CN107699629A - 检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光pcr检测用引物及探针、试剂盒 - Google Patents

检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光pcr检测用引物及探针、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物及探针、试剂盒，分别针对空肠弯曲菌的mapA基因、沙门氏菌的fimY基因、单增李斯特菌的hly基因设计引物和探针。实验结果表明，上述特异性的引物及探针能够同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌，且扩增时没有交叉污染，检测的灵敏度高。

Description

检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检 测用引物及探针、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物及探针、试剂盒。
背景技术
我们日常生活所食用的商品在生产、加工、包装、储存、运输、销售、烹调等各环节都存在一些非故意的污染，主要包括：生物性污染、化学性污染以及放射性污染三类。其中生物性污染发病最为迅速且具有一定的传染性。对于食源性疾病，66％以上由细菌引起的，沙门氏菌、空肠弯曲菌和单增李斯特氏菌是三种人畜共患病的病原体，传染性比较强，能够尽早发现传播源并且切断才是有效的途径。
沙门氏菌(Salmonella)是一群形态、培养、生化反应和抗原构造相类似的革兰氏阴性杆菌，种类繁多，分布广泛。沙门氏菌病的主要是通过蛋、家禽和肉类产品传播，易感人群主要是小孩、老年人及免疫缺陷个体，能够引起肠热症、肠炎症、败血症以及慢性肠炎。空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是抗原构造与肠道杆菌一样具有o、h和k抗原的革兰氏阴性杆菌，主要寄生在多种动物如牛、羊、狗及禽类的生殖道或肠道内，通过分娩或排泄物污染食物和饮水。空肠弯曲菌在人群中普遍易感，尤其是5岁以下儿童，夏秋季多见，感染的产妇可在分娩时传染给胎儿。空肠弯曲菌能够产生内毒素通过侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性短杆菌，广泛存在于自然界，由于该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，所以冷藏食品包括肉类与奶类制品中危害最大。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。因此，在食品卫生微生物检验中，建立一种能够快速、准确并且一次能够同时检测多种致病菌的检测方法具有重要的意义。
然而，基于传统培养的方法来进行检测的，整个过程周期长，操作繁琐，还容易造成错检和漏检。基于普通PCR来进行的多重PCR检测，这种方法虽然周期大大缩短了，但由于空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌菌属比较接近，多种扩增引物同时扩增这三种菌时容易产生交叉污染，影响结果的判定。综上，目前市面上缺乏能够同时高灵敏的检测出空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种致病菌的复合荧光PCR检测用引物及探针。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够同时高灵敏检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针。
此外，还有必要提供一种同时高灵敏检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用试剂盒及其应用。
一种同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，其特征在于，包括：
用于扩增空肠弯曲菌的上游引物mapA-F，所述上游引物mapA-F针对空肠弯曲菌的mapA基因设计；
用于扩增空肠弯曲菌的下游引物mapA-R，所述下游引物mapA-R针对空肠弯曲菌的mapA基因设计；
用于检测空肠弯曲菌的探针probe-1，所述探针probe-1针对空肠弯曲菌的mapA基因设计，所述探针probe-1的两端分别结合有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团；
用于扩增沙门氏菌的上游引物fimY-F，所述上游引物fimY-F针对沙门氏菌的fimY基因设计；
用于扩增沙门氏菌的下游引物fimY-R，所述下游引物fimY-R针对沙门氏菌的fimY基因设计；
用于检测沙门氏菌的探针probe-2，所述探针probe-2针对沙门氏菌的fimY基因设计，所述探针probe-2的两端分别结合有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团；
用于扩增单增李斯特菌的上游引物hly-F，所述上游引物hly-F针对单增李斯特菌的hly基因设计；
用于扩增单增李斯特菌的下游引物hly-R，所述下游引物hly-R针对单增李斯特菌的hly基因设计；
用于检测单增李斯特菌的探针probe-3，所述探针probe-3针对单增李斯特菌的hly基因设计，所述探针probe-3的两端分别结合有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团；
所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团以及所述第三荧光报告基团各不相同。
在一个实施方式中，所述上游引物mapA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物mapA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述上游引物fimY-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述下游引物fimY-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述上游引物hly-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述下游引物hly-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
