二系列在它们的延伸温度条件上不同。然而，该实例并非意在限制，因为可以使用不同延伸和变性条件的任意组合。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以使靶核酸在引物延伸反应启动之前经受变性条件。在多个系列的引物延伸反应的情况下，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以在执行所述多个系列之前使靶核酸经受变性条件，或者在所述多个系列之间使靶核酸经受变性条件。例如，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以使靶核酸在所述多个系列的第一系列与第二系列之间经受变性条件。此类变性条件的非限制性实例包括变性温度分布(例如，一个或多个变性温度)和变性剂。
在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可被单独或共同地程序设计，以在进行引物延伸反应之前预加热生物样品。预加热生物样品的温度(例如，预加热温度)和持续时间(例如，预加热持续时间)可根据例如所分析的具体生物样品而变化。在一些实例中，可将生物样品预加热不超过约60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、15秒、10秒或5秒。在一些实例中，可在约80℃至约110℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约100℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约97℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约92℃至约95℃的温度下预加热生物样品。在另外其他的实例中，可在约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃的温度下预加热生物样品。
在一些实施方案中，本发明的系统包括具有显示图形元素的用户界面的电子显示屏，该图形元素可被用户访问，以执行用以扩增生物样品中的靶核酸的扩增方案。该系统还可包含计算机处理器(包括如本文其他地方所述的具有计算机处理器的任何适宜的装置)，其耦合至该电子显示屏并被程序设计为在用户选择所述图形元素时执行该扩增方案。该扩增方案可包括：使包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成扩增产物。该扩增产物可指示生物样品中存在靶核酸。此外，每个系列的引物延伸反应可包括两个或更多个如下的循环：在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物。就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列可不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
在一些实施方案中，靶核酸可与疾病相关。例如，该疾病可与RNA病毒或DNA病毒相关。病毒的实例在本文其他地方提供(例如，柯萨奇病毒A16)。在一些实施方案中，该疾病可与本说明书中其他地方描述的致病细菌(如，结核分枝杆菌或沙门氏菌)或致病原生动物(例如，疟疾中的疟原虫)相关。在一些实施方案中，该扩增方案可涉及基于扩增产物的存在来分析所述疾病的存在。
在一些情况下，用户界面可以是图形用户界面。此外，用户界面可包括一个或多个图形元素。图形元素可包括图像和/或文本信息，如图片、图标和文本。图形元素在用户界面上可具有不同的尺寸和方向。此外，电子显示屏可以是任何适宜的电子显示器，包括本文其他地方描述的实例。电子显示屏的非限制性实例包括监视器、移动装置屏、膝上型计算机屏、电视、便携式视频游戏系统屏和计算器屏。在一些实施方案中，电子显示屏可包括触摸屏(例如，电容式或电阻式触摸屏)，使得在电子显示屏的用户界面上显示的图形元素可经由用户触摸电子显示屏来选择。
在一些实施方案中，所述扩增方案可进一步包括为靶核酸选择引物组。在这类情况下，该引物组可以是为扩增靶核酸分子的一个或多个序列而特别设计的引物组。在一些实施方案中，该扩增方案可进一步包括选择对靶核酸分子的一个或多个序列具有特异性的报告剂(例如，包含光学活性种类的寡核苷酸探针或本文其他地方所述的其他类型的报告剂)。此外，在一些实施方案中，该试剂可包括如本文其他地方所述的对于核酸扩增所必需的任何适宜的试剂，例如脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、针对靶核酸的引物组以及(在一些情况下)逆转录酶。
在一些实施方案中，所述用户界面可显示多个图形元素。每个图形元素可与多个扩增方案中的给定扩增方案相关联。所述多个扩增方案中的每个方案可包括系列引物延伸反应的不同组合。然而，在一些情况下，用户界面可显示与同一扩增方案相关联的多个图形元素。具有多个各自与给定扩增方案相关联的图形元素的用户界面的实例示于图28A中。如图28A所示，与计算机处理器相关联的示例性电子显示屏2800包括用户界面2801。用户界面2801包括图形元素2802、2803和2804的显示。各个图形元素图形元素可与特定的扩增方案相关联(例如，“方案1(Prot.1)”针对图形元素2802，“方案2(Prot.2)”针对图形元素2803以及“方案4(Prot.4)”针对图形元素2804)。一旦用户选择(例如，当电子显示屏2800包括具有用户界面的触摸屏时，用户触摸)特定的图形元素，与该图形元素相关联的特定扩增方案即可由关联的计算机处理器来执行。例如，当用户选择图形元素2803时，由关联的计算机处理器来执行扩增“方案2”。尽管在图28A的示例性用户界面2801中仅示出三个图形元素，但用户界面可具有任何适当数目的图形元素。此外，尽管图28A的用户界面2801中显示的每个图形元素仅与一个扩增方案相关联，但用户界面的每个图形元素可与一个或多个扩增方案(例如，一系列的扩增方案)相关联，使得关联的计算机处理器在用户与图形元素交互后执行一系列的扩增方案。
在一些实施方案中，每个图形元素和/或可与疾病相关联，并且所述多个扩增方案中的给定扩增方案可指向测定受试者的疾病的存在。因此，在这样的情况下，用户可选择图形元素以便运行一个扩增方案(或一系列的扩增方案)从而分析特定的疾病。在一些实施方案中，该疾病可与病毒(例如，任何RNA病毒或DNA病毒，包括本文其他地方描述的此类病毒的实例)相关。病毒的非限制性实例包括人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIVII)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒或H5N1病毒)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV))、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒(ADV55)、7型腺病毒(ADV7))、水痘病毒、肠病毒和诺如病毒。在一些实施方案中，该疾病可与致病细菌(例如，结核分枝杆菌)或致病原生动物(例如，疟疾中的疟原虫)(包括本文其他地方描述的此类病原体的实例)相关。
具有多个各自与给定扩增方案相关联的图形元素的用户界面的实例示于图28B中。如图28B所示，与计算机处理器相关联的示例性电子显示屏2810包括用户界面2811。用户界面2811包括图形元素2812、2813和2814的显示。各个图形元素可与特定的疾病相关联(例如，图形元素2812对应“埃博拉”，图形元素2813对应“H1N1”，以及图形元素2814对应“Hep C(丙型肝炎)”)，该疾病又与一个或多个指向特定疾病的扩增方案相关联。一旦用户选择(例如，当电子显示屏2810包括具有用户界面的触摸屏时，用户触摸)特定的图形元素，与关联于该图形元素的该疾病相关联的特定扩增方案即可由关联的计算机处理器来执行。例如，当用户与图形元素2812交互时，由关联的计算机处理器来执行一个或多个与分析埃博拉病毒相关联的扩增方案。尽管在图28B的示例性用户界面2811中仅示出三个图形元素，但用户界面可具有各自对应于各种疾病的任何适当数目的图形元素。此外，尽管图28B的用户界面2811中显示的每个图形元素仅与一种疾病相关联，但用户界面的每个图形元素可与一种或多种疾病相关联，使得关联的计算机处理器在用户选择该图形元素时执行一系列的扩增方案(例如，各单个扩增方案指向特定疾病)。例如，图形元素可对应于埃博拉病毒和H1N1病毒，使得该图形元素的选择导致关联的计算机处理器执行针对埃博拉病毒和H1N1病毒两者的扩增方案。
在多个方面，所述系统可包括输入模块，该输入模块接收扩增存在于生物样品中的靶核酸(例如，靶RNA、靶DNA)的用户请求。该生物样品可从受试者直接获得。可使用能够接收此类用户请求的任何合适的模块。该输入模块可包括，例如，包含一个或多个处理器的装置。包含处理器(例如，计算机处理器)的装置的非限制性实例包括：台式计算机、膝上型计算机、平板计算机(例如，iPad、Galaxy Tab)、蜂窝电话、智能电话(例如，iPhone、支持的电话)、个人数字助理(PDA)、视频游戏控制面板、电视、音乐播放设备(例如，iPod)、视频播放设备、寻呼机和计算器。处理器可与一个或多个控制器、计算单元和/或计算机系统的其他单元相关联，或者在需要时植入固件中。如果在软件中实施，则例程(或程序)可存储于任何计算机可读存储器如RAM、ROM、闪速存储器、磁盘、激光盘或其他存储介质中。同样地，该软件可经由传送方法输送到装置，该方法包括，例如，经通信信道，如电话线、因特网、本地内部网络、无线连接等，或者经由便携式介质，如计算机可读磁盘、闪盘驱动器等。各个步骤可作为各种区组、操作、工具、模块或技术来实施，后者又可以在硬件、固件、软件或其任意组合中实施。当在硬件中实施时，这些区组、操作、技术等中的一些或全部可在例如定制集成电路(IC)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程逻辑阵列(FPGA)、可编程逻辑阵列(PLA)等中实施。
在一些实施方案中，所述输入模块被配置成接收进行靶核酸扩增的用户请求。该输入模块可直接地(例如，通过输入设备，诸如由用户操作的键盘、鼠标或触摸屏)或间接地(例如，通过有线或无线连接，包括经因特网)接收用户请求。该输入模块可经由输出电子器件向扩增模块提供用户的请求。在一些实施方案中，输入模块可包括用户界面(UI)，如图形用户界面(GUI)，该用户界面被配置成能够使用户提供扩增靶核酸的请求。GUI可包括文本、图形和/或音频成分。GUI可在电子显示器上提供，该电子显示器包括含有计算机处理器的装置的显示器。此类显示器可包括电阻式或电容式触摸屏。
用户的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医务人员、临床医生(例如，医生、护士、实验室技术员)、实验室人员(例如，医院实验室技术人员、研究科学家、药学科学家)、临床试验的临床监视者，或医疗保健行业中的其他用户等。
在多个方面，所述系统包括扩增模块，该扩增模块用于响应于由输入模块接收的用户请求而对靶核酸或其部分进行核酸扩增反应。该扩增模块可以能够执行本文所述的任何方法，并且可包括流体处理装置、一个或多个热循环仪、用于接纳一个或多个反应容器(例如，热循环的热块的孔)的装置或模块、能够检测扩增产物的检测器(例如，光学检测器、光谱检测器、电化学检测器)以及用于向接收者输出关于扩增产物(例如，扩增的DNA产物)的存在和/或量的信息(例如，原始数据，经处理的数据或本文所述的任何其他类型的信息)的装置或模块中的任何装置。在一些情况下，该扩增模块可包括具有如本文其他地方所述的计算机处理器的装置，并且还可以能够在适宜软件的辅助下分析自检测获得的原始数据。此外，在一些实施方案中，该扩增模块可包括从输入模块接收指令所必需的输入电子器件并且可包括与输出模块进行通信所必需的输出电子器件。
在一些实施方案中，向反应容器提供材料、扩增核酸、检测扩增产物和输出信息的一个或多个步骤可由扩增模块自动化操作。在一些实施方案中，自动化操作可包括使用一个或多个流体处理器和相关联的软件。可采用若干可商购的流体处理系统来运行这类过程的自动化操作。此类流体处理器的非限制性实例包括来自Perkin-Elmer、Caliper LifeSciences、Tecan、Eppendorf、Apricot Design和Velocity 11的流体处理器。
在一些实施方案中，扩增模块可包括实时检测仪器。此类仪器的非限制性实例包括实时PCR热循环仪、ABI 7000序列检测系统、ABI 7700序列检测系统、Applied Biosystems 7300实时PCR系统、Applied Biosystems 7500实时PCR系统、Applied Biosystems 7900 HT快速实时PCR系统(均来自Applied Biosystems)；LightCyclerTM系统(Roche Diagnostics GmbH)；Mx3000PTM实时PCR系统、Mx3005PTM实时PCR系统和多重定量PCR系统(Multiplex Quantitative PCR System)(Stratagene,La Jolla,Calif.)；以及智能循环仪系统(Smart Cycler System)(Cepheid，由Fisher Scientific分销)。在一些实施方案中，扩增模块可包括另一种自动化仪器，例如，AmpliPrep/系统(Roche Molecular Systems)、TIGRIS DTS系统(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、PANTHER系统(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、BD MAXTM系统(Becton Dickinson)、GeneXpert系统(Cepheid)、(BioFire Diagnostics)系统、iCubate系统、IDBox系统(Luminex)、EncompassMDxTM(Rheonix)系统、LiatTM Aanlyzer(IQuum)系统、Biocartis的MolecularDiagnostic Platform系统、ML系统(Enigma Diagnostics)、系统(T2Biosystems)、系统(NanoSphere)、Great Basin的Diagnostic System、UnyveroTM系统(Curetis)、PanNAT系统(Micronics)或SpartanTMRX系统(SpartanBioscience)。
在多个方面，所述系统可包括可操作地连接至扩增模块的输出模块。在一些实施方案中，该输出模块可包含具有如上所述的用于输入模块的处理器的装置。该输出模块可包括如本文所述的输入设备，并且/或者可包括用于与扩增模块进行通信的输入电子器件。在一些实施方案中，该输出模块可以是电子显示器，在一些情况下，该电子显示器包括UI。在一些实施方案中，该输出模块是可操作地耦合至计算机网络如因特网的通信接口。在一些实施方案中，该输出模块可使用任何合适的通信媒介(包括计算机网络、无线网络、本地内部网络或因特网)将信息传送至处于本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，该输出模块能够分析从扩增模块接收到的数据。在一些情况下，该输出模块包括能够生成报告并将报告传送至接收者的报告生成器，其中该报告包含如本文其他地方所述的关于扩增产物的量和/或存在的任何信息。在一些实施方案中，该输出模块可响应于从扩增模块接收到的信息自动地传送信息，例如以原始数据或由包含在扩增模块中的软件进行的数据分析的形式。或者，该输出模块可在接收用户指令后传送信息。由输出模块传送的信息可以经电子方式进行查看或者由打印机打印出来。
输入模块、生物样品处理模块、识别模块、检测模块、扩增模块和输出模块中的一种或多种可包含在同一装置中，或者可包含一种或多种相同的组件。例如，扩增模块也可包含输入模块、生物样品处理模块、识别模块、检测模块、输出模块或它们中的两个或更多个都包含。在其他实例中，包含处理器的装置既可包含在输入模块中也可包含在输出模块中。用户可使用该装置来请求对靶核酸进行扩增，并且也可使用该装置将关于扩增产物的信息传送至接收者。在一些情况下，包含处理器的装置可包含在全部六种模块中，使得该包含处理器的装置也可用于控制包含在扩增模块或任何其他模块中的仪器(例如，热循环仪、检测器、培养箱、流体处理装置)，对该仪器提供指令，并接收从该仪器返回的信息。这六种模块中的每一种均可进一步包含如本文所述的一个或多个计算机处理器中的任一个，并且/或者可执行所述一个或多个计算机处理器被程序设计以供执行的功能。
用于根据本文所述方法扩增靶核酸的示例性系统示于图1中。该系统包括既可充当输入模块的一部分又可充当输出模块的一部分的计算机101。用户将包含准备进行核酸扩增的反应混合物的反应容器102放入扩增模块104中。该扩增模块包括热循环仪105和检测器106。输入模块107包括计算机101和相关的输入设备103(例如，键盘、鼠标等)，输入设备103可以接收用户对反应混合物中的靶核酸进行扩增的请求。输入模块107将用户的请求通信至扩增模块104，并且核酸扩增在热循环仪105中开始。随着扩增进行，扩增模块的检测器106对扩增产物进行检测。关于扩增产物的信息(例如，由检测器获得的原始数据)从检测器106传送回计算机101，计算机101也充当输出模块108的组件。计算机101接收来自扩增模块104的信息，对该信息进行任何额外的操作，随后生成包含经处理的信息的报告。一旦报告生成，计算机101随后经由计算机网络接口110通过计算机网络(例如，内部网络、因特网)、经由打印机111以硬拷贝形式或者经由可操作地连接至计算机101的电子显示器112将报告传送至其最终接收者109。
在另一个方面，本发明提供了一种用于本发明的目的，例如，用于进行本发明方法的试剂盒。根据本发明的多个方面的任何方面，该试剂盒可包含任意组合的一个或多个元素。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的试剂盒。该试剂盒包含：
(a)一个或多个针对所述靶核酸分子的引物组；
(b)进行核酸扩增所必需的酶，如脱氧核糖核酸(DNA)聚合物和可选的逆转录酶；
(c)进行核酸扩增所必需的缓冲液；
(d)能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物，如dNTP；以及
(e)可选的报告剂，如产生指示存在核酸扩增的扩增产物的可检测信号的报告剂，
所述试剂盒可进一步包含阴性对照、阳性对照和/或内部参照物或用于定量的其他参照物。
