CN109971873A - 鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法。本发明通过对单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的基因组序列进行分析，提供了用于高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO.1‑2所示。在此基础上，建立了利用高分辨熔解曲线技术鉴别三种李斯特氏菌的方法，具有较高的灵敏度、特异性和准确性，能够高效检出上述三种李斯特氏菌，具有操作简单、成本低、快速、高通量等优点，可用于临床检测、农业生产、食品安全等领域的李斯特氏菌的鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的特异性引物对、试剂盒以及单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的鉴别方法。
背景技术
李斯特氏菌属有7个菌种，常见的有单核细胞增生李斯特氏菌，伊氏李斯特氏菌，英诺克李斯特氏菌。该菌属能够引起食物中毒的主要是单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特氏菌)，单增李斯特氏菌是一种常见的食源性致病菌，世界贸易组织于20世纪90年代将其列为四大食源性致病菌之一。该菌为革兰氏阳性短杆菌，广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。由于单增李斯特氏菌特有的毒力相关蛋白(包括与黏附和侵入宿主细胞、在胞内生存复制、逃逸吞噬液泡及细胞间扩散等相关的毒力因子)的分子特点及作用机制，人类受感染后可导致脑膜炎、肠胃炎、败血症、孕妇流产等，新生儿及免疫力低下者更易感染。单增李斯特氏菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，在极端的环境中亦能存活，因此是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，对人体的身体健康造成潜在的危害。
传统的李斯特氏菌分类鉴定方法主要有GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》和聚合酶链式反应技术(PCR)。国标中的生化鉴定方法，鉴定周期长(10天左右)、步骤繁琐，而且单增李斯特氏菌的菌落形态与伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌极其相似，溶血圈的大小凭借肉眼难以分辨，必须借助协同溶血试验才能将几种李斯特氏菌分辨。除形态学培养鉴定外，李斯特氏菌的鉴定方法还有普通PCR和实时荧光PCR法，这些方法步骤繁琐、耗时长、或是探针成本较高，使得无法及时鉴定病原，进而影响食品安全监测的时效性。因此，开发快速、准确、简单易行、成本低的单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的鉴别方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异、灵敏、高效扩增的用于高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的特异性引物对，以及利用该引物对建立的快速、准确、灵敏、简单易行且成本低的单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌鉴别方法。
为实现上述目的，本发明通过对单核细胞增生李斯特氏菌 (Listeriamonocytogenes)，伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)，英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)这三种李斯特氏菌以及13种其它常见的真菌和食源性致病菌(Staphylococcusaureus、Escherichia coli、Campylobacter jejuni、Salmonella enteritidis、Klebsiella pneumoniae、Mycoplasma pneumoniae、Vibrio parahemolyticus、Vibriocholerae、Candida albicans、Trichosporon beigelii、Curvularia lunata、 Alternariaalternata、Cladosporium)的基因组序列进行大量分析和比对，寻找单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌这三种李斯特氏菌高度特异的靶序列，确定以iap基因(登录号：DQ054587.1)为靶标；在iap基因序列中寻找差异性靶序列，并针对该差异性靶序列设计鉴别引物，通过精心设计和筛选，得到适用于高分辨熔解曲线(Highresolution melting，HRM)技术的特异性引物对(SEQ ID NO.1-2)，利用该特异性引物对通过HRM技术能够灵敏、准确地鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌。
具体地，本发明的技术方案如下：
首先，本发明提供用于高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。
SEQ ID NO.1:TGACACTATTTGGGCTTTATCC；
SEQ ID NO.2:CCGTTTTCACTTCTGCTTTTG。
单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的iap基因片段的序列不同会使PCR扩增产物双链DNA的Tm值发生变化，使得双链DNA在升温过程中先后解链，形成不同的熔解曲线形状；HRM技术能够实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度和时间曲线上就能判断是否存在有差异的iap基因片段，能够有效区分单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的特异性iap基因序列。
HRM分析技术对于特异性引物对的扩增效率要求十分严格，特异性引物对的扩增效率会影响HRM分析的准确性，本发明经过人工设计和优化，确定了SEQ ID NO.1-2的特异性引物对，该引物对能够实现灵敏、准确的单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的HRM技术鉴别。
在此基础上，本发明提供序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对在制备用于鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的试剂盒中的应用。
本发明还提供用于高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的试剂盒，包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对。
进一步地，本发明提供序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对或含有所述特异性引物对的试剂盒的如下任一种应用：
(1)鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌中的应用；
(2)在食品、农产品的李斯特氏菌检测中的应用；
(3)在农业生产安全或食品安全监测中的应用。
本发明还提供一种利用高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法，采用序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对进行PCR扩增，根据PCR 扩增产物的序列特征判断待测样品中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌或英诺克李斯特氏菌。
具体地，所述利用高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对进行荧光PCR扩增；
(3)采用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线峰形，判断待测样品中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌或英诺克李斯特氏菌。
