CN102443629B - 一种沙门氏菌荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种沙门氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照及阴性对照。其特异性引物的序列为：上游引物：5’-TGCGCCTGCCGTTATCAC-3’；下游引物：5’-AATTGAGCTGTTGGTTCAGTAACTC-3’；荧光探针序列为：5’-CCAACGCCGCAGATATTTGATCGCC-3’。采用本发明的试剂盒检测临床粪便中的沙门氏菌具有很好的特异性、敏感性及稳定性，可在2-3小时内完成整个检测过程，同时也能快速准确地检测食品或者其他培养物中的沙门氏菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种利用沙门氏菌的高度保守序列设计特异性引物和探针，运用荧光定量PCR技术开发的检测沙门氏菌的试剂盒及其检测方法。
背景技术
沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科的一个大属，其菌型繁多，分布广泛，是常见的重要的人畜共患病病原菌之一，也是引起人发生食物中毒最常见的病原菌。据统计，在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒也排在细菌性食物中毒的首位，为了查找引起食物中毒的病原菌，通常采集患者的排泄物、呕吐物、粪便、剩余食物、用具等进行检测，其中以粪便的检测最为常见和普遍，粪便中沙门氏菌的检测对患者的诊断及治疗具有重要的指导意义。
目前，世界各国对食源性沙门氏菌的检测方法及限量标准均制定出了非常严格的规定，使受污染的食品能够得到及时处理，以保障食品质量及食品安全。然而，包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的临床检测仍然采用传统的培养方法，这种方法程序繁琐，耗费大量的时间，报告检验结果大约需要4-7天，已经远远不能满足现代快速检测诊断的需要。因此，建立一种快速、准确的临床沙门氏菌检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种沙门氏菌检测试剂盒及检测方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种检测沙门氏菌的试剂盒，其组成包括：沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照及阴性对照。
1、所述的沙门氏菌PCR反应液包括：PCR缓冲液（含MgCl2），dNTP以及沙门氏菌特异性上游引物、下游引物和探针，其中MgCl2 浓度1.5 mM；dNTP浓度为0.1-0.5 mM；上、下游引物浓度为0.1-1.0μM，探针浓度为0.1-0.5μM。
2、根据沙门氏菌fimY基因序列（GenBank登录号为M90677）设计并合成特异性引物和荧光探针，其序列如下：
上游引物：5’- TGCGCCTGCCGTTATCAC -3’；
下游引物：5’- AATTGAGCTGTTGGTTCAGTAACTC -3’；
荧光探针：5’- CCAACGCCGCAGATATTTGATCGCC-3’。
3、制备阳性标准品即阳性对照：上述引物的PCR扩增的阳性产物经过2%低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外下，切下目的条带回收纯化，将产物连接到载体上构建成质粒。提取阳性克隆质粒，稀释到适当的浓度即可作为阳性标准品。
4、为了达到定量的效果，利用阳性克隆质粒稀释制备阳性标准品梯度：取上述阳性质粒5μL，按10倍梯度稀释，依次稀释4-7个梯度即为阳性标准品梯度。以梯度阳性标准品及样本DNA在相同条件下进行荧光定量PCR反应，以梯度阳性标准品的浓度对数值为纵坐标，实验结果Ct值为横坐标绘制标准曲线，根据样本测试得到的Ct值，可计算获得样本中的沙门氏菌的浓度。
本发明的另一目的在于提供一种检测沙门氏菌的方法，其步骤如下：
1、提取待测样品基因组DNA。
2、以上述基因组DNA为模板，设定阳性标准品对照和双蒸水阴性对照，与沙门氏菌PCR反应液及Taq酶混合配制PCR反应体系，在优化的反应条件下进行荧光定量PCR反应。
3、选择荧光检测模式检测FAM荧光，以6-15个循环的荧光信号标准差的10倍作为阈值，以正常阴性对照荧光值的最高点作为基线，由电脑自动分析并计算结果。
所述步骤2中PCR反应体系终浓度组成如下：1×PCR 缓冲液，0.1-0.5mM dNTP，0.1-1.0μM上、下游引物，0.1-0.5μM荧光探针，0.5-5U/反应的Taq酶，10-1000ng/μL基因组DNA模板；
所述步骤2中的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性5sec，55℃退火35sec，40个循环。
荧光定量PCR检测技术融合传统PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体，具有很高的检测灵敏度，同时，扩增的目标序列由特异性引物和荧光探针双重控制，具有更好的特异性，使检测假阳性大大降低。
本发明针对沙门氏菌的fim Y基因序列设计特异性引物和荧光探针研制出检测沙门氏菌的试剂盒，fimY基因经证实是沙门氏菌的高度保守序列，以其为检测靶点设计的特异性引物和探针通过荧光定量PCR技术检测沙门氏菌，在检测临床粪便样品、食品和培养物中的沙门氏菌时，具有更高的特异性、敏感性和稳定性，是一种快速、准确的沙门氏菌检测方法。
附图说明
图1 是荧光定量PCR标准品扩增曲线；
图2 是荧光定量PCR标准曲线；
图3 是实施例2中荧光定量PCR检测特异性扩增曲线；
图4 是实施例2中荧光定量PCR检测灵敏度扩增曲线；