所述一个或多个引物组、进行核酸扩增所必需的酶、进行核酸扩增所必需的缓冲液、报告剂、核苷酸及其类似物、阴性对照、阳性对照、内部参照物或用于定量的其他参照物可以是如本文其他地方所述的那些中的任一种。所述试剂盒可进一步包含进行核酸扩增所必需的其他试剂。进行核酸扩增所必需的试剂可以是如本文其他地方所述的那些中的任何试剂。该试剂盒可进一步包含如本文其他地方所述的用于处理、预处理、培养、富集或鉴定任何样品的任何试剂、缓冲液或其他物质，包括如本文所述的那些试剂、缓冲液或其他物质中的任一种。例如，该试剂盒可包含如本文所述的悬浮缓冲液、裂解缓冲液，等等。
试剂盒中的试剂或其他物质可提供在任何合适的容器中，包括但不限于试管、小瓶、烧瓶、瓶子、安瓿、注射器等。这些试剂或其他物质可以以可准备好用于本发明方法的形式提供，或者以需要在使用前与试剂盒中的其他试剂或由用户提供的试剂进行组合的形式(例如，浓缩组合物的稀释或冻干组合物的重建)提供。可在试剂盒中提供的缓冲液包括但不限于盐水、NaOH溶液、碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液，如本文其他地方所述的任何其他缓冲液，或它们的组合。该试剂盒可包含对照样品，例如，纯化的DNA，其用于物种和量/浓度已知的微生物，和/或用作阳性对照、内部参照物或用于定量的其他参照物，以及已知对核酸扩增不敏感的阴性对照。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含关于根据本发明的一种或多种方法使用该试剂盒的说明书。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于检测生物样品中的沙门氏菌的试剂盒。该生物样品可为粪便样品。该试剂盒可包含：
(a)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合，以供在扩增反应中扩增靶核酸序列以获得扩增产物，
(b)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，
(c)用于核酸扩增的缓冲液，
(d)能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物，
(e)可选的报告剂，其产生指示存在扩增产物的可检测信号，以及
(f)可选的关于使用所述一个或多个引物组、DNA聚合酶和核苷酸及其类似物进行核酸扩增以检测生物样品中的沙门氏菌的说明书。
在一些实施方案中，能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物为dNTP。
所述一个或多个引物组可包含正向引物。该正向引物可选自SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)、SEQ ID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)和SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)。所述一个或多个引物组可包含反向引物。该反向引物可选自SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)、SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)和SEQ IDNO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)。
所述一个或多个引物组可包括由如SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物组成的引物组。备选地或者附加地，所述一个或多个引物组可包括由如SEQ ID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物组成的引物组。备选地或者附加地，所述一个或多个引物组可包括由如SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物组成的引物组。
在一些实施方案中，所述报告剂可以是序列特异性寡核苷酸探针。该序列特异性寡核苷酸探针可包含选自SEQ ID NO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)、SEQ ID NO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)和SEQ ID NO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)的核酸序列。
在一些实施方案中，使用所述试剂盒的方法可包括如本文所述的任何方法。例如，该试剂盒可用于检测生物样品中的沙门氏菌，其包括：
(a)将粪便样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将该混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；
(c)将来自(b)的混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，该试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及
(d)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在该样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就该变性条件和/或该延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。该生物样品可为粪便样品。
在一些实施方案中，所述试剂盒可进一步用独特标识符标记。该独特标识符可以是条形码。该条形码可以是一维或二维条形码。该条形码可允许通过扫描从试剂盒提取信息。该独特标识符可涉及非接触式技术。非接触式技术允许通过将试剂盒放置在非接触式检测器附近来提取试剂盒上的信息。非接触式检测器可使用RFID(射频识别)技术来从试剂盒提取信息。在一些实施方案中，该独特标识符可以是RFID标签。
所述信息可以是关于试剂盒组分的信息。所述信息可以是关于使用试剂盒的方法的信息。所述信息可以是关于如本文所述的任何方法、系统、元素、试剂、试剂盒、计算机辅助方法和系统、生物样品和/或各种物质的信息。
在一些实施方案中，本文所述的系统可通过识别试剂盒上的独特标识符来从该试剂盒提取信息。例如，本文所述的系统可通过扫描试剂盒上的条形码或使用RFID技术来从该试剂盒提取信息(例如，通过识别模块)。
一旦提取到试剂盒上的信息，本文所述的系统可根据该信息自动执行本文所述的方法。在一些实施方案中，该信息涉及本文所述方法的元素。在一些实施方案中，该信息涉及样品预处理、培养或处理。例如，该信息可涉及孵育温度、孵育时间段、悬浮缓冲液、裂解缓冲液、处理持续时间、处理条件，但不限于此。在一些实施方案中，该信息涉及用于进行本文所述的引物延伸反应的参数。例如，该信息可涉及引物延伸反应的系列数目、每个系列中的循环数、变性条件、延伸条件、一个或多个引物组、报告剂、寡核苷酸探针或其组合，但不限于此。在一些实施方案中，该信息允许本文所述的系统在没有人为干预的情况下自动执行本文所述的方法。
在另一个方面，本发明提供了试剂在制备用于检测生物样品中的靶核酸分子的试剂盒中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了试剂在制备用于检测生物样品中的沙门氏菌的试剂盒中的用途。该生物样品可为粪便样品。该试剂可以是如本文所述的任何试剂或物质。在一些情况下，该试剂为如本文所述的引物组。例如，该试剂可以是能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组。
在另一个方面，本发明提供了一种用于本发明的目的，例如，用于进行本发明的方法的反应混合物。根据本发明的多个方面的任何方面，该反应混合物可包含任意组合的一个或多个元素。
在一些实施方案中，本发明提供了一种反应混合物，其包含：
(a)生物物质；
(b)一个或多个针对靶核酸分子的引物组；
(c)进行核酸扩增所必需的酶，如脱氧核糖核酸(DNA)聚合物和可选的逆转录酶；
(d)可选的进行核酸扩增所必需的缓冲液；
(e)能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物，如dNTP；以及
(f)可选的报告剂，如产生指示存在核酸扩增的扩增产物的可检测信号的报告剂。
在一些实施方案中，所述生物物质可以是如本文所述的生物样品。该生物样品可以是已经根据本发明的方法处理的生物样品。例如，生物样品可悬浮于悬浮缓冲液中。生物样品可与裂解缓冲液混合。例如，生物样品可与裂解缓冲液混合，随后如本文所述在孵育温度下孵育一个孵育时间段。生物样品可以在与裂解缓冲液混合之前或之后离心，以产生上清液。此处，所述生物物质可包括与裂解缓冲液混合后的生物样品的上清液或裂解物。在一些实施方案中，该生物样品可为粪便样品。
在一些实施方案中，所述生物物质可以是如本文其他地方所述的病毒、细菌、真菌或原生动物。在一些实施方案中，所述生物物质可以是病毒、细菌、真菌或原生动物的裂解物。在一些实施方案中，所述生物物质可以是对病毒、细菌、真菌或原生动物的各个种特异或在其之间保守的核酸。所述生物物质可以是可作为扩增反应中的模板的任何生物物质。
在一些实施方案中，本发明提供了一种反应混合物，其包含：
(a)沙门氏菌、沙门氏菌裂解物或沙门氏菌核酸，
(b)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合，以供在扩增反应中扩增所述靶核酸序列以获得扩增产物，
(c)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，
(d)能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物，以及
(e)可选的报告剂，其产生指示存在所述扩增产物的可检测信号。
在一些实施方案中，所述沙门氏菌可以是肠沙门氏菌。所述沙门氏菌可以是邦戈尔沙门氏菌。所述沙门氏菌可以是包含在沙门氏菌属内的任何细菌，包括但不限于曾被认为是沙门氏菌属的独立种的细菌，如伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌等。所述沙门氏菌可以是已经根据本发明的方法处理的沙门氏菌。例如，所述沙门氏菌可以是沙门氏菌裂解物。
在一些实施方案中，能够在扩增反应中通过DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物为dNTP。
所述一个或多个引物组可包含正向引物。该正向引物可选自SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)、SEQ ID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)和SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)。所述一个或多个引物组可包含反向引物。该反向引物可选自SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)、SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)和SEQ IDNO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)。
所述一个或多个引物组可包括由如SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物组成的引物组。备选地或者附加地，所述一个或多个引物组可包括由如SEQ ID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物组成的引物组。备选地或者附加地，所述一个或多个引物组可包括由如SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物组成的引物组。
在一些实施方案中，所述报告剂可以是序列特异性寡核苷酸探针。该核酸特异性寡核苷酸探针可选自如SEQ ID NO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)、SEQ ID NO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)和SEQ ID NO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)所示的核酸序列。
本发明的反应混合物可容纳在任何合适的反应位点。该反应位点可以是器皿，如多孔板的孔、板、管、室、流动池、微流体装置的室或通道，或芯片。该反应位点可以是溶液内的分区，如小液滴(例如，乳液混合物内的小液滴)。在一些实施方案中，该反应混合物为脱水形式，例如粘附于器皿表面的珠或膜、冻干粉或沉淀物。
在一个方面，本发明提供了一种计算机可读介质，其包含机器可执行代码，该代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现本发明的方法。例如，该方法可以是检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了一种计算机可读介质，其包含机器可执行代码，该代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现检测生物样品中的靶核酸分子的方法。该方法可包括：(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(在一些情况下)逆转录酶，以及(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
计算机可读介质可采取许多形式，包括但不限于，有形(或非暂时性)存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机或类似物中的任何存储设备等等，例如可用于实施计算步骤、处理步骤等。易失性存储介质包括动态存储器，如计算机的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括包含计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波如在射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中生成的电信号或电磁信号或者声波或光波的形式。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘(flexible disk)、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列载送至处理器以供执行。
在另一个方面，本发明进一步提供了引物组和探针。在本发明中使用以下引物组和探针。
实施例
实施例1：病毒储备样品和生物样品中的核酸的扩增和检测
进行扩增和检测实验，以比较从病毒标准样品和生物样品获得的结果。使包含RNA病毒病原体的生物样品和病毒病原体的标准样品经受扩增条件，从而扩增病原体的RNA。对H3N2和H1N1(2007)流感病毒中的每一个进行一组实验。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。各个病毒标准样品作为包含病毒的储备溶液的系列稀释液而获得。H3N2和H1N1(2007)的浓度为106IU/mL。对于H5N1和H1N1(2007)，将1/2、1/20、1/200、1/2000和1/20000的稀释液进行扩增。在各个实验组中，阴性对照(例如，不包含病毒RNA的样品)也进行扩增。
将5微升的每个样品在具有进行病毒RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增(例如，平行的核酸扩增)所必需的试剂的25μL反应管中合并。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂作为可商购的预混合物(例如，Qiagen One-Step RT-PCR或One-Step RT-qPCR试剂盒)来提供，该预混合物包含逆转录酶(例如，Sensiscript和Omniscript转录酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaq DNA聚合酶)和各dNTP。此外，该反应管还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。为了生成扩增的DNA产物，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在95℃下5分钟，随后在45℃下20分钟，然后在95℃下2分钟，并接着进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
H3N2的扩增结果以图形示于图2中(图2A对应于各个病毒标准样品，图2B对应于生物样品)，而H1N1(2007)的扩增结果以图形示于图3中(图3A对应于各个病毒标准样品，图3B对应于生物样品)。所记录的FAM染料的荧光相对于循环数作图。
如图2A所示，各个H3N2病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为18至32。如图2B所示，各个病毒H3N2生物样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为29-35。
如图3A所示且除1/20000稀释液外，各个H1N1(2007)病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为24-35。如图3B所示，各个H1N1(2007)生物样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为28-35。
总体而言，图2和图3中所示的数据表明，在低至50IU/mL的浓度下以及在4-log浓度范围上，经由扩增的DNA产物可检测到所测试的病毒，且具有良好的灵敏度，循环阈值不超过约40。此外，数据还表明，从获自受试者的生物样品中获得的病毒RNA也可以以类似的方式进行检测。
实施例2：病毒核酸在不同的缓冲液体系中的扩增和检测
