CN101967516B

CN101967516B - 一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN101967516B
Application number: CN201010145729A
Authority: CN
Inventors: 田桢干; 方筠; 韩晓辉; 陆晔; 张继伦; 张宏; 钱宇; 何宇平; 何琼; 董瑞华; 高秀洁; 陈华云
Original assignee: Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC; Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd; Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Priority date: 2010-04-12
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-04-12
Also published as: CN101967516A

Abstract

本发明涉及一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包含DNA提取液；PCR反应液：由PCR反应缓冲液、四对霍乱弧菌特异性的正、反向引物、四条霍乱弧菌特异性的探针组成，引物和探针分别根据溶血素基因、O139型霍乱弧菌O抗原基因、O1型霍乱弧菌O抗原基因和霍乱毒素(CTX)毒力基因的核酸序列的特异性保守区进行设计；Taq酶系；阳性质控品；阴性质控品。本发明结果可靠稳定，操作简单，快速，能够实现对霍乱弧菌分型及其是否具备毒力基因的快速判定，利于霍乱弧菌引起的公共卫生事件的溯源和检测工作，同时也利于霍乱弧菌的常规监测。

Description

一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

霍乱是一类以腹泻为主要症状的烈性传染病，至今已发生7次世界大流行，1961年开始由埃尔托霍乱弧菌引起的霍乱第7次世界大流行，波及140个国家和地区，报告病例400万以上。据WHO专家会议估计，全球每年约发生550万例，其中以亚洲、非洲和拉丁美洲较为严重，引起亚洲10万和非洲2万人死亡。时至今日，霍乱仍然是最危险的烈性传染病之一。因此，早期迅速和正确的诊断对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。

目前霍乱弧菌已被分为200多个血清群，但只有O1血清群和O139血清群能够引起流行。霍乱弧菌的主要致病因素包括霍乱毒素(cholera toxin，CTX)，产生毒素的霍乱弧菌致病力强，易引起流行和暴发，非产毒的霍乱弧菌一般致病力不强或仅引起散发的腹泻病例。因此，分型及对CTX毒素的检测对判断流行株、非流行株，判定疫情的严重程度，从而采取不同防制策略和措施有着重要作用。

霍乱弧菌检测方法主要有常规检验方法、生物学方法和分子生物学方法等几大类，但常规检验方法(直接镜检和细菌分离培养)和生物学方法(各种实验动物模型和细胞方法)均存在检测时间长，通量小或条件要求高等缺点，不适合用于广泛应用。PCR和酶联免疫技术是目前在霍乱弧菌检测中使用最广泛的分子生物学方法，而实时荧光PCR技术是一种新的PCR方法，是在常规PCR反应的基础上增加了能与扩增模板特异性结合的探针，与传统PCR相比，该方法无需对PCR产物进行再处理，完全是在封闭状态下完成检测的全过程，具有实时、准确、快速等特点。

实时荧光PCR技术是一种直接检测核酸的分子生物学技术，具有灵敏度高，特异性好，简便，廉价等优点。本发明采用多重实时荧光PCR方法，利用针对霍乱弧菌溶血素基因、O抗原基因及CTX毒力基因核酸序列的高效、特异的引物和荧光探针，在同一管中进行扩增，最后从扩增曲线及Ct值判定各基因的扩增情况，并据此对其型别及毒力基因作出判断。本发明涉及的试剂盒可广泛运用于霍乱弧菌分型及毒力基因的检测，作为血清学试验及细菌分离培养法的可靠补充，提高检测的准确性和时效性，可大大地降低检测的周期，有利于霍乱弧菌的快速检测和分型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，本发明能对霍乱弧菌及其CTX毒力基因进行检测，同时可区分O139血清型和O1血清型，可广泛用于由霍乱弧菌感染所致疾病的检测或公共卫生事件的溯源，指导临床治疗以及疫情监控等。

本发明在对GENBANK上已知的溶血素基因、O139型霍乱弧菌O抗原基因、O1型霍乱弧菌O抗原基因和CTX毒力基因的核酸序列进行查找、比对的基础上，寻找以上四个基因各自核酸序列的特异性保守区，并针对各自的保守区分别设计O抗原基因、溶血素基因、CTX毒力基因的靶多核苷酸引物和探针，这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺等的PCR反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现体外核酸的循环扩增。依据四重PCR的扩增曲线及Ct值进行霍乱弧菌分型及毒力基因检测，从而实现对霍乱弧菌及其主要致病型别的检测或监测。