在一个实施方式中，所述探针probe-1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述探针probe-2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述探针probe-3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
在一个实施方式中，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团和所述第三荧光报告基团均选自FAM荧光基团、JOE荧光基团、cy5荧光基团、ROX荧光基团、VIC荧光基团和TET荧光基团中的一种；
所述第一荧光淬灭基团、所述第二荧光淬灭基团和所述第三荧光淬灭基团均选自Tamara淬灭基团、BHQ20淬灭基团和Dabcy1淬灭基团中的一种。
在一个实施方式中，所述第一荧光报告基团为FAM荧光基团，所述第二荧光报告基团为JOE荧光基团，所述第三荧光报告基团为cy5荧光基团。
一种同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括上述任一项所述的复合荧光PCR检测用引物以及探针。
在一个实施方式中，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTP、直扩PCR聚合酶、阳性对照品以及阴性对照品。
在一个实施方式中，所述上游引物mapA-F、所述下游引物mapA-R、所述探针probe-1、所述上游引物fimY-F、所述下游引物fimY-R、所述探针probe-2、所述上游引物hly-F、所述下游引物hly-R、所述探针probe-3、所述PCR缓冲液与所述dNTP混合形成PCR混合液。
在一个实施方式中，所述PCR混合液中所述上游引物mapA-F、所述下游引物mapA-R、所述探针probe-1、所述上游引物fimY-F、所述下游引物fimY-R、所述探针probe-2、所述上游引物hly-F、所述下游引物hly-R以及所述探针probe-3的浓度均为10μmol/L～30μmol/L，所述dNTP的浓度为1mmol/L～5mmol/L。
上述任一项所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针或者如上述任一项所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒在检测可食用材料中的应用。
上述复合荧光PCR检测用引物以及探针，其中扩增空肠弯曲菌的上游引物mapA-F、下游引物mapA-R以及检测空肠弯曲菌的探针probe-1分别针对空肠弯曲菌的mapA基因设计，扩增沙门氏菌的上游引物fimY-F、下游引物fimY-R以及检测沙门氏菌的探针probe-2分别针对沙门氏菌的fimY基因设计，扩增单增李斯特菌的上游引物hly-F、下游引物hly-R以及检测单增李斯特菌的探针probe-3分别针对沙门氏菌的hly基因设计。实验结果表明，上述特异性的引物及探针能够同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌，且扩增时没有交叉污染，检测的灵敏度高。
附图说明
图1为用实施例1中引物和探针特异性扩增空肠弯曲菌的实时荧光PCR扩增曲线图；
图2为用实施例1中引物和探针特异性扩增沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线图；
图3为用实施例1中引物和探针特异性扩增单增李斯特菌的实时荧光PCR扩增曲线图；
图4为用实施例1中引物和探针特异性扩增梯度稀释的空肠弯曲菌的实时荧光PCR扩增曲线图；
图5为用实施例1中引物和探针特异性扩增梯度稀释的沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线图；
图6为用实施例1中引物和探针特异性扩增梯度稀释的单增李斯特菌的实时荧光PCR扩增曲线图；
图7为用实施例1中引物和探针特异性扩增梯度稀释的空肠弯曲菌的建立的浓度与CT值关系的标准曲线图；
图8为用实施例1中引物和探针特异性扩增梯度稀释的沙门氏菌的建立的浓度与CT值关系的标准曲线图；
图9为用实施例1中引物和探针特异性扩增梯度稀释的单增李斯特菌的建立的浓度与CT值关系的标准曲线图；
图10为用实施例1中引物和探针同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的三重荧光PCR扩增曲线图；
图11为用实施例1中引物和探针同时扩增稀释后的空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的三重荧光PCR扩增曲线图；
图12a为用实施例1中引物和探针特异性三重荧光PCR扩增空肠弯曲菌建立的浓度与CT值关系的标准曲线图；
图12b为用实施例1中引物和探针特异性三重荧光PCR扩增沙门氏菌建立的浓度与CT值关系的标准曲线图；
图12c为用实施例1中引物和探针特异性三重荧光PCR扩增单增李斯特菌建立的浓度与CT值关系的标准曲线图；
图13为用实施例1中引物和探针特异性扩增模拟样品1得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图14为用实施例1中引物和探针特异性扩增模拟样品2得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图15为用实施例1中引物和探针特异性扩增模拟样品3得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图16为用实施例1中引物和探针特异性扩增模拟样品4得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图17为用实施例1中引物和探针特异性扩增模拟样品7得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图18为用对比例1的组合1中引物和探针特异性扩增模拟样品7得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图19为用对比例1的组合2中引物和探针特异性扩增模拟样品7得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图20为用对比例1的组合3中引物和探针特异性扩增模拟样品7得到的实时荧光PCR扩增曲线图；