进行扩增和检测实验，以比较使用不同的缓冲液体系进行扩增而获得的结果。针对两种不同的缓冲液体系(S1和S2)进行一组实验。S1缓冲液包含两性离子缓冲剂和BSA，而S2缓冲液包含两性离子缓冲剂和氢氧化钠。使用一组作为包含病毒的储备溶液的系列稀释液而获得的H5N1流感病毒标准样品来完成针对每种缓冲液的实验。H5N1的浓度为106IU/mL。对1/2、1/20、1/200、1/2000、1/20000、1/200000稀释液和阴性对照进行扩增。
将5微升的每个样品在具有进行病毒RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增(例如，平行的核酸扩增)所必需的试剂的25μL反应管中合并。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP和适宜的S1或S2缓冲液。此外，该反应管还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。为了生成扩增的DNA产物，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在95℃下5分钟，随后在45℃下20分钟，然后在95℃下2分钟，并接着进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
缓冲液体系S1的扩增结果以图形示于图4A中，而缓冲液体系S2的扩增结果以图形示于图4B中。所记录的FAM染料的荧光相对于循环数作图。
如图4A所示，在缓冲液体系S1中扩增的各个病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为25至36。如图4B所示，在缓冲液S2中扩增的各个病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为25-35。
总体而言，图4中所示的数据表明，在低至50IU/mL的浓度下以及在5-log浓度范围上，经由扩增的DNA产物可检测到所测试的病毒，且具有良好的灵敏度，循环阈值不超过约40。此外，数据还表明，使用不同的缓冲液体系可获得类似的扩增结果。
实施例3：血浆样品中的乙型肝炎病毒(HBV)的扩增和检测
进行扩增实验，以确定用于检测生物样品中的靶核酸的扩增方法的稳健性。对包含不同浓度(例如，50感染单位/毫升(IU/mL)、200IU/mL、2000IU/mL、20000IU/mL)的乙型肝炎病毒(HBV)的稀释的人血浆样品分别进行扩增反应。HBV是经由RNA中间体进行复制的DNA病毒。HBV经由DNA病毒的直接PCR是可检测的。除阴性对照的多个样品(例如，不包含HBV的血浆)外，也对各个浓度下的多个样品(n＝2-4)进行了测试。
将2.5μL的每个样品与进行RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增(例如，平行的核酸扩增)所必需的试剂置于50μL反应管中以获得反应混合物。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂作为可商购的预混合物(例如，Qiagen One-Step RT-PCR或One-Step RT-qPCR试剂盒)来提供，该预混合物包含逆转录酶(例如，Sensiscript和Omniscript转录酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaq DNA聚合酶)和各dNTP。此外，该混合物还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。该反应混合物还包含两性离子缓冲剂和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)，以阻止在血浆中发现的扩增抑制剂的抑制效果。在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在94℃下1分钟，随后在50℃下10分钟，然后在94℃下2分钟，接着进行在94℃下5秒和在58℃下35秒的50个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
扩增结果以图形示于图5中，而所确定的Ct值列表于表1中。在图5中，所记录的FAM染料的相对荧光单位(RFU)相对于循环数作图。如图5和表1所示，HBV可以在所测试的每个浓度下检测到，循环阈值的范围为28.99至39.39。通常，较高浓度的样品对应于较低的循环阈值。
总体而言，图5和表1中所示的数据表明，在低至50IU/mL(所测试的最低值)的浓度下，经由扩增的DNA产物可检测到HBV，且具有良好的灵敏度，循环阈值不超过约40。尽管测试的最高浓度(20000IU/mL)比测试的最低浓度(50IU/mL)浓缩了400倍，但对于较低浓度而言，循环阈值仅高出约25％，这表明该扩增方案总体上是稳健的。
表1：实施例3中的实验的Ct结果
实施例4：在扩增生物样品中的核酸前预加热生物样品以及一系列的扩增反应
进行扩增实验，以确定预加热生物样品对检测灵敏度的影响，并且还确定使用多个系列的扩增反应对检测灵敏度的影响。
制备20份25μL的反应混合物，每份反应混合物包含1μL的致病种类、完成适当的核酸扩增反应(例如，RNA种类的逆转录和DNA扩增，以及DNA种类的DNA扩增)所必需的试剂和包含FAM染料的TaqMan探针。其中四份反应混合物包含H1N1(2007)(即，RNA病毒)，四份反应混合物包含H3N2(即，RNA病毒)，四份反应混合物包含H1N1(2009)，四份反应混合物包含结核菌(TB)(即细菌样品)，而四份反应混合物包含阿留申病病毒(Aleutian disease virus，ADV)(即DNA病毒)。H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2和ADV致病种类来自从受试者获得的口咽拭子。TB从细菌储备物获得。
使用预加热和扩增方案的各种组合并将其汇总于表2中。对于各种致病种类的第一反应混合物，将致病种类在添加至反应混合物之前在95℃下预加热10分钟。在将致病种类添加至反应混合物之后，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育该反应混合物，该方案包括在95℃下2分钟，随后进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PH-1混合物。
对于各个致病种类的第二反应混合物，将致病种类在添加至反应混合物之前在50℃下预加热30分钟。在将致病种类添加至反应混合物之后，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育该反应混合物，该方案包括在95℃下2分钟，随后进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PH-2混合物。
对于各个致病种类的第三反应混合物，致病种类在添加至反应混合物之前不进行预加热。在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育这些反应混合物，该方案包括在95℃下1分钟，随后在55℃下10分钟，然后在95℃下2分钟，接着进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PTC-1混合物。
对于各个致病种类的第四反应混合物，致病种类在添加至反应混合物之前不进行预加热。使这些反应混合物经历包括多个系列的扩增反应的方案，各个系列包括变性和延伸条件的多个循环。在实时PCR热循环仪中根据此方案孵育反应混合物，该方案包括在95℃下1分钟，随后进行系列1(在95℃下5秒，在60-50℃下20秒(以1℃/循环步进下降)，及在60℃下10秒)的10个循环，然后在95℃下2分钟，接着进行系列2(在95℃下5秒，在55℃下30秒)的40个循环。系列1和系列2在它们的延伸温度和延伸持续时间上有所不同。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PTC-2混合物。
表2：实施例4的实验条件
各种致病种类的结果以图形示于图6(H1N1(2007))、图7(H3N2)、图8(H1N1(2009))、图9(TB)和图10(ADV)中。图6至图10中的每一个中的A项表示对于反应混合物PH-1和PH-2获得的结果，而图6至图10中的每一个中的B项表示对于反应混合物PTC-1和PTC-2获得的结果。对各个实验确定的Ct值汇总于表3中。对于PH-1和PH-2ADV反应混合物无法确定Ct值，这与图10A中所示的数据对应。
根据表3所示的数据，PH-1和PH-2反应混合物之间的Ct值非常相似，这表明可以在一系列条件下预加热致病种类(或包含致病种类的生物样品)，以获得类似的检测灵敏度。此外，PTC-1反应混合物具有与针对PH-1和PH-2反应混合物所确定的Ct值相似的Ct值。PTC-1与PH-1/PH-2方案相似，不同之处在于PTC-1不包括预加热步骤。因此，PTC-1数据与PH-1/PH-2数据的比较表明：在将致病种类提供至反应混合物之前预加热该致病种类对于以良好的灵敏度获得结果可能不是必要的。然而，在使用TB和ADV样品的一些情况下，预加热可能比不进行预加热更差。
然而，对于所测试的所有致病种类，PTC-2的Ct值比PH-1、PH-2或PTC-1中的任何一个的Ct值都低。PTC-1和PTC-2数据的比较表明：使反应混合物经历多个系列的扩增反应(各个系列包括变性和延伸条件的多个循环)可以提高检测灵敏度。
表3：实施例4中的实验的Ct结果
实施例5：样品的多重化(Multiplexing)
进行扩增和检测实验，以基准化(benchmark)各种扩增方案并确定是否可以实现多重化。使包含RNA(例如，H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2)或DNA(例如，ADV、人博卡病毒(HBoV)病毒病原体或DNA细菌病原体(例如，TB))的生物样品经受各种扩增条件。除了来自细菌储备物的TB样品外，各个生物样品均经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。
为了评估扩增方案的多重化能力，在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育三种反应混合物(各自包含H3N2、ADV或H3N2与ADV之混合物中的一种)，该扩增方案包括在94℃下2分钟，在45℃下20分钟，在94℃下1分钟，随后进行在94℃下5秒和在55℃下35秒的50个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
实验结果以图形示于图11中并在以下示于表4中。如图11所示，H3N2和TB当组合在一起时或在另一个不存在时都可以相似地被检测到。当ADV不存在时，对于H3N2反应混合物记录到Ct值为26.03，而当H3N2不存在时，对于ADV反应混合物记录到Ct值为30.5。当H3N2和ADV合并为单一反应混合物时，得到26(H3N2)和30(ADV)的Ct值。合并的反应混合物与单一组分反应混合物相比，Ct值几乎相同。结果表明：能以良好的灵敏度实现多重化，且可检测RNA和DNA种类两者。
表4：实施例5中的H3N2和ADV多重化实验的结果
类型 样品 Ct
RNA病毒 H3N2 26.03
DNA病毒 ADV 30.5
RNA与DNA病毒 H3N2与ADV 26(H3N2)与30(ADV)
在另一个评估扩增方案的多重化能力的实验中，在实时PCR热循环仪中根据扩增方案(包括在95℃下2分钟，随后进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环)孵育三种反应混合物(各自包含H3N2、TB或H3N2与TB之混合物中的一种)。在孵育期间进行扩增产物的检测。
实验结果以图形示于图12中并在以下示于表5中。如图12所示，H3N2和TB当组合在一起时或在另一个不存在时都可以相似地被检测到。当TB不存在时，对于H3N2反应混合物记录到Ct值为32，而当H3N2不存在时，对于TB反应混合物记录到Ct值为32。当H3N2和TB合并为单一反应混合物时，得到29(H3N2)和30(TB)的Ct值。合并的反应混合物与单一组分反应混合物相比，Ct值相似。结果表明：能以良好的灵敏度实现多重化，并且在多重化方案中，可检测RNA和DNA种类两者。
表5：实施例5中的H3N2和TB多重化实验的结果
实施例6：多个系列的扩增反应的基准化
进行扩增和检测实验，以基准化包括多个系列的扩增反应的各种扩增方案。使包含RNA(例如，H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2)或DNA(例如，ADV、人博卡病毒(HBoV)病毒病原体或DNA细菌病原体(例如，TB))的生物样品经受各种扩增条件。除了来自细菌储备物的TB样品外，各个生物样品均经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。
在一组实验中，使扩增混合物经历包括两个系列的扩增反应的扩增方案，各个系列包括不同的变性和延伸条件。在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育六份反应混合物(两份包含H3N2，两份包含ADV，两份包含HBoV)，该扩增方案包括在94℃下1秒，随后进行系列1(在94℃下1秒，并且在45℃下10秒)的11个循环，接着在95℃下1分钟，接着进行系列2(在95℃下5秒，并在55℃下30秒)的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
实验结果在以下示于表6中。如表6所示，所确定的Ct值的范围为8.35至23。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：采用包括多个系列的扩增反应的方案可检测RNA和DNA种类两者。
表6：实施例6中的H3N2、ADV和HBoV实验的结果
在另一组实验中，使扩增混合物经历包括三个系列的扩增反应的扩增方案，就其变性和/或延伸条件而言，各个系列彼此不同。在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育五份反应混合物(一份包含sH1N1(2007)，一份包含H3N2，一份包含pH1N1(2009)，一份包含ADV，且一份包含TB)，该扩增方案包括在94℃下1分钟，随后进行系列1(在94℃下5秒，以及在60-50℃下30秒(以1℃/循环步进下降))的5个循环，然后进行系列2(在94℃下5秒和在50℃下30秒)的5个循环，随后在95℃下2分钟，接着进行系列3(在95℃下5秒和在55℃下30秒)的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
实验结果在以下示于表7中。如表7所示，所确定的Ct值的范围为20至30。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：采用包括多个系列的扩增反应的方案可检测RNA和DNA种类两者。
表7：实施例6中的sH1N1(2007)、H3N2、pH1N1(2009)、ADV和TB实验的结果
类型 样品 Ct
RNA病毒 sH1N1(2007) 22
RNA病毒 H3N2 23
RNA病毒 pH1N1(2009) 24
DNA病毒 ADV 30
DNA细菌 TB 20
实施例7：多个系列的扩增反应的基准化
进行扩增和检测实验，以基准化包括多个系列的扩增反应的各种扩增方案。使包含H3N2的生物样品经受各种扩增条件。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。
使扩增混合物经历扩增方案，一些方案包括扩增反应的三个不同第一系列之一和相同的第二系列，所述三个第一系列包括与第二系列不同的变性和延伸条件。第一系列和第二系列中的每一个包括多个循环。另一个实验在没有第一系列的情况下进行，其仅包括第二系列。在实时PCR热循环仪中，根据以下表8中所示的扩增方案之一孵育四份包含H3N2的反应混合物中的每一份：
表8：实施例7中的实验方案
实验结果以图形示于图13中并在以下列于表9中。如图13所示，反应混合物3具有最高的Ct值(28.59)。其他包括多个系列的反应混合物具有范围为8.5至26.5的较低值。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：包括多个系列的扩增反应的方案与仅具有单一系列的方案相比可达到更佳的灵敏度。
表9：实施例7的实验结果
反应混合物 Ct
1 22.97
2 26.5
3 28.59
4 8.5
实施例8：多个系列的扩增反应的基准化
进行扩增和检测实验，以基准化包括多个系列的扩增反应的各种扩增方案。使包含H3N2的生物样品经受各种扩增条件。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。
使扩增混合物经历扩增方案，一些方案包括扩增反应的六个第一系列之一和相同的第二系列，所述六个第一系列包括与第二系列不同的变性和延伸条件。另外六个实验在没有第一系列的情况下进行。在实时PCR热循环仪中，根据以下表10中所示的扩增方案之一孵育十二份包含H3N2的反应混合物中的每一份：
表10：实施例8中的实验方案
实验结果在以下列于表11中。Ct值范围为14.53至27.28，且反应混合物2-5没有检测到产物。一般而言，未经历多个系列的扩增反应的反应混合物或者不具有可检测的产物，或者具有比经历多个系列的扩增反应的反应混合物更高的Ct值。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：包括多个系列的扩增反应的方案与仅具有单一系列的方案相比可达到更佳的灵敏度。在一些情况下，多个系列的扩增反应对于产生可检测量的扩增产物可能是必需的。
表11：实施例8的实验结果
反应混合物 Ct
1 26.03
2 -
3 -
4 -
5 -
6 27.28
7 21.64
8 19.56
9 17.2
10 14.53
11 19.2
12 -
实施例9：比较经纯化的和未纯化的样品的结果
进行扩增和检测实验，以比较采用经纯化的和未纯化的样品获得的结果。使包含H1N1的经纯化的和未纯化的生物样品经历扩增方案。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。产生三份反应混合物，其中两份反应混合物包含通过柱纯化或磁性纯化之一纯化的样品。第三份反应混合物包含未纯化的样品。
在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育反应混合物，该扩增方案包括在94℃下2分钟，在45℃下20分钟，在94℃下1分钟，随后进行在94℃下5秒和在55℃下35秒的50个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