本发明所提供的霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，包括下列组成：

(1)DNA提取液

(2)PCR反应液：由PCR反应缓冲液、四对霍乱弧菌特异性的正、反向引物、四条霍乱弧菌特异性的探针组成，引物和探针分别根据溶血素基因、O139型霍乱弧菌O抗原基因、O1型霍乱弧菌O抗原基因和霍乱毒素(CTX)毒力基因的核酸序列的特异性保守区进行设计；荧光探针由荧光报告基团与荧光淬灭基团双色标记；

(3)Taq酶系；

(4)阳性质控品：为克隆构建并经测序确认的O139型霍乱弧菌O抗原基因、O1型霍乱弧菌O抗原基因、溶血素基因和CTX毒力基因四个基因PCR扩增产物拼接的DNA片段；

(5)阴性质控品：为生理盐水。

DNA提取液由40mM NaOH、20mMTris-HCl(pH8.8)、5％TritonX-100、0.1mM EDTA(pH8.0)组成。

PCR反应液中的PCR反应缓冲液优选由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.5)、MgCl₂(8mmol/L)、KCl(250mmol/L)和dNTPs(25mmol/L)组成。

PCR反应液中霍乱弧菌靶多核苷酸扩增的四对正、反向引物的序列见序列表SEQ.ID.NO1-8。

PCR反应液中用于荧光PCR扩增的四条霍乱弧菌寡核苷酸探针序列分别见序列表SEQ.ID.NO9-12，所述的PCR反应液中任意一条荧光标记探针荧光报告基团可为以下任意一种FAM、HEX、TEXAS、CY3、CY5、TAMRA、TET、JOE、VIC、NED、ROX；荧光淬灭基团可为以下任意一种TAMRA、BHQ、DABCYL。SEQ ID NO9探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1，SEQ ID NO10探针的两端分别结合有荧光发生基团CY5和荧光淬灭基团BHQ2，SEQ ID NO11探针的两端分别结合有荧光发生基团TEXAS RED和荧光淬灭基团BHQ2，SEQ ID NO12探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。

PCR反应液中所述的引物浓度均优选为0.2mmol/L，所述的探针浓度均优选为0.1mmol/L。

Taq酶系中的主要成份热启动Taq酶可采用市售的产品，如Qiagen公司产品，其中每人份试剂Taq酶的用量为5U。

所述的四个DNA片段阳性质控品用紫外分光光度计分别测定260nm的吸光度(OD260)和280nm的吸光度(OD280)，要求1.60＜OD260/OD280＜2.10。

本发明试剂盒中进行待检标本检测同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测呈阳性，阴性质控品检测呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测方法，包括如下步骤：

(1)标本前处理；

(2)核酸提取：取培养后的菌液50μl于灭菌1.5ml离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1min，12，000rpm离心5min，备用或-20±5℃保存待用；

(3)根据本发明的试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增及检测

a.试剂准备：按比例取相应量的PCR反应液、Taq酶系，充分混匀后按30μl/管分装成PCR反应管，备用；

b.加样：向PCR反应管中，分别加入提取后的DNA溶液20μl，或者阴、阳性质控品20μl，并盖紧管盖，放入仪器样品槽；

c.PCR扩增；

(4)结果分析。

本发明的PCR扩增的条件优选为：95℃15分钟；94℃15秒，55℃45秒，循环40次。

本发明的试剂盒在扩增待检标本时，检测过程由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于由于霍乱弧菌分型及毒力基因的检测、霍乱弧菌常规监测以及由霍乱弧菌引起的突发公共卫生事件的溯源监控等多个领域研究。

本发明与现有试剂盒相比，具有如下优点：①可对霍乱弧菌溶血素基因、O1或O139型霍乱弧菌特异抗原基因以及CTX毒力基因的扩增水平进行检测，从而达到一个反应即可实现霍乱弧菌分型和毒力基因检测的目的，更有助于霍乱弧菌感染的的检测，也可用于常规监测；②荧光PCR技术针对四种基因特异性序列设计引物、探针，与血清分型相比具有更高的特异性和更多的检测指标，与分离培养法相比具有操作简便、时间短、通量大的优点，更适用于大多数霍乱弧菌患者的检测和疫情暴发时的筛查；③闭管检测不需PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。