图21为用对比例1的组合4中引物和探针特异性扩增模拟样品7得到的实时荧光PCR扩增曲线图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
一实施方式的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，包括用于扩增空肠弯曲菌的上游引物mapA-F、用于扩增空肠弯曲菌的下游引物mapA-R、用于检测空肠弯曲菌的探针probe-1、用于扩增沙门氏菌的上游引物fimY-F、用于扩增沙门氏菌的下游引物fimY-R、用于检测沙门氏菌的探针probe-2、用于扩增单增李斯特菌的上游引物hly-F，用于扩增单增李斯特菌的下游引物hly-R以及用于检测单增李斯特菌的探针probe-3。
其中，上游引物mapA-F针对空肠弯曲菌的mapA基因设计，下游引物mapA-R针对空肠弯曲菌的mapA基因设计，探针probe-1针对空肠弯曲菌的mapA基因设计，探针probe-1的两端分别结合有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。
上游引物fimY-F针对沙门氏菌的fimY基因设计，下游引物fimY-R针对沙门氏菌的fimY基因设计，探针probe-2针对沙门氏菌的fimY基因设计，探针probe-2的两端分别结合有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团。
上游引物hly-F针对单增李斯特菌的hly基因设计，下游引物hly-R针对单增李斯特菌的hly基因设计，探针probe-3针对单增李斯特菌的hly基因设计，探针probe-3的两端分别结合有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团。
第一荧光报告基团、第二荧光报告基团以及第三荧光报告基团各不相同。
具体地，空肠弯曲菌的mapA基因的序列参见GenBank上序列号为905321的序列。沙门氏菌的fimY基因的序列参见GenBank上序列号为M90677的序列。单增李斯特菌的hly基因的序列参见GenBank上序列号为DQ844159的序列。
发明人在空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的引物设计、探针设计等方面进行了大量的探索研究，特别是对三种菌属的针对性的基因做了大量的组合研究。预料不到地发现，针对空肠弯曲菌的mapA基因设计上游引物mapA-F、下游引物mapA-R以及探针probe-1，针对沙门氏菌的fimY基因设计上游引物fimY-F、下游引物fimY-R以及探针probe-2，针对单增李斯特菌的hly基因设计上游引物hly-F、下游引物hly-R以及探针probe-3，三种菌的特异性引物和探针组合形成的复合荧光PCR检测用引物以及探针能够同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌，且扩增时没有交叉污染，检测的灵敏度高。
在一个实施方式中，上游引物mapA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物mapA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，使用上游引物mapA-F以及下游引物mapA-R能够特异性的扩增空肠弯曲菌。上游引物fimY-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物fimY-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，使用上游引物fimY-F以及下游引物fimY-R能够特异性的扩增沙门氏菌。上游引物hly-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物hly-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，使用上游引物hly-F和下游引物hly-R能够特异性的扩增单增李斯特菌。上述特定序列的引物组合能够同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌，且扩增时没有交叉污染。
在一个实施方式中，探针probe-1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，探针probe-2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，探针probe-3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。三种特异性设计的探针之间相互不干扰，实现同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌。
在一个实施方式中，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团和第三荧光报告基团均选自FAM荧光基团、JOE荧光基团、cy5荧光基团、ROX荧光基团、VIC荧光基团和TET荧光基团中的一种。第一荧光淬灭基团、第二荧光淬灭基团和第三荧光淬灭基团均选自Tamara淬灭基团、BHQ20淬灭基团和Dabcy1淬灭基团中的一种。
第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团以及所述第三荧光报告基团各不相同，便于通过不同的荧光信号通道分别检测判定样本中是否含有空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌。如果能够检测到第一荧光报告基团的信号，则说明样本中含有空肠弯曲菌。如果能够检测到第二荧光报告基团的信号，则说明样本中含有沙门氏菌。如果能够检测到第三荧光报告基团的信号，则说明样本中含有单增李斯特菌三种菌。第一荧光淬灭基团、第二荧光淬灭基团和第三荧光淬灭基团可以相同，也可以不同，本实施例中，三者相同。