实验结果以图形示于图14中并在以下示于表12中。如表12所示，所确定的Ct值的范围为27至31，且在未纯化的样品与通过各种手段纯化的样品之间是相似的。结果表明：样品的纯化对于达到类似的检测灵敏度可能不是必要的。
表12：实施例9的实验结果
样品类型 Ct
柱纯化 31
磁珠纯化 27
未纯化的 28
实施例10：全血和唾液样品的分析
对包含H3N2病毒的血液和唾液样品进行扩增和检测实验。测试了四个不同的样品。两个样品包含全血或唾液样品之一，且两个样品包含全血或唾液样品之一的10倍稀释液(在PBS中)。将这四个样品中的每一个与进行病毒RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增所必需的试剂合并。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂作为可商购的预混合物(例如，Takara One-Step RT-PCR或One-Step RT-qPCR试剂盒)来提供，该预混合物包含逆转录酶(例如，Sensiscript和Omniscript转录酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaq DNA聚合酶)和各dNTP。此外，该反应管还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。为了生成扩增的DNA产物，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在45℃下20分钟，随后在94℃下2分钟，接着进行在94℃下5秒和在55℃下35秒的42个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。
H3N2的扩增结果以图形示于图15(图15A对应于未稀释的血液，图15B对应于稀释的血液)和图16(图16A对应于未稀释的唾液，图16B对应于稀释的唾液)中。所记录的FAM染料的荧光相对于循环数作图。
如图15和图16所示，未稀释的和经稀释的血液和唾液反应混合物均显示可检测信号，Ct值的范围为24-33。因此，图15和图16所示的数据表明：能以良好的灵敏度分析未稀释的生物样品，Ct值不大于约40。此外，数据还表明：在样品的稀释对于分析是必要的情况下，也可以以类似的方式检测扩增产物。在一些情况下，如果来自样品的抑制剂太多，稀释可以为用于消除来自样品(例如，全血)的抑制的另一种方式。
实施例11：巢式PCR
对含有H1N1病毒的样品进行扩增和检测实验。测试了八个样品。每个样品均包括H1N1(2007)病毒储备物。将样品分别在PBS中按以下表13中所示的稀释度进行稀释。病毒储备物的浓度为1x106IU/mL。为了生成扩增的DNA产物，根据变性和延伸条件的方案对包含给定样品的反应混合物进行孵育。该方案包括：(i)在第一次运行中，将混合物在热循环仪中在94℃下加热1分钟，随后进行10或15个如下循环(如以下表13所示)：在94℃下5秒和在57℃下10秒；以及(ii)在第二次运行中，将混合物在热循环仪中在94℃下加热1分钟，随后进行35个如下循环：在94℃下5秒和在57℃下30秒。将1μL系列稀释样品添加至25μL反应体积的Takara One-step qPCR预混合物中。在第一次运行经过某些循环后，将来自于该反应的1μL添加至第二次运行的反应混合物中。H1N1的扩增结果以图形示于图17中。该图显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。八个样品(1-8)中的每一个的曲线图均已在该图中示出。具有可检测信号的样品具有表13所示的Ct值。
表13：实施例11的实验结果
实施例12：埃博拉重组质粒的扩增和检测
对人全血样品进行扩增和检测实验，该样品包含不同拷贝数的与扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)相对应的重组质粒。测试了八个样品。其中六个样品包含特定拷贝数(250000、25000、2500、250、25和2.5个拷贝)的重组质粒，而两个样品(一个仅含有血液，一个仅含有水)作为对照样品。在未进行样品纯化的情况下对全血样品进行了分析。
将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、各dNTP、引物、辅因子、合适的缓冲液、引物等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。按照样品编号对各反应混合物的汇总(包括重组质粒的拷贝数)示于表14中。为了生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。所述两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图18中，每条曲线均用与表14中示出的样品编号相对应的样品编号标出。图18所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图18中的曲线获得的Ct值汇总于表15中。
如图18所示，除样品6外，对于所有包含重组质粒的样品，均经由扩增产物检测到重组质粒。此外，在任一对照样品(样品7和8)中均未检测到重组质粒。因此，图18所示的结果表明，在一些情况下，使用多个系列的变性和延伸条件，并且在不进行样品纯化的情况下，可获得25个质粒拷贝/反应(rxn)的检测灵敏度。
表14：实施例12的实验反应混合物
样品 质粒(拷贝/反应)
1 250000
2 25000
3 2500
4 250
5 25
6 2.5
7 0(仅有血液)
8 0(仅有水)
表15：由实施例12中的实验确定的Ct值
样品 拷贝/反应 Ct
1 250000 26.12
2 25000 33.61
3 2500 37.61
4 250 40.61
5 25 42.97
6 2.5 ---
7 0 ---
8 0 ---
实施例13：埃博拉病毒的扩增和检测
对包含不同拷贝数的扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血样品进行扩增和检测实验。一式两份测试了八种样品(重复组1和重复组2)，共16个样品。其中六种样品包含特定拷贝数(2500000、250000、25000、2500、250和25个拷贝)的假病毒，而两种样品(一种仅含有血液，一种仅含有水)作为对照样品。在未进行样品纯化的情况下对全血样品进行了分析。
将每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、各dNTP、辅因子、引物、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。反应混合物按样品编号的汇总(包括假病毒的拷贝数)示于表16中。为了由假病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图19A(重复组1)和图19B(重复组2)中，每条曲线均用与表16中示出的那些样品编号相对应的样品编号标出。图19A和图19B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图19A和图19B中的曲线获得的Ct值汇总于表17中，其中“Ct 1”对应于重复组1，而“Ct 2”对应于重复组2。
如图19A和图19B所示，对于所有包含假病毒的样品(样品1-6)，经由扩增产物在两个重复组中均检测到假病毒。此外，在任何对照样品(样品7和8)中均未检测到假病毒。因此，图19A和图19B所示结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件在不进行样品纯化的情况下获得25个病毒拷贝/反应的检测灵敏度。
表16：实施例13的实验反应混合物
表17：由实施例13中的实验确定的Ct值
样品 拷贝/反应 Ct 1 Ct 2
1 2500000 8.57 8.44
2 250000 12.09 11.27
3 25000 15.03 14.99
4 2500 18.90 18.87
5 250 21.71 21.71
6 25 27.86 39.42
7 0(仅有血液) --- ---
8 0(仅有水) --- ---
实施例14：埃博拉病毒的扩增和检测
对包含不同拷贝数的扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血样品进行扩增和检测实验。测试了八个样品。其中六个样品包含特定拷贝数(2500000、250000、25000、2500、250和25)的假病毒，而两个样品(一个含有20000个拷贝的假病毒阳性对照，一个仅含有水)作为对照样品。在未进行样品纯化的情况下对全血样品进行了分析。
将每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。各反应混合物按样品编号的汇总(包括假病毒的拷贝数)示于表18中。为了由假病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的35个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图20中，每条曲线均用与表18中示出的那些样品编号相对应的样品编号标出。图20所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图20中的曲线获得的Ct值汇总于表19中。
如图20所示，对于所有包含假病毒的样品(样品1-6)，包括包含阳性对照假病毒的样品(样品7)，经由扩增产物均检测到假病毒。此外，在仅含水的对照样品(样品8)中未检测到假病毒。因此，图20所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件在不进行样品纯化的情况下获得25个病毒拷贝/反应的检测灵敏度。
表18：实施例14的实验反应混合物
样品 假病毒(拷贝/反应)
1 2500000
2 250000
3 25000
4 2500
5 250
6 25
7 20000(阳性对照假病毒)
8 0(仅有水)
表19：由实施例14中的实验确定的Ct值
样品 拷贝/反应 Ct
1 2500000 10.44
2 250000 13.30
3 25000 16.14
4 2500 19.62
5 250 22.92
6 25 30.00
7 20000(阳性对照) 15.94
8 0(仅有水) ---
实施例15：埃博拉病毒的扩增和检测
对包含两种拷贝数(250个拷贝/反应或25个拷贝/反应)之一的扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血样品进行扩增和检测实验。对于总共八个样品，每个全血样品均使用四种试剂体系之一进行测试。每种试剂体系(B-1、B-2、B-3和B-4)均包含对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)。各种不同的试剂体系在试剂体系中含有不同浓度的多种组分。将每个全血样品与其适当的试剂体系合并成30μL的反应混合物。各反应混合物按样品编号的汇总(包括假病毒的拷贝数和试剂体系)在以下示于表20中。为了由假病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的40个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图21中，每条曲线均用与表20中所示的那些样品编号相对应的样品编号标出。图21所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图21中的曲线获得的Ct值汇总于表21中。
如图21所示，对于所有样品，包括含有25个拷贝/反应的样品，经由扩增产物均检测到假病毒。因此，图21所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件，使用不同的试剂体系，且在不进行样品纯化的情况下，获得25个病毒拷贝/反应的检测灵敏度。
表20：实施例15的实验反应混合物
表21：由实施例15中的实验确定的Ct值
样品 拷贝/反应 Ct
1 250 20.38
2 25 24.82
3 250 20.62
4 25 24.05
5 250 20.26
6 25 25.09
7 250 19.86
8 25 24.00
实施例16：扎伊尔埃博拉病毒的实时PCR检测
使用本发明的一步(one-step)qPCR方法来分析患者血清样品的扎伊尔埃博拉病毒。该样品未经纯化。该样品包括九个扎伊尔埃博拉病毒阳性样品和七个扎伊尔埃博拉病毒阴性样品。使用Roche LC96实时PCR系统。
本实施例中用于分析样品的程序示于表22中。
表22：热循环程序
该一步qPCR方法的结果示于表23中。与经验证的试剂和方法相比，该一步qPCR方法在测试扎伊尔埃博拉病毒方面显示出100％的一致性。
表23：结果
实施例17：疟疾的扩增和检测
对包含未知浓度的疟疾病原体的人全血样品进行扩增和检测实验。完成了两组实验。在第一组实验中，对人全血样品的1:4稀释液(在1XPBS中)完成了重复实验；对包含全血和与疟疾病原体相对应的质粒的样品完成了实验；并且对仅含水的对照完成了实验。在第二组实验中，对包含人全血样品在1X PBS中的多个稀释液(1:4、1:40、1:400、1:4000、1:40000和1:400000)的样品与仅有血液和仅有水的对照样品完成了实验。在未进行样品纯化的情况下分析了全血样品。
将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。第一组实验的反应混合物按样品编号的汇总(包括稀释度)示于表24中。第二组实验的反应混合物按样品编号的汇总(包括稀释度)示于表25中。为了由疟疾病原体生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的13个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线。第一组实验的扩增曲线以图形示于图22A中，而第二组实验的扩增曲线以图形示于图22B中。各条曲线分别用其在表24和表25中相应的样品编号标出。图22A和图22B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。
如图22A所示，对于包含全血样品(样品1和2)的两种反应混合物以及对于包含重组质粒的阳性对照(样品3)，经由扩增产物检测到疟疾病原体。此外，在仅有水的对照样品(样品4)中未检测到疟疾病原体。因此，图22A所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件在不进行样品纯化的情况下对疟疾病原体进行检测。
如图22B所示，对于包含全血样品(样品1-6)的所有反应混合物，经由扩增产物检测到疟疾病原体。此外，在仅有水和仅有血液的对照样品(样品7和8)中未检测到疟疾病原体。因此，图22B所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件且在不进行样品纯化的情况下，在高达1:400000的稀释度下检测病原体，包括疟疾病原体。
表24：实施例17中的第一组实验的实验反应混合物
样品 稀释度
1 1:4
2 1:4
3 1:2(全血对照中的质粒)
4 零(仅有水)
表25：实施例17中的第二组实验的实验反应混合物
实施例18：登革病毒的扩增和检测
对从包含未知浓度的登革病毒的培养物中获得的样品进行扩增和检测实验。完成了三组实验。在第一组实验中，对未稀释的培养物完成了重复实验；对培养物的1:10稀释液完成了实验；并对仅有水的对照完成了实验。在第二组实验中，对培养物的多个稀释液(未稀释、1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000)以及仅有水的对照样品完成了实验。在第三组实验中，对培养物的多个稀释液(未稀释、1:10、1:100、1:1000和1:10000)以及仅有水的对照样品完成了实验。在未进行样品纯化的情况下分析了培养物样品。
将2μL的每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。关于反应混合物的汇总(包括稀释度)，第一组实验的示于表26中，第二组实验的示于表27中，而第三组实验的示于表28中。为了由病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，在42℃下1分钟，进行在95℃下5秒和在45℃下10秒的10个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线。第一组实验的扩增曲线以图形示于图23A中，第二组实验的扩增曲线以图形示于图23B中，而第三组实验的扩增曲线以图形示于图23C中。每条曲线分别用其在表26、表27和表28中相应的样品编号标出。图23A、图23B和图23C所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图23A、图23B和图23C中的曲线获得的Ct值分别示于表26、表27和表28中。
如图23A所示，对于包含病毒的三种反应混合物(样品1-3)，经由扩增产物检测到病毒。此外，在仅有水的对照样品(样品4)中未检测到病毒。因此，图23A所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件检测登革病毒。
如图23B所示，对于包含登革病毒并且未稀释(样品1)或稀释至最高达1:1000(样品2、3和4)的反应混合物，经由扩增产物检测到病毒。然而，未确定1:1000反应混合物(样品4)的Ct值。在较高稀释度(样品5、6和7)或在仅有水的对照样品(样品8)中均未检测到病毒。因此，图23B所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件并在不进行样品纯化的情况下，在最高达1:1000的稀释度时检测到病毒，其中在最高达1:100的稀释度时可产生Ct值。
如图23C所示，对于包含登革病毒并且未稀释(样品1)或稀释至最高达1:1000(样品2、3和4)的反应混合物，经由扩增产物检测到病毒。然而，未确定1:1000反应混合物的Ct值。在较高稀释度(样品5)或在仅有水的对照样品(样品6)中均未检测到病毒。因此，图23C所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件并在不进行样品纯化的情况下，在最高达1:1000的稀释度时检测到病毒，其中在最高达1:100的稀释度时可产生Ct值。
表26：实施例18中第一组实验的实验反应混合物和确定的Ct值
