CN101805799A - 单核细胞增生李斯特菌荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种食品安全技术领域的增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，其中的试剂盒包括：荧光定量PCR反应液、荧光探针、热启动TaqDNA聚合酶、标准阳性模板和阴性质控标准品；本发明通过采用常规方法提取待测样品DNA，并以所得DNA为模板，利用单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR扩增，得反应产物，之后将反应产物置于定量PCR仪中进行荧光检测，对样品中单核细胞增生李斯特菌进行定性检测或定量检测。本发明的试剂盒可用于单核细胞增生李斯特菌的定性和定量检测；本发明的试剂盒检测特异性高，检测灵敏度高，定量准确，检测速度快。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品安全技术领域的试剂盒及检测方法，具体是一种单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
李斯特菌是革兰氏阳性无芽孢杆菌，该属内共有7种菌(单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、绵羊李斯特菌(L.ivanovii)、墨氏李斯特菌(L.murrayi)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、威尔氏李斯特菌(L.welshimeri)、英诺克李斯特菌(L.innocua))，其中仅单核细胞增生李斯特菌对人有致病性，是一种人畜共患病的病原菌，中毒症状严重，除了常见的呕吐、腹泻等胃肠道表现外，还可以侵蚀人体中枢神经系统(主要表现为败血症、脑膜炎、流产等疾病)，对机体造成极大的伤害。人类李斯特菌病的大多数病例分为零散性发生，爆发性发生或二者兼而有之。其发病率虽不高，但致死率可高达20％～30％。孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷者是易感人群。它在自然界广泛分布，蔬菜、乳制品、海产品、肉类和禽类等食品中都已证实是李斯特菌的传播载体，它可在4℃的环境中生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
近年发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(如Walker CG，Meier S，Mitchell MD等在《BMC Molecular Biology》(BMC分子生物学)2009年第10卷第100页发表的题为《Evaluationof real-time PCR endogenous control genes for analysis of gene expression in bovineendometrium》(实时荧光定量PCR法分析牛子宫内膜内源控制基因的表达)一文中所述的)和病原体的定性定量检测(如Zago M，Bonvini B，Carminati D等在《Systematic and AppliedMicrobiology》(系统与应用微生物学)2009第32卷第514～521页发表的题为《Detection andquantification of Enterococcus gilvus in cheese by real-time PCR》(荧光定量PCR法定性定量检测奶酪中的肠球菌)一文中所述的)等方面得到广泛应用。
经对现有技术的文献检索发现，陈慧燕等发表于《中国热带医学》2006年第6卷第770～772页的题为《食品中李斯特菌检测方法探讨及药敏结果分析》的文章。该技术通过对8类食品45件样品的检测，其采用的国标法以及改良方法需要制备培养基、计算菌落数量和鉴定菌落的生化特性等，耗时较长，操作繁琐；其采用的Mini VIDAS法检出率较低，检测灵敏度不高。因此该现有技术并不适合当前食品快速检测的需求。
目前常规鉴定单核细胞增生李斯特菌的方法以常规培养方法为主(可见标准GB/T4789.30-2003)，根据生化特性、致病力及协同溶血试验等进行鉴定，鉴定周期需要5～10天。免疫学方法较快，但单克隆抗体制备困难，易产生交叉反应，特异性差。常规PCR方法虽然具有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题，因此亟待开发精确、灵敏、快速、无污染的快速检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒可用于单核细胞增生李斯特菌的定性和定量检测；本发明的试剂盒检测特异性高，检测灵敏度高，定量准确，检测速度快。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括：荧光定量PCR反应液、荧光探针、热启动TaqDNA聚合酶、标准阳性模板和阴性质控标准品；
所述的荧光定量PCR反应液具体为：10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs、正向引物、反向引物；其中正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示；
所述的荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，其中，荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为ELIPCE；
所述的标准阳性模板为重组质粒的DNA，该重组质粒的质粒为pMD18-T，整合的基因的碱基序列如SEQ ID No.4所示；
所述的阴性质控标准品为沙门氏菌、副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌DNA等。
优选地，所述的荧光定量PCR反应液的组分为：按体积比，2体积的10×PCR buffer，1体积的5μmol/L的正向引物，1体积的5μmol/L的反向引物，1.5体积的25mM的MgCl2，1.5体积的25mM dNTPs。
本发明涉及上述单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
①采用常规方法提取待测样品DNA为模板，
②用单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR扩增，得反应产物，
③将反应产物置于定量PCR仪中进行荧光检测，