图5 是实施例3中临床粪便样本的荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明技术方案作进一步说明。
实施例1
荧光定量PCR检测方法的建立
1、特异性引物、荧光探针的获得：
从GenBank上查找各种属沙门氏菌的fimY基因序列，进行同源性比对分析，查找该基因的最保守区域。以登录号为M90677的序列为模板，利用Primer express 2.0 软件设计基于沙门氏菌fimY基因的特异性引物和荧光探针。对所设计的特异性引物和探针序列进行BLAST分析，结果表明该套引物与探针具有较高的特异性。探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-1，委托上海英骏生物技术有限公司合成。
序列如下：（F表示上游引物，R表示下游引物，P表示探针）
F: 5’- TGCGCCTGCCGTTATCAC -3’；
R: 5’- AATTGAGCTGTTGGTTCAGTAACTC -3’；
P: 5’- CCAACGCCGCAGATATTTGATCGCC-3’。
2、制备阳性标准品：上述引物的PCR扩增的阳性产物经过2%低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外下，切下目的条带。用核酸回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）回收纯化，将纯化的PCR产物连接到T载体上，并转化DH5α大肠杆菌，37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选挑取白色菌落。用质粒提取试剂盒（QIAprep Spin Miniprep Kit）提取阳性克隆质粒，稀释后即为阳性标准品。
3、制备阳性标准品梯度：取阳性标准品5μl，以双蒸水按10倍稀释，依次稀释4-7个梯度，即为阳性标准品梯度。
4、采用水煮裂解法提取沙门氏菌的基因组DNA，其步骤如下：取菌悬液1mL于10000rpm离心1min，沉淀重悬于500μl无菌双蒸水中，混匀，置沸水浴中裂解10min，然后置于-20℃冷冻5-6min，10000rpm离心5min，所得上清液即为沙门氏菌基因组DNA。
5、以上述基因组DNA为模板进行PCR反应，反应体系如下：
| 10×PCR Buffer | 2.5μL |
| 2.5mM dNTP | 2μL |
| 0.03 mM上游引物 | 0.5μL |
| 0.03 mM 下游引物 | 0.5μL |
| 0.015 mM荧光探针 | 0.3μL |
| 5U/μL Taq酶 | 0.2μL |
| DNA模板 | 2μL |
| ddH2O | 18.8μL |
| 总反应体系 | 25μL |
10×PCR Buffer成分：100mM Tris-Hcl（pH8.3），500mM KCl，15mM MgCl2
反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性5sec，55℃退火35sec，40个循环。
6、选择荧光检测模式检测FAM荧光，以6-15个循环的荧光信号标准差的10倍作为阈值，以正常阴性对照荧光值的最高点作为基线，由电脑自动分析并计算结果。
7、标准曲线的建立：采用上述步骤5的反应体系及反应条件，对上述标准品质粒的各个梯度进行荧光定量PCR扩增，获得了梯度标准品扩增曲线（如图1所示）和一条标准曲线（如图2所示）。
实施例 2
荧光定量PCR检测方法的性能评估
1、 检测方法的特异性评估，其步骤如下：
（1）、按照实施例1所述的方法设计特异性引物和荧光探针，制备阳性标准品及标准品梯度。
（2）、标准菌株基因组DNA提取：标准菌株（均购于广东省微生物菌种保藏中心）大肠杆菌 (CMCC44103)、单核增生李斯特菌（ATCC19115）、双歧双歧杆菌（ATCC29521）、痢疾志贺氏菌（CMCC51252）、肠炎沙门氏菌（ATCC14028）的基因组DNA的提取均采用细菌基因组提取试剂盒（宁波基内生物技术有限公司）提取，严格按照试剂盒要求步骤进行提取。
（3）、以上述标准菌株基因组DNA为模板进行荧光定量PCR检测，同时设定阳性标准品对照和双蒸水阴性对照，反应体系各组分用量为：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，0.03mM上、下游引物各0.5μL，0.015mM荧光探针0.3μL，5U/μL Taq酶0.2μL，基因组DNA模板2μL，以无菌双蒸水补足25μL；反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性5sec，55℃退火35sec，40个循环。
（4）、选择荧光检测模式检测FAM荧光，以6-15个循环的荧光信号标准差的10倍作为阈值，以正常阴性对照荧光值的最高点作为基线，由电脑自动分析并计算结果。
用上述检测方法对5种标准菌株同时检测，结果（如图3所示），其中标记1、2、3的曲线为阳性标准品扩增的曲线，标记4的曲线为沙门氏菌的扩增曲线，其余非沙门氏菌的标准菌株均未出现扩增曲线，由此可见，该引物对和探针针对fimY基因扩增的特异性较好。
2、 检测方法的灵敏度评估：将质粒标准品稀释为108拷贝/μL~100拷贝/μL，9个梯度，用上述检测方法对这9个梯度进行荧光定量PCR检测，结果见图4，标记为1、2、3、4、5、6、7的曲线分别是浓度为：108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL的质粒扩增曲线，浓度为101拷贝/μL、100拷贝/μL的质粒没有出现指数型扩增曲线，可见该方法最低检测限为102拷贝/μL，样本低于该限度时则无法检出。