附图说明

图1实施例1的PCR扩增的反应条件；

图2实施例2的试剂盒阴性质控品的扩增曲线；

图中的扩增曲线为不呈S型曲线，且Ct均大于37，说明检测样本中无霍乱弧菌核酸的扩增；

图3实施例2的试剂盒阳性质控品的扩增曲线；

图中扩增曲线为S型曲线，且Ct值均小于37，说明检测体系可以有效地检测到霍乱弧菌四种基因的扩增；

图4实施例2的2例阴性样本的扩增曲线；

图中同一样本的扩增曲线不呈S型曲线，且Ct值均大于37，说明2例阴性样本中无霍乱弧菌核酸的扩增；

图5实施例2的2例阳性样本的扩增曲线；

图中霍乱弧菌O139抗原基因、溶血素基因和CTX毒力基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明2例样本均为霍乱弧菌O139型感染，且该菌株中含有CTX毒力基因；

图6实施例2的3例阴性样本的扩增曲线；

图中同一样本的扩增曲线不呈S型曲线，且Ct值均大于37，说明3例样本均无霍乱弧菌核酸的扩增；

图7实施例2的6例阳性样本的扩增曲线；

图中2例样本霍乱弧菌O1抗原基因、溶血素基因和CTX毒力基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明2例样本存在霍乱弧菌O1型的感染，且具有CTX毒力基因；图中2例样本霍乱弧菌溶血素基因和CTX毒力基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明2例样本存在非O1非O139型霍乱弧菌感染，且具有CTX毒力基因；图中2例样本霍乱弧菌溶血素基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明2例阳性样本存在非O1非O139型霍乱弧菌感染，菌株不具有CTX毒力基因。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：

DNA提取液(1.2mL/管)1管：由40mM NaOH、20mMTris-HCl(pH8.8)、5％TritonX-100、0.1mM EDTA(pH8.0)组成。

PCR反应液(650μl/管)1管：PCR反应缓冲液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.5)、MgCl₂(8mmol/L)、KCl(250mmol/L)和dNTPs(25mmol/L)组成；用于荧光PCR扩增的四条霍乱弧菌寡核苷酸探针序列分别见序列表SEQ.ID.NO9-12，SEQ ID NO9探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1，SEQ ID NO10探针的两端分别结合有荧光发生基团CY5和荧光淬灭基团BHQ2，SEQ ID NO11探针的两端分别结合有荧光发生基团TEXAS RED和荧光淬灭基团BHQ2，SEQ ID NO12探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1；引物浓度均为0.2mmol/L，探针浓度均为0.1mmol/L。

Taq酶系(75μl/管)1管：Qiagen公司产品，其中每人份试剂Taq酶的用量为5U。

阳性质控品(100μl/管)1管：为克隆构建并经测序确认的O139型霍乱弧菌O抗原基因、

O1型霍乱弧菌O抗原基因、溶血素基因和CTX毒力基因四个基因PCR扩增产物拼接的DNA片段。

阴性质控品(100μl/管)1管：生理盐水。

2、标本的采集、保存和运输

2.1适用标本类型：动植物食品及其加工食品、粪便。

2.2标本采集：

2.2.1动植物食品及其加工食品

动植物食品及其加工食品包括冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品；鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品。按照常规国标方法，无菌操作称取25g(ml)食品放入无菌均质杯内，密闭送检。

2.2.2粪便

腹泻病人样品应争取在发病早期，服用抗菌药物之前采取，并尽快送至实验室。用棉拭采取自然排出的新鲜大便，一般要求水样便采1～3ml，成形便采指甲大小的粪量；无自然排出的新鲜粪便时，可用棉拭子由肛门插入直肠内采取：小孩插入直肠内1～3cm采样，成人插入直肠内3～5cm采样，使拭子变成湿润并染有一些粪便颜色。将棉球或拭子放入无菌离心管密闭送检或培养后送检。

2.3标本的保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于2～8℃(1～2天)或-20±5℃(6个月)待测。标本运送时，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。