本实施方式中，第一荧光报告基团为FAM荧光基团，第二荧光报告基团为JOE荧光基团，第三荧光报告基团为cy5荧光基团。
上述特异性的引物及探针能够同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌，且扩增时没有交叉污染，检测的灵敏度高。
此外，本发明还提供一实施方式的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒，该试剂盒中包括上述的复合荧光PCR检测用引物以及探针。
在一个实施方式中，该试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTP、直扩PCR聚合酶、阳性对照品以及阴性对照品。
具体地，PCR缓冲液中含有MgCl2，MgCl2的浓度为1mmol/L～10mmol/L。
具体地，dNTP是指包括了dATP、dGTP、dTTP和dCTP的混合物，dNTP为PCR扩增提供原料。
具体地，阳性对照品包括空肠弯曲菌标准品、沙门氏菌标准品和单增李斯特菌标准品。
具体地，阴性对照品为无菌水。
在一个实施方式中，使用时，上游引物mapA-F、下游引物mapA-R、探针probe-1、上游引物fimY-F、下游引物fimY-R、探针probe-2、上游引物hly-F、下游引物hly-R、探针probe-3、PCR缓冲液与dNTP混合形成PCR混合液。
使用时，在PCR混合液中加入直扩PCR聚合酶，从而直接用于处理待检测的样本，无需提取基因组DNA的步骤，一步检测即能够同时测出三种致病菌，大大节省了成本和时间，而且灵敏度与准确度高。
具体地，PCR混合液中上游引物mapA-F、下游引物mapA-R、探针probe-1、上游引物fimY-F、下游引物fimY-R、探针probe-2、上游引物hly-F、下游引物hly-R以及探针probe-3的浓度均为10μmol/L～30μmol/L。dNTP的浓度为1mmol/L～5mmol/L。
具体地，直扩PCR聚合酶的浓度为0.5U/反应～5U/反应。
一实施方式的上述复合荧光PCR检测用引物以及探针在检测可食用材料中的应用。
一实施方式的上述荧光PCR检测用试剂盒在检测可食用材料中的应用。
具体地，可食用材料包括各类可食用的食品，例如肉类制品、奶制品、水果、蔬菜、饮料等等。
使用时，将上述待检测的可食用材料与上述特异性的引物及探针混合，通过荧光PCR检测是否含有空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌。
实验结果表明，上述检测用试剂盒针能够同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌，且扩增时没有交叉污染，检测的灵敏度高。一步即能够同时测出三种致病菌，大大节省了成本和时间，
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
菌株的选取及检测引物、检测探针的设计
实验所用的空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌均为深圳市草履虫生物科技有限公司分离保存。
根据GenBank上的空肠弯曲菌中特异性基因mapA(序列号：905321)，用Oligo软件设计检测引物和检测探针。根据GenBank上查找各种属沙门氏菌的fimY基因序列，进行同源性比对分析，查找该基因的最保守区域，以序列号为M90677的序列为模板，用Oligo软件设计检测引物和检测探针；根据Genbank公布的单增李斯特菌hly基因(单增李斯特菌恪血素O基因)序列J(序列号:DQ844159)，用Oligo软件设计检测引物和检测探针，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。所设计的检测引物和检测探针序列如表1所示。
表1：实时荧光PCR检测引物和检测探针序列
注：probe-1的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMARA；probe-2的5’端标记荧光报告基团JOE，3’端标记淬灭基团TAMARA；probe-3的5’端标记荧光报告基团cy5，3’端标记淬灭基团BHQ2。PCR检测时，选择不同的荧光报告基团通道，检测样品中含有的组分。
一种同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒，包括：PCR混合液、直扩PCR聚合酶(直扩酶omniTaq，美国VitaNavi)、阴性对照以及阳性对照。其中PCR混合液中包括PCR缓冲液、直扩PCR聚合酶、dNTP以及特异性引物和探针。PCR缓冲液中含有MgC12，MgC12浓度为5mmol/L，dNTP浓度为2.5mmol/L。OmniTaq酶浓度为0.5U/反应～5U/反应。特异性引物和探针包括上游引物mapA-F、下游引物mapA-R、探针probe-1、上游引物fimY-F、下游引物fimY-R、探针probe-2、上游引物hly-F、下游引物hly-R、探针probe-3，具体序列参见表1所示，各引物和探针的浓度均为20μmol/L。测试实验
通过如下方法进行测试
(1)提供实施例1的试剂盒。
(2)制备阳性标准品:分别将空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的引物的各PCR产物克隆到载体上构建成质粒，然后提取阳性克隆质粒作为阳性标准品。
(3)制备阳性标准品梯度:为了达到定量的效果，利用阳性克隆质粒稀释制备阳性标准品梯度:取上述阳性质粒5μL，按10倍梯度稀释，依次稀释4～7个梯度即为阳性标准品梯度。以梯度阳性标准品及样本DNA在相同条件下进行荧光定量PCR反应，以梯度阳性标准品的浓度对数值为纵坐标，实验结果Ct值为横坐标绘制标准曲线，根据样本测试得到的Ct值，可计算获得样本中的各菌的浓度。
(4)取部分待测样品加入225mL缓冲蛋白胨水BP，用拍打器拍打20min，37℃培养10h。