样品 稀释度 Ct值
1 未稀释 19.32
2 未稀释 20.40
3 1:10 23.23
4 不含病毒(仅有水) ---
表27：实施例18中第二组实验的实验反应混合物和确定的Ct值
表28：实施例18中第三组实验的实验反应混合物和确定的Ct值
样品 稀释度 Ct值
1 未稀释 19.22
2 1:10 22.43
2 1:100 26.55
4 1:1000 ---
5 1:10000 ---
6 不含病毒(仅有水) ---
实施例19：单核苷酸多态性(SNP)的检测
对包含特定基因型的细胞色素P450 2C19、CYP2C19*2(具有“GA”基因型)或CYP2C19*3(具有“GG”基因型)的人口咽拭子或血液样品进行扩增和检测实验。进行了两组实验—一组针对从人口咽拭子获得的样品且一组针对从血液获得的样品。在第一组实验中，在未进行样品纯化的情况下分析了从人口咽拭子获得的七个不同的样品。在第二组实验中，在未进行样品纯化的情况下分析了五个不同的血液样品。
将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及两种报告剂(例如，用于检测核酸扩增的包含FAM染料的寡核苷酸探针，用于检测“GA”基因型的包含得克萨斯红染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。为了产生扩增产物，使各反应混合物经历热循环方案，该方案包括在95℃下5分钟，随后进行在95℃下5秒和在49℃下10秒的50个循环。在热循环过程中，记录来自报告剂的信号以产生扩增曲线。第一组实验(人口咽拭子)的扩增曲线以图形示于图24A(对应于FAM寡核苷酸探针的信号)和图24B(对应于德克萨斯红寡核苷酸探针的信号)中。第二组实验(血液样品)的扩增曲线以图形示于图25A(对应于FAM寡核苷酸探针的信号)和图25B(对应于德克萨斯红寡核苷酸探针的信号)中。图24A、图24B、图25A和图25B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。每条曲线均用其在表29(口咽拭子实验)或表30(血液实验)中相应的反应混合物编号标出。由扩增曲线确定的Ct值也与确定的基因型一起示于表29或表30中。在图24B或图25B中，在观察到来自德克萨斯红的信号的扩增曲线中，确定相应的反应混合物具有“GA”基因型。此外，在图24B或图25B中，在未观察到来自德克萨斯红的信号的扩增曲线中，确定相应的反应混合物具有“GG”基因型。
如图24A所示，对于含有从口咽拭子获得的样品的每种反应混合物均观察到扩增产物，表明发生了核酸的扩增。然而，如图24B所示，仅在一些含有从口咽拭子获得的样品的反应混合物(反应混合物1、4、6和7)中观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GA”基因型。在其他反应混合物(反应混合物2、3和5)中，未观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GG”基因型。使用从口腔拭子样品提取的DNA通过扩增和检测实验验证了图24A和24B所示的结果(数据未示出)。因此，图24A和图24B所示的结果表明，在一些情况下，可通过实时扩增在不进行样品纯化的情况下检测从口咽拭子获得的样品中的SNP。
如图25A所示，对于含有从血液获得的样品的每种反应混合物均观察到扩增产物，表明发生了核酸的扩增。然而，如图25B所示，仅在一些含有从血液获得的样品的反应混合物(反应混合物1、2和5)中观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GA”基因型。在其他反应混合物(反应混合物3和4)中，未观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GG”基因型。使用核酸测序验证了图25A和25B所示的结果。因此，图25A和图25B所示的结果表明，在一些情况下，可通过实时扩增在不进行样品纯化的情况下检测从血液获得的样品中的SNP。
表29：对于实施例19中的口咽拭子实验所确定的Ct值和基因型
表30：对于实施例19中的血液实验所确定的Ct值和基因型
实施例20：55型腺病毒(ADV55)和7型腺病毒(ADV7)的扩增和检测
对从口咽拭子获得的包含不同拷贝数的55型腺病毒(ADV55)或未知浓度的7型腺病毒(ADV7)的样品进行扩增和检测实验。完成了两组实验—一组针对具有ADV55的样品且一组针对采有ADV7的实验。在第一组实验中，在未进行样品纯化的情况下完成了采用包含不同拷贝数(1、10、100、1000、10000和100000个拷贝)的ADV55的样品的六个不同实验，并一起完成了阴性对照实验。在第二组实验中，在未进行样品纯化的情况下，完成了采用包含未知拷贝数的ADV7的样品的八个不同实验。
将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。对第一组实验的反应混合物的汇总(包括ADV55的拷贝数)示于表31中。为了由病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的20个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在60℃下34秒的35个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。第一组实验的扩增曲线以图形示于图26A中，每条曲线均用与表31中示出的那些反应混合物编号相对应的反应混合物编号标出。第二组实验的扩增曲线以图形示于图26B中并且相应的Ct值示于表32中。在图26B中以与表32所示的反应混合物编号相对应标出该扩增曲线。图26A和图26B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。
如图26A所示，对于所有包含含有病毒的样品的反应混合物(反应混合物1-6)，经由扩增产物均检测到ADV55。此外，在阴性对照反应混合物(反应混合物7)中未检测到病毒。因此，图26A所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件，在不进行样品纯化的情况下且在多种稀释水平下检测ADV55病毒。
如图26B所示，对于所有反应混合物经由扩增产物均检测到ADV7。因此，图26B所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件且在不进行样品纯化的情况下检测ADV7病毒。
表31：实施例20中的ADV55实验的实验反应混合物
反应混合物 ADV55拷贝数/反应
1 1
2 10
3 100
4 1000
5 10000
6 100000
7 0(阴性对照)
表32：对于实施例20中的ADV7实验所确定的Ct值
反应混合物 Ct值
1 5.12
2 7.16
3 10.97
4 14.15
5 17.58
6 20.29
7 22.13
8 17.66
实施例21：具甲的RNA丙型肝炎病毒(RNA-HCV)的扩增和检测
对包含不同拷贝数的具甲的RNA丙型肝炎病毒(RNA-HCV)的血浆样品进行扩增和检测实验。在未进行样品纯化的情况下完成了采用包含不同拷贝数(10、100和500个拷贝)的RNA-HCV的样品的三个不同实验，并一起完成了针对阴性对照的实验。
将每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。反应混合物的汇总(包括RNA-HCV的拷贝数)示于表33中。为了由病毒生成扩增的DNA产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的20个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在60℃下34秒的55个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线。第一组实验的扩增曲线以图形示于图27中，每条曲线用与表33中示出的反应混合物编号相对应的编号标出。图27所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。
如图27所示，对于所有包含含有病毒的样品的反应混合物(反应混合物1-3)，经由扩增产物均检测到RNA-HCV。此外，在阴性对照反应混合物(反应混合物4)中未检测到RNA-HCV。因此，图27所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件在不进行样品纯化的情况下检测RNA-HCV。也可达到10个拷贝/反应的检测灵敏度。
表33：实施例21中的RNA-HCV实验的实验反应混合物
反应混合物 RNA-HCV拷贝数/反应
1 10
2 100
3 500
4 0(阴性对照)
实施例22：粪便样品中沙门氏菌的扩增和检测
对包含不同浓度的沙门氏菌的粪便样品进行扩增和检测实验。在未进行样品纯化的情况下完成了采用包含不同量的沙门氏菌的临床样品的四个不同实验。在这四个临床样品中，如通过使用来自粪便的相应的纯化DNA样品的PCR分析所确定的，只有4号样品是沙门氏菌阴性的，而其他三个是沙门氏菌阳性的。
对于每个实验，将0.2g粪便样品添加至1.5mL离心管中。将200μl生理盐水溶液添加至每个管中。然后将管以最大速度涡旋，直到粪便样品充分匀质化。
然后，对于每个样品，将50μl匀质化的粪便样品悬浮液转移至新的1.5mL离心管中。然后，添加50μl裂解缓冲液(100mM NaOH，pH12.5)，并将其与匀质化的粪便样品充分混合。然后将该混合物在室温下孵育不超过10分钟。
接下来，将混合物在12,000rpm下离心1min。对于每个样品，然后将5μl的所得上清液添加至包含45μl用于进行PCR的扩增试剂的反应容器中。
扩增反应根据以下表34中描述的方案进行。
表34：实施例22中采用的PCR方案
从表35中所示的结果可以看出，在未进行样品纯化的情况下，使用本发明的方法成功地检测到沙门氏菌。
表35：实施例22的PCR扩增结果
然后通过LOD(检测极限)测试确定用于检测粪便样品中的沙门氏菌的本方法的灵敏度。简言之，通过将45μl不包含任何沙门氏菌的粪便悬浮液与5μl已知浓度的沙门氏菌稀释液混合而制备样品。然后通过将100μl样品接种在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上，然后对活菌落的总数进行计数而确定样品中沙门氏菌的浓度。如上所述，还使用本发明的方法扩增并分析该样品。结果显示，使用本发明的方法对粪便样品中的沙门氏菌的检测极限(LOD)为1.1E+3CFU/mL。
因此，与用于分析粪便样品的其他方法和可商购的试剂盒(例如，由Shanghai ZJBio-Tech Co.,Ltd.或DAAN Gene Co.,Ltd.提供的实时PCR试剂盒)相比，本发明的方法可以不需要粪便样品纯化、DNA提取，或在升高温度(例如，100℃或沸腾温度)下的孵育(例如，用于裂解)。本方法采用的步骤较少并且耗费的时间相当短，但其可用于以更高的灵敏度成功检测粪便样品中的沙门氏菌。
实施例23：粪便样品和拭子样品中柯萨奇病毒A16的扩增和检测
进行了粪便样品和咽拭子样品中柯萨奇病毒A16的扩增和检测。用三个粪便样品和三个咽拭子样品以及阴性对照进行了实验。
咽拭子样品直接从受试者获得，并且将其悬浮于悬浮缓冲液中。简言之，使用纤维尖端(fiber tip)或Q-尖端(Q-tip)擦拭受试者的后咽和扁桃体区域，然后将其插入包含含有蛋白质稳定剂和缓冲液的介质的样品管中。使样品与介质充分混合。然后，将5-10μl如此制备的每个咽拭子样品添加至用于PCR扩增的反应容器中。
对于粪便样品，将200mg粪便样品添加至2mL离心管中。然后，向每个管中添加0.2ml悬浮缓冲液。将样品连续涡旋1分钟或直到粪便样品充分匀质化。在另一种情况下，将匀质化的样品在12000rpm下离心2min以获得沉淀和包含生物样品的上清液。然后将20μl所得的每种上清液添加至新的1.5ml离心管中，并添加20μl裂解缓冲液。将管在室温下连续涡旋15s，并短时离心。将10μl的每种样品添加至用于PCR扩增的反应容器中。如实施例22所述进行PCR反应。
如图29所示，成功检测到粪便样品和拭子样品中的柯萨奇病毒A16。经确定，对柯萨奇病毒A16的检测灵敏度为25个拷贝/反应。
实施例24：采用不同方法的扩增和检测结果的比较
使用如实施例23中所述的方法(即，不进行样品纯化和核酸提取)和对照方法A比较了咽拭子样品中的柯萨奇病毒A16的扩增和检测。在对照方法A中，使用纯化试剂盒纯化病毒核酸，其中将样品裂解、结合至纯化柱的膜并洗涤若干次，然后将结合的核酸洗脱下来以供进一步的分析。
如图30A和图30B所示，本发明的方法使得能够以更低的Ct值检测柯萨奇病毒A16。
实施例25：采用不同方法的扩增和检测结果的比较
使用如实施例23中所述的方法(即，不进行样品纯化和核酸提取)和对照方法B比较了咽拭子样品和粪便样品中的柯萨奇病毒A16的扩增和检测。在对照方法B中，使用纯化试剂盒纯化病毒核酸，其中将样品裂解、结合至纯化柱的膜并洗涤若干次，然后将结合的核酸洗脱下来以供进一步的分析。
如图31A和图31B所示，本发明的方法使得能够以显著更低的Ct值检测柯萨奇病毒A16。
实施例26：采用不同方法的扩增和检测结果的比较
使用如实施例23中所述的方法(即，不进行样品纯化和核酸提取)和对照方法C比较了咽拭子样品和粪便样品中的柯萨奇病毒A16的扩增和检测。在对照方法C中，使用纯化试剂盒纯化病毒核酸，其中将样品用Trizol裂解并用氯仿处理。然后，使用SiO2吸附核酸。然后洗涤样品，并洗脱吸附的核酸。
如图32A和32B所示，对照方法C未检测到咽拭子样品中的柯萨奇病毒A16。对于粪便样品，本发明的方法使得能够以显著更低的Ct值检测柯萨奇病毒A16。
实施例27：在未进行富集培养的情况下对奶样品中沙门氏菌的扩增和检测
在未进行培养富集的情况下，对包含未知浓度的沙门氏菌的奶样品进行扩增和检测实验。在未进行培养富集和样品纯化的情况下分析了包含未知量的沙门氏菌的奶样品。简言之，将2mL奶样品添加至2mL离心管中。然后将该管在6,000rpm下离心2min。去除上清液。然后，添加50μl裂解缓冲液(100mM NaOH，pH 12.5)并充分混合。然后将该混合物在室温下孵育10分钟。
接下来，将3μl该混合物添加至包含47μl用于进行PCR的扩增试剂的反应容器中。
扩增反应根据以下表36中描述的方案进行。
表36：实施例27中采用的PCR方案
结果显示，成功检测到奶样品中的沙门氏菌。
然后通过LOD(检测极限)测试确定用于检测奶样品中的沙门氏菌的本方法的灵敏度。简言之，通过将1800μl不包含任何沙门氏菌的奶样品与200μl已知浓度的沙门氏菌稀释液混合而制备六个样品。然后通过将100μl样品接种在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上，然后对活菌落的总数进行计数而确定样品中沙门氏菌的浓度。如上所述，还使用本发明的方法扩增并分析该样品。结果显示，使用实施例27的方法对奶样品中的沙门氏菌的检测极限(LOD)平均为2.9E+2CFU/mL。
因此，与用于分析奶样品的其他方法和可商购的试剂盒(例如，由Norgen BiotekCorp.提供的实时PCR试剂盒)相比，本发明的方法可以不需要奶样品纯化、DNA提取，或在升高温度(例如，100℃或沸腾温度)下的孵育(例如，用于裂解)。本方法采用的步骤较少并且耗费的时间相当短，但其可用于以更高的灵敏度成功检测奶样品中的沙门氏菌。
实施例28：在富集培养的情况下对奶样品中沙门氏菌的扩增和检测
在培养富集的情况下，对包含未知浓度的沙门氏菌的奶样品进行扩增和检测实验。在不进行样品纯化但进行富集培养的情况下分析包含未知量的沙门氏菌的奶样品。简言之，将2mL奶样品添加至2mL离心管中。然后将该管在12,000rpm下离心2min。去除上清液。然后，向该管中添加1mL胰蛋白酶大豆培养液(TSB)液体培养基并充分混合。在剧烈振摇的情况下将混合物在37℃下培养1～3小时。然后将培养的混合物在6,000rpm下离心2min，并去除上清液。然后，添加30μl裂解缓冲液(100mM NaOH，pH 12.5)并充分混合。
将混合物在室温下孵育10分钟。然后，将3μl混合物添加至包含47μl用于进行PCR的扩增试剂(例如，DNA聚合酶、引物、各dNTP、辅因子、合适的缓冲剂等)的反应容器中。
扩增反应根据以下表37中描述的方案进行。
表37：实施例28中采用的PCR方案
结果显示，成功检测到奶样品中的沙门氏菌。
然后通过LOD(检测极限)测试确定用于检测奶样品中的沙门氏菌的本方法的灵敏度。简言之，通过将1800μl不包含任何沙门氏菌的奶样品与200μl已知浓度的沙门氏菌稀释液混合而制备六个样品。然后通过将100μl样品接种在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上，然后对活菌落的总数进行计数而确定样品中沙门氏菌的浓度。如上所述，还使用本发明的方法扩增并分析该样品。结果显示，使用实施例28的方法对奶样品中的沙门氏菌的检测极限(LOD)平均为1CFU/mL(参见以下表38，也参见图33)。
表38：实施例28的PCR扩增结果
因此，与用于分析奶样品的其他方法和可商购的试剂盒(例如，由3M公司提供的PCR试剂盒)相比，本发明的方法可以不需要延长(例如，8-24小时)的(预)富集培养、推断性生化鉴定、DNA提取，或在升高温度(例如，100℃或沸腾温度)下的孵育(例如，用于裂解)。本方法采用的步骤较少并且耗费的时间相当短，但其可用于以相若或更高的灵敏度成功检测奶样品中的沙门氏菌。
实施例29：粪便样品中诺如病毒GI和GII的扩增和检测
对包含诺如病毒GI(50个拷贝/μl)和GII(20个拷贝/μl)的粪便样品进行扩增和检测实验。使用诺如病毒GI/GII核酸检测试剂盒(Coyotebio Inc.)进行这些实验。
该试剂盒包含以下组分：
(1)NoV GI/GII反应混合物，其包含诺如病毒GI/GII引物、荧光探针、内部参照引物和探针、dNTP和缓冲液；
(2)酶混合物，其包含DNA聚合物和逆转录酶；
(3)Nov GI/GII阳性对照，其包含具有GI/GII靶序列的假病毒；
(4)内部参照物，其包含含有内部参照物的靶序列的质粒；
(5)阴性对照，其包含无DNA酶和RNA酶的水；以及
(6)裂解缓冲液，其包含NaOH。
对于每个实验，通过涡旋将粪便样品悬浮于0.5mL PBS中。将悬浮液转移至1.5mL离心管中并在13,000rpm下离心5分钟。将10μl至50μl上清液转移至新鲜的1.5mL离心管中并加热至95℃，持续5分钟。随后，将该上清液与等体积裂解缓冲液混合并将该混合物涡旋15秒。取出10μl裂解物用于进行PCR。