作为优选，上述步骤(2)中，所述PCR扩增的反应程序包括： 95℃预变性10min；95℃变性15s，56℃退火20s，35个循环，升降温速度1.6℃/s；
熔解曲线的制作程序包括：①95℃、10s，60℃、1min；②95℃、15s，60℃、15s；其中，步骤①至步骤②过渡的升温速率为0.025℃/s；步骤①和步骤②的升降温速率为1.6℃/s速率。
上述熔解曲线制作过程中，连续检测荧光强度，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。
作为优选，上述步骤(2)中，所述PCR扩增的30μL反应体系如下：2×Mix TaqmanPCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、 100×Rox Reference DyeⅡ0.3μL、20×Evagreenin Water 1.5μL、待测样品基因组DNA 2μL，以灭菌纯水补足反应体系至30μL。
作为优选，上述步骤(3)中，根据熔解曲线制作熔解峰值图，若Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰，且峰形与单核细胞增生李斯特氏菌的标准菌株一致，则判断待测样品中单核细胞增生李斯特氏菌检出；若Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰，且峰形与伊氏李斯特氏菌的标准菌株一致，则判断待测样品中伊氏李斯特氏菌检出；若Tm值在77～79℃范围内出现熔解峰，且峰形与英诺克李斯特氏菌的标准菌株一致，则判断待测样品中英诺克李斯特氏菌检出。
上述单核细胞增生李斯特氏菌的标准菌株可以为单核细胞增生李斯特氏菌的常用菌株，包括但不限于单核增生细胞李斯特氏菌 ATCC19115。
上述伊氏李斯特氏菌的标准菌株可以为伊氏李斯特氏菌的常用菌株，包括但不限于伊氏李斯特式菌ATCC19119。
上述英诺克李斯特氏菌的标准菌株可以为英诺克李斯特氏菌的常用菌株，包括但不限于英诺克李斯特氏菌ATCC33090。
本发明的有益效果在于：
本发明利用荧光实时定量PCR(RT-PCR)及高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌，在检测过程中采用全密闭反应管检测与结果分析，无需进行后续PCR产物电泳检测与分析，简化操作流程、降低实验检测成本，提高检测效率和检测通量、避免样品和环境的交叉污染；无需设计特异性探针，能够有效降低检测成本。
本发明针对特异的单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的iap基因片段的差异靶序列设计了具有高效扩增效率和特异性的引物对，在该特异性引物对的基础上开发的检测方法具有较高的灵敏度，检测下限为100拷贝，且HRM得到的熔解曲线标准峰形区分明显，能有效区分单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌；具有较高的准确性和特异性，能够特异、准确地检出单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌，有效避免假阳性和假阴性；具有操作简单、成本低、快速、高通量等优点，可用于临床检测、农业生产、食品安全等领域的李斯特氏菌的鉴别，为农业生产、食品安全以及李斯特氏菌感染的监测提供有效方法和依据。
附图说明
图1为本发明实施例1中候选引物组合中引物对F2/R2、F3/R3、 F4/R4的HRM曲线图，其中A，B为候选引物对F2/R2的HRM曲线图，C、D为候选引物对F3/R3的HRM曲线图，E、F为候选引物对F4/R4的HRM曲线图。
图2为本发明实施例2中鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的高分辨熔解曲线和熔解峰值图谱，其中，A为单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的熔解曲线图；B为单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的HRM熔解峰值图；C为单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的HRM曲线差异图。
图3为本发明实施例3中鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的方法对于单核细胞增生李斯特氏菌检测灵敏度的分析结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1适用于HRM技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的特异性引物对的设计和确定
下载单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的基因组序列，进行序列比对分析，确定以iap基因(登录号： DQ054587.1)为靶标；在iap基因序列中寻找差异性靶序列，针对该差异性靶序列设计不同的引物对，通过筛选确定适用于HRM技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的特异性引物对。本发明经过大量筛选和对比实验发现并非只要满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现很好的HRM鉴别效果，相反，在筛选过程中，一些符合引物设计原则或采用软件设计打分较高的引物对并没有得到较好的扩增和HRM鉴别效果。
在满足一般性的设计原则和软件设计引物的基础上，本发明针对引物与靶序列结合的稳定性、引物对之间或引物与靶序列之间的二级结构、GC含量、Tm值、、引物长度、扩增片段长度等进行了人工优化设计和大量引物对的筛选对比，候选引物对的部分罗列及效果说明如表1和图1所示，其中，表1中的正向引物和反向引物进行任意组合形成引物对进行扩增检测，图1中显示部分引物组合的HRM检测结果。
表1 候选引物序列
上述Tm值的计算公式如下：
其中，ΔH为双螺旋形成的焓，ΔS为双螺旋形成的熵，R为摩尔气体常数，C为引物浓度，F为稀释倍数，M为一价阳离子总浓度。
通过人工优化和大量筛选，本发明最终得到一对适用于HRM技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的最佳特异性引物对：
正向引物F1：SEQ ID NO.1:TGACACTATTTGGGCTTTATCC；
反向引物R1：SEQ ID NO.2:CCGTTTTCACTTCTGCTTTTG。
采用上述引物对(SEQ ID NO.1-2)扩增得到的单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的iap基因的PCR 产物长度为155bp，扩增产物序列如表2所示。
表2 李斯特氏菌的iap扩增片段序列
实施例2鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的方法
本实施例提供利用高分辨熔解曲线分析技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：
1、提取待测样品的基因组DNA
采用粗提法提取待测样品的基因组DNA，凝胶电泳成像法对基因组DNA的浓度和纯度进行检测，使其能够满足后续PCR扩增的模板要求。
2、以步骤1提取得到的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行实时荧光定量PCR扩增。
正向引物F1：SEQ ID NO.1:TGACACTATTTGGGCTTTATCC；
反向引物R1：SEQ ID NO.2:CCGTTTTCACTTCTGCTTTTG。
上述PCR扩增的反应体系(30μl)如下：2×Mix Taqman PCR Master 15ul、正向引物0.9μl、反向引物0.9μl(正向和反向引物浓度均为10μM)、100×Rox Reference DyeⅡ0.3ul、20×Evagreen in Water 1.5μl、待测样品基因组DNA模板2μl，用灭菌纯水补足体系至30μl。
实时荧光定量PCR扩增反应在ABI QuantStudio 6flex上进行， PCR扩增的反应程序如表3所示。
表3 PCR扩增的反应程序
3、利用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线峰形，判断待测样品中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌或英诺克李斯特氏菌