(5)取步骤(4)的培养物3μL为模板，步骤(1)的引物和探针在优化的荧光定量PCR反应体系和反应条件下检测样品中的空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌。扩增反应体系为:模板DNA3μL，10×PCR缓冲液3μL，三种20μmol/L TaqMan检测探针各1μL，共3μL，六条20μmol/L检测引物各1μL，共6μL，2.5U Taq聚合酶3μL，去离子水加至30μL。反应条件如下:95℃预变性2min；94 0C变性5sec，60℃退火35sec，40个循环。
(6)根据荧光定量PCR的扩增曲线是否有指数扩增判断结果，如果相对于该菌的阳性对照有指数扩增，表明样本含有该菌，如果没有，则样本中不含该菌。
特异性试验一：空肠弯曲菌的检测引物和检测探针的特异性试验
按照上述测试方法取本公司分离保存的空肠弯曲菌、阳性标准品以及阴性对照培养物，按照上述单重实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增(检测引物和检测探针为针对空肠弯曲菌特异基因mapA设计的检测引物和检测探针，序列参见表1)。其检测结果如图1所示，左边曲线(a)表示扩增本公司分离保存的空肠弯曲菌(浓度为2×107Cfu/mL)，右边曲线(b)表示扩增阳性标准品菌株(标准品是核酸浓度为300ng/μL)。从图1中可以看出，本公司分离保存的空肠弯曲菌与阳性标准品菌株的实时荧光PCR扩增曲线指数期明显，Ct值在20～30之间，为阳性，而阴性对照菌扩增曲线平滑，未出现Ct值，为阴性。
特异性试验二：沙门氏菌的检测引物和检测探针的特异性试验
按照上述测试方法取本公司分离保存的沙门氏菌、阳性标准品以及阴性对照培养物，按照上述单重实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增(检测引物和检测探针为针对沙门氏菌特异基因fimY设计的检测引物和检测探针，序列参见表1)。其检测结果如图2所示，左边曲线(a)表示扩增本公司分离保存的沙门氏菌(浓度为2×107Cfu/mL)，右边曲线(b)表示扩增阳性标准品菌株(标准品是核酸浓度为300ng/μL)。从图2中可以看出，本公司分离保存的沙门氏菌与阳性标准品菌株的实时荧光PCR扩增曲线指数期明显，Ct值在20～40之间，为阳性，而阴性对照菌扩增曲线平滑，未出现Ct值，为阴性。
特异性试验三：单增李斯特菌的检测引物和检测探针的特异性试验
按照上述测试方法取本公司分离保存的单增李斯特菌、阳性标准品以及阴性对照培养物，按照上述单重实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增(检测引物和检测探针为针对单增李斯特菌特异基因hly设计的检测引物和检测探针，序列参见表1)。其检测结果如图3所示，左边曲线(a)表示扩增本公司分离保存的单增李斯特菌(浓度为2×107Cfu/mL)，右边曲线(b)表示扩增阳性标准品菌株(标准品是核酸浓度为300ng/μL)。从图3中可以看出，本公司分离保存的单增李斯特菌与阳性标准品菌株的实时荧光PCR扩增曲线指数期明显，Ct值在20～40之间，为阳性，而阴性对照菌扩增曲线平滑，未出现Ct值，为阴性。
结合特异性试验一、特异性试验二及特异性试验三的结果，说明实施例1中设计的空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的检测引物和检测探针具有高度的特异性，分别适合对空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌进行特异性检测。
敏感性试验及标准曲线的制作
将经过平板菌落计数原始浓度分别为2.8×106cfu/mL、2.6×106cfu/mL、3.0×106cfu/mL的空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的培养液，进行10倍梯度稀释，空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌菌液浓度依次为105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL和101cfu/mL。按照上述测试方法进行单重实时荧光PCR方法进行扩增，检测最低检测浓度，制作标准曲线。空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌梯度稀释荧光PCR扩增结果分别如图4、图5、图6所示，曲线从依左到右的分别为扩增浓度为105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL和101cfu/mL对应的曲线。空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌单重实时荧光PCR扩增标准曲线分别如图7、图8、图9所示。结果表明梯度稀释空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌后进行单重实时荧光PCR扩增，Ct值与初始模板浓度之间出现良好的线性关系，空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌线性相关系数分别为0.998、0.997和0.997，扩增效率依次98.3％、97.2％和112％，最低检测浓度分别为102cfu/mL、105cfu/mL和103cfu/mL，与以往报道的检测最低限度一致。由此可见，实施例1的检测引物和检测探针灵敏度高。
三重实时荧光PCR扩增方法的建立、敏感性试验及标准曲线制作
在单重实时荧光PCR扩增的基础上优化PCR反应体系，得到三重实时荧光PCR反应体系。三重实时荧光PCR反应体系列30μL，包括:模版DNA3μL(空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的培养液DNA各1μL，共3μL)，10×PCR混合液3μL，20μmol/LTaqMan检测探针各1μL(包括针对mapA基因的检测探针1μL、针对fimY的检测探针1μL和针对hly的检测探针1μL，共3μL，探针的序列见表1)，20μmol/L检测引物各1μL(包括针对mapA基因的引物各1μL、针对fimY基因的引物各1μL和针对hly基因的引物各1μL，共6μL，引物的序列见表1),2.5U Taq聚合酶3μL，去离子水加至30μL。荧光PCR反应参数为95℃2min、95℃5s、55℃35s，40个循环。
