CN102154497A - 霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法 - Google Patents

Abstract

霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法。所述引物和探针分别是序列为SEQ ID NO.1～3的沙门氏菌的fimY基因的检测引物和探针，序列为SEQ ID NO.4～6的霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针以及序列为SEQ ID NO.7～9的副溶血性弧菌的toxR基因的检测引物和探针。基于此，本发明进一步公开了包含上述引物和探针序列的检测方法。本发明的探针和引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。

Description

霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法

技术领域

本发明涉及食品中病原微生物的检测方法，尤其涉及利用实时荧光PCR技术检测样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的方法。还涉及检测所使用的特异性引物和探针序列。

背景技术

快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的重要条件。现有的检测方法中，对霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的检测仍采用常规的微生物检测方法，这些方法费时费力，无法满足快速高通量检测的要求，检测时还会出现假阳性，影响结果分析，可能会带来较大的经济损失。并且，食品检测中常常是一份样品同时检测几种致病性微生物。因此，有必要研究一种方法，可同时针对多个致病菌、快速且大批量进行检测。在PCR反应中使用一对以上的引物和不同荧光标记物的探针进行检测的多重实时PCR技术在同一样品的多种致病菌检测中已经有一定的应用，但现有技术中还未见有针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌检测的多重PCR技术。本发明人即旨在建立利用多重实时PCR技术快速、准确、灵敏检测多种致病菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供食品样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR检测方法，以及检测中所使用的包含特异性引物及探针序列。

为实现上述目的，本发明首先提供食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针，它们分别是：

①沙门氏菌的fimY基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-CCGTATGGCTGGGCGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-CAGAGGCCAGATTTT-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′--GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT--3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG-3′；

③副溶血性弧菌的toxR基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-CAAACATCAAACTGTTCGCACAA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCAGCGACCTTTCTCTGAAATATT-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-CTCGACGGCTGAATC-3′。

本发明进一步提供了利用上述引物和探针的食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR检测方法，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：总体积20ul，包括步骤①制得的模板DNA溶液1μl，2×PCRTaqman GEx酶预混液10μl，沙门氏菌上下游引物各0.8μL、探针0.3μL，霍乱弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，副溶血性弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水5.1μl；其中各引物和探针的浓度均为10μM；

以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

本发明中所应用的具体的判断标准是：

Ct值≥40，可判断样品结果为阴性，可直接报告未检出相应致病菌；

Ct值≤35.0，可判断该样品结果为阳性；

Ct值＞35.0而＜40，建议重做样本。重做结果Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。

与经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法相比，本发明的方法更快速、准确。且较一般的多重PCR方法特异性强，灵敏度高，能够同时对以上述三种病原菌进行检测和鉴定。对此三种菌的检测特异性均为100％，检测灵敏度分别为沙门氏菌：13CFU/ml、霍乱弧菌17CFU/ml和副溶血性弧菌23CFU/ml。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

若无特殊说明，本部分试验所用生物样品来自丹东出入境检验检疫局微生物实验室、沈阳出入境检验检疫局微生物实验室和辽宁出入境检验检疫局微生物实验室的水产品和动植物样品。

DNA提取试剂盒(货号D9093)购于宝生物工程(大连)有限公司；

2×PCR Taqman GEx酶预混液(美国应用生物系统公司)

ABI 7300实时荧光PCR仪(ABI公司，美国)，

实施例1、检测方法的建立

一、引物和探针的设计

根据同源性基因筛查比较结果，选择具有很高特异性的沙门氏菌的fimY基因(SEQ ID NO.10)、霍乱弧菌的hlyA基因(SEQ ID NO.11)和副溶血性弧菌的toxR基因(SEQ ID NO.12)为检测扩增的目标基因。据NCBI上已公布的上述基因的核酸序列，并通过对检测引物和探针的退火温度的一致性以及GC含量的相似性等因素的综合考虑，设计了如下特异性引物和探针：

①沙门氏菌的fimY基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-CCGTATGGCTGGGCGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-CAGAGGCCAGATTTT-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′--GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT--3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG-3′；

③副溶血性弧菌的toxR基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-CAAACATCAAACTGTTCGCACAA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCAGCGACCTTTCTCTGAAATATT-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-CTCGACGGCTGAATC-3′。

二、霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR检测方法的建立：

①制备模板DNA样品溶液；

本实施例基因组DNA的抽提采用宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA提取试剂盒(货号D9093)并按其操作说明进行抽提样品DNA。

DNA浓度和纯度的测定：取5μL制得的DNA溶液加ddH₂O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照如下公式计算获得：C＝A×N×50/1000，式中：

C为DNA浓度(μg/μL)；

A为260nm处的吸光值；

N为核酸稀释倍数；

1OD_260nm＝50μg/mL双链DNA；

当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。

2、m-PCR检测

①反应体系：总体积20ul，包括步骤1制得的模板DNA溶液1μl，2×PCRTaqman GEx酶预混液10μl，沙门氏菌上下游引物各0.8μL、探针0.3μL，霍乱弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，副溶血性弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水5.1μl；

其中各引物和探针的浓度均为10μM；

②以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，其中Ct值(cycle threshold)是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；