通过将10μl裂解物、阳性对照或阴性对照添加至44.8μl NoVGI/GII反应混合物、4.2μl酶混合物和1μl内部参照物来进行每个PCR扩增，并且使所得混合物经历以下表39所述的方案。
表39：实施例29中采用的PCR方案
在定量PCR系统(例如，Coyotebio Mini8Plus)上进行检测。在FAM通道上读取荧光信号。
从表40和41所示的从20个诺如病毒GI样品和20个诺如病毒GII样品获得的结果可以看出，在未进行样品纯化的情况下，可使用本发明的方法成功检测诺如病毒GI/GII。LOD可低至50个拷贝/μl(GI)和20个拷贝/μl(GII)，并且样品之间的一致性较高。
表40：诺如病毒GI的PCR扩增结果
样品孔 浓度 模板 Ct(FAM)
1 50个拷贝/μl 5μl 23.09
2 50个拷贝/μl 5μl 24.96
3 50个拷贝/μl 5μl 24.61
4 50个拷贝/μl 5μl 24.11
5 50个拷贝/μl 5μl 25.32
6 50个拷贝/μl 5μl 24.39
7 50个拷贝/μl 5μl 25.08
8 50个拷贝/μl 5μl 26.51
9 50个拷贝/μl 5μl 24.94
10 50个拷贝/μl 5μl 27.53
11 50个拷贝/μl 5μl 24.33
12 50个拷贝/μl 5μl 24.04
13 50个拷贝/μl 5μl 25.65
14 50个拷贝/μl 5μl 24.72
15 50个拷贝/μl 5μl 24.88
16 50个拷贝/μl 5μl 24.33
17 50个拷贝/μl 5μl 26.94
18 50个拷贝/μl 5μl 26.14
19 50个拷贝/μl 5μl 25.91
20 50个拷贝/μl 5μl 25.54
表41：诺如病毒GII的PCR扩增结果
因此，与用于分析粪便样品的其他方法和可商购的试剂盒(例如，由Shanghai ZJBio-Tech Co.,Ltd.或DAAN Gene Co.,Ltd.提供的实时PCR试剂盒)相比，本发明的方法可以不需要纯化粪便样品、提取DNA或在升高温度(例如，100℃或沸腾温度)下孵育(例如，用于裂解)。本方法采用的步骤较少并且耗费的时间相当短，但其可用于以更高的灵敏度和一致性成功检测粪便样品中的诺如病毒GI/GII。
实施例30：粪便样品中肠病毒的扩增和检测
对包含肠病毒71(38个拷贝/μl)的粪便样品进行扩增和检测实验。
对于每个实验，通过在1.5mL离心管中涡旋将0.1g粪便样品悬浮于900μl悬浮缓冲液中，随后在13,000rpm下离心10分钟。将100μl上清液转移至新鲜的1.5mL离心管中并加热至70℃，持续2分钟。随后，将10μl上清液与1μl裂解缓冲液混合并将该混合物涡旋5秒并取出用于进行PCR。
通过将11μl裂解物添加至45μl试剂中来进行每个PCR扩增，并且使所得混合物经历以下表42中所述的方案。
表42：实施例30中采用的PCR方案
在定量PCR系统(例如，Coyotebio Mini8Plus)上进行检测。在FAM通道上读取荧光信号。
从表43所示的从20个肠病毒71样品获得的结果可以看出，在未进行样品纯化的情况下，可使用本发明的方法成功检测肠病毒。LOD可低至38个拷贝/μl，并且样品之间的一致性较高。
表43：肠病毒71的PCR扩增结果
因此，与用于分析粪便样品的其他方法和可商购的试剂盒(例如，由Shanghai ZJBio-Tech Co.,Ltd.或DAAN Gene Co.,Ltd.提供的实时PCR试剂盒)相比，本发明的方法可以不需要纯化粪便样品、提取DNA或在升高温度(例如，100℃或沸腾温度)下孵育(例如，用于裂解)。本方法采用的步骤较少并且耗费的时间相当短，但其可用于以更高的灵敏度和一致性成功检测粪便样品中的肠病毒。
实施例31：粪便样品中沙门氏菌的扩增和检测
对包含2.6x106CFU/g、2.6x105CFU/g、2.6x104CFU/g、2.6x103CFU/g和2.6x102CFU/g的沙门氏菌的粪便样品进行扩增和检测实验。培养以供细菌增殖后进行五次单独的实验。
对于每个实验，将1.0g粪便样品转移至50mL管中的10mL SBG培养基中进行培养。所有培养物在200rpm，37℃下剧烈振摇4小时，然后取样。
对于每种培养物，取出100μl培养物并在95℃加热10分钟，然后添加10μl裂解缓冲液。随后，将裂解物在12,000rpm下离心3分钟。取出10μl上清液作为后续扩增的模板。
使用本文公开的由正向引物和反向引物组成的引物组以及序列特异性荧光寡核苷酸探针，按照如表44所述的程序进行扩增。
表44：实施例31中采用的PCR方案
从表45和图34中所示的结果可以看出，在未进行样品纯化的情况下，可使用本发明的方法成功检测沙门氏菌。LOD可以低至2.6*102CFU/g。
表45：实施例31的PCR扩增结果
因此，与用于分析粪便样品的其他方法和可商购的试剂盒(例如，由Shanghai ZJBio-Tech Co.,Ltd.或DAAN Gene Co.,Ltd.提供的实时PCR试剂盒)相比，本发明的方法可以不需要纯化粪便样品、提取DNA或在升高温度(例如，100℃或沸腾温度)下孵育(例如，用于裂解)。本方法采用的步骤较少并且耗费的时间相当短，但其可用于以更高的灵敏度成功检测粪便样品中的沙门氏菌。
实施例32：培养物样品中沙门氏菌的基因组DNA扩增和检测与mRNA扩增和检测之间的比较
通过使用沙门氏菌培养物系列稀释液比较了使用基因组DNA和mRNA作为靶核酸的沙门氏菌扩增和检测的灵敏度。
从-80℃冰箱中取出沙门氏菌菌株以接种到液体LB培养基中。该菌株在37℃、200rpm下培养过夜。用0.9％NaCl洗涤培养物并两次在13,000rpm下离心3分钟。在0.9％NaCl中进行沙门氏菌的1:10系列稀释。沙门氏菌的初始浓度为106CFU/μl。基因组DNA和mRNA扩增均使用稀释液-3(1,000CFU/μl)、稀释液-4(100CFU/μl)、稀释液-5(10CFU/μl)和稀释液-6(1CFU/μl)。
如本文其他地方所述进行样品制备。不含沙门氏菌裂解物的反应混合物用作阴性对照。
对于ttr DNA检测，使用本文公开的由正向引物、反向引物组成的引物组以及序列特异性荧光寡核苷酸探针。
对于invA mRNA检测，使用本文公开的由正向引物、反向引物组成的引物组以及序列特异性荧光寡核苷酸探针。
按照如表46所述的程序进行扩增。
表46：实施例32中采用的PCR方案
从表47和图35(A对应DNA检测，而B对应mRNA检测)中所示的结果可以看出，可使用本发明的方法通过DNA扩增和mRNA扩增二者成功检测沙门氏菌。LOD可低至10CFU/μl。此外，与DNA扩增相比，mRNA扩增在所有测试浓度下均有更高的灵敏度。这一趋势在接近更低的浓度范围时更为突出。
表47：实施例32的PCR扩增结果
实施例33：粪便样品中沙门氏菌的基因组DNA扩增和检测与mRNA扩增和检测之间的比较
通过使用沙门氏菌粪便样品来比较使用基因组DNA和mRNA作为靶核酸的沙门氏菌扩增和检测的灵敏度。
通过将拭子浸入粪便表面并将拭子转动一圈来采集粪便样品。将拭子没入500μl0.9％NaCl中并充分涡旋。
如本文其他地方所述进行样品制备。将初始裂解物(其中沙门氏菌浓度约为1,000CFU/μl)和两种稀释液(分别为10x和100x)用于后续扩增。不含沙门氏菌的粪便样品用作阴性对照。
对于ttr DNA检测，使用如本文公开的由正向引物和反向引物组成的引物组以及序列特异性荧光寡核苷酸探针。
对于invA mRNA检测，使用如本文公开的由正向引物、反向引物组成的引物组以及序列特异性荧光寡核苷酸探针。
按照如表48所述的程序进行扩增。
表48：实施例33中采用的PCR方案
从表49和图36(A对应DNA检测，而B对应mRNA检测)中所示的结果可以看出，在未进行样品纯化的情况下，可使用本发明的方法通过DNA扩增和mRNA扩增二者成功检测沙门氏菌。对于mRNA检测，LOD可低至10CFU/μl，而对于DNA检测，LOD可低至1000CFU/μl。此外，与DNA扩增相比，mRNA扩增具有更高的测试灵敏度。这一趋势在接近更低的浓度范围时更为突出，其中在使用DNA扩增无法检测到的100和10CFU/μl下，通过mRNA扩增可检测到沙门氏菌。
表49：实施例33的PCR扩增结果
实施例34：沙门氏菌的组合基因组DNA与mRNA扩增和检测
通过使用沙门氏菌培养物系列稀释液来比较使用组合的基因组DNA/mRNA和仅使用mRNA作为靶核酸的沙门氏菌扩增和检测的灵敏度。
如本文其他地方所述制备沙门氏菌培养物样品和系列稀释液。针对组合的基因组DNA/mRNA扩增和仅mRNA扩增两者均使用稀释液0(1,000CFU/μl)、稀释液-1(100CFU/μl)、稀释液-2(10CFU/μl)和稀释液-3(1CFU/μl)。
如本文其他地方所述进行样品制备。不含沙门氏菌裂解物的反应混合物用作阴性对照。
对于仅invA mRNA检测，使用如本文公开的由正向引物、反向引物组成的引物组以及序列特异性荧光寡核苷酸探针。
对于组合的ttr DNA+invA mRNA检测，除上述引物组与探针之外，还使用如本文公开的由正向引物、反向引物组成的另一引物组以及另一序列特异性荧光寡核苷酸探针。
按照如表50所述的程序进行扩增。
表50：实施例34中采用的PCR方案
从表51和图37(A对应组合的基因组DNA/mRNA检测，而B对应仅mRNA检测)中所示的结果可以看出，可使用本发明的方法通过组合的基因组DNA/mRNA扩增与mRNA扩增两者成功检测沙门氏菌。LOD可低至1CFU/μl。此外，与仅mRNA扩增相比，组合的基因组DNA/mRNA扩增在所有测试浓度下均有甚至更高的灵敏度。这一趋势在接近更低的浓度范围时更为突出。这些结果表明，在通过扩增检测沙门氏菌时靶向基因组DNA和mRNA两者可能是有利的。
表51：实施例34的PCR扩增结果
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下，现将想到大量变化、改变和替代。应当理解，本文描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在用以下述权利要求限定本发明的范围，由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (249)

1.一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法，其包括：
(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。
2.一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法，其包括：
(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在(a)之前将所述生物样品悬浮于溶液中，以获得包含所述生物样品的匀质化制品。
4.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在(a)之前使所述生物样品经历离心，以产生沉淀和包含所述生物样品的溶液。
5.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在(b)与(c)之间使所述混合物经历离心，以产生包含所述生物样品的上清液。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品在没有预培养、非选择性富集、选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下直接从其来源获得。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品来自受试者的组织或流体。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述组织或流体为粪便。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述生物样品通过口腔拭子或直肠拭子获得。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品包括土壤或食物样品。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述食物样品为乳制品样品。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述乳制品样品包括奶。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)提取的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
14.如权利要求1或2所述的方法，其中所述混合物在没有经历纯化的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
15.如权利要求1或2所述的方法，其中所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)浓缩的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
16.如权利要求1或2所述的方法，其中(b)中的所述温度为约20℃至40℃。
17.如权利要求1或2所述的方法，其中(b)中的所述时间段不超过约10分钟。
18.如权利要求1或2所述的方法，其中(b)中的所述时间段不超过约1分钟。
19.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品未用去污剂处理。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含NaOH。
21.如权利要求1或2所述的方法，其中所述裂解缓冲液具有约8至13的pH。
22.如权利要求1或2所述的方法，其中在(a)中，所述生物样品与所述裂解缓冲液的比例在约1:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)之间。
23.如权利要求1或2所述的方法，其中(c)中的所述试剂包括进行逆转录扩增和脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述试剂包括逆转录酶。
25.如权利要求1或2所述的方法，其中(c)中的所述试剂包括产生指示存在所述扩增产物的可检测信号的报告剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述可检测信号的强度与所述扩增产物或靶核酸分子的量成比例。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述报告剂为染料。
28.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸分子为DNA。
29.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸分子为核糖核酸(RNA)。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述RNA为病毒RNA。
31.如权利要求1或2所述的方法，其中所述变性温度为约90℃至100℃。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述变性温度为约92℃至95℃。
33.如权利要求1或2所述的方法，其中所述延伸温度为约35℃至72℃。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述延伸温度为约45℃至65℃。
35.如权利要求1或2所述的方法，其中所述变性持续时间少于或等于约30秒。
36.如权利要求1或2所述的方法，其中所述延伸持续时间少于或等于约30秒。
37.如权利要求1或2所述的方法，其中所述扩增以小于30的循环阈值(Ct)产生指示所述生物样品中存在所述靶核酸分子的可检测量的所述扩增产物。
38.如权利要求1或2所述的方法，其中所述扩增在10分钟或更短的时间段内产生指示所述样品中存在所述靶核酸分子的可检测量的所述扩增产物。
39.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括检测所述扩增产物的量。
40.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括向接收者输出指示所述扩增产物的量的信息。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述接收者为治疗医师、制药公司或所述受试者。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述信息作为报告而输出。
43.如权利要求1或2所述的方法，其中(d)在35个或更少的循环内进行。
44.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸分子与疾病相关。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述疾病与病毒相关。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述病毒为RNA病毒。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述病毒为DNA病毒。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述病毒选自人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒、水痘病毒、肠病毒和诺如病毒。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述流感病毒选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述腺病毒为55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述丙型肝炎病毒为具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。
52.如权利要求48所述的方法，其中所述肠病毒为柯萨奇病毒。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16。
54.如权利要求48所述的方法，其中所述肠病毒为肠病毒71。
55.如权利要求48所述的方法，其中所述诺如病毒为诺如病毒GI或诺如病毒GII。