原始浓度分别为2.8×106cfu/mL、2.6×106cfu/mL、3.0×106cfu/mL的空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的培养液，进行10倍梯度稀释，按照上述三重实时荧光PCR体系进行实时荧光PCR扩增，评价三重荧光PCR体系的最低检测浓度。在荧光PCR仪上选择标准品模式，仪器配套软件自动绘制标准曲线。
结果表明:空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的三个实时荧光PCR扩增曲线指数期明显，而且三个实时荧光PCR扩增曲线相互之间互不干扰(如图10所示，每一种菌左边曲线表示扩增本公司分离保存的沙门氏菌，右边曲线表示扩增阳性标准品菌株)。梯度稀释后三重实时荧光PCR扩增结果显示上述3种菌株的模板浓度与Ct值之间也出现良好的线性关系(如图11所示，每一种菌四个浓度)，空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的线性系数为别为0.992、0.993和0.988，最低检测浓度分别达到106cfu/mL、108cfu/mL和104cfu/mL。从标准曲线的斜率计算三重荧光PCR扩增效率，空肠弯曲菌为89％、沙门氏菌为87％、单增李斯特菌为90％。三重实时荧光PCR标准曲线如图12a、图12b、图12c所示。由此可见，实施例1的检测引物和检测探针在三重实时荧光PCR反应灵敏度高。
模拟样品的检测
用均质袋分别秤取25g冻鸡肉每份样品中分别添加1mL己知浓度的空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌，制成7份模拟样品。样品中加入的空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的浓度依次为106cfu/mL、108cfu/mL和104cfu/mL。各模拟样品加入的菌如表2所示。
表2：模拟样品中的菌类
再向每份样品中加入225mL缓冲蛋白胨水BP，用拍打器拍打20min，37℃培养10h，然后取一部分按照三重实时荧光PCR扩增，同时取一部分用实施例1中的检测试剂盒按GB4789.4-2010<<食品卫生微生物检验》继续进行检测。
结果表明:加入空肠弯曲菌的样品1扩增出mapA基因保守区域的扩增曲线(如图13所示)，加入沙门氏菌的样品2出现fimY基因保守区域扩增曲线(如图14所示)，加入单增李斯特菌的样品3出现hly基因的保守区域扩增曲线(如图15所示)，加入混合的空肠弯曲菌和沙门氏菌的样品4中扩增出mapA基因保守区域以及fimY基因保守区域的保守区域两条扩增曲线(如图16所示，同样另外两两混合的样品5和6也检测出对应扩增曲线，为了方便观察，只列出其中一种)。加入空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌混合的样品7进行三重实时荧光PCR扩增时，同时出现了mapA基因保守区域、fimY基因保守区域以及hly基因保守区域三条扩增曲线(如图17所示)。按照GB4789.4-2010<<食品微生物学检验》检测的模拟样品，均分离出与空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌添加的菌株相符的，结果与三重实时荧光PCR法相同。
以上结果说明，实施例1中的特异性的引物及探针能够同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌，且扩增时没有交叉污染，检测的灵敏度高。
对比例1
菌株的选取及检测引物、检测探针的设计
空肠弯曲菌参考菌株、沙门氏菌、单增李斯特菌均为深圳市草履虫生物科技有限公司分离保存。
根据GenBank上的空肠弯曲菌中特异性基因ORF保守序列基因C(序列号：905987)，用Oligo软件设计检测引物和检测探针。根据GenBank上查找各种属沙门氏菌AceA基因(序列号：U43344.1)，用Oligo软件设计检测引物和检测探针。根据Genbank公布的单增李斯特菌iap基因(登录号：NC_003210.1)，用Oligo软件设计检测引物和检测探针，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
所设计的检测引物和检测探针序列如表3所示。
表3：另一种设计的实时荧光PCR检测引物和检测探针序列
注：probe-C的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMARA；probee-AceA的5’端标记荧光报告基团JOE，3’端标记淬灭基团TAMARA；probe-iap的5’端标记荧光报告基团cy5，3’端标记淬灭基团BHQ2。
一种荧光PCR检测用试剂盒，包括：PCR混合液、直扩PCR聚合酶(直扩酶omniTaq，美国VitaNavi)、阴性对照以及阳性对照。其中PCR混合液中包括PCR缓冲液、直扩PCR聚合酶、dNTP以及引物和探针。PCR缓冲液中含有MgC12，MgC12浓度为5mmol/L，dNTP浓度为2.5mmol/L。OmniTaq酶浓度为0.5U/反应～5U/反应。引物和探针包括上游引物ORF-C-F、下游引物ORF-C-R、探针probe-C、上游引物AceA-F、下游引物AceA-R、探针probe-AceA上游引物iap-F、下游引物iap-R和探针probe-iap，具体序列参见表3所示，各引物和探针的浓度均为20μmol/L。
对比例1的检测
三重实时荧光PCR反应体系列以及条件同对实施例1的检测方法，其中探针和引物的组合如下(具体序列参见表1和表3)。
组合1：20μmol/LTaqMan检测探针各1μL(包括针对C基因的检测探针1μL、针对fimY的检测探针1μL和针对hly的检测探针1μL，共3μL)，20μmol/L检测引物各1μL(包括针对C基因的引物各1μL、针对fimY基因的引物各1μL和针对hly基因的引物各1μL，共6μL)；
组合2：20μmol/LTaqMan检测探针各1μL(包括针对mapA基因的检测探针1μL、针对AceA的检测探针1μL和针对hly的检测探针1μL，共3μL)，20μmol/L检测引物各1μL(包括针对mapA基因的引物各1μL、针对AceA基因的引物各1μL和针对hly基因的引物各1μL，共6μL)；
组合3：20μmol/LTaqMan检测探针各1μL(包括针对mapA基因的检测探针1μL、针对FimY的检测探针1μL和针对iap的检测探针1μL，共3μL)20μmol/L检测引物各1μL(包括针对mapA基因的引物各1μL、针对FimY基因的引物各1μL和针对iap基因的引物各1μL，共6μL)；