3、结果判断：

Ct值≥40，可判断样品结果为阴性，可直接报告未检出相应致病菌；

Ct值≤35.0，可判断该样品结果为阳性；

Ct值＞35.0而＜40，建议重做样本。重做结果Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。

对于阳性结果，沙门氏菌参照GB 4789.4-2010方法、霍乱弧菌和副溶血性弧菌参照ISO/TS 21872-1方法做进一步的生化鉴定和报告。

实施例2、特异性试验

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法检测含有沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌的DNA样品。同时检测含有单增李斯特氏菌、麦氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、拟态弧菌、创伤弧菌、弗尼斯弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌等其它致病菌DNA样品，以对方法的特异性进行评估，检测结果如下。

阴性对照结果显示，FAM、NED和VIC通道均无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染。阳性对照结果显示，FAM、NED和VIC通道均有荧光信号检出，反应结果正常。

对沙门氏菌中fimY基因进行检测结果显示，在Ct值为15.5左右时，出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对霍乱弧菌中hlyA基因进行检测结果显示，在Ct值为18左右时，出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对副溶血性弧菌中toxR基因进行检测结果显示，在Ct值为17左右时，出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

其他致病菌的fimY基因、hlyA基因和toxR基因检测结果显示，FAM、NED和VIC三通道，均无荧光信号检出，检测结果均为阴性。

由上述实验结果可见，本发明具有很好的特异性。

实施例3、灵敏度试验

一、标准菌株纯培养物检测灵敏度

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法，对沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌标准菌株纯培养物进行检测灵敏度的研究。

取上述三种标准菌株于普通肉汤培养基中培养18h左右后，测其OD值，估计其菌数，然后按十倍递增进行梯度稀释到10^-7，取最后四个稀释液的菌液进行平板计数，每个稀释度重复3个，按照相应的方法培养后进行菌落计数取平均值确定其真实的菌密度。同时每个稀释液各取1mL菌液于2mL离心管中并作3管重复，用于提取DNA并应用本发明方法进行三重实时荧光PCR检测，以确定本发明方法的检测灵敏度。

检测结果：阴性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均有荧光信号检出，反应结果正常；标准菌株纯培养物灵敏度检测结果显示，沙门氏菌标准菌株浓度分别为1300CFU/ml、130CFU/ml和13CFU/ml时均能很好检出，霍乱弧菌标准菌株浓度分别为1700CFU/ml、170CFU/ml和17CFU/ml时均能很好检出，副溶血性弧菌标准菌株浓度分别为2300CFU/ml、230CFU/ml和23CFU/ml时均能很好检出。

结果表明该标准方法对标准菌株纯培养物检测灵敏度分别为：沙门氏菌13CFU/ml、霍乱弧菌17CFU/ml和副溶血性弧菌23CFU/ml。

二、样品中添加沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌标准菌株的灵敏度实验

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法，对样品中添加沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌标准菌株进行检测灵敏度的研究。

选用已经确认沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌均为阴性的样品，分别取10g样品加入100mL增菌液中同时添加已知不同浓度梯度的上述三种致病菌，均质后取1mL均质液提取DNA，用于三重灵敏度试验，确定样品中添加上述三种致病菌的灵敏度。同时提取阴性样品均质液1mL提DNA用于PCR检测。

检测结果：阴性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均有荧光信号检出，反应结果正常；样品中添加沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌标准菌株灵敏度检测结果显示，沙门氏菌菌株添加浓度分别为1300CFU/ml、130CFU/ml和13CFU/ml时均能很好检出，霍乱弧菌菌株添加浓度分别为1700CFU/ml、170CFU/ml和17CFU/ml时均能很好检出，副溶血性弧菌菌株添加浓度分别为2300CFU/ml、230CFU/ml和23CFU/ml时均能很好检出。

结果表明该标准方法对样品中添加沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌标准菌株检测灵敏度分别为：沙门氏菌13CFU/ml、霍乱弧菌17CFU/ml和副溶血性弧菌23CFU/ml。

实施例4、应用于实际样品检测

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法，以传统的检测方法为对照(沙门氏菌检测：GB 4789.4-2010；霍乱弧菌检测：SN/T 1022-2010；副溶血性弧菌检测：SN/T 0173-2010)。实际检测样品包括江瑶贝、蚬子肉、冻鸡肉及冻花菜等共358份。检测结果如下表(表1)所示：

表1

结果显示，所检测实际样品共358份，其中：

检测水产品188份，采用m-PCR方法检测沙门氏菌阳性9份，霍乱弧菌阳性11份，副溶血性弧菌阳性12份，与采用传统生化培养方法检测所得结果一致；

检测动物产品62份，采用m-PCR方法检测沙门氏菌阳性8份，霍乱弧菌和副溶血性弧菌均未检出，与采用传统生化培养方法检测所得结果一致；

检测植物产品108份，采用m-PCR方法检测沙门氏菌阳性4份，霍乱弧菌和副溶血性弧菌均未检出，与采用传统生化培养方法检测所得结果一致。

由大量的实际应用结果可见，应用本发明方法检测沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌三种致病菌，具有较好的应用结果。

Claims (2)

1.霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针，分别是：

①沙门氏菌的fimY基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-CCGTATGGCTGGGCGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-CAGAGGCCAGATTTT-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′--GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT--3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG-3′；

③副溶血性弧菌的toxR基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-CAAACATCAAACTGTTCGCACAA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCAGCGACCTTTCTCTGAAATATT-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-CTCGACGGCTGAATC-3′。

2.霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR检测方法，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：总体积20ul，包括步骤①制得的模板DNA溶液1μl，2×PCRTaqman GEx酶预混液10μl，沙门氏菌上下游引物各0.8μL、探针0.3μL，霍乱弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，副溶血性弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水5.1μl；其中各引物和探针的浓度均为10μM；

以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。