利用ABI软件进行熔解曲线结果分析，通过与标准菌株(单核增生细胞李斯特氏菌ATCC19115、伊氏李斯特式菌ATCC19119、英诺克李斯特氏菌ATCC33090)的基因组DNA的HRM曲线(标准曲线)进行比较，基于曲线偏移和曲线形状变化反映不同李斯特氏菌种的iap基因片段差异；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。若Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰且与单核增生细胞李斯特氏菌ATCC19115的熔解曲线峰形一致，则判断待测样品中单核细胞增生李斯特氏菌检出；若Tm值在 78～80℃范围内出现熔解峰，且与伊氏李斯特氏菌ATCC19119的熔解曲线峰形一致，则判断待测样品中伊氏李斯特氏菌检出；若Tm 值在77～79℃范围内出现熔解峰且与英诺克李斯特氏菌ATCC33090的熔解曲线峰形一致，则判断待测样品中英诺克李斯特氏菌检出。
标准菌株单核增生细胞李斯特氏菌ATCC19115、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、英诺克李斯特氏菌ATCC33090的基因组DNA的 HRM检测结果如图2所示，结果表明，单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的熔解曲线的标准峰形区分明显(图2的A)；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标制作熔解峰值图(图2的B)，单核细胞增生李斯特氏菌的 Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰；伊氏李斯特氏菌的Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰；英诺克李斯特氏菌的Tm值在77～79℃范围内出现熔解峰。
实施例3鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法的灵敏度、特异性和准确性分析
1、灵敏度分析
以10倍系列梯度稀释的单核细胞增生李斯特氏菌的标准菌株 (单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115)的基因组DNA为模板，采用实施例2提供的鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法进行PCR扩增并分析其HRM的标准峰形。结果如图3所示，结果表明，实施例2提供的鉴别方法对单核细胞增生李斯特氏菌的DNA模板的检测下限为100拷贝，具有很高的灵敏度。
2、特异性分析
利用实施例2提供的鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法对单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌以及多种真菌和食源性致病菌 (Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Campylobacterjejuni、 Salmonella enteritidis、Klebsiella pneumoniae、 Mycoplasma pneumoniae、Vibrio parahemolyticus、Vibrio cholerae、 Candida albicans、Trichosporonbeigelii、Curvularia lunata、 Alternaria alternata、Cladosporium)同时进行种别鉴定。
结果显示，仅单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌能够成功扩增，单核细胞增生李斯特氏菌的Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰；伊氏李斯特氏菌的Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰；英诺克李斯特氏菌的Tm值在77～79℃范围内出现熔解峰；其它非李斯特氏菌均不能成功扩增。结果表明，实施例2 提供的鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法具有较高的特异性。
实施例4鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法的应用
1、购买市售牛板筋、冻鸡肉等标本共30个，以无菌操作取样品 25g加入到含有225mL的LB1增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min，于30℃恒温箱中培养24h。
2、采用粗提法提取待测样本的基因组DNA，以待测样本的基因组DNA为模板采用本发明实施例2提供的鉴别方法进行菌种鉴定。作为对照，同时以标准菌株(单核增生细胞李斯特氏菌ATCC19115、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、英诺克李斯特氏菌ATCC33090)的基因组DNA为模板进行扩增。
3、利用ABI软件进行PCR扩增结果分析，通过将待测样品的 HRM曲线与标准菌株扩增得到的标准曲线进行比较，基于熔解曲线的偏移和曲线形状变化获得不同李斯特菌种的iap基因片段的序列差异，判断样本中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌，鉴定结果如表4所示。
表4食品样品中单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的鉴别
对于上述表3中采用本发明实施例2的方法鉴别出相应李斯特氏菌的样本，再采用GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》的方法检测该样本，结果表明，本发明实施例2的方法与国标方法的检测结果一致，可见本发明实施例2的鉴别方法具有较高的准确性。
对于上述表3中采用本发明实施例2的方法检测结果显示未扩增的样本，再采用GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》的方法检测该样本，结果证明均不是单核细胞增生李斯特氏菌，可见，本发明实施例2鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法具有较高的准确性，无假阴性、无假阳性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 宁夏回族自治区食品检测研究院
<120> 鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法
<130> KHP191111676.3
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgacactatt tgggctttat cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 3
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<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaacgaacgg aggaagagc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccaacttaca ggcaggttgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagtcgaac gaacggagga 20
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccggtttccc ggagtta 17
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtcgaacga acggagga 18
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gacctggtac gattttatct gttgt 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagcactgta gtagtcgaag ctg 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tccacctttg atggacgtaa t 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaagctggtg atactctttg gg 22