组合4：20μmol/L TaqMan检测探针各1μL(包括针对C基因的检测探针1μL、针对AceA的检测探针1μL和针对iap的检测探针1μL，共3μL)，20μmol/L检测引物各1μL(包括针对C基因的引物各1μL、针对AceA基因的引物各1μL和针对iap基因的引物各1μL，共6μL)；
用各组合的引物和探针按同样的方法检测加入空肠弯曲菌、沙门氏菌、单增李斯特菌混合的样品7(参见表2)，并进行三重实时荧光PCR扩增。
结果表明:组合1中，沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线指数期不明显，与空肠弯曲菌的实时荧光PCR扩增曲线重叠，单增李斯特菌没有扩增曲线(如图18所示)。说明三个种引物和探针在同时扩增时，相互干扰，组合1的引物和探针不能同时检测出空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌。
组合2中虽然都有扩增曲线，但是沙门氏菌、空肠弯曲菌以及单增李斯特菌的实时荧光PCR扩增曲线指数期不明显，与空肠弯曲菌的实时荧光PCR扩增曲线重叠，三个实时荧光PCR扩增曲线相互干扰(如图19所示)。说明组合2的引物和探针不能同时检测出空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌。
组合3中空肠弯曲菌没有扩增曲线，单增李斯特菌实时荧光PCR扩增曲线指数期不明显，与沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线重(如图20所示)。说明三个种引物和探针在同时扩增时，相互干扰，组合3的引物和探针不能同时检测出空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌。
组合4中单增李斯特菌没有扩增曲线，空肠弯曲菌和沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线指数期不明显(如图21所示)。说明三个种引物和探针在同时扩增时，相互干扰，组合4的引物和探针不能同时检测出空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌。
比较实施例1的试剂盒与对比例1的试剂盒的检测结果，而对比例1中针对不同基因设计的引物和探针，各组合均不能达到同时检测出空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌的目的。而实施例1中的特异性的引物及探针能够同时扩增空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种菌(参见图17)，且扩增时没有交叉污染，检测的灵敏度高。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市草履虫生物科技有限公司
<120> 检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物及探针、试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtcaagcac aactattcct c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaaagaagg gcaaaaggt 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accgcattaa aattcacatc gaca 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgcctgcc gttatcac 18
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattgagctg ttggttcagt aactc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaacgccgc agatatttga tcgcc 25
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaacttcaa aagcttatac agatgga 27
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcaaataga tggacgatgt gaaat 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgatcactc tggaggatac gttgctc 27
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggtatggc tataggaact cttatagct 29
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacacctgaa gtatgaagtg gtctaagt 28
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcatatc ctaattta 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcaccgaaag accaacagaa g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaactcgctg aaatgagcag 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggcaggaga agtacccaca gg 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttatacgcga ccgaagccaa c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caaactgcta acacagctac t 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aggagaagta cccaacacag ctac 24