56.如权利要求44所述的方法，其中所述疾病与致病细菌或致病原生动物相关。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述致病细菌为革兰氏阳性致病细菌或革兰氏阴性致病细菌。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述致病细菌选自金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌和志贺氏菌。
59.如权利要求56,所述的方法，其中所述致病细菌为结核分枝杆菌。
60.如权利要求56所述的方法，其中所述致病原生动物为疟原虫。
61.如权利要求56所述的方法，其中所述致病细菌为沙门氏菌。
62.如权利要求1或2所述的方法，其中(d)中的所述扩增产物为扩增的DNA产物。
63.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在(d)之前使所述靶核酸分子经受一种或多种变性条件。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种变性条件选自变性温度分布和变性剂。
65.如权利要求2所述的方法，其进一步包括使所述靶核酸分子在所述多个系列的引物延伸反应的第一系列与第二系列之间经受一种或多种变性条件。
66.如权利要求2所述的方法，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个而言，所述单个系列是不同的。
67.如权利要求66所述的方法，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意两个而言，所述单个系列是不同的。
68.如权利要求2所述的方法，其中所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，所述第一系列包括超过十个循环，所述第一系列的每个循环包括(i)将所述反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将所述反应混合物在约35℃-65℃下孵育不超过1分钟，所述第二系列包括超过十个循环，所述第二系列的每个循环包括(i)将所述反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将所述反应混合物在约40℃-60℃下孵育不超过1分钟。
69.如权利要求2所述的方法，其中与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的可检测量的扩增产物。
70.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在(d)之前将所述生物样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述预加热持续时间不超过1分钟。
72.一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统，其包括：
输入单元，其接收来自用户的处理所述生物样品以检测所述靶核酸分子的请求；以及
与所述输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，从而：
(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。
73.一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统，其包括：
输入单元，其接收来自用户的处理所述生物样品以检测所述靶核酸分子的请求；以及
与所述输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，从而：
(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
74.如权利要求72或73所述的系统，其进一步包括将所述生物样品与所述裂解缓冲液混合以获得所述混合物的生物样品处理模块。
75.如权利要求74所述的系统，其中所述生物样品处理模块孵育所述混合物。
76.如权利要求72或73所述的系统，其进一步包括与所述生物样品处理模块可操作地耦合的扩增模块，其中所述扩增模块(i)将一定量的所述混合物从所述生物样品处理模块添加至所述反应容器中，并且(ii)使所述反应容器中的所述反应混合物经历所述引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸分子的所述扩增产物。
77.如权利要求72或73所述的系统，其进一步包括与所述一个或多个计算机处理器可操作地耦合的输出模块，其中所述输出模块将关于所述靶核酸分子或所述扩增的DNA产物的信息输出至接收者。
78.如权利要求72或73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(a)之前将所述生物样品悬浮于溶液中，从而获得包含所述生物样品的匀质化制品。
79.如权利要求72或73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(a)之前使所述生物样品经历离心，从而产生沉淀和包含所述生物样品的溶液。
80.如权利要求72或73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(b)与(c)之间使所述混合物经历离心，从而产生包含所述生物样品的上清液。
81.如权利要求72或73所述的系统，其中所述生物样品在没有预培养、非选择性富集、选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下直接从其来源获得。
82.如权利要求72或73所述的系统，其中所述生物样品来自受试者的组织或流体。
83.如权利要求82所述的系统，其中所述组织或流体为粪便。
84.如权利要求82所述的系统，其中所述生物样品通过口腔拭子或直肠拭子获得。
85.如权利要求72或73所述的系统，其中所述生物样品包括土壤或食物样品。
86.如权利要求85所述的系统，其中所述食物样品为乳制品样品。
87.如权利要求86所述的系统，其中所述乳制品样品包括奶。
88.如权利要求72或73所述的系统，其中所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)提取的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
89.如权利要求72或73所述的系统，其中所述混合物在没有经历纯化的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
90.如权利要求72或73所述的系统，其中所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)浓缩的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
91.如权利要求72或73所述的系统，其中(b)中的所述温度为约20℃至40℃。
92.如权利要求72或73所述的系统，其中(b)中的所述时间段不超过约10分钟。
93.如权利要求72或73所述的系统，其中(b)中的所述时间段不超过约1分钟。
94.如权利要求72或73所述的系统，其中所述生物样品未用去污剂处理。
95.如权利要求72或73所述的系统，其中所述裂解缓冲液包含NaOH。
96.如权利要求72或73所述的系统，其中所述裂解缓冲液具有约8至13的pH。
97.如权利要求72或73所述的系统，其中在(a)中，所述生物样品与所述裂解缓冲液的比例在约1:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)之间。
98.如权利要求72或73所述的系统，其中(c)中的所述试剂包括进行逆转录扩增和脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂。
99.如权利要求98所述的系统，其中所述试剂包括逆转录酶。
100.如权利要求72或73所述的系统，其中(c)中的所述试剂包括产生指示存在所述扩增产物的可检测信号的报告剂。
101.如权利要求100所述的系统，其中所述可检测信号的强度与所述扩增产物或靶核酸分子的量成比例。
102.如权利要求100所述的系统，其中所述报告剂为染料。
103.如权利要求72或73所述的系统，其中所述靶核酸分子为DNA。
104.如权利要求72或73所述的系统，其中所述靶核酸分子为核糖核酸(RNA)。
105.如权利要求101所述的系统，其中所述RNA为病毒RNA。
106.如权利要求72或73所述的系统，其中所述变性温度为约90℃至100℃。
107.如权利要求103所述的系统，其中所述变性温度为约92℃至95℃。
108.如权利要求72或73所述的系统，其中所述延伸温度为约35℃至72℃。
109.如权利要求108所述的系统，其中所述延伸温度为约45℃至65℃。
110.如权利要求72或73所述的系统，其中所述变性持续时间少于或等于约30秒。
111.如权利要求72或73所述的系统，其中所述延伸持续时间少于或等于约30秒。
112.如权利要求72或73所述的系统，其中所述扩增以小于30的循环阈值(Ct)产生指示所述生物样品中存在所述靶核酸分子的可检测量的所述扩增产物。
113.如权利要求72或73所述的系统，其中所述扩增在10分钟或更短的时间段内产生指示所述样品中存在所述靶核酸分子的可检测量的所述扩增产物。
114.如权利要求72或73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以检测所述扩增产物的量。
115.如权利要求72或73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以向接收者输出指示所述扩增产物的量的信息。
116.如权利要求115所述的系统，其中所述接收者为治疗医师、制药公司或所述受试者。
117.如权利要求115所述的系统，其中所述信息作为报告输出。
118.如权利要求72或73所述的系统，其中(d)在35个或更少的循环内进行。
119.如权利要求72或73所述的系统，其中所述靶核酸分子与疾病相关。
120.如权利要求119所述的系统，其中所述疾病与病毒相关。
121.如权利要求120所述的系统，其中所述病毒为RNA病毒。
122.如权利要求120所述的系统，其中所述病毒为DNA病毒。
123.如权利要求120所述的系统，其中所述病毒选自人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒、水痘病毒、肠病毒和诺如病毒。
124.如权利要求123所述的系统，其中所述流感病毒选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。
125.如权利要求123所述的系统，其中所述腺病毒为55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。
126.如权利要求123所述的系统，其中所述丙型肝炎病毒为具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。
127.如权利要求123所述的系统，其中所述肠病毒为柯萨奇病毒。
128.如权利要求127所述的系统，其中所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16。
129.如权利要求123所述的系统，其中所述肠病毒为肠病毒71。
130.如权利要求123所述的系统，其中所述诺如病毒为诺如病毒GI或诺如病毒GII。
131.如权利要求119所述的系统，其中所述疾病与致病细菌或致病原生动物相关。
132.如权利要求131所述的系统，其中所述致病细菌为革兰氏阳性致病细菌或革兰氏阴性致病细菌。
133.如权利要求131所述的系统，其中所述致病细菌选自金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌和志贺氏菌。
134.如权利要求131所述的系统，其中所述致病细菌为结核分枝杆菌。
135.如权利要求131所述的系统，其中所述致病原生动物为疟原虫。
136.如权利要求131所述的系统，其中所述致病细菌为沙门氏菌。
137.如权利要求72或73所述的系统，其中(d)中的所述扩增产物为扩增的DNA产物。
138.如权利要求72或73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计以在(d)之前使所述靶核酸分子经受一种或多种变性条件。
139.如权利要求138所述的系统，其中所述一种或多种变性条件选自变性温度分布和变性剂。
140.如权利要求73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，以使所述靶核酸分子在所述多个系列的引物延伸反应的第一系列与第二系列之间经受一种或多种变性条件。
141.如权利要求73所述的系统，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个而言，所述单个系列是不同的。
142.如权利要求141所述的系统，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意两个而言，所述单个系列是不同的。
143.如权利要求73所述的系统，其中所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，所述第一系列包括超过十个循环，所述第一系列的每个循环包括(i)将所述反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将所述反应混合物在约35℃-65℃下孵育不超过1分钟，所述第二系列包括超过十个循环，所述第二系列的每个循环包括(i)将所述反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将所述反应混合物在约40℃-60℃下孵育不超过1分钟。
144.如权利要求73所述的系统，其中与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的可检测量的扩增产物。
145.如权利要求72或73所述的系统，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，以在(d)之前将所述生物样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。
146.如权利要求145所述的系统，其中所述预加热持续时间不超过1分钟。
147.一种计算机可读介质，其包含机器可执行代码，该代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现检测生物样品中的靶核酸分子的方法，该方法包括：
(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。
148.一种计算机可读介质，其包含机器可执行代码，该代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现检测生物样品中的靶核酸分子的方法，该方法包括：
(a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在约15℃至70℃的温度下孵育不超过约15分钟的时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)针对所述靶核酸分子的引物组；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
149.一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的方法，其包括：
(a)将所述粪便样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述裂解缓冲液是碱性的。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述裂解缓冲液具有约8至13的pH。
152.如权利要求149所述的方法，其进一步包括在(b)与(c)之间使所述混合物经历离心，以产生用作后续步骤中的混合物的上清液。
153.如权利要求149所述的方法，其中已对所述粪便样品进行了培养以供微生物增殖。
154.如权利要求153所述的方法，其中用于微生物增殖的培养包括使所述粪便样品在富集培养条件下经历一个培养时间段。
155.如权利要求149所述的方法，其中所述粪便样品在没有预培养、非选择性富集、选择性富集、在鉴别培养基上接种和/或推断性生物医学鉴定的情况下直接从其来源获得。
156.如权利要求149所述的方法，其中所述粪便样品为固体粪便样品。
157.如权利要求149所述的方法，其中所述粪便样品为液体粪便样品。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述液体粪便样品为水样腹泻粪便。
159.如权利要求149所述的方法，其中所述粪便样品通过拭子获得。
160.如权利要求149所述的方法，其中所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)提取的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
161.如权利要求149所述的方法，其中所述混合物在没有经历纯化的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
162.如权利要求149所述的方法，其中所述混合物在没有经历DNA或核糖核酸(RNA)浓缩的情况下添加至(c)中的所述反应容器中。
163.如权利要求149所述的方法，其中(b)中的所述温度为约80℃至100℃。
164.如权利要求149所述的方法，其中(b)中的所述孵育时间段不少于约2分钟。
165.如权利要求164所述的方法，其中(b)中的所述孵育时间段约为10分钟。
166.如权利要求149所述的方法，其中所述粪便样品未用去污剂处理。
167.如权利要求149所述的方法，其进一步包括在(a)之前将悬浮缓冲液添加至所述粪便样品，以获得该粪便样品的匀质化制品。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述悬浮缓冲液包含NaCl、PBS和/或HEPES。
169.如权利要求167所述的方法，其中所述粪便样品与所述悬浮缓冲液的比例为约1:1(wt/vol)至约1:100(wt/vol)。