④对样品中单核细胞增生李斯特菌进行定性检测或定量检测。
所述的定性检测具体为：选择荧光检测模式为FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，设定阈值线，若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈对数增长，则判断为阳性，即样品中存在单核细胞增生李斯特菌，否则则样品中不存在单核细胞增生李斯特菌；
所述的定量检测具体为：设定梯度浓度的标准阳性模板，采用与步骤二的PCR扩增相同的反应体系和参数进行PCR扩增，以标准阳性模板的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，得到样品单核细胞增生李斯特菌的含量。
所述的PCR扩增中，20μl的PCR反应体系组成如下：模板DNA 2μl，5U/μl的热启动TaqDNA聚合酶0.2μl，5μmol/L荧光探针0.4μl，荧光定量PCR反应液10μl，阴性质控标准品7.4μl。
所述的PCR反应的参数为：95℃15S，95℃5S，65℃34S；45个循环。
本发明的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒中有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号变化。在PCR退火和延伸过程中，探针和模板特异性结合，随着引物的延伸，热启动Taq DNA聚合酶利用其5′-3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对单核细胞增生李斯特菌的定量可通过与标准品的循环阈值相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
本发明的试剂盒可用于单核细胞增生李斯特菌的定性和定量检测；本发明的试剂盒检测特异性高，降低了常规PCR方法的假阳性率；检测灵敏度高，定量准确；利用本发明的试剂盒进行检测，速度快，仅需1小时，加上样品DNA的提取制备时间，总体检测时间可控制在3小时以内。
附图说明
图1是实施例中试剂盒检测单核细胞增生李斯特菌标准菌株特异性结果图；
图2是实施例中试剂盒检测标准菌株DNA模板等比例稀释结果；
图3是实施例中试剂盒的荧光定量PCR的标准曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例
本实施例涉及的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的组分为：
(均购自宝生物工程(大连)有限公司)：
荧光定量PCR反应液，荧光探针(5μM，1ul)，热启动TaqDNA聚合酶(5U/μl，0.2ul)，标准阳性模板，阴性质控标准品；
所述的荧光定量PCR反应液具体为：10×PCR buffer 2ul、25mM MgCl21.5ul、2.5mM dNTPs1.5ul、正向引物(5μM，1ul)、反向引物(5μM，1ul)；其中正向引物的碱基序列如SEQIDNo.1所示，反向引物的碱基序列如SEQID No.2所示；
所述的荧光探针的碱基序列如SEQID NO：3所示，其中，荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为ELIPCE；
所述的标准阳性模板为重组质粒的DNA，该重组质粒的质粒为pMD18T，整合的基因的碱基序列如SEQ ID No.4所示；(浓度为109拷贝/μl标准阳性模板pM-Lm)
所述的阴性质控标准品：沙门氏菌、副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌DNA等。
利用所述的试剂盒进行检测，包括如下步骤：
步骤一，DNA模板的制备
参考菌株培养及制备：
李斯特菌参考菌株：
单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes(ATCC BAA-751、ATCC13313、ATCC13932、ATCC 7644、ATCC 27708、CMCC54002、CMCC54003、CCTCC AB97021)；绵羊李斯特菌L.ivanovii(CCTCC AB97016)；西尔李斯特菌L.seeligeri(CCTCC AB97018)、格氏李斯特菌L.grayi(CCTCCAB97017、CCTCC AB97019)、威尔氏李斯特菌L.welshimeri(CCTCC AB97020)和英诺克李斯特菌L.innocua(CCTCC AB97022)；
非李斯特菌属菌株：
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC13565)、沙门氏菌Salmonella(ATCC10708)、弧菌Vibrio(ATCC27562)、变形杆菌Bacillus proteus(ATCC12453)、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae(CMCC51335)、藤黄八叠球菌Sarcina lutea(ATCC9341)、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae(ATCC700323)、粪肠球菌Enterococcus faecalis(ATCC49452)、肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae(ATCC27336)、大肠杆菌Escherichiacoli 0157:H7(ATCC43889)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ATCC6633)、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii(ATCC8090)和沙雷氏菌Serratia liquefaciens(ATCC27592)。(注：ATCC：美国标准菌种收藏所；CMCC：中国医学细菌菌种保藏管理中心；CCTCC：中国典型培养物保藏中心)
DNA的提取：取菌悬液1ml，充分震荡摇匀，转至1.5ml离心管中，10,000g离心5min，重复洗涤1次，再次离心后采用试剂盒(上海奥润微纳新材料科技有限公司)提取DNA，取2ul做PCR反应，提取的DNA模板在-20℃贮存备用。
步骤二，荧光定量PCR反应
反应体系如下：
成分 加样量(μl)
模板DNA 2
热启动TaqDNA聚合酶(5U/μl) 0.2
荧光探针(5μmol/L) 0.4
荧光定量PCR反应液 10
阴性质控标准品 7.4
总体积 20