Claims (10)

1.一种同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，其特征在于，包括：
用于扩增空肠弯曲菌的上游引物mapA-F，所述上游引物mapA-F针对空肠弯曲菌的mapA基因设计；
用于扩增空肠弯曲菌的下游引物mapA-R，所述下游引物mapA-R针对空肠弯曲菌的mapA基因设计；
用于检测空肠弯曲菌的探针probe-1，所述探针probe-1针对空肠弯曲菌的mapA基因设计，所述探针probe-1的两端分别结合有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团；
用于扩增沙门氏菌的上游引物fimY-F，所述上游引物fimY-F针对沙门氏菌的fimY基因设计；
用于扩增沙门氏菌的下游引物fimY-R，所述下游引物fimY-R针对沙门氏菌的fimY基因设计；
用于检测沙门氏菌的探针probe-2，所述探针probe-2针对沙门氏菌的fimY基因设计，所述探针probe-2的两端分别结合有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团；
用于扩增单增李斯特菌的上游引物hly-F，所述上游引物hly-F针对单增李斯特菌的hly基因设计；
用于扩增单增李斯特菌的下游引物hly-R，所述下游引物hly-R针对单增李斯特菌的hly基因设计；
用于检测单增李斯特菌的探针probe-3，所述探针probe-3针对单增李斯特菌的hly基因设计，所述探针probe-3的两端分别结合有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团；
所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团以及所述第三荧光报告基团各不相同。
2.根据权利要求1所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，其特征在于，所述上游引物mapA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物mapA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述上游引物fimY-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述下游引物fimY-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述上游引物hly-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述下游引物hly-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
3.根据权利要求1所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，其特征在于，所述探针probe-1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述探针probe-2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述探针probe-3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
4.根据权利要求1所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，其特征在于，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团和所述第三荧光报告基团均选自FAM荧光基团、JOE荧光基团、cy5荧光基团、ROX荧光基团、VIC荧光基团和TET荧光基团中的一种；
所述第一荧光淬灭基团、所述第二荧光淬灭基团和所述第三荧光淬灭基团均选自Tamara淬灭基团、BHQ20淬灭基团和Dabcy1淬灭基团中的一种。
5.根据权利要求1或4所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，其特征在于，所述第一荧光报告基团为FAM荧光基团，所述第二荧光报告基团为JOE荧光基团，所述第三荧光报告基团为cy5荧光基团。
6.一种同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1～5任一项所述的复合荧光PCR检测用引物以及探针。
7.根据权利要求6所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTP、直扩PCR聚合酶、阳性对照品以及阴性对照品。
8.根据权利要求7所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒，其特征在于，所述上游引物mapA-F、所述下游引物mapA-R、所述探针probe-1、所述上游引物fimY-F、所述下游引物fimY-R、所述探针probe-2、所述上游引物hly-F、所述下游引物hly-R、所述探针probe-3、所述PCR缓冲液与所述dNTP混合形成PCR混合液。
9.根据权利要求8所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒，其特征在于，所述PCR混合液中所述上游引物mapA-F、所述下游引物mapA-R、所述探针probe-1、所述上游引物fimY-F、所述下游引物fimY-R、所述探针probe-2、所述上游引物hly-F、所述下游引物hly-R以及所述探针probe-3的浓度均为10μmol/L～30μmol/L，所述dNTP的浓度为1mmol/L～5mmol/L。
10.如权利要求1～5任一项所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针或者如权利要求6～9任一项所述的同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的荧光PCR检测用试剂盒在检测可食用材料中的应用。
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