3、标本前处理及核酸提取：

3.1标本前处理

3.1.1食品类标本处理

如为冷冻食品，应于室温解冻，且不超过18h；若不能及时检验，应置于-20±5℃保存。非冷冻的易腐食品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2～8℃冰箱保存，在24h内检验。若为固体食品应以灭菌剪刀充分剪碎或用匀浆器均质成匀浆后置于均质杯内。(按照食品质量∶培养基体积＝1∶9的比例)在均质杯内(25g食品)加入营养肉汤培养基225ml，均质混匀，37℃摇床培养过夜备用。

3.1.2粪便标本处理

直接把棉球或拭子接种于5～10ml营养肉汤培养基中，37℃摇床培养过夜备用。

3.2核酸提取

取培养后的菌液50μl于灭菌1.5ml离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±lmin，12，000rpm离心5min，备用或-20±5℃保存待用。

4、实时荧光定量PCR扩增及检测

4.1试剂准备：按比例取相应量的PCR反应液、Taq酶系(PCR反应液27μl/人份+Taq酶系3μl/人份)，充分混匀后按30μl/管分装成PCR反应管，备用。

4.2加样：向PCR反应管中，分别加入提取后的DNA溶液20μl，或者阴、阳性质控品20μl，并盖紧管盖，放入仪器样品槽。

4.3编辑：(ABI Prism 7500荧光定量PCR仪)

打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector，选择Reporter为FAM和Quencher为BHQ1，然后选择Reporter为CY5和Quencher为BHQ2，再选择Reporter为TEXAS和Quencher为BHQ2，最后选择Reporter为HEX和Quencher为BHQ1后关闭窗口。在Passive Reference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件：95℃15分钟；94℃15秒，55℃45秒；40个循环(见附图1)。所有设置完成后保存文件，运行。

4.4结果分析：

反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amp plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：15，并打开manual设定Threshold：5000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

实施例2

应用霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒检测临床样品

选取2例经过分离培养法检测为霍乱弧菌阴性，2例经过分离培养法检测为霍乱弧菌O139型阳性的标本，标本核酸提取、PCR扩增及结果分析参照实施例1进行，同时进行阴、阳性质控品的检测。

检测结果解释：

阴性质控品的扩增曲线不呈S型曲线，且Ct值均大于37，说明阴性质控品中霍乱弧菌核酸的扩增(见附图2)。阳性质控品的扩增曲线为S型曲线，且Ct值小于37，在试剂盒质控范围内，说明检测体系可以有效地检测到霍乱弧菌核酸的扩增(见附图3)。阴阳性质控品在同一实验中均符合试剂盒的质控要求。

2例经过分离培养法检测为霍乱弧菌阴性的标本经检测，扩增曲线不呈S型曲线，且Ct均大于37，说明该2例样本中不存在霍乱弧菌核酸的扩增(见附图4)。

2例经过分离培养法检测为霍乱弧菌阳性的标本经检测，O139抗原基因、溶血素基因和CTX毒力基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明该2例样本中存在O139型霍乱弧菌，且样本菌株具有CTX毒力基因(见附图5)。

实施例3

应用霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒检测临床样品

选取3例经过分离培养法检测为霍乱弧菌阴性，6例经过分离培养法检测为霍乱弧菌阳性的标本，标本核酸提取、PCR扩增及结果分析参照实施例1进行，同时进行阴、阳性质控品的检测。

检测结果解释同实施例2。

3例经过分离培养法检测为霍乱弧菌阴性的标本经检测，扩增曲线不呈S型曲线，且Ct均大于37，说明该3例样本中无霍乱弧菌核酸的扩增(见附图6)。

6例经过分离培养法检测为霍乱弧菌阳性的标本经检测：其中2例样本霍乱弧菌O1抗原基因、溶血素基因和CTX毒力基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明此2例样本中存在O1型霍乱弧菌，且样本菌株具有CTX毒力基因(见附图7)；另有2例样本霍乱弧菌溶血素基因和CTX毒力基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明该2例样本中存在霍乱弧菌，且样本菌株具备CTX毒力基因(见附图7)；最后2例样本霍乱弧菌溶血素基因扩增曲线均为S型曲线，且Ct值均小于37，说明该2例样本中存在不具备CTX毒力基因的非O1非O139型霍乱弧菌(见附图7)。