PCR反应参数如下：95℃15S，95℃5S，65℃34S；45个循环。
仪器：ABI7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司。
步骤三，定量标准曲线的制作
将标准阳性模板10倍倍比稀释成109～101拷贝/μl的浓度梯度，在上述反应条件下每个浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，反应结束后采用ABI 7500Software v2.0.1软件分析。如图3所示，起始模板在107-101拷贝/μl线性良好，得到线性回归方程：y＝-3.914x+41.718，R2＝0.999。
步骤四，敏感性及特异性测定
取单核细胞增生李斯特菌标准菌株储备液提取基因组DNA后，按照10倍比例稀释，用荧光定量PCR分析，以确定最低下限。取绵羊李斯特菌、墨氏李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌、威尔氏李斯特菌、英诺克李斯特菌以及金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等非李斯特菌株储备液提取DNA后分析检测。结果如图2所示，其中1～6分别为浓度为5.4×106CFU/ml，5.4×105CFU/ml，5.4×104CFU/ml，5.4×103CFU/ml，5.4×102CFU/ml，5.4×101CFU/ml的标准菌株基因组DNA，7是阴性对照。由图2可知，标准菌株基因组DNA等比例稀释，Q-PCR结果呈现规律的Ct值变化，说明仪器参数稳定，最低检测下限达到67CFU/ml。单核细胞增生李斯特菌标准菌株呈阳性扩增，绵羊李斯特菌等及金黄色葡萄球菌等非李斯特菌的检测结果均为阴性，与预期结果完全相同，无非特异性扩增。
步骤五，重复性测定
将标准阳性模板10倍系列稀释，在上述反应条件下进行扩增。循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：单核细胞增生李斯特菌标准阳性模板107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl的Ct值分别为13.12，16.96，20.97，25.00，28.88；阴性对照为0。反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。
由本实施例的实验数据可证实，利用本实施例的试剂盒进行荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2小时就可完成，传统的培养方法全过程需要4～7天，使用本实施例的试剂盒可大大缩短检测时间，且操作过程仅需1人即可。
Claims (7)
1.一种单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括：荧光定量PCR反应液、荧光探针、热启动TaqDNA聚合酶、标准阳性模板和阴性质控标准品，其特征在于：
所述的荧光定量PCR反应液具体为：10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs、正向引物、反向引物；其中正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示；
所述的荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，其中，荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为ELIPCE；
所述的标准阳性模板为重组质粒的DNA，该重组质粒的质粒为pMD18-T，整合的基因的碱基序列如SEQ ID No.4所示；
所述的阴性质控标准品为沙门氏菌、副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌DNA。
2.根据权利要求1所述的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是，所述的荧光定量PCR反应液的组分为：按体积比，2体积的10×PCR buffer，1体积的5μmol/L的正向引物，1体积的5μmol/L的反向引物，1.5体积的25mM的MgCl2，1.5体积的25mM dNTPs。
3.一种根据权利要求1所述的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
①采用常规方法提取待测样品DNA为模板，
②用单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR扩增，得反应产物，
③将反应产物置于定量PCR仪中进行荧光检测，
④对样品中单核细胞增生李斯特菌进行定性检测或定量检测。
4.根据权利要求3所述的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征是，所述的PCR扩增中，20μl的PCR反应体系组成如下：模板DNA 2μl，5U/μl的热启动TaqDNA聚合酶0.2μl，5μmol/L荧光探针0.4μl，荧光定量PCR反应液10μl，阴性质控标准品7.4μl。
5.根据权利要求3所述的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征是，所述的PCR反应的参数为：95℃ 15S，95℃ 5S，65℃ 34S；45个循环。
6.根据权利要求3所述的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征是，所述的定性检测为：选择荧光检测模式为FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，设定阈值线，若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈对数增长，则判断为阳性，即样品中存在单核细胞增生李斯特菌，否则则样品中不存在单核细胞增生李斯特菌。
7.根据权利要求3所述的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征是，所述的定量检测为：设定梯度浓度的标准阳性模板，采用与PCR扩增相同的反应体系和参数进行PCR扩增，以标准阳性模板的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，得到样品单核细胞增生李斯特菌的含量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100818 |