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgtgccagc cgttagatt 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccgcaagcac tgtagtagtc g 21
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttgtgccag ccgttaga 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tctgttagcg caacttggtt 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtttgttgtt gcgttgctg 19
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
actgtagtag tcgaagctgg tga 23
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtttgttg ttgcgttgc 19
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggtgacacta tttgggcttt at 22
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcttctgttg gtgctttagg 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttctgttgg tgctttaggt g 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acactatttg ggctttatcc g 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gttttgcagc ttctgttggt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aagcggtgac actatttggg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gttgcgttgc tgtttctttt 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaagcggtg acactatttg g 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttgttgcgtt gctgtttctt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tggttttgca gcttctgttg 20
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgttttcact tctgcttttg ga 22
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gcagcttctg ttggtgctt 19
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cacttctgct tttggagtag ct 22
Claims (10)
1.用于高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的特异性引物对，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。
2.权利要求1所述特异性引物对在制备用于鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的试剂盒中的应用。
3.用于高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对。
4.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌中的应用。
5.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在食品、农产品的李斯特氏菌检测中的应用，或在农业生产安全或食品安全监测中的应用。
6.一种利用高分辨熔解曲线技术鉴别单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列特征判断待测样品中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌或英诺克李斯特氏菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行荧光PCR扩增；
(3)采用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线，判断待测样品中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌或英诺克李斯特氏菌。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15s，56℃退火20s，35个循环，升降温速度1.6℃/s；
熔解曲线的制作程序包括：①95℃、10s，60℃、1min；②95℃、15s，60℃、15s；其中，步骤①至步骤②过渡的升温速率为0.025℃/s；步骤①和步骤②的升降温速率为1.6℃/s速率。
9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的30μL反应体系如下：2×Mix Taqman PCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、100×Rox Reference Dye Ⅱ0.3μL、20×Evagreen in Water 1.5μL、待测样品基因组DNA 2μL，以灭菌纯水补足反应体系至30μL。
10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，根据熔解曲线制作熔解峰值图，若Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰且峰形与单核细胞增生李斯特氏菌的标准菌株一致，则判断待测样品中单核细胞增生李斯特氏菌检出；若Tm值在78～80℃范围内出现熔解峰且峰形与伊氏李斯特氏菌的标准菌株一致，则判断待测样品中伊氏李斯特氏菌检出；若Tm值在77～79℃范围内出现熔解峰且峰形与英诺克李斯特氏菌的标准菌株一致，则判断待测样品中英诺克李斯特氏菌检出。
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|---|---|---|---|---|
| CN111378774A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-07-07 | 重庆市计量质量检测研究院 | 一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法 |
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| CN104342496A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-02-11 | 上海海洋大学 | 一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法 |
| WO2018119443A1 (en) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | The Regents Of The University Of California | Method and device for digital high resolution melt |
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