综合实施例2和实施例3中的两次实验，结果表明13例标本的检测结果与分离培养法的检测结果完全吻合，说明利用本试剂盒对临床标本进行霍乱弧菌分型及毒力基因检测是可行的。与分离培养法相比，本试剂盒能同时进行霍乱弧菌的分型和与致病性密切相关的毒力基因的检测，并且通过四对基因的同时检测显著降低试验中假阳性及假阴性结果的产生，加之操作简便、检测时间短、检测通量大、自动化程度高等优点，适合于大范围快速筛查，有较好的市场前景。

序列表

<110>上海市出入境检验检疫局，中山大学达安基因股份有限公司

<120>一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其检测方法

<160>12

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>PCR正向引物1

<400>1

agcctcttta ttacgggtgg 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>PCR反向引物1

<400>2

ccctcgtgag aaaagacagc 20

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>PCR正向引物2

<400>3

acatattcat gcctattctg acg 23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>PCR反向引物2

<400>4

accaaggtca tctgtaagta caac 24

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>PCR正向引物3

<400>5

gccaaaattg tgcgtatcag 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>PCR反向引物3

<400>6

ataatcttgg gcaatcgca 19

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>PCR正向引物4

<400>7

acagaatgag tactttgacc gaggta 26

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>PCR反向引物4

<400>8

aaactaattg aggtggaaac atatcc 26

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>荧光标记探针1

<400>9

tcatcccagt tttgaaggca gc 22

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>荧光标记探针2

<400>10

taagcctact ttacctggcc cacac 25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>荧光标记探针3

<400>11

aactggctcc aaactgacga taacc 25

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>荧光标记探针4

<400>12

catcgtgcct aacaaatccc gtctga 26

Claims

1.一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，其特征在于：包括下列组成：

(1)DNA提取液；

(2)PCR反应液：由PCR反应缓冲液、四对霍乱弧菌特异性的正、反向引物、四条霍乱弧菌特异性的荧光探针组成，引物和探针分别根据溶血素基因、O139型霍乱弧菌O抗原基因、O1型霍乱弧菌O抗原基因和霍乱毒素(CTX)毒力基因的核酸序列的特异性保守区进行设计；荧光探针由荧光报告基团与荧光淬灭基团双色标记；

(3)Taq酶系：主要成份为热启动Taq酶；

(5)阴性质控品：为生理盐水或纯水；

所述(2)的PCR反应液中霍乱弧菌靶多核苷酸扩增的四对正反向引物的序列见序列表SEQ.ID.NO1-8：

正向引物1：SEQ.ID.NO1反向引物1：SEQ.ID.NO2

正向引物2：SEQ.ID.NO3反向引物2：SEQ.ID.NO4

正向引物3：SEQ.ID.NO5反向引物3：SEQ.ID.NO6

正向引物4：SEQ.ID.NO7反向引物4：SEQ.ID.NO8

所述(2)的PCR反应液中用于荧光PCR扩增的四条霍乱弧菌寡核苷酸探针序列分别见序列表SEQ.ID.NO9-12。

2.根据权利要求1所述的霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的DNA提取液由40mM NaOH，pH8.8的20mM Tris-HCl，5％TritonX-100，pH8.0的0.1mM EDTA组成。

3.根据权利要求1所述的霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应缓冲液由50mmol/L Tris-HCl，pH8.5的8mmol/L MgCl₂，250mmol/L KCl，25mmol/L dNTPs组成。

4.根据权利要求1所述的霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应液中任意一条荧光标记探针荧光报告基团可为以下任意一种FAM、HEX、TEXAS、CY3、CY5、TAMRA、TET、JOE、VIC、NED、ROX；荧光淬灭基团可为以下任意一种TAMRA、BHQ、DABCYL。

5.根据权利要求1所述的霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的SEQ IDNO9探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1，SEQ ID NO10探针的两端分别结合有荧光发生基团CY5和荧光淬灭基团BHQ2，SEQ ID NO11探针的两端分别结合有荧光发生基团TEXAS RED和荧光淬灭基团BHQ2，SEQ ID NO12探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。

6.根据权利要求1所述的霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物浓度为0.2mmol/L，所述的探针浓度为0.1mmol/L。

7.根据权利要求1所述的霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒，其特征在于：所述的热启动Taq酶的用量为每人份试剂5U。