3、检测方法的重复性评估：取浓度为102拷贝/μL、104拷贝/μL、106拷贝/μL、108拷贝/μL 4个质粒标准品梯度按上述检测方法进行三次独立检测，每个浓度各重复三次。检测结果显示（表1）：质粒标准品102拷贝/μL、104拷贝/μL、106拷贝/μL、108拷贝/μL不同时间检测的循环阈值平均数分别为：33.52±0.24、29.95±0.07、21.05±0.08、12.32±0.14；其变异系数分别为：0.72%、0.22%、0.36%、1.09%，说明不同时间检测的循环阈值基本保持一致，本检测方法的重复性较好。
实施例3
临床样品中沙门氏菌的荧光定量PCR检测
1、临床样品：细菌性腹泻患儿粪便100例。
2、分别采用传统培养法和本发明所建立的试剂盒对上述样品进行检测，以比对检测结果。
3、传统培养检测方法严格按照GB/T 4789.4-2003的要求进行，检测结果如下表2所示。
4、本发明所建立的检测方法步骤如下：
（1）、按照实施例1所述的方法设计特异性引物和荧光探针，制备阳性标准品及标准品梯度。
（2）、粪便样品细菌基因组DNA提取：采用粪便基因组DNA快速提取试剂盒（原平皓（天津）生物技术有限公司），严格按照试剂盒要求步骤进行提取。
（3）、以上述粪便基因组DNA为模板进行荧光定量PCR检测，同时设定阳性标准品对照和双蒸水阴性对照，反应体系各组分用量为：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，0.03mM上、下游引物各0.5μL，0.015mM荧光探针0.3μL，5U/μL Taq酶0.2μL，基因组DNA模板2μL，以无菌双蒸水补足25μL；反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性5sec，55℃退火35sec，40个循环。
（4）、选择荧光检测模式检测FAM荧光，以6-15个循环的荧光信号标准差的10倍作为阈值，以正常阴性对照荧光值的最高点作为基线，由电脑自动分析并计算结果。样品的检测曲线见图5，结果见表2。
5、100例粪便样本中，以传统培养检测方法所用检测时间为6天，采用本发明建立的荧光定量PCR方法所用检测时间为2.5小时。由表2可以看出，以传统培养检测方法共检出21例沙门氏菌阳性，采用本发明建立的荧光定量PCR方法检出35例沙门氏菌阳性，包括上述21例。由此可见，本发明所建立的荧光定量PCR方法检测粪便中的沙门氏菌比传统培养检测的方法更快速，检测结果更准确，是值得推广的，有很好的应用前景的检测方法。
<120>一种沙门氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
<160> 3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列F
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列P
<400> 3
ccaacgccgcagatatttgatcgcc 25
Claims (1)
1.一种沙门氏菌的荧光定量PCR检测试剂盒，包括沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照及阴性对照，所述沙门氏菌PCR反应液含有PCR缓冲液和dNTP，其特征在于，所述沙门氏菌PCR反应液还含有沙门氏菌特异性上游引物、下游引物和探针，所述引物及探针序列如下：
上游引物：5’- TGCGCCTGCCGTTATCAC -3’；
下游引物：5’- AATTGAGCTGTTGGTTCAGTAACTC -3’；
探针序列：5’- CCAACGCCGCAGATATTTGATCGCC-3’；
所述PCR缓冲液中含有MgCl2 ，所述MgCl2浓度为1.5 mM；所述dNTP浓度为0.1-0.5 mM；上、下游引物浓度为0.1-1.0μM，探针浓度为0.1-0.5μM；Taq酶浓度为0.5-5U/反应。
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Denomination of invention: Fluorescence quantitative PCR (polymerase chain reaction) detection kit for salmonella and detection method thereof Effective date of registration: 20190116 Granted publication date: 20130828 Pledgee: Guangzhou Branch of Guangzhou Bank Co., Ltd. Pledgor: The silver-colored medical test of China center, Guangzhou Co., Ltd Registration number: 2019440000027 |
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Assignee: Shenzhen Xinghai Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: GUANGZHOU HUAYIN MEDICAL LABORATORY CENTER Co.,Ltd. Contract record no.: 2017440000187 Date of cancellation: 20200826 Assignee: GUANGZHOU HEZHU BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: GUANGZHOU HUAYIN MEDICAL LABORATORY CENTER Co.,Ltd. Contract record no.: 2017440000188 Date of cancellation: 20200826 |