170.如权利要求167所述的方法，其中在(a)中，所述粪便样品的所述匀质化制品与所述裂解缓冲液的比例为约5:1(vol/vol)至约1:5(vol/vol)。
171.如权利要求149所述的方法，其中(c)中的所述试剂包括进行逆转录扩增和脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂。
172.如权利要求171所述的方法，其中所述试剂包括逆转录酶。
173.如权利要求149所述的方法，其中(c)中的所述试剂包括产生指示存在所述扩增产物的可检测信号的报告剂。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述可检测信号的强度与所述扩增产物或靶核酸的量成比例。
175.如权利要求173所述的方法，其中所述报告剂是在与所述扩增产物杂交时具有光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。
176.如权利要求175所述的方法，其中所述序列特异性寡核苷酸探针与光学活性报告剂和可选的猝灭剂连接。
177.如权利要求173所述的方法，其中所述报告剂是在与所述扩增产物杂交时具有阻断的光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述寡核苷酸探针在断裂时具有光学活性。
179.如权利要求173所述的方法，其中所述报告剂为染料。
180.如权利要求149所述的方法，其中所述序列特异性寡核苷酸探针与能够特异性结合所述靶核酸的所述引物组中的引物之间的所述靶核酸上的区域杂交。
181.如权利要求149所述的方法，其中所述引物组包括能够与来自沙门氏菌基因组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组和能够与来自沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合的引物组。
182.如权利要求149所述的方法，其中每个靶核酸独立地为DNA或RNA。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述RNA为mRNA。
184.如权利要求149所述的方法，其中所述变性温度为约90℃至100℃。
185.如权利要求149所述的方法，其中所述延伸温度为约35℃至72℃。
186.如权利要求149所述的方法，其中所述变性持续时间少于或等于约30秒。
187.如权利要求149所述的方法，其中所述延伸持续时间少于或等于约30秒。
188.如权利要求149所述的方法，其中所述扩增以小于30的循环阈值(Ct)产生指示所述粪便样品中存在所述靶核酸的可检测量的所述扩增产物。
189.如权利要求149所述的方法，其中所述扩增在30分钟或更短的时间段内产生指示所述粪便样品中存在所述靶核酸的可检测量的所述扩增产物。
190.如权利要求149所述的方法，其进一步包括检测所述扩增产物的量和/或存在。
191.如权利要求149所述的方法，其进一步包括向接收者输出指示所述扩增产物的量和/或存在的信息。
192.如权利要求149所述的方法，其中所述信息作为报告而输出。
193.如权利要求149所述的方法，其中(d)中的每个系列在35个或更少的循环内进行。
194.如权利要求149所述的方法，其中(d)中的所述扩增产物为扩增的DNA产物。
195.如权利要求149所述的方法，其进一步包括在(d)之前使所述靶核酸经受一种或多种变性条件。
196.如权利要求149所述的方法，其中所述一种或多种变性条件选自变性温度分布和变性剂。
197.如权利要求149所述的方法，其进一步包括使所述靶核酸分子在所述多个系列的引物延伸反应中的任意两个连续系列之间经受一种或多种变性条件。
198.如权利要求149所述的方法，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个而言，所述单个系列是不同的。
199.如权利要求149所述的方法，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意两个而言，所述单个系列是不同的。
200.如权利要求149所述的方法，其中所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，所述第一系列包括十个或更多个循环，所述第一系列的每个循环包括(i)将所述反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将所述反应混合物在约35℃-65℃下孵育不超过1分钟，所述第二系列包括十个或更多个循环，所述第二系列的每个循环包括(i)将所述反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将所述反应混合物在约40℃-60℃下孵育不超过1分钟。
201.如权利要求200所述的方法，其进一步包括在所述第一系列与所述第二系列之间将所述反应混合物在约92℃-95℃下孵育不超过120秒。
202.如权利要求149所述的方法，其中与在相若的变性和延伸条件下进行的一个系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在所述粪便样品中存在所述靶核酸的可检测量的扩增产物。
203.如权利要求149所述的方法，其进一步包括在(d)之前将所述粪便样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。
204.如权利要求203所述的方法，其中所述预加热持续时间不超过1分钟。
205.如权利要求149所述的方法，其中所述靶核酸为invA mRNA。
206.如权利要求205所述的方法，其中所述引物组包含如SEQ ID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物。
207.如权利要求206所述的方法，其中所述序列特异性寡核苷酸探针包含如SEQ IDNO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)所示的核酸序列。
208.如权利要求205所述的方法，其中所述引物组包含如SEQ ID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物。
209.如权利要求206所述的方法，其中所述序列特异性寡核苷酸探针包含如SEQ IDNO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)所示的核酸序列。
210.如权利要求149所述的方法，其中所述靶核酸为ttr基因。
211.如权利要求205所述的方法，其中所述引物组包含如SEQ ID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物。
212.如权利要求206所述的方法，其中所述序列特异性寡核苷酸探针包含如SEQ IDNO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)所示的核酸序列。
213.如权利要求149所述的方法，其中所述试剂进一步包含MgCl2。
214.如权利要求213所述的方法，其中所述试剂进一步包含约1.5mM MgCl2。
215.如权利要求149所述的方法，其中所述试剂进一步包含约0.1至0.5mM dNTP。
216.如权利要求149所述的方法，其中所述试剂包含约0.1-1.0μM正向引物和反向引物。
217.如权利要求178所述的方法，其中所述试剂包含约0.1-0.5μM序列特异性寡核苷酸探针。
218.试剂在制备用于检测粪便样品中的沙门氏菌的试剂盒中的用途，所述检测包括：
(a)将所述粪便样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
其中所述试剂为所述引物组。
219.一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的计算机辅助方法，其包括：
(a)输入步骤，用于接收来自用户的处理所述粪便样品以检测所述粪便样品中的沙门氏菌的请求；
(b)混合步骤，用于将所述粪便样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；
(c)孵育步骤，用于将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；
(d)添加步骤，用于将来自(c)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及
(e)反应步骤，用于使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
220.一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的计算机辅助系统，其包括：
(a)输入装置，用于接收来自用户的处理所述粪便样品以检测所述粪便样品中的沙门氏菌的请求；
(b)混合装置，用于将所述粪便样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；
(c)孵育装置，用于将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；
(d)添加装置，用于将来自(c)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及
(e)反应装置，用于使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
221.一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的系统，其包括：
输入单元，其接收来自用户的处理所述粪便样品以检测所述粪便样品中的沙门氏菌的请求；
与所述输入单元可操作地耦合的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地程序设计，从而：
(a)将所述粪便样品与裂解缓冲液混合，以获得混合物；
(b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不超过约15分钟的孵育时间段；
(c)将来自(b)的所述混合物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中，以获得反应混合物，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合；以及
(d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
222.一种反应混合物，其包含：
(a)沙门氏菌、沙门氏菌裂解物或沙门氏菌核酸，
(b)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合，以供在扩增反应中扩增所述靶核酸序列以获得扩增产物，
(c)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，
(d)能够在扩增反应中通过所述DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物，以及
(e)可选的报告剂，其产生指示存在所述扩增产物的可检测信号。
223.如权利要求222所述的反应混合物，其中所述沙门氏菌核酸选自基因组DNA、cDNA、非编码DNA、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、shRNA、miRNA及其组合。
224.如权利要求222所述的反应混合物，其中所述能够在扩增反应中通过所述DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物为dNTP。
225.如权利要求222所述的反应混合物，其中所述一个或多个引物组包括包含如SEQID NO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物的引物组。
226.如权利要求222所述的反应混合物，其中所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
227.如权利要求222所述的反应混合物，其中所述一个或多个引物组包括包含如SEQID NO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物的引物组。
228.如权利要求222所述的反应混合物，其中所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
229.如权利要求222所述的反应混合物，其中所述一个或多个引物组包括包含如SEQID NO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物的引物组。
230.如权利要求229所述的反应混合物，其中所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
231.一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的试剂盒，其包含：
(a)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合，以供在扩增反应中扩增所述靶核酸序列以获得扩增产物，
(b)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，
(c)用于核酸扩增的缓冲液，
(d)能够在扩增反应中通过所述DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物，
(e)可选的报告剂，其产生指示存在所述扩增产物的可检测信号，以及
(f)关于使用所述一个或多个引物组、DNA聚合酶和核苷酸及其类似物进行核酸扩增以检测所述粪便样品中的沙门氏菌的说明书。
232.如权利要求231所述的试剂盒，其中所述能够在扩增反应中通过所述DNA聚合酶掺入的核苷酸及其类似物为dNTP。
233.如权利要求231所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物组包括包含如SEQ IDNO:1(TGCTCGTTTACGACCTGAATTA)所示的正向引物和SEQ ID NO:2(ACACCAATATCGCCAGTACG)所示的反向引物的引物组。
234.如权利要求231所述的试剂盒，其中所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:3(TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGA)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
235.如权利要求231所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物组包括包含如SEQ IDNO:4(TCGTTTACGACCTGAATTAC)所示的正向引物和SEQ ID NO:5(TAGAACGACCCCATAAACA)所示的反向引物的引物组。
236.如权利要求231所述的试剂盒，其中所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:6(CTGGTTGATTTCCTGATCGCACT)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
237.如权利要求231所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物组包括包含如SEQ IDNO:7(CTCACCAGGAGATTACAACATGG)所示的正向引物和SEQ ID NO:8(AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC)所示的反向引物的引物组。
238.如权利要求237所述的试剂盒，其中所述报告剂包括包含如SEQ ID NO:9(CACCGACGGCGAGACCGACTTT)所示的核酸序列的序列特异性寡核苷酸探针。
239.如权利要求231所述的试剂盒，其进一步包含可提取关于用于进行引物延伸反应的一个或多个相关参数的信息的独特标识符。
240.如权利要求231所述的试剂盒，其中所述参数选自所述引物延伸反应的系列数目、每个系列中的循环数、变性条件、延伸条件、一个或多个引物组、报告剂、寡核苷酸探针及其组合。
241.如权利要求239所述的试剂盒，其中所述独特标识符为条形码。
242.如权利要求239所述的试剂盒，其中所述独特标识符为RFID标签。
243.一种用于检测粪便样品中的沙门氏菌的系统，其包括：
(a)识别模块，用于识别关于用于进行引物延伸反应的一个或多个相关参数的信息，所述信息包含在与所述系统结合使用的试剂盒中；
(b)扩增模块，在识别所述信息时，其自动地使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。
其中所述反应混合物通过将来源于所述粪便样品的裂解物添加至包含进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器中而获得，所述试剂包括(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和可选的逆转录酶，以及(ii)一个或多个引物组，每个引物组均能够与来自沙门氏菌基因组或沙门氏菌转录物组的靶核酸序列或其变体特异性结合。
244.如权利要求243所述的系统，其中所述系统进一步包括用于向接收者输出指示所述扩增产物的量和/或存在的信息的输出模块。
245.如权利要求243所述的系统，其中所述识别模块包含用于扫描所述试剂盒上的条形码以提取信息的条形码扫描模块。
246.如权利要求243所述的系统，其中所述识别模块包含用于识别所述试剂盒上的RFID标签以提取信息的RFID识别模块。
247.如权利要求243所述的系统，其中所述参数选自所述引物延伸反应的系列数目、每个系列中的循环数、变性条件、延伸条件、一个或多个引物组、报告剂、寡核苷酸探针。
248.如权利要求243所述的系统，其中在识别所述信息时，所述识别模块与所述扩增模块进行通信，从而将所述一个或多个相关参数传送至所述扩增模块，以供进行所述多个系列的引物延伸反应。
249.如权利要求243所述的系统，其进一步包括用于检测所述扩增产物的量和/或存在的检